CN104762374A

CN104762374A - 作为乳腺癌辅助检测的lincRNA标记物及试剂盒、探针、芯片

Info

Publication number: CN104762374A
Application number: CN201510101547.5A
Authority: CN
Inventors: 甘绍举; 丁先锋; 郭江峰; 王青; 沈建宇; 胡志迪; 赵明; 谢浩
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2015-03-09
Publication date: 2015-07-08

Abstract

本发明涉及一组用于辅助检测乳腺癌的基因间长片段非编码RNA标记物，该lincRNA生物标记物包含以下序列中的任意一种或者一种以上：LincRNA-BC2:SEQ ID NO.1；LincRNA-BC4:SEQ ID NO.2；LincRNA-BC5:SEQ ID NO.3；LincRNA-BC8:SEQ ID NO.4。并在此基础上，通过设计试剂盒来检测上述标记物，以及在设计试剂盒过程中设计的探针或探针组合、生物芯片。本发明可以进一步应用于早期确诊乳腺癌，这种新的组织学乳腺癌标记物不仅为人们在分子上全面了解乳腺癌的机理提供了物质基础，也加速了临床疾病诊断学和治疗学的进步。

Description

作为乳腺癌辅助检测的lincRNA标记物及试剂盒、探针、芯片

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体的说，本发明涉及一组用于辅助检测乳腺癌的基因间长片段非编码RNA(lincRNA)标记物，该RNA(lincRNA)标记物是一类位于两个基因间区的非编码RNA，转录本长度超过200碱基的RNA，其长度介于200bp～100kb之间，此类ncRNA不具有编码蛋白质的功能；另外本发明还涉及检测该标记物的相关试剂盒、试剂盒中的探针或探针组合以及用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的生物芯片。

背景技术

乳腺癌是最常见的妇科恶性肿瘤，其发生率和致死率居各肿瘤之首。据统计，2013年美国的癌症统计研究报告中，大约有23.24万女性罹患乳腺癌，占女性所有新发恶性肿瘤的29％，占全部女性所患癌症总人数的29％，位列妇女恶性肿瘤的首位，有约4万人死于乳腺癌，占因癌症造成死亡的14％，在女性因癌症死亡率居第二位，仅次于肺癌。其中50％乳腺癌病例和60％因乳腺癌死亡均发生在经济发达国家。通常在北欧和西欧和北美的一些国家，以及澳大利亚的发病率比较高。从20世纪90年代起，原属于低发区的亚洲国家发病率呈逐年升高趋势，在我国，据上海、北京、等发达城市的统计，其发病率正逐年以2％-3％的速度递增，在女性恶性肿瘤中已属首位并成为威胁妇女健康的重要因素。据2010年中国肿瘤登记年报，城市居民发病率(51.24/10万)高于农村居民(19.6/10万)。乳腺癌已成为严重危及女性生命安全的恶性肿瘤。目前乳腺癌的病因尚不明确，遗传、内分泌、免疫功能与环境因素等相互作用，可能共同参与了癌变的演进过程。

在最初的研究中，长片段非编码RNA一直被认为基因组转录过程中的“噪声”或者是“暗物质”，主要原因是其长度、数量、种类、产生和作用方式、功能状况都不明确，并还缺乏对此类RNA的研究方法。之前的研究认为lncRNA是转录过程中的副产物，不编码蛋白质，并不具备生物学上的功能，而近年来的研究逐渐表明，lncRNA参与转录激活、转录的干扰以及转录后的调控；同时在基因组印记、X染色体沉默、染色质的修饰、以及原癌基因的活化等过程中起到重要作用。

目前的研究将lncRNA大致分为五类：1)正义lncRNA(Sense lncRNA)：当与同一链上另一转录物的一个或者多个外显子相重叠，即为正义lncRNA，也叫做同义lncRNA；2)反义lncRNA(atisense lncRNA)：其转录结果与反义链上的转录物的外显子相重叠时即为反义lncRNA；3)双向lncRNA(bidirectional lncRNA):此类lncRNA的表达起始位点与其互补链上相邻编码转录物的表达起始点十分靠近；4)内含子lncRNA(Intronic lncRNA)：其序列来源于基因内部的内含子区域；5)基因间lincRNA(Long intergenic RNA，lincRNA)：位于两个基因间的间隔区域。

长片段基因间非编码RNA(Long intergenic noncoding RNA，lincRNA)是一类数量较多且功能研究较为清楚的lncRNA。目前研究已证明基因间存在大量的lincRNA，但其结构与功能方面研究得较成熟的仅仅有十几种。这些lincRNA具有不同的分子生物学功能，如作为调节肿瘤发生的作用因子、参与癌细胞的迁移。

与此同时，乳腺癌是严重危害女性健康的主要恶性肿瘤，发病率有逐年增高且呈趋于年轻化的趋势。随着分子生物学技术的发展，肿瘤的基因治疗层面上的研究已成为近年来的热点。在lncRNA的研究领域中，microRNA研究已逐渐明了，而与microRNA相比，lncRNA的研究尚处于起步阶段，而在乳腺癌的诊断和治疗中，非编码RNA表达与乳腺癌的相关性研究，报道很少。

发明内容

本发明的LincRNA是一种位于两个基因间区的非编码RNA，转录本长度超过200碱基的RNA，其长度介于200bp～100kb之间，此类ncRNA不具有编码蛋白质的功能，其结构具有多个茎环结构，能够与DNA、RNA或者转录因子相结合共同调节基因的转录或翻译过程，从而起到调节机体功能的作用。发明人在这种基础上，从乳腺癌组织及对应的癌旁组织中分离出检测乳腺癌准确度高的lincRNA生物标记物，并在此基础上，通过设计试剂盒来检测上述标记物，以及在设计试剂盒过程中设计的探针或探针组合、生物芯片。因此，本发明具有如下四个发明目的，以及围绕这四个发明目的多个技术方案：

本发明的第一个发明目的在于提供一组用于辅助检测乳腺癌，并且检测准确度高的lincRNA生物标记物以及其在乳腺癌辅助检测中的应用；

为了实现上述第一个发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一组作为乳腺癌辅助检测的lincRNA生物标记物，所述lincRNA生物标记物包含以下序列中的任意一种或者一种以上：

LincRNA-BC2:SEQ ID NO.1；

LincRNA-BC4:SEQ ID NO.2；

LincRNA-BC5:SEQ ID NO.3；

LincRNA-BC8:SEQ ID NO.4。

作为优选，所述lincRNA生物标记物是采用高通量测序技术取自乳腺癌组织及对应的癌旁组织的lincRNA生物标记物。

在提供lincRNA生物标记物的基础上，本发明第二个发明目的在于提供一种采用检测上述lincRNA生物标记物表达情况以用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒；

为了实现上述第二个发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒，所述试剂盒用于检测上述lincRNA生物标记物的表达情况；所述试剂盒包括反转录体系及扩增引物系统：

i所述反转录体系包括：反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；

ii所述扩增引物系统包括LincRNA-BC2，LincRNA-BC4，LincRNA-BC5和LincRNA-BC8中的至少一种的扩增引物以及作为内参基因的β-actin的扩增引物；其中前述扩增引物相对应地包括如下：

上游扩增引物：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.5)：5'-CTGTTGAGGCCAGAATCCAG-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.6)：5'-GGGTCATCTGCATTCAGAGATT-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.7)：5'-CGTGCCACGTTCCCACC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.8)：5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

下游扩增引物：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.9)：5'-GGGTTTGGGCTTCTTGGT-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.10)：5'-TGGCTGGAATCATTCACATATC-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.11)：5'-GGTGGTAGAAGTGGAGGGC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.12)：5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'。

作为优选，所述的试剂盒为荧光定量染料法试剂盒，该试剂盒还包括DNA染料法实时定量PCR检测引物，用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别是：

DNA染料法荧光定量上游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.13)：5'-CCAAAACCTGTCCCTACC-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.14)：5'-ACTTAGACTTGTGCTTCTGCTGTTG-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.15)：5'-CGCCGCCTCTCAGCCTATC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.16)：5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

DNA染料法荧光定量下游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.17)：5'-GCACCTTCATCTCTACCCCCA-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.18)：5'-AATCATTCACCTATCTTGGGTTTGG-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.19)：5'-GCCACATTCCCACCCAACG-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO:20)：5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'。

作为优选，所述的试剂盒中的内参照基因β-actin的序列及引物由以下核苷酸序列组成：

β-actin的序列：SEQ ID NO.25

β-actin的上游引物(SEQ ID NO.26)：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'

β-actin的下游引物(SEQ ID NO.27)：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'。

作为优选，所述的试剂盒为TaqMan探针法荧光定量试剂盒，该试剂盒还包括TaqMan探针法实时定量PCR检测引物和探针，用于实时定量PCR检测的上及下游引物分别是：

