KR20180065746A - Nls가 결합된 그래핀을 포함하는 핵 내 핵산 나노그래핀센서 또는 진단키트 - Google Patents

Nls가 결합된 그래핀을 포함하는 핵 내 핵산 나노그래핀센서 또는 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NLS가 결합된 그래핀을 포함함으로써, 기존 FISH 분석을 대체할 수 있어 기초생물학 전분야에 다양하게 적용될 수 있고, 높은 신뢰도 및 해상도의 결과물을 얻을 수 있고, 세포 또는 조직 내 존재하는 다양한 핵산을 동시에 또는 독립적으로 검출할 수 있고, 살아있는 조직 또는 세포에서 간편, 신속 및 정확하게 검출할 수 있고, 특정질환에 국한되지 않고 조직 또는 세포 내 특정 핵산 유무 및/또는 발현량으로 확인할 수 있는 모든 질환에 대해 활용이 가능하고, siRNA 치료 시 핵 내 핵산의 억제효과를 쉽게 관찰할 수 있고, 빠른 질환진단이 가능하고 신속한 치료방침을 결정하는 데 도움을 줄 수 있고, 저비용으로 핵 내 핵산을 검출할 수 있는, NLS가 결합된 그래핀을 포함하는 핵 내 핵산 검출용 나노그래핀센서 또는 진단키트에 관한 것이다.

Description

NLS가 결합된 그래핀을 포함하는 핵 내 핵산 나노그래핀센서 또는 진단키트 {Nanographene-sensor or diagnose kit comprising nuclear localizing signal(NLS) conjugated graphene for detecting nucleotide located in nuclear}
본 발명은 NLS가 결합된 그래핀을 포함하는 핵 내 핵산 검출용 나노그래핀센서 또는 진단키트에 관한 것이다.
과거에는 주로 단백질을 이용한 분석을 위주로 하였으나, 점차 유전자 변형의 검출을 통해 질병의 진단뿐 아니라 예측, 회복되었는지를 진단할 수 있다는 점에서 유전자 변형을 검출하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 현재 환자의 조직을 통해 질환을 진단하는 기술로는 단백질에 존재하는 각종 항원들이나 바이오 마커 등을 타겟으로 면역 염색 등을 통해 단백질의 변형 정도를 측정하는 방법과 유전자의 일부인 RNA를 타겟으로 삼아 FISH(fluorescence in situ hybridization, 형광 동소 보합법) 분석을 통해 유전자의 변형 정도를 측정하는 방법 등이 알려져 있다.
이러한 방법은 세포질 내 유전자를 타겟으로 하는 경우가 대부분이나, 질병의 분류, 예측, 진단, 재발, 치료반응을 더욱 정확하게 진단할 수 있다고 평가되고 있는 바이오 마커인 mRNA, microRNA, Long non-coding RNA 등은 핵 내 위치하는 경우가 많다.
그러나 기존 FISH 방법으로는 핵 내 유전자를 측정하기 위해 많은 시간과 비용이 요구되고 있으며, 숙련자에 의해 수행되어야 하는 등 작업이 어렵다는 문제점이 있다. 이에, 핵 내 핵산을 빠르고 정확하면서 저렴하고 간편하게 검출하기 위한 기술 개발이 절실히 필요하다.
한국공개특허공보 제2015-0028514호
본 발명은 기존 FISH 분석을 대체할 수 있어 기초생물학 전분야에 다양하게 적용될 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 높은 신뢰도 및 해상도의 결과물을 얻을 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 세포 또는 조직 내 존재하는 다양한 핵산을 동시에 또는 독립적으로 검출할 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 살아있는 조직 또는 세포 내 핵산을 간편, 신속 및 정확하게 검출할 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 특정 질환에 국한되지 않고 조직 또는 세포 내 핵산 유무 및/또는 발현량으로 확인할 수 있는 모든 질환에 대해 활용이 가능한 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 siRNA 치료 시 핵 내 핵산의 억제효과를 쉽게 관찰할 수 있는 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 신속한 치료방침을 결정하는 데 도움을 줄 수 있는 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 저비용으로 핵 내 핵산을 검출할 수 있는 나노그래핀센서, 진단키트 및 방법의 제공을 목적으로 한다.