探针法荧光定量上游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.5)：5'-CTGTTGAGGCCAGAATCCAG-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.6)：5'-GGGTCATCTGCATTCAGAGATT-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.7)：5'-CGTGCCACGTTCCCACC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.8)：5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

探针法荧光定量下游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.9)：5'-GGGTTTGGGCTTCTTGGT-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.10)：5'-TGGCTGGAATCATTCACATATC-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.11)：5'-GGTGGTAGAAGTGGAGGGC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.12)：5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'

探针：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.21):(6-FAM)TTCAGTTGAG CTGCCTCA(MGB)；

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.22):(6-FAM)TTCAGTTGAG TGCATTCAG(MGB)；

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.23):(6-FAM)TTCAGTTGAG GTCTGTAC(MGB)；

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.24):(6-FAM)TTCAGTTGAG ATCGATAA(MGB)。

进一步的，上述的试剂盒中的内参照基因β-actin的序列、引物及探针由以下核苷酸序列组成：

β-actin的序列：SEQ ID NO.25

β-actin的上游引物(SEQ ID NO.26)：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'

β-actin的下游引物(SEQ ID NO.27)：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'

β-actin的探针(SEQ ID NO.28)：(6-FAM)TTCAGTTGAGATGACGAG(MGB)。

本发明的第三个发明目的在于提供一种用于检测上述乳腺癌标记物lincRNA的核酸探针或探针组合；

为了实现上述该发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测上述乳腺癌标记物lincRNA的核酸探针或探针组合，探针或探针组合包括以下探针中的任意一种或者一种以上的组合：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.21):(6-FAM)TTCAGTTGAG CTGCCTCA(MGB)；

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.22):(6-FAM)TTCAGTTGAG TGCATTCAG(MGB)；

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.23):(6-FAM)TTCAGTTGAG GTCTGTAC(MGB)；

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.24):(6-FAM)TTCAGTTGAG ATCGATAA(MGB)；

所述探针或探针组合用于TaqMan探针法荧光定量试剂盒中。

此外，本发明第四个发明目的在于提供一种用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的生物芯片。所述生物芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的探针或探针组合，所述探针或探针组合为如权利要求9中所述的探针组合。

本发明具有如下有益效果：

1.本实验基于乳腺癌的发生具有高度异质性和侵袭性、高发生率的特点，深入探索lincRNAs在乳腺癌发生发展中的表达差异。从而筛选出一组的lincRNA作为的辅助乳腺癌检测的分子标记物，该标记物不仅检测准确度高，而且制备用于乳腺癌早期检测的试剂盒和生物芯片具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低等优点。

2.采用上述lincRNA作为疾病标记物，将改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低差异和低灵敏性，显著提高了疾病的临床检出率和实现疾病的早期诊疗。

3.上述lincRNA作为标记物的检测技术的优势在于，其检测的可以是四个相关标记物，因而能够克服病人个体之间的差异(即年龄、性别、种族、饮食和环境等)，而这正是单一疾病标记物所无法逾越的一个主要障碍。

总之，本发明可以进一步应用于早期确诊乳腺癌，这种新的组织学乳腺癌标记物不仅为人们在分子上全面了解乳腺癌的机理提供了物质基础，也加速了临床疾病诊断学和治疗学的进步，基于lincRNA检测的优越性，相信不久的将来，对各种癌症的检测将成为常规体检的一部分，lincRNA检测方法将有望成为检测的重要工具。

附图说明

图1：乳腺癌及癌旁组织总RNA经变性琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2：lincRNAs(BC2,BC4,BC5，BC8)的反转录PCR与内参的半定量结果检测。

泳道C为癌中检测结果，泳道A为癌旁中的检测结果。

图3：lincRNAs(BC2,BC4,BC5,BC8)在乳腺癌组织中异常表达情况与临床指标(癌、病理分期、ER水平、PR水平)的相关性。

图4：lincRNAs(BC2,BC4,BC5,BC8)在乳腺癌组织中异常表达情况与临床指标(HER2、 p53、淋巴结转移情况、不同年龄组)的相关性。

图5：RNAfold预测的lincRNA(BC2，BC4，BC5，BC8)的二级结构.(A)lincRNA-BC2的二级结构；(B)lincRNA-BC4的二级结构；(C)lincRNA-BC5的二级结构；(D)lincRNA-BC8的二级结构；

图6：lincRNAs(BC2，BC4，BC5，BC8)在染色体上的位置以及其两侧基因位置。

(A)lincRNA-BC2及两侧基因在染色体上的位置；(B)lincRNA-BC4及两侧基因在染色体上的位置；(C)lincRNA-BC5及两侧基因在染色体上的位置；(D)lincRNA-BC8及两侧基因在染色体上的位置。

图7：通过RPIseq预测lincRNAs(BC2，BC4，BC5，BC8)与乳腺癌发生相关蛋白相互作用的预测。

具体实施方式

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，可以理解的是，在此描述的实施方案通过举例的方式来说明，其并不能作为本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1：

一组作为乳腺癌辅助检测的lincRNA生物标记物，该lincRNA生物标记物由以下四种lincRNA任意选择一种组成或者一种以上任意组合构成：

LincRNA-BC2:SEQ ID NO.1；

LincRNA-BC4:SEQ ID NO.2；

LincRNA-BC5:SEQ ID NO.3；

LincRNA-BC8:SEQ ID NO.4；

这四种具体序列，详见序列表；RNAfold预测的lincRNA(BC2，BC4，BC5，BC8)的二级结构如图5所示。lincRNAs(BC2，BC4，BC5，BC8)在染色体上的位置以及其两侧基因位置如图6所示。

以下采用涉及BC2，BC4，BC5和BC8即表示上述序列的lincRNA生物标记物。

为了充分公开本发明上述lincRNA生物标记物，以下详述本发明上述lincRNA生物标记物的获得过程：

首先，通过高通量(solexa)测序技术对乳腺癌患者癌组织中的基因间长片段非编码RNA进行高通量测序。

1.乳腺癌及对应癌旁组织总RNA提取

组织裂解：

1)在较少RNase干扰的清洁区(所有用具均用1‰DEPC水擦拭)，研钵需200℃灭菌5个小时并冷却4个小时，称取离体乳腺组织样本约20mg至已倒有液氮预冷的研钵中，用杵棒研磨至粉末状(研磨不彻底则会严重影响RNA的产量)；

2)加入700μl QIAzol裂解液至研钵中，继续研磨至无明显组织块的均匀液体，然后转移至无RNA酶的1.5ml eppendorf管中；

3)冷冻离心机4℃，12000×g，离心10min以除去溶液中未裂解完全组织及细胞碎片；

4)小心吸取离心后的上清液，移至另一新的eppendorf管，切勿吸取下层细胞碎片残渣沉淀；

5)加入140μl氯仿，上下颠倒，剧烈振荡后静置2min；

6)冷冻离心机4℃离心，12000×g，15min，并将上层清液转移至一新的无RNA酶eppendorf管中；

7)加入1.5倍无水乙醇，涡旋混匀，完成组织裂解。

RNA吸附：

8)将所有液体全部转移至吸附柱中，并将吸附柱置于2ml的收集管内，8000×g离心15s，弃收集管中的滤液；

9)取700μl的RWT溶液至吸附柱中，8000×g离心15s，弃滤液；

RNA洗涤和洗脱：

10)取500μl的buffer RPE至吸附柱中洗涤，8000×g离心15s，弃滤液；

11)再次用500μl的buffer RPE洗涤吸附柱，8000×g离心2min，弃滤液及下层收集套管；

12)将吸附柱转移至一个新的2ml收集管中，全速离心1min；

13)弃下层收集管，把吸附柱移入新的1.5ml eppendorf管中，加入45μl RNase-free water洗脱吸附膜，静置1min，8000×g离心1min；

14)再次全速离心1min。

其次、总RNA的定量和质量检测

利用Nanodrop 2000检测乳腺组织RNA样本的含量，经OD值定量测定，以便计算LincRNA反转录时所需要的RNA溶液的体积；经定性检测排除已降解的和DNA污染较严重的RNA样本，以保证后续实验的特异性。具体检测方法如下：

1)总RNA定量：在紫外分光光度计上测定260nm和280nm的OD值，并得出A260/A280，当其数值在1.8～2.0之间说明总RNA的纯度较好；当小于2.0说明有残余的盐离子和小分子杂志的污染，当大于2.0则说明可能总RNA的降解：

2)总RNA的完整性检测：1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA中的核糖体RNA(rRNA)，最大的两条条带28r RNA和18s RNA的亮度大致比为2:1时，说明RNA的完整性较好，未出现降解现象。