1. 핵이행신호가 함유된 그래핀; 및 형광물질을 함유하는 프로브를 포함하는 세포핵 내 핵산 검출용 나노그래핀센서 또는 진단키트.
2. 위 1에 있어서, 상기 그래핀은 산화그래핀 또는 환원형 산화그래핀인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
3. 위 1에 있어서, 상기 그래핀은 폴리에틸렌글리콜 및 세포 투과성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나가 더 함유된 그래핀인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
4. 위 1에 있어서, 상기 핵이행신호는 CGGGPKKKRKVED, KR-PAATKKAGQA-KKKK, AVKRPAATKKAGQAKKKKLD, MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, GRKKRRQRRRPQ 및 KIPIK로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
5. 위 1에 있어서, 상기 프로브는 DNA, RNA 및 PNA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
6. 위 1에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
7. 위 1에 있어서, 상기 핵산은 long non-coding RNA인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
8. 위 1에 있어서, 상기 핵산은 Gomafu long non-coding RNA인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
9. 위 1의 나노그래핀센서 또는 위 1의 진단키트와 시료를 혼합하는 단계를 포함하는 세포핵 내 핵산 검출방법.
10. 핵이행신호가 함유된 그래핀; 및 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 프로브;를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 나노그래핀센서 또는 키트.
11. 위 10에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 퇴행성 신경질환 진단용 나노그래핀센서 또는 키트.
12. 핵이행신호가 함유된 그래핀; 및 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 프로브;를 포함하는 신경발달장애 진단용 나노그래핀센서 또는 키트.
13. 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 프로브.
14. 위 13에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 퇴행성 신경질환 진단용 프로브.
15. 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 신경발달장애 진단용 프로브.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 기존 FISH 분석을 대체할 수 있어 기초생물학 전분야에 다양하게 적용될 수 있다.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 높은 신뢰도 및 해상도의 결과물을 얻을 수 있다.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 세포 또는 조직 내 존재하는 다양한 핵산을 동시에 또는 독립적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 살아있는 조직 또는 세포에서 간편, 신속 및 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 특정질환에 국한되지 않고 조직 또는 세포 내 특정 핵산 유무 및/또는 발현량으로 확인할 수 있는 모든 질환에 대해 활용이 가능하다.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 siRNA 치료 시 핵 내 핵산의 억제효과를 쉽게 관찰할 수 있다.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 신속한 치료방침을 결정하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 진단키트, 나노그래핀센서 및 방법은 저비용으로 핵 내 핵산을 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 나노그래핀센서가 세포핵 내로 진입하여 Gomafu long non-coding(lnc) RNA를 검출하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 2에서는 Neuro2a parent에 Gomafu lncRNA를 삽입하여 제조한 Neuro2a/Gomafu 세포에서 Gomafu lncRNA가 발현하는 것을 (A) 및 (B)에서 나타내고 있고, (C)에서는 Neuro2a/Gomafu stable cell의 n 수를 3으로 하여 도 1에 나타난 5개의 구간에 해당하는 RNA와 상보적인 siRNA(siGomafu-1 내지 siGomafu-5)를 세포와 혼합하였을 때 어떤 siRNA의 특이성이 가장 높았는지를 확인할 수 있는 그래프로, siGomafu-5의 특이성이 가장 높은 것을 나타낸 것이다(특이성이 높을수록 Gomafu의 발현량이 감소). siNC는 siRNA를 처리하지 않은 대조군을 나타낸 것이다.
도 3은 long non-coding RNA 중 하나인 Gomafu lncRNA를 간략히 나타낸 것이며, bp는 base pair를 나타내는 것이고, RNA에 표시되어 있는 구간인 738 내지 756, 1583 내지 1601, 6861 내지 6879, 7769 내지 7787, 8675 내지 8693은 도 2의 siGomafu-1 내지 siGomafu-5 중 어느 하나와 상보적으로 결합할 수 있는 부분을 나타낸 것으로, 각각이 결합할 수 있는 부분을 표 1에 나타내었다.