接着、针对ncRNA的文库构建

(1)核糖体的去除

样本的杂交：

1)将水浴锅温度调至70-75℃。

2)在已灭菌且无RNase的1.5ml的离心管中，依次加入如下试剂：

总RNA 5μg

RibominusTM探针 0.15μmol

Hybridization Buffer 100μl

3)将以上加好试剂的离心管在70-75℃水浴5min，使RNA变性

4)变性完成后，将样本进行降温，即把样本放到37℃水浴锅中温育约30min，此过程中可使样品的温度逐渐降到37℃，为了促进序列特异性杂交(切忌把样品直接放在冷水中快速降温，影响杂交的效率)。

Beads的准备：

1)将装有磁珠的塑料瓶均匀混合RibominusTM Magnetic Beads(磁珠)。

2)取750μl磁珠混合液加入到无菌且无RNase的1.5ml的EP管中。

3)把装有磁珠混合液的EP管放到磁力架上静置1min.磁珠被吸附到与磁力架相连的一侧管壁，然后吸取管内液体并弃掉。

4)向管内加入750μl的无菌DEPC水，低速振荡使磁珠重新溶解；

5)把EP管放到磁力架上静置1min后分离并弃去废液；重复这两步一次。

6)用750μl的Hybridization Buffer(杂交液)重新溶解磁珠并吸取250μl混合液放入另一新的EP管中备用。

7)把装有500μl混合液的管子放在磁力架上1min，弃去管内液体。

8)用200μl杂交溶液重新溶解磁珠并置于37℃。

rRNA去除：

1)当杂交后样品已经降温到37℃时，快速离心，把样品收集到EP管底部；

2)把320μl的样本转移到已经准备好的RibominusTM Magnetic Bead；利用移液器枪头上下吹打混合均匀；

3)置于37℃水浴中温育15min，在温育期间，间隔轻微振荡样品。然后低速离心把样品收集到管底部；

4)将EP管放在磁力架上静置1min，已经结合rRNA的磁珠会被吸附到管壁上，RibominusTM RNA已经存在于溶液中；

5)把已准备好的250μl的磁珠混合液(在Beads的准备中第7步)放在磁力架上静置1min，吸取管内液体并弃去；

6)向EP管中加入约320μl的含有RibominusTM RNA(第4步)，用枪上下吹打混合均匀；

7)37℃温育15min，期间偶尔轻微振荡，然后离心把样品收集到EP管底部；

8)把EP管放在磁力架上静置1min，把含有RibominusTM RNA的溶液转移至新EP管内。酒精沉淀法浓缩RiboMinusTM RNA

1)把RiboMinusTM RNA样本转移至RNase-free的2ml的离心管内，

2)向RiboMinusTM RNA中加入以下试剂：

Glycogen(20ng/μl) 1μl

醋酸钠(3M) 53μl

100％的酒精 1325μl

3)混合均匀，-80℃静置30min。

4)4℃，12000×g离心15min。小心吸走溶液，不要碰触到底部的沉淀，

5)加入500μl 70％的已经预冷的酒精，

6)4℃，12000×g离心5min；去除上清，

7)重复5-6步。

8)打开试管盖，室温自然干燥约5min，用30μl DEPC水来重新溶解RiboMinusTM RNA。

(2)割胶回收100-200nt非编码RNA

凝胶电泳：

1)制备缓冲液，把5×TBE缓冲液用DEPC水稀释成1×TBE。

2)用以下配方制备12％聚丙烯酰胺凝胶(PAGE):

3)用1×TBE缓冲液将加样孔，并在200V电压下预跑15min。

4)用RNase-free的EP管把1μl的SRA ladder以及1μl的RNA 6000Ladder分别与1μl的SRA gel loading dye混合均匀，10μl RiboMinusTM RNA与10μl SRA gel loading dye混合。

5)在加样之前，把已混合好的20μl的RiboMinusTM RNA与SRA gel loading dye混合液在65℃的恒温金属浴中变性5min。

6)把RiboMinusTM RNA，SRA ladder和RNA 6000ladder加样电泳，为避免各样本的相互干扰需要在每个加样孔之间留一个空白泳道，

7)设置200V电压电泳一个小时。

8)电泳完毕将PAGE胶取出，用TBE/EB染色2min。

9)凝胶电泳结果参见图1：

泳道1、2：样本196799癌及癌旁组织RNA的电泳结果；泳道3、4:样本212471癌及癌旁组织RNA的电泳结果；泳道5、6:样本180104癌及癌旁组织RNA的电泳结果。

回收RNA：

1)用21-gauge needle，把无菌nuclease-free的0.5ml的离心管底部穿刺4-5次；

2)把0.5ml的离心管放进一个无菌的圆底RNase的2ml的离心管中；

3)在割胶仪上用紫外光观察PAGE胶，用干净的刀片切下对应200-300bp条带的胶，把切下的胶条放入0.5ml的离心管中；

4)将0.5ml的EP转套放在2ml的EP以最大的最转速离心，把胶通过小孔甩到下层的2ml的离心管中。

5)加入300μl的SRA 0.3M NaCl到凝胶碎片中。室温下用旋转离心管的方式洗脱RNA，4个小时。

6)转移洗脱液和凝胶碎片到Spin X乙酸纤维滤芯，以≥13,000×g的离心速度把装有滤芯的2ml的离心套管离心2min，弃去上层的Spin X乙酸纤维滤芯。

7)加入30μl的室温下的100％酒精。

8)-80℃静置30min

9)立即放入4℃，14,000g离心25min。吸取并弃去溶液。打开盖子自然干燥。用ddH₂O重新溶解RNA沉淀。

(3)solexa测序

将以构建完成的ncRNA文库交至华大基因进行Solexa测序。采用的测序仪为Hi-seq2000，策略为双末端测序，两侧各测100bp即得出的序列长度均是2×100bp。双端测序是测序技术中的一个重要的技术，通过双端测序可以准确的计算出测序片段的长度，弥补了单端测序的缺陷，因此可以更准确的进行重复区域序列的定位以及序列的拼接等。

根据solexa中所得测序结果，对所得的数据进行基因间长片段非编码RNA(lincRNA)的筛选。

高通量测序的数据分析主要包括匹配(mapping)，拼接(assembly)，测序序列定量以及下游功能分析。从原始数据到可用数据的具体的处理包括以下几个方面：

1)测序质量评估：

高通量测序原始数据的质量是后续实验的重要基础，碱基质量值是衡量测序质量的重要指标。软件FastQC是较为成熟的对高通量测序数据进行质量控制的软件。碱基质量值用Q表示，其值越高代表碱基被出错的概率(P)越小，其计算公式为Q＝-10lgP，一般采用Q20和Q30这两个值评估，Q20即表示碱基测序出错的概率为1％，Q30表示碱基测序出错的概率为1‰。本实验采用的是Hi-seq 2000的2×100的双末端(paired end)策略进行的，Illumina公司常用大于80％的碱基准确度到达Q30才可用于后续的实验分析。

2)测序read低质量过滤

对原始数据低质量的过滤是关键的一步，主要采取修剪掉接头序列，polyA尾巴，并除去修剪后非常短的读取。

3)核糖体比对去除

在文库构建时需去除的核糖体RNA，但未完全清除的序列在测序结果中也会出现，并且干扰有效数据的丰度，因此有必要对rRNA进行清除，本实验采用从ncbi上下载的rRNA数据库作为比对，将mapping到此数据库上的片段进行去除。

4)基因组的去除

本实验是对ncRNA进行测序，因此需要将基因组和转录组的信息去除，文库构建的过程采用oligo dT将带有polyA尾巴的mRNA去除，但并不能保证文库中完全没有转录组的数据，因此在测序后的数据中，需要进行确认。本实验采用ncbi上的人类的基因组数据作为比对，将mapping到此数据库上的重复片段进行去除。

5)ncRNA表达水平评估

RNA测序数据是对所提取的癌组织和癌旁组织的中非编码RNA随机进行的短片段测序，若某一转录本的表达量高，则在测序所得的数据中定位到该转录本位置的读段(Fragment)也就高。因此，读段计数与其真实的基因表达水平成正比，也与其长度成正比，同时与测序深度即测序样本中所得的总Fragmen有关。目前多采用FPKM(Fragment Per Million reads)作为测序深度归一化的指标，即每百万读段中来自于某一基因每千个碱基长度的读段数。公式为：

FPKM不仅对测序深度作了归一化处理，而且对基因的长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同的测序深度下得到表达水平估计值具有了可比性。在FPKM的基础上，通过癌组织和癌旁组织的比值上取log2得出两者的差异倍数(fold change)，差异倍数在大于2和小于-2均属差异表达的ncRNA。

6)目标lincRNA的筛选

本实验将差异表达的ncRNA中筛选200bp以上的片段，进一步分析其位置，我们将在两个基因间区的lncRNA为lincRNA，具体的基因间的认定为基因的上下游1500bp。

7)通过solexa测序技术所得数据，共检测到538条异常表达的lincRNA,其中62条lincRNA仅在乳腺癌组织中表达，而在乳腺癌旁组织中未检测到，124条仅仅在乳腺癌旁组织中表达，在乳腺癌组织中无表达，134条lincRNA在乳腺癌中高表达，272条在乳腺癌中低表达。

根据上述筛选所得538条lincRNA，在其基础上选出一组lincRNA的用于临床检测，即为本发明提供的上述四条序列的lincRNA生物标记物。根据该组转录本的表达量检测制备用于乳腺癌辅助诊断或者疗效预测的试剂，对于其检测在临床中的应用方法，主要是依据其检测到该组序列中的任意一条；或者是与序列中任意一条具有90％以上的同源性的核苷酸序列；或者是与序列表中任意一条的序列经过甲氧基/硫代修饰得到的核苷酸序列。

试验例1：

针对实施例1，以下是对上述实施例1提供的LincRNA表达的定量分析及其在不同病理指标上的表达相关性。

首先，乳腺癌组织和乳腺癌旁组织样本来源：取自浙江省肿瘤医院2008年2月～2010年12月之间在接受治疗的100例乳腺癌患者的癌组织及对应的100例癌旁组织。入组患者要求有明确的细胞学诊断，手术前未经任何治疗，且有完整的病理信息。整理如表1：

表1 乳腺癌及癌旁组织病人的临床病理信息

为了分析上述定量分析LincRNA的表达，本发明进行如下步骤：

1.特异性引物的设计

利用primer 5.0进行荧光定量PCR引物设计，对于荧光定量PCR引物设计原则如下：1)扩增的PCR产不能形成二级结构；2)引物的长度一般在17-25个碱基之间，上下游的引物的长度不能相差太大；3)CG的含量在40％-60％之间，一般45-55％的范围内最佳；4)碱基的分布要随机，尽量分布均匀；5)荧光定量产物的长度一般在60-200bp之间，最长不超过300bp；6)引物的Tm值一般在58-65℃之间，用SYBR Green作为染料的Tm一般在60℃以上，但不超过65℃；7)设计好的引物需要在NCBI进行blast,以防止有同源的非特异性扩增产物。对所挑选的lincRNA进行荧光定量的引物设计信息如下表2：

表2 用于荧光定量PCR的特异性引物

2.Real-Time PCR

1)cDNA第一链的合成

分别以组织中总RNA为模板进行反转录反应合成cDNA。

荧光定量PCR

在新的200μl光学PCR八联管中依次加入以下试剂：

2)混匀后稍微离心于ABI PRISM 7300中进行PCR反应，反应条件设置为:

两步法PCR扩增标准程序

Stage 1：预变性

循环数：1

95℃ 30s

Stage 2:PCR反应

循环数：40

95℃ 5s

60℃ 31s

3.数据的处理及分析

如图2，荧光定量PCR定量检测LincRNA的相对表达变化量时，以β-actin为内参基因，来对目标lincRNA进行归一化处理，以确保在相等的数量的样本中比较目标基因的表达量。表达量倍数的变化的公式为：

RQ＝2^-△△Ct，

△△Ct＝(CtlincRNA-Ctβ-actin)BC-(CtlincRNA-CtlincRNA)BA，其中RQ代表相对表达量(Relative Quantitation)，CtlincRNA和Ctβ-actin分别代表荧光定量检测到的目标lincRNA和内参基因β-actin的Ct值，BC代表乳腺癌组织(Breast Cancer tissue)，BA代表与肿瘤组织对应的癌旁组织样本(Breast cancer Adjacent tissue)，定量中设置三次重复实验和阴性对照实验，定量样本中每个样本重复3次，阴性对照中不加入样本模板cDNA，而是用水代替，用于检测是否存在PCR污染或者较高的引物二聚体污染。

荧光定量得出的数据进行统计学分析，采用SPSS16.0统计学分析软件。LincRNA在两个样本中的相对表达量分析采用levene’s卡方检验和independent-sample t检验，当P值＜0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异。当P值＜0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异。LincRNA在不同病理的乳腺癌患者组织中表达的差异性分析的直观表现通过绘制含误差线的柱状图实现，采用GraphPad Prism5绘图软件；其中误差的来源多在于不同病例样本，不同的RNA提取步骤和不同的实验操作环境。

本实验对Real-time PCR所得的数据进行分析，得出癌组织及对应的癌旁组织之间的相对变化倍数(Relative Quantation,RQ),再利用SPSS17.0统计分析软件中的levene’s卡方检验和independent-samples t检验，分析各个病理指标上的lincRNA在乳腺癌组织中的差异表达在统计学上是否具有差异性。

如图3所示，lincRNA-BC5：高年龄组、PR阴性、癌症三期患者中显著高表达，可初步判定乳腺癌的分型。lincRNA-BC4：乳腺癌组织中显著低表达，随着癌症的进展，三期亦显著低表达，可推测在乳腺癌的早期发生中表达。lincRNA-BC2：在癌组织中显著高表达(7倍)，但与其病理指标的相关性并不显著，为潜在的分子分子标记物。lincRNA-BC8：在乳腺癌组织中显著低表达，p53阳性样本中高表达，而与预后的指标相关。通过荧光定量PCR技术和皮尔逊相关系数分析4条LincRNA在癌和对应的癌旁组织样本中的表达的差异性分析，LincRNA在癌和癌组织中均具差异性，且差异水平已达到了极显著的水平，表明LincRNA在组织学水平上可筛查乳腺癌。结合雌激素、孕激素水平进行差异性分析，这四条LincRNA和这两个激素受体水平的表达大多没有相关性，仅有LincRNA-BC5与孕激素水平有显著的差异性，即为独立于激素表达的指标。

如图4所示，lincRNA-BC2/BC4/BC5：与BRCA-1、BRCA-2、HER-2、K-ras相互作用可能性较高，可能参与癌基因的表达及信号通路。lincRNA-BC8：与BRCA-2、K-ras、PR、p53潜在的相互作用较可能性得分相对较高，在乳腺癌发张过程中可能参与激素表达、信号转导的过程。对乳腺癌患者组织中的四条LincRNA表达水平结合乳腺癌患者的HER2、p53蛋白受体的表达水平分析其差异性，这四条LincRNA和HER2的表达大多没有相关性，LincRNA-BC8与p53表达水平有显著的差异性，而另外三条即为独立于p53表达的指标。lincRNA在疾病的诊断和治疗上代表了一个重要的分子靶标。目前的研究已表明，lincRNA在表达水平上的差异或在某些癌症类型特异型的表达，可作为肿瘤的临床诊断标志物，如HOTAIR可作为乳腺癌的高度特异性的标志物。除此之外，lincRNA还可能作为治疗靶点，让人类在攻克癌症的道路上加快脚步。

此外，本试验中lincRNAs(BC2，BC4，BC5，BC8)在乳腺组织及癌旁组织中的差异性分析主要通过以下七个因素来实现

1)lincRNA在乳腺癌(临床病理Ⅱ期和Ⅲ期)组织及对应癌旁组织中表达水平的差异性。

2)lincRNA在不同的临床病理分级(乳腺癌病理分期临床病理Ⅱ期和Ⅲ期)上，乳腺癌患者病变组织相对于对应的癌旁组织表达水平的差异性。

3)lincRNA在激素表达水平上的表达差异性分析雌激素受体阳性(ER+)及雌激素受体阴性的乳腺癌患者相对癌旁组织的表达差异性，以及在孕激素受体阳性(PR+)及孕激素受体阴性(PR-)的乳腺癌患者相对癌旁组织的表达差异性。

4)lincRNA在不同患病年龄组(＜54和≥54)的乳腺癌组织及相对癌旁组织的表达差异性。

5)lincRNA在HER2阳性(HER2+)及HER2阴性(HER2-)的乳腺癌患者相对癌旁组织的表达差异性。

6)lincRNA在p53阳性(p53+)及p53阴性(p53-)的乳腺癌患者相对癌旁组织的表达差异性。

7)lincRNA在淋巴结转移阳性及淋巴结转移阴性的乳腺癌患者相对癌旁组织的表达差异性。

1.lincRNA在乳腺癌及对应的癌旁组织之间的表达差异性分析

本试验对100腺癌患者的癌组织及其对应的癌旁组织中的目标lincRNA的表达量进行分析，lincRNA-BC2(RQ＝6.31465,P＜0.01)和lincRNA-BC5(RQ＝2.724055，P＜0.01)在乳腺癌组织中显著高表达，而lincRNA-BC4(RQ＝0.3580180，P＜0.01)和lincRNA-BC8(RQ＝0.436706，P＜0.01)则呈现显著低表达，并且已达到极显著的水平，因此根据这四种乳腺癌组织中的表达情况可明显的用于区分癌组织和癌旁组织。