도 4는 NLS를 산화그래핀(GO)에 결합하는 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 4㎍의 형광물질을 함유하고 있는 프로브를 NLS가 부착된 산화그래핀(GO) 30㎍이상과 혼합하면 형광물질이 대부분 소광되는 것을 나타낸 것이다. 즉, 소광 효율이 30㎍에서 최대인 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 NLS가 부착된 산화그래핀 표면에 흡착된 Gomafu 프로브가 Gomafu lncRNA를 검출할 수 있다는 것을 나타낸 그래프이다.
도 7은 NE-4C 세포에 동일한 프로브를 포함하며, 산화그래핀, NLS가 결합된 산화그래핀을 각각 독립적으로 혼합하였을 때, NLS가 결합된 산화그래핀만이 핵 내로 침투한 것을 나타낸 것이며, 핵 내로 침투된 곳을 Merge 사진에서 화살표로 표시하였다.
도 8은 환원형 산화그래핀의 소광능이 산화그래핀의 것보다 우수한 것을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 NLS가 결합된 그래핀을 포함함으로써, 기존 FISH 분석을 대체할 수 있어 기초생물학 전분야에 다양하게 적용될 수 있고, 높은 신뢰도 및 해상도의 결과물을 얻을 수 있고, 세포 또는 조직 내 존재하는 다양한 핵산을 동시에 또는 독립적으로 검출할 수 있고, 살아있는 조직 또는 세포에서 간편, 신속 및 정확하게 검출할 수 있고, 특정질환에 국한되지 않고 조직 또는 세포 내 특정 핵산 유무 및/또는 발현량으로 확인할 수 있는 모든 질환에 대해 활용이 가능하고, siRNA 치료 시 핵 내 핵산의 억제효과를 쉽게 관찰할 수 있고, 신속한 치료방침을 결정하는 데 도움을 줄 수 있고, 저비용으로 핵 내 핵산을 검출할 수 있는, NLS가 결합된 그래핀을 포함하는 핵 내 핵산 검출용 나노그래핀센서 또는 진단키트에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본원 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로서 사용된다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 "상보적"은 실질적으로 상보적이면 충분하다. "실질적으로 상보적이다"는 것은 핵산과 완전히 상보적일 필요는 없으나, 타겟 물질로서 핵산과 혼성화가 가능한 정도로 충분히 상보적인 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 "핵"은 세포핵을 의미하며, 상기 "세포"는 어류, 파충류, 포유류 동물의 세포일 수 있으며, 또한, 척추 또는 무척추 동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 세포는 포유류 유래 바람직하게는 인간 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 핵 내 핵산 검출용 나노그래핀센서 또는 진단키트는 핵이행신호를 함유하는 그래핀; 및 형광물질을 함유하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 핵이행신호 (Nuclear Localizing Signal, NLS)가 함유된 나노그래핀을 활용하여 질환을 가진 조직의 핵 내부에서 발현되는 핵산의 유무 및/또는 변화 정도를 감지하여 질환의 유무, 질환의 진행 정도를 진달할 수 있는 시간적, 비용적인 측면에서 효율적이면서도 정확하고 간편한 진단 기술이다. 즉, 세포질 내부의 핵산 변화뿐만 아니라 핵 내 핵산의 변화를 감지함으로써 다양한 질환의 발병 여부, 진행 경과 등에 대한 정보를 빠르고 정확하게 얻을 수 있다.
핵 내 핵산은 세포 내에 존재하는 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 세포는 기질에 고정되어 배양되고 있는 세포, 배지 내에 부유하며 배양되고 있는 세포, 생체 내의 세포, 생체에서 분리된 세포, 또는 분석을 위해 처리된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 포함할 수 있으며, 고정액에 의해 고정된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 "세포 내"는 세포질 내 및/또는 핵 내를 포함하는 것이다. 예컨대, DNA는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 단백질을 코딩하지 않는 DNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, RNA는 mRNA, microRNA, long non-coding RNA, snRNA (small nuclear RNA), snoRNA (small nucleolar RNA), aRNA (antisense RNA), siRNA (small interfering RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, miRNA는 miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA-155, 또는 miRNA-159를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA124, 또는 miRNA-155는 인간 세포에서 발현되는 miRNA인 것일 수 있으며, miRNA-159는 식물 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-124 및 miRNA-125b는 유방암 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, 또는 miRNA-155는 모델질병 세포주인 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-435, 또는 MCF-7; 또는 기타 암세포 등에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본 발명의 나노그래핀센서 또는 진단키트는 핵 내 핵산 검출 외 세포질 내 핵산, 세포 내 또는 세포 밖 핵산의 검출에도 활용될 수 있다. 예컨대, RNA는 단백질로 번역되는 RNA, 단백질로 번역되지 않는 RNA, 5'-비번역 부위, 3'-비번역 부위, 또는 조절 RNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, RNA는 long non-coding RNA일 수 있고, 상기 long non-coding RNA는 long non-coding RNA는 XIST (X-inactive specific transcript), HOTAIR (HOX transcript antisense RNA), Gomafu RNA 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
핵이행신호 (Nuclear Localizing signal, NLS)는 핵국제화신호, 핵이동서열, 핵위치서열등 다양한 용어와 혼용될 수 있다. 핵이행신호는 핵에서 이용되는 여러 가지 단백질들이 세포질에서 합성된 후 핵 내부로 수송될 수 있도록 도와주는 펩타이드 가닥으로, 그래핀을 핵 내로 진입시킬 수 있어 조직 또는 세포에서 높은 해상도와 신뢰도로 핵 내 핵산을 검출할 수 있고, 빠른 시간 안에 핵 내 핵산 검출이 가능하여 특정 질환의 진단, 생명과학 실험 등의 결과를 신속하게 알 수 있다.
핵이행신호는 그래핀에 부착될 수 있고, 그래핀나노센서를 핵 내로 진입시킬 수 있도록 하는 것이면 그 종류가 제한되지 않는다. 예컨대, 핵이행신호는 CGGGPKKKRKVED, KR-PAATKKAGQA-KKKK, AVKRPAATKKAGQAKKKKLD, MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, GRKKRRQRRRPQ, KIPIK 등일 수 있다. 예컨대, 핵이행신호는 CGGGPKKKRKVED일 수 있다. CGGGPKKKRKVED는 the SV40 Large T-antigen (a monopartite NLS)에서 발견된 핵이행신호고, KR-PAATKKAGQA-KKKK 및 AVKRPAATKKAGQAKKKKLD는 Nucleoplasmin (염색체를 응축하는데 관여하는 단백질)의 핵이행신호며, MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN는 EGL-13의 핵이행신호고, PAAKRVKLD는 c-Myc의 핵이행신호고, KLKIKRPVK는 TUS-protein의 핵이행신호다.
NLS를 함유하는 그래핀은 탄소의 동소체 중 하나이며 탄소 원자들이 모여 2차원 평면을 이루고 있는 구조의 탄소 화합물로, 상기 그래핀은 산화그래핀, 환원형 산화그래핀, 그래핀퀀텀닷, CVD 방식으로 제조한 그래핀 등일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 그래핀은 산화그래핀 또는 환원형 산화그래핀일 수 있으며, 바람직하게는 환원형 산화그래핀일 수 있다. 상기 그래핀이 환원형 산화그래핀인 경우 산화그래핀보다 소광 효율이 더 우수하여, 형광이 대부분 소광되기까지 요구되는 그래핀의 농도가 감소할 수 있어 비용을 절감할 수 있으며, 정확한 검출이 가능해지며, 이와 더불어 해상도가 높아질 수 있다. 산화그래핀은 그라파이트를 산화시킨 후 소니케이션을 통해 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 환원형 산화그래핀은 산화그래핀을 환원시켜 얻은 것을 말하며, 환원은 당업계에 공지된 방법을 통해 이루어질 수 있다.
그래핀에 함유되는 NLS는 그래핀의 가장자리에 결합되어 있거나, 및/또는 그래핀의 내부 표면에 결합되어 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 함유는 공유결합일 수 일 수 있으며, 예컨대, 링커에 의한 공유결합일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, NLS가 함유된 그래핀은 PEG 및 세포 투과성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나가 더 함유된 것일 수 있다.