2.lincRNA在不同的临床病理分级上表达差异性分析

如图所示，lincRNA-BC4和lincRNA-BC8在乳腺癌组织和对应乳腺癌的病理分期Ⅱ期(45例)和Ⅲ期(55例)组织中表达具有差异性，其中lincRNA-BC4(P＝0.03)在乳腺癌组织中显著低表达，lincRNA-BC5(P＝0.007)在乳腺癌组织中显著高表达，且已达到极显著的水平。而lincRNA-BC2在乳腺癌组织中高表达，但是在统计学上并没有达到显著水平；lincRNA-BC8在乳腺癌组织中低表达，但是在统计学上并没有达到显著水平。

结果显示，lincRNA-BC4在Ⅱ期中的乳腺癌中显著高表达，有报道表明lincRNA在肿瘤发生的早期可通过介导转录水平的基因沉默途径以调控癌基因相关蛋白的表达，因此lincRNA-BC4有可能参与癌组织发生的早期过程中。LincRNA-BC8在lincRNA-BC4在Ⅲ期中显著高表达，即在乳腺癌晚期表达量较高，很有可能与肿瘤的恶化有关。

3.lincRNA在激素受体上的表达差异性分析

由于雌激素受体和孕激素受体的过表达是乳腺癌的主要因素之一，大量的研究表明二者在恶性肿瘤的发生扮演着重要的角色，与癌细胞的分化、转移及内分泌治疗有密切的关系。因此本实验根据收集到的100例用于荧光定量PCR的样本分为ER阴性(ER-，共45例)或阳性(ER+，共55例)、PR阴性(pR-，共25例)和阳性(PR+，共75例)，进一步分析目标lincRNA在这些病理状态下的表达水平。发现lincRNA在ER阴性上高表达，而在PR阳性上高表达，但二者并没有显著性差异，lincRNA-BC4和lincRNA-BC8在ER和PR阳性上高表达，但在统计学上均没有显著性差异，lincRNA-BC5在ER阴性上明显高表达，但差异不明显，而在PR阴性上高表达，具有显著差异(P＝0.031)。这一结果表明，这四条lincRNA在ER水平上并没有相关性，是独立于雌激素受体的作用因子；lincRNA-BC2、lincRNA-BC4、lincRNA-BC8与PR水平的表达量同样也不具有相关性，也是独立于孕激素受体的作用因子，而lincRNA-BC5在PR阴性上显著高表达，可以初步反映PR在乳腺癌的表达情况，并根据表达水平进行有效的治疗方案，在临床上具有潜在的应用意义。

4.lincRNA在HER2水平上的表达差异性分析

原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)基因，是重要的乳腺癌预后判断因子，其在患者中过表达，临床表现的特点与表达为阴性的患者差异很大。因此本实验通过所收集的病理资料中Her2水平进行分类，Her2阳性(Her2+，共54例)和Her2阴性(Her2-，共46例)，在不同水平上的差异性分析如图4显示，lincRNA-BC2、lincRNA-BC4、lincRNA-BC8在HER2水平上呈现相似的表达量，lincRNA-BC5在阳性指标上高表达，但均无显著性差异。

5.lincRNA在p53水平上的表达差异性分析

p53是肿瘤中重要的抑癌基因，是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，如图4.B所示为本实验所用的100例乳腺癌病人及对应癌旁组织中的的lincRNA表达情况，其中lincRNA-BC8在p53阳性水平(67例)上呈现显著的高表达(P＝0.004)，差异程度已达到了极显著水平；而lincRNA-BC2和lincRNA-BC5在p53阴性水平(33例)上呈现高表达，但在统计学上并没有达到显著水平，lincRNA-BC4在p53上的表达水平具有相似性，并没有区别。因此在临床上可用lincRNA-BC8的表达量反映p53的表达水平。

6.lincRNA在淋巴结转移上的表达差异性

乳腺癌的癌细胞沿淋巴管扩散性淋巴转移，可根据其转移的位置确定是否可采用保乳手术。本实验中所采用的20例样本中，阳性样本中为49例，阴性为51例，如图4为其表达水平，在这4条目标lincRNA中lincRNA-BC2、lincRNA-BC5在淋巴结转移阳性水平上表达量高，lincRNA-BC4表达量在淋巴结转移的阴性和阳性水平上的表达相当、lincRNA-BC8在淋巴结转移阴性水平上表达量高，但在统计学上并没有差异性，即目标lincRNA是独立于淋巴结转移的因素的独立因子。

7.目标lincRNA在不同患病年龄组上的表达差异性

本实验对取自同一病人的癌组织及对用的癌旁组织共100例样本，根据年龄大小得出中位数为54岁，在大于54岁和小于等于54岁的两个年龄组进行表达差异分析，如图所示，lincRNA-BC2(P＝0.502)、lincRNA-BC4(P＝0.139)和lincRNA-BC8(P＝0.713)在乳腺癌组织上并无显著性的差异，呈现出相似的表达水平lincRNA-BC5(P＝0.021)。

除了上述试验以及分析以外，本发明提供的lincRNAs(BC2,BC4,BC5,BC8)还与乳腺癌发生相关的蛋白的相互作用的预测具有如下关系，

RPIseq是爱荷华州立大学的Dobbs and Honavar实验室开发的在线预测RNA与蛋白质相互作用的工具，目前已有研究采用此工具且与实验的验证报道一致。RPIseq的计算相互作用的算法中采用了两种不同的计算方法，一种是RPIseq-SVM即Support Vector Machine，另一种是RPIseq-RF。此软件可通过lincRNA的序列结构与已知的蛋白序列结构进行分析，得出其作用的得分，分值从0-1之间，作用可能性越大，得分就越高。

本实验运用RPIseq在线计算lincRNA(BC2，BC4，BC5，BC8)与乳腺癌相关的蛋白质潜在的相互作用，乳腺癌相关的蛋白有：BRCA1、BRCA2、ER、HER2、P53、PR、K-ras、PTEN、EGFR、TNF，在RPIseq的计算相互作用的算法中采用了两种不同的计算方法，一种是RPIseq-SVM即Support Vector Machine，另一种是RPIseq-RF，即Random forest classifier。利用这两种算法所得的具体结论如下，如图7所示。

LincRNA-BC2在RPIseq预测得分值绝大多数在0.5以上，且分值0.8以上的也有，两种预测的方法在与BRCA1、BRCA2的得分很高，特别是BRCA2，同时与ER、HER2的两种预测结果均大于0.5。说明潜在的作用可能性较高。LincRNA-BC4在RPIseq预测得分值绝大多数在0.5以上，且分值0.8以上的也有，两种预测的方法在与BRCA1、BRCA2、HER2的得分很高，说明潜在的作用可能性较高。而在其他的几种蛋白相互作用的可能性两种算法有所差别，但大多数也都在0.5的上下，还需要其他的软件的预测作为参考。但初步认定此lincRNA有可能参与乳腺癌的发生过程。LincRNA-BC5在RPIseq预测得分值绝大多数在0.5以上，两种预测的方法在BRCA1、BRCA2、HER2、PTEN相近，说明有潜在的作用可能性；LincRNA-BC8在RPIseq预测中，SVM的算法得分绝大多数在0.5以上，并且在分值0.8-0.9左右，而RF算法的得分仅仅在0.5-0.6，两者有一定的差别，不过在根本上能说明有作用的可能性。

下面是本发明来验证LincRNA的方法步骤：

1.LincRNA PCR引物设计：

全长扩增PCR引物的设计应用Primer 5.0软件，设计的原则为：a)PCR产物长度为所筛选lincRNA的长度，即序列全长；b)退火温度58-60℃左右，GC含量在40％-60％之间，上下游引物之间的退火温度相差不超过2℃，c)引物长度在18-25bp。

荧光定量PCR引物的设计原则：a)定量产物长度在80-250bp最好长度不超过300bp。荧光定量引物的退火温度应不低于60℃，但尽可能低于65℃，而PCR产物的Tm值应在80℃以上；c)引物长度一般在17-25bp之间，上下上下游引物Tm值相差不超过3℃；d)G+C的含量在40-60％之间，45-55％最佳；e)避免引物二聚体和非特异性扩增的存在；f)避免重复碱基，尤其是G，且碱基要随机分布，尽量均匀，3’端最后5个碱基内不能多于两个连续的G或C。

软件设计好需要在NCBI上通过BLAST比对扩增产物来检测引物的特异性，将所有的引物委托上海生物工程有限公司合成。

2.cDNA第一链的合成(RT-PCR)

1)在无RNase的200μl PCR管中依次加入定量的组织总RNA和随机引物(Random Primers 100μM)；

2)将上述RNA溶液70℃变性，变性完成后立即放入冰上3min，离心数秒使变性RNA溶液聚集于管底部，再依次加入反转录试剂：RNase抑制剂(40U/μl)、dNTP混合物(各10mM，RNase-free)、5×M-MuLV反转录酶(200U/μl)；

3)加入终反应浓度为2μM的引物，混匀后稍微离心甩下管壁的液滴，然后放在PCR仪中进行反应；反应设置无RNA模板作为阴性对照。

表3 反转录反应及阴性对照体系

反应条件设置：

1)加入以上表中反转录反应液后42℃保温1个小时；

2)70℃保温15min后于冰上冷却，得到cDNA溶液用于PCR扩增。

3.PCR扩增反应

1)在0.2ml的PCR管中按以下试剂配制PCR反应液，总体系为10μl

2)混匀后稍离心在PCR仪中进行反应；反应条件设置为：

3)配制2％的琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)，取5μl PCR Production与6×loading buffer以5:1的比例混合均匀后，恒压90V进行电泳，30～40min，凝胶成像仪观察电泳条带结果。

4.扩增产物割胶回收

利用AXYGEN割胶回收试剂盒对PCR产物条带进行纯化。

5.构建质粒载体的连接反应

本实验采用TA克隆的方法用于克隆lincRNA，载体选择为18-T Vector，载体的连接体系如下表所示：

表4 TA克隆连接接反应体系

按照以上反应体系配制反应液混合物，并用移液枪轻微的吹打均匀，在4℃条件下连接过夜。

6.重组质粒的转化

E.coli DH-5α感受态细胞的制备

1)活化大肠杆菌DH-5α菌种：取在-80℃甘油保存的DH-5α菌株，在培养基上进行划线，37℃培养，选取单菌落接种于10ml的液体培养基中，置于37℃摇床(180rpm)培养12-14h；

2)取1％-2％的接种量转接到的已灭菌LB液体培养基中，继续摇菌培养至对数生长对数期；

3)立即转移到已灭菌且预冷的50ml离心管中，冰浴10min；

4)4℃离心，5000×g离心10min，弃上层清液回收菌体；

5)加入0.5倍体积的0.1M CaCl₂溶液悬浮细胞，冰浴30min；

6)4℃离心，5000×g离心10min重新收集菌体细胞，用5％的菌液体积的0.1M CaCl₂(含15％甘油)重新悬浮细胞，此时即为已制备的感受态细胞，分装至1.5ml的EP管中，每管100μl，用液氮速冻，存于-80℃冰箱备用。

7.连接产物的转化

1)以下操作均需要在冰上进行，分别取2μl连接产物于1.5ml预冷的EP管中；

2)从-80℃冰箱备用的已制备好的感受态细胞，置于冰上融化，轻轻振动混匀；

3)取已融化好的感受态细胞50μl，分别加入1)中的EP管中，轻微振荡，使连接产物和感受态细胞充分混匀，冰浴30min；

4)42℃水浴中热击50s(切勿振荡)；热击后立即转移到冰上，使细胞冷却3min；

5)在超净工作台中，把每管连接转化的细胞中加入1ml含有氨苄的的LB(Amp+)培养基；

6)放入37℃摇床低速振荡培养(150rpm)培养1.5h；

7)将每个转化后培养物取200μl于含氨苄的LB固体平板培养基上涂布；把涂布好的平板放于37℃培养箱培养，正面向上放置30min后，待菌液在培养基表面完全无液体状后，37℃培养过夜(12-16h)。

8.重组质粒的筛选和鉴定

重组质粒筛选：

1)取5ml含Amp+的LB液体培养基于已灭菌的15ml离心管中；

2)从平板上用牙签挑取单菌落5-6个，接种于培养基中，37℃振荡培养3-4h，待培养基颜色不在透明时，转移到4℃冰箱，进一步进行菌液PCR验证。

菌液PCR对重组质粒的验证：

3)把菌液作为模板进行对目的基因进行PCR验证基因是否成功的克隆的载体上。按照以下体系进行PCR体系(10μl)的配制：

PCR反应条件设置如下：

4)反应结束后，配制2％的1×TAE琼脂糖凝胶电泳，将PCR扩增产物与6×loading buffer以5:1的比例混合后，90V电压，半个小时左右，凝胶成像仪检测PCR结果。

9.目的基因序列的测定及分析

1)目的基因的序列测定

此实验委托上海生工生物有限公司对菌液中目的基因进行序列的测定，并提供目的基因对应的引物。

2)序列的比对分析

通过Chromas2.31(Technelysium)软件读取测序上的色谱峰值图文件，人工评价测序结果并校正测序因素造成的错误。用DNAStar^TM软件包(DNAStar Lasergene 7.1)中的EditSeq和MegAlign程序对序列结果进行编辑和剪接并导出，利用EditPlus导出序列，保存为FASTA格式的文件，用于多重序列的比对分析。

实施例2：

为了使其能够合理地应用，本发明在提供作为乳腺癌辅助检测的lincRNA生物标记物的基础上，基于上述四个序列的lincRNA生物标记物，本发明提供一种用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒，该试剂盒包括如下反转录体系及扩增引物系统：

上游扩增引物(以下括号内的“SEQ ID NO.”表示其序列属于序列表中对应序列标识符的序列)：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.5)：5'-CTGTTGAGGCCAGAATCCAG-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.6)：5'-GGGTCATCTGCATTCAGAGATT-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.7)：5'-CGTGCCACGTTCCCACC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.8)：5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

下游扩增引物：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.9)：5'-GGGTTTGGGCTTCTTGGT-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.10)：5'-TGGCTGGAATCATTCACATATC-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.11)：5'-GGTGGTAGAAGTGGAGGGC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.12)：5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'。

上述内参照基因β-actin的序列及引物由以下核苷酸序列组成：

β-actin的序列：SEQ ID NO.25

β-actin的上游引物(SEQ ID NO.26)：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'

β-actin的下游引物(SEQ ID NO.27)：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'。

实施例3：

在实施例2的基础之上，其是荧光定量染料法试剂盒，该试剂盒除实施例2之外，还包括DNA染料法实时定量PCR检测引物，用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别是：

DNA染料法荧光定量上游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.13)：5'-CCAAAACCTGTCCCTACC-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.14)：5'-ACTTAGACTTGTGCTTCTGCTGTTG-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.15)：5'-CGCCGCCTCTCAGCCTATC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.16)：5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

DNA染料法荧光定量下游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.17)：5'-GCACCTTCATCTCTACCCCCA-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.18)：5'-AATCATTCACCTATCTTGGGTTTGG-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.19)：5'-GCCACATTCCCACCCAACG-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO:20)：5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'。

基于本发明所衍生的试剂盒包括上述lincRNA引物、Taq酶、dNTP等试剂，其中lincRNA的引物包括lincRNA-BC2、lincRNA-BC4、lincRNA-BC5、lincRNA-BC8以及作为归一化的β-actin的上下游引物。

采用本实施例所提供的试剂盒，基于DNA染料法的荧光定量PCR检测的使用方法如下：

在新的0.2μl光学PCR反应管中依次加入：

混匀后稍离心，反应参数设置为：

此试剂盒的价值在于通过患者的组织RNA样品，利用简单的DNA染料法检测lincRNA的表达水平，再通过该表达水平的差异程度预测乳腺癌的发生的病理阶段。因此此试剂盒投入生产实践，可在辅助乳腺癌的诊断、治疗、疗效评价、预后复发情况中得到应用。

实施例4

在实施例2的基础之上，其为TaqMan探针法荧光定量试剂盒，该试剂盒还包括TaqMan探针法实时定量PCR检测引物和探针，用于实时定量PCR检测的上及下游引物分别是：

探针法荧光定量上游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.5)：5'-CTGTTGAGGCCAGAATCCAG-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.6)：5'-GGGTCATCTGCATTCAGAGATT-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.7)：5'-CGTGCCACGTTCCCACC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.8)：5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

探针法荧光定量下游引物序列：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.9)：5'-GGGTTTGGGCTTCTTGGT-3'

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.10)：5'-TGGCTGGAATCATTCACATATC-3'

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.11)：5'-GGTGGTAGAAGTGGAGGGC-3'

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.12)：5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'

探针：

LincRNA-BC2(SEQ ID NO.21):(6-FAM)TTCAGTTGAG CTGCCTCA(MGB)；

LincRNA-BC4(SEQ ID NO.22):(6-FAM)TTCAGTTGAG TGCATTCAG(MGB)；

LincRNA-BC5(SEQ ID NO.23):(6-FAM)TTCAGTTGAG GTCTGTAC(MGB)；

LincRNA-BC8(SEQ ID NO.24):(6-FAM)TTCAGTTGAG ATCGATAA(MGB)。

β-actin的探针(SEQ ID NO.28)：(6-FAM)TTCAGTTGAGATGACGAG(MGB)。

基于本发明所衍生的试剂盒包括上述lincRNA引物、Taq酶、dNTP等试剂，其中lincRNA的引物包括上述lincRNA-BC2、lincRNA-BC4、lincRNA-BC5、lincRNA-BC8以及作为归一化的β-actin的上下游引物。