PEG는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)로, PEG가 함유된 그래핀은 면역원성 (immunogenicity) 감소, 용해성 (solubility) 증가, 생리활성용액에서 분산성 증가, 안정성 (stability) 향상, 핵산 검출의 민감도 증가 등의 효과를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
세포 투과성 펩타이드는 일종의 신호 펩타이드 (Signal Peptide)이며, 예로 TAT 단백질에 존재하는 11개 아미노산 서열의 b-galactosidase (120 kDa) 단백질, 초파리의 단백질에서 유래한 Antennapedia (Penetratin), HSV-1 바이러스로부터 유래된 VP22, Simian Virus 40 large antigen T 로부터 유래한 Pep-1 등이 있을 수 있고, 또한, poly Arginine, poly Lysine 과 같이 단순히 Arginine, Lysine 과 같은 양이온성 아미노산이 반복적으로 여러개가 연결된 펩타이드가 포함될 수 있으나, 이제 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 세포투과성 펩타이드로 Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 세포투과성 펩타이드는 RKKRRQRR의 서열(서열번호 18)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 세포 투과성 펩타이드는 그래핀의 세포막 투과도를 향상시킬 수 있으며, 그래핀에 흡착된 프로브를 세포 내로 전달시키는 능력을 향상시킬 수 있어 핵 내 핵산 검출 속도를 증가시킬 수 있어, 질병의 유무, 질병의 경과, 세포 내 변화 등에 대해 빠른 진단이 가능하다.
NLS가 함유된 그래핀은 단일층의 시트 형태인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 단일층의 시트 형태인 그래핀은 단일층의 시트 형태가 아닌 그래핀에 비하여 동일한 질량에서 표면적이 넓어 적은 양으로도 많은 핵산 프로브를 흡착할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
NLS가 함유된 그래핀은 세포에 유해하지 않아 생체적합성을 가지고, 화학적 기능화 과정을 통해 세포에 도입할 수 있으며, 시그널 감지에 적합할 수 있다.
NLS가 함유된 그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 700 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 1 μm, 약 100 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 300 nm 내지 약 1 μm, 약 400 nm 내지 약 1 μm, 약 500 nm 내지 약 1 μm, 약 700 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 400 nm 이하인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 그래핀은 작은 크기 때문에 표면에 흡착된 핵산과 함께 핵막 및/또는 세포막을 용이하게 통과하여 핵 내 및/또는 세포 내로 들어갈 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
프로브는 NLS가 함유된 그래핀 상에 위치할 수 있다. 상기 "상에 위치"는 프로브가 NLS가 함유된 그래핀에 접해 있는 경우뿐 아니라 프로브와 NLS가 함유된 그래핀 사이에 전술한 프로브와 다른 프로브, 전술한 그래핀과 다른 그래핀이 존재하는 경우, 프로브 및 그래핀이 아닌 다른 물질이 존재하는 경우도 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
핵산에 일부 또는 전부 상보적으로 결합하는 프로브는 DNA, RNA 및/또는 PNA(peptide nucleic acid), 단백질일 수 있다.
DNA 및/또는 RNA는 상기 DNA 또는 RNA에 함유되어 있는 서열끼리 수소 결합, 비공유 결합 등을 형성하여 2차원 이상의 구조를 형성할 수 있으며, 경우 프로브와 상기 DNA 및 RNA와의 상보적 결합이 어려워져 정확도가 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. 이에 본 발명의 센서 또는 진단키트에 포함되는 프로브는 타겟물질의 검출 정확도를 향상시키기 위해 DNA 및/또는 RNA가 2차원 이상의 구조를 형성하지 않은 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 프로브는 Gomafu lncRNA의 2차원 이상의 구조가 형성되지 않은 서열과 상보적으로 결합하는 것일 수 있으며, 구체적으로는 Gomafu lncRNA 서열의 738 내지 756번, 1583 내지 1601번, 6861 내지 6879번, 7769 내지 7787번 및 8675 내지 8693번 서열 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 센서 또는 진단키트는 상기 Gomafu lncRNA를 검출할 수 있는 프로브를 포함함으로써 신경발달장애, 퇴행성 신경질환 등 신경계 장애인 신경 질환에 적용될 수 있고, 예로 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계 (뇌신경을 포함함), 및 자율 신경계 (이의 일부는 중추 및 말초 신경계 둘 모두에 위치함) 와 관련되는 장애를 포함한다. 특히 신경 질환은 신경 능선 세포 또는 슈반 세포의 기능이 손상, 변경 또는 방해되는 임의의 질환을 포함한다. 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 척수장애, 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 급성 산재성 뇌척수염 (ADEM), 감염후 또는 백신접종후 뇌척수염, 말초 신경장애, 신경초종증, 샤르코 마리 치아 질환, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경증 (CIDP) 등의 슈반 세포와 연결된 신경 질환, 뇌졸중 (stroke), 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병 (Pick's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 외상성 중추 신경계 질환 (traumatic central nervous system diseases) 및 척수 손상 질환 (spinal cord injury disease)등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신, 디아미노퓨린 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
프로브는 단일가닥일 수 있으며, 올리고디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오타이드 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 프로브가 단일가닥으로 존재할 때는 프로브의 노출된 소수성 염기부분이 pi-pi 상호작용으로 그래핀의 표면에 흡착될 수 있다. 프로브가 타겟물질인 핵산과 혼성화되어 이중가닥으로 존재할 때는 프로브의 소수성 염기부분이 프로브-핵산 사이의 수소 결합으로 인해 외부에 노출되지 않으므로 그래핀의 표면에 흡착이 되지 않는다.
프로브는 약 50 염기 이하의 길이를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 약 50 염기 이하, 약 5 염기 내지 약 50 염기, 약 10 염기 내지 약 50 염기, 약 15 염기 내지 약 50 염기, 약 20 염기 내지 약 50 염기, 약 25 염기 내지 약 50 염기, 약 30 염기 내지 약 50 염기, 약 40 염기 내지 약 50 염기, 약 5 염기 내지 약 40 염기, 약 5 염기 내지 약 30 염기, 약 5 염기 내지 약 20 염기, 약 15 염기 내지 약 25 염기의 길이를 가지는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 약 18 염기 또는 약 22 염기를 가지는 것일 수 있다.
프로브는 적절한 서열의 클로닝, 제한효소 분해 및 포스포트리에스테르 방법, 디메틸포스포라미다이트 방법 등과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
프로브의 염기 서열은 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로브는 PNA일 수 있다. PNA는 올리고핵산의 주사슬이 펩티드 결합으로 구성되어 있어 전기적으로 중성을 띠고 있으므로 소수성인 그래핀에의 흡착성이 전기적으로 음성을 띠는 DNA 또는 RNA에 비하여 우수하다. 또한 PNA-RNA 결합은 DNA-RNA, 또는 RNA-RNA 결합보다 강하며 Tm 값이 염기당 약 1℃씩 높다. 따라서 표적물질로서의 핵산과의 결합력은 DNA 또는 RNA 프로브에 비하여 PNA 프로브가 우수하다. 또한, PNA는 체내에 존재하는 핵산분해효소(nuclease) 또는 단백질분해효소(protease)에 대하여 매우 안정하기 때문에 세포 내로 PNA 프로브가 도입되었을 때 PNA 프로브의 소실 가능성이 DNA, RNA, 또는 단백질 프로브에 비하여 매우 낮다. 추가적으로, PNA는 구조적으로 강한 공유결합으로 이루어져 있이 때문에 다양한 pH 범위 및 온도 조건에서 안정성을 유지할 수 있어 프로브로 사용할 올리고핵산으로서 다른 종류의 핵산에 비하여 우수한 조건을 가진다.
표적 물질인 핵산과 프로브의 결합은 표적 물질인 핵산의 염기서열과 프로브의 염기서열이 서로 상보적이어서 혼성화될 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 프로브는 표적 물질인 핵산의 길이와 동일한 길이를 가지거나, 표적 물질인 핵산의 길이보다 짧은 길이 또는 긴 길이를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 프로브의 염기서열은 표적 물질인 핵산의 염기서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브의 염기서열과 표적물질인 핵산의 염기 서열 일부 또는 전부와의 상보성은 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 프로브는 서열이 정해져 상업적으로 판매되는 것, 구매자가 디자인한 서열로 제조되어 판매되는 것, 또는 비상업적으로 제조된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 파나진(panagene) 사로부터 구입한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
NLS가 함유된 그래핀은 프로브 외 다양한 방향족 분자와 바이오 물질들이 흡착될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
NLS가 함유된 그래핀과 형광물질 사이에는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET)현상이 일어난다. 즉, 그래핀은 형광 공명 에너지 전달 현상을 통해 근처에 있는 형광물질의 형광신호를 소광시킬 수 있다. 이에 따라, 형광물질을 함유하는 프로브가 그래핀