采用本实施例所提供的试剂盒，基于TaqMan探针法的荧光定量PCR检测使用方法如下：

在新的0.2μl光学PCR反应管中依次加入：

混匀后稍离心，反应参数设置为：

此试剂盒的价值在于通过患者的组织RNA样品，利用最精简的探针库检测lincRNA的表达水平，再通过该表达水平的差异程度预测乳腺癌的发生的病理阶段。因此此试剂盒投入生产实践，可在辅助乳腺癌的诊断、治疗、疗效评价、预后复发情况中得到应用。

实施例5：

一种用于检测乳腺癌标记物lincRNA的核酸探针组合，所述的探针组合包括根据以下核苷酸序列所设计探针中的任意一种或者一种以上：

根据一种核苷酸序列所设计的探针：

探针一：LincRNA-BC2(SEQ ID NO.21):(6-FAM)TTCAGTTGAG CTGCCTCA(MGB)；

探针二：LincRNA-BC4(SEQ ID NO.22):(6-FAM)TTCAGTTGAG TGCATTCAG(MGB)；

探针三：LincRNA-BC5(SEQ ID NO.23):(6-FAM)TTCAGTTGAG GTCTGTAC(MGB)；

探针四：LincRNA-BC8(SEQ ID NO.24):(6-FAM)TTCAGTTGAG ATCGATAA(MGB)；

根据两种核苷酸序列所设计的探针：

组合五：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22组合；

组合六：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.23组合；

组合七：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.24组合；

组合八：SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23组合；

组合九：SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.24组合；

组合十：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24组合；

根据三种核苷酸序列所设计的探针：

组合十一：SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23组合；

组合十二：SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24组合；

组合十三：SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.24组合；

组合十四：SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24组合；

根据四种核苷酸序列所设计的探针：

组合十五：SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24组合；

实施例6：

一种用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的生物芯片，该生物芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的探针或探针组合，所述探针或探针组合为实施例5提供的探针或探针组合。

该生物芯片以实施例提供的四条lincRNA作为芯片背景，固定于芯片上，采集乳腺癌患者的组织所提取的总RNA，与芯片杂交。具体如下：

(1)将RNA样品用荧光标记：利用T4RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；

(2)杂交与清洗：将RNA溶于16μl杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3X SSC；50X Denhardt’ssolution)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先于42℃左右含0.2％SDS，3X SSC的液体中洗4min，之后于0.2X SSC液体中室温4min，玻片甩干后用于扫描；

(3)芯片扫描：芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描；

(4)数据提取及分析：采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析统计差异表达基因。

此外，本发明如本实施例上述描述的一样，将定量PCR技术与生物芯片技术双重验证在乳腺癌组织及癌旁组织中差异表达程度大的一组lincRNA探针或探针组合，用于制备上述生物芯片。该生物芯片与传统芯片相比，其优点在于简化了探针库，因此将大大减少了芯片的制作成本和生产时间，较易于制备。同时也增加了芯片的针对性和实用性。将此芯片投入实践，仅仅需要病人组织中提取的少量RNA即可，可辅助乳腺癌的诊断和治疗。

最后，还需要注意的是，以上所举的案例的仅是本发明的若干个具体实施例，所述lincRNA还可应用于乳腺肿瘤患者的血清，血浆，尿液，唾液等体液的检测。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江理工大学

<120> 作为乳腺癌辅助检测的lincRNA标记物及试剂盒、探针、芯片

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1019

<212> RNA

<213> 人体组织

<400> 1

cuggccugua cucagaucuu cgcggagcgg aucagcggcc ggagcguuug gcggacucug 60

cguggacuug gagcucacag cgucuugcga cuuggaagcg gauucagagg acaggacaga 120

acacuugggc aagugaaucu cugucugucu gucugucugu cugucucauu gguugguuga 180

uuuccauuuu cuuaaggggc acauaccuca caccgcacac acacaaacac acaccgcaca 240

cacaaacaca cacacacaca cacgcgcaca cacacacucc uuccuucugc gaguuagaaa 300

auugguacgg gccccuggga gcugcagguu uccuaaucau gucugcaccu aagaacagua 360

gggucuuguc uggcucuucu uaugaacggu cccccagcug ggacucccca agguccaugc 420

gagccucacc cagcuucucc cucuccccuc ucagaaacuc aggcuuaagg ggaagcuccu 480

caccagggau ccggagcuac cauucaccau ccccuagggc uucaccacac ucaccucugu 540

caucaccaga aucccacaag cucccauuuc ccuguccuca ccgugauggg caaucaauga 600

agccauuggg cucucccgug uccuccucug aggauuccuc agagucccca cguucaucaa 660

uaauauacca caugcucuua cugccaucac ccagcagcuc acccccagcu cucggggggu 720

cuccuguguc ucccagcuac ucuccaaaca accccagauu ucagcuggag ucagcccccc 780

acacccagga aucaccuaca aacucacgag ccucacggug cuccaccccu gugucuuuca 840

ucucuucacc cccaggccuc agggacucuc cuguggcucc caguuacucu ucagccaucc 900

ccagguuccu gcgggagcca gccccaugca cccaggaguc ccccagagac ucacaggucu 960

cgggagaaua ugagcggucc cccagcccug acuccucaag auucaugccu gccucaccc 1019

<210> 2

<211> 931

<212> RNA

<213> 人体组织

<400> 2

aguuuggcgu ugggguguca gccugugauu uccugaucuc caacuccacu ccucuuaagu 60

cacccagccu aaggcacuga accucaucau cagaaccuca gaguccaaca ucuugaccau 120

agccuugcaa ccccacuguu aggugaguuu caaguucuca cuccccauaa acuucuucag 180

accacugcuc ccucgaauga cuuuguuucc ucccagguca ucaguuuccu uagucaauuu 240

ccaaguccua ucaguuguag acacuacgau uggucauccc aucugaguga cuauuucacu 300

uaaacuugcc uuuccuccuc uguuugcaau aacucucaua cauagcucua gcuuaacauc 360

cacguugccu ucucuauucu uaccuccagg acagcagaac acuaaacauu aaguucuuca 420

augcuaaaaa acauccugua aucacgaaaa ucagcccagu acaaauucau gcucacuaca 480

cgugguucuc agcugcugug gggccucucu cuucccuuca guauccacag acuugcaacg 540

uucuucucag ccuuccuucg caccacuaaa uuaucucauu aagucaggac caucuggugg 600

gaacuccuuu aacuucccag ggcccaggaa aaauaaacca uauuuaccca ugccucccuc 660

uuucuccaug ugccuuuuca agaagagagg cucuucuccc agugucucuc ucccugauuc 720

cauaucaccc ucucuucuuu gggauacuuc uccaaagagu guggucuuuc agguauccuu 780

acugucuuau gacugaguca uuccacuugg cuuaugaacc ucuuuguugc uuauuccagg 840

cacucugagu cuccccugca uucagucucc cuucagcaua caacacuguu caugaugcuu 900

uuuguaaagc ccucugcuuc cccauccucc u 931

<210> 3

<211> 373

<212> RNA

<213> 人体组织

<400> 3

ucaugccugc cucacccagc uucucccucu ccccucccag aaacucagac ccaaggggca 60

gcuccucacc agggaugugg aaguacucua caucaucccg cagggcuuca ccacucucac 120

auccaucauc aacagaauuc cacagcuuua cguuuccauu uccuaaccaa gcaggacagu 180

cacucauguc auuguguucu cccguguccu ccucuggaga uucuucacag ucaccucauu 240

caucaauaau auaccauaug uucuuacugc caucauccag cagcucaccc ccagccaccc 300

augacucucc ugucuguccc agcuacucuc caaccacgcc cacauuucag cgggagucug 360

uaccccacac ccc 373

<210> 4

<211> 239

<212> RNA

<213> 人体组织

<400> 4

aguuguaaaa aacuccaguu gauacaaaau aaacuacgaa aguggcuuua acauaucuga 60

acacacaaua gcuaagaccc aaacugggau uagauacccc acuaugcuua gcccuaaacc 120

ucaacaguua aaucaacaaa acugcucgcc agaacacuac gagccacagc uuaaaacuca 180

aaggaccugg cggugcuuca uaucccucua gaggagccug uucuguaauc gauaaaccc 239

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 5

5'-ctgttgaggc cagaatccag-3' 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 6

5'-gggtcatctg cattcagaga tt-3' 22

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 7

5'-cgtgccacgt tcccacc-3' 17

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 8

5'-aacataactg cttgccagaa cactac-3' 26

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 9

5'-gggtttgggc ttcttggt-3' 18

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 10

5'-tggctggaat cattcacata tc-3' 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 11

5'-ggtggtagaa gtggagggc-3' 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 12

5'-gaaccgccag gtcctttgag-3' 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 13

5'-ccaaaacctg tccctacc-3' 18

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 14

5'-acttagactt gtgcttctgc tgttg-3' 25

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 15

5'-cgccgcctct cagcctatc-3' 19

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 16

5'-aacataactg cttgccagaa cactac-3' 26

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 17

5'-gcaccttcat ctctaccccc a-3' 21

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 18

5'-aatcattcac ctatcttggg tttgg-3' 25

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 19

5'-gccacattcc cacccaacg-3' 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 20

5'-gaaccgccag gtcctttgag-3' 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 21

(6-FAM)ttcagttgag ctgcctca(MGB) 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 22

(6-FAM)ttcagttgag tgcattcag(MGB) 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 23

(6-FAM)ttcagttgag gtctgtac(MGB) 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 24

(6-FAM)ttcagttgag atcgataa(MGB) 18

<210> 25

<211> 382

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 25

gaagagctac gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg 60

ccctgaggca ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac 120

taccttcaac tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac 180

agtgctgtct ggcggcacca ccatgtaccc tggcattgcc gacaggatgc agaaggagat 240

cactgccctg gcacccagca caatgaagat caagatcatt gctcctcctg agcgcaagta 300

ctccgtgtgg atcggcggct ccatcctggc ctcgctgtcc accttccagc agatgtggat 360

cagcaagcag gagtatgacg ag 382

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 26

5'-gcatacacga aactaccttc aactcc-3' 26

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 27

5'-atggtggtgc cgccagaca-3' 19

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人体组织

<400> 28

(6-FAM)ttcagttgag atgacgag(MGB) 18

Claims

1.一组作为乳腺癌辅助检测的lincRNA生物标记物，其特征在于：所述lincRNA生物标记物包含以下序列中的任意一种或者一种以上：

LincRNA-BC2:SEQ ID NO.1；

LincRNA-BC4:SEQ ID NO.2；

LincRNA-BC5:SEQ ID NO.3；

LincRNA-BC8:SEQ ID NO.4。

2.如权利要求1所述的一组作为乳腺癌辅助检测的lincRNA生物标记物，其特征在于：所述lincRNA生物标记物是采用高通量测序技术取自乳腺癌组织及对应的癌旁组织的lincRNA生物标记物。

3.一组如权利要求1所述的lincRNA生物标记物在乳腺癌辅助检测中的应用。

4.一种用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测权利要求1所述的lincRNA生物标记物的表达情况；所述试剂盒包括反转录体系及扩增引物系统：

上游扩增引物：

相对应的LincRNA-BC2上游扩增引物为SEQ ID NO.5：

5'-CTGTTGAGGCCAGAATCCAG-3'

相对应的LincRNA-BC4上游扩增引物为SEQ ID NO.6：

5'-GGGTCATCTGCATTCAGAGATT-3'

相对应的LincRNA-BC5上游扩增引物为SEQ ID NO.7：

5'-CGTGCCACGTTCCCACC-3'

相对应的LincRNA-BC8上游扩增引物为SEQ ID NO.8：

5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

下游扩增引物：

相对应的LincRNA-BC2下游扩增引物为SEQ ID NO.9：

5'-GGGTTTGGGCTTCTTGGT-3'

相对应的LincRNA-BC4下游扩增引物为SEQ ID NO.10：

5'-TGGCTGGAATCATTCACATATC-3'

相对应的LincRNA-BC5下游扩增引物为SEQ ID NO.11：

5'-GGTGGTAGAAGTGGAGGGC-3'

相对应的LincRNA-BC8下游扩增引物为SEQ ID NO.12：

5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'。

5.如权利要求4所述的用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒为荧光定量染料法试剂盒，该试剂盒还包括DNA染料法实时定量PCR检测引物，用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别是：

DNA染料法荧光定量上游引物序列：

相对应的LincRNA-BC2的上游引物序列为SEQ ID NO.13：

5'-CCAAAACCTGTCCCTACC-3'

相对应的LincRNA-BC4的上游引物序列为SEQ ID NO.14：

5'-ACTTAGACTTGTGCTTCTGCTGTTG-3'

相对应的LincRNA-BC5的上游引物序列为SEQ ID NO.15：

5'-CGCCGCCTCTCAGCCTATC-3'

相对应的LincRNA-BC8的上游引物序列为SEQ ID NO.16：

5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

DNA染料法荧光定量下游引物序列：

相对应的LincRNA-BC2的下游引物序列为SEQ ID NO.17：

5'-GCACCTTCATCTCTACCCCCA-3'

相对应的LincRNA-BC4的下游引物序列为SEQ ID NO.18：

5'-AATCATTCACCTATCTTGGGTTTGG-3'

相对应的LincRNA-BC5的下游引物序列为SEQ ID NO.19：

5'-GCCACATTCCCACCCAACG-3'

相对应的LincRNA-BC8的下游引物序列为SEQ ID NO.20：

5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'。

6.如权利要求4或5所述的用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中的内参照基因β-actin的序列及引物由以下核苷酸序列组成：

β-actin的序列：SEQ ID NO.25

β-actin的上游引物为SEQ ID NO.26：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'

β-actin的下游引物为SEQ ID NO.27：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'。

7.如权利要求4所述的用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒为TaqMan探针法荧光定量试剂盒，该试剂盒还包括TaqMan探针法实时定量PCR检测引物和探针，用于实时定量PCR检测的上及下游引物分别是：

探针法荧光定量上游引物序列：

相对应的LincRNA-BC2的上游引物序列为SEQ ID NO.5：

5'-CTGTTGAGGCCAGAATCCAG-3'

相对应的LincRNA-BC4的上游引物序列为SEQ ID NO.6：

5'-GGGTCATCTGCATTCAGAGATT-3'

相对应的LincRNA-BC5的上游引物序列为SEQ ID NO.7：

5'-CGTGCCACGTTCCCACC-3'

相对应的LincRNA-BC8的上游引物序列为SEQ ID NO.8：

5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'

探针法荧光定量下游引物序列：

相对应的LincRNA-BC2的下游引物序列为SEQ ID NO.9：

5'-GGGTTTGGGCTTCTTGGT-3'

相对应的LincRNA-BC4的下游引物序列为SEQ ID NO.10：

5'-TGGCTGGAATCATTCACATATC-3'

相对应的LincRNA-BC5的下游引物序列为SEQ ID NO.11：

5'-GGTGGTAGAAGTGGAGGGC-3'

相对应的LincRNA-BC8的下游引物序列为SEQ ID NO.12：

5'-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3'

探针：

相对应的LincRNA-BC2探针为SEQ ID NO.21：

(6-FAM)TTCAGTTGAG CTGCCTCA(MGB)；

相对应的LincRNA-BC4探针为SEQ ID NO.22：

(6-FAM)TTCAGTTGAG TGCATTCAG(MGB)；

相对应的LincRNA-BC5探针为SEQ ID NO.23：

(6-FAM)TTCAGTTGAG GTCTGTAC(MGB)；

相对应的LincRNA-BC8探针为SEQ ID NO.24：

(6-FAM)TTCAGTTGAG ATCGATAA(MGB)。

8.如权利要求7所述的用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中的内参照基因β-actin的序列、引物及探针由以下核苷酸序列组成：

β-actin的序列：SEQ ID NO.25

β-actin的上游引物为SEQ ID NO.26：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'

β-actin的下游引物为SEQ ID NO.27：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'

β-actin的探针为SEQ ID NO.28：(6-FAM)TTCAGTTGAGATGACGAG(MGB)。

9.一种用于检测如权利要求1所述乳腺癌标记物lincRNA的核酸探针或探针组合，其特征在于：探针或探针组合包括以下探针中的任意一种或者一种以上的组合：

相对应的LincRNA-BC2探针为SEQ ID NO.21：

(6-FAM)TTCAGTTGAG CTGCCTCA(MGB)；

相对应的LincRNA-BC4探针为SEQ ID NO.22：

(6-FAM)TTCAGTTGAG TGCATTCAG(MGB)；

相对应的LincRNA-BC5探针为SEQ ID NO.23：

(6-FAM)TTCAGTTGAG GTCTGTAC(MGB)；

相对应的LincRNA-BC8探针为SEQ ID NO.24：

(6-FAM)TTCAGTTGAG ATCGATAA(MGB)；

所述探针或探针组合用于TaqMan探针法荧光定量试剂盒中。

10.一种用于检测乳腺肿瘤或辅助检测乳腺肿瘤的生物芯片，其特征在于：所述的生物芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的探针或探针组合，所述探针或探针组合为如权利要求9中所述的探针组合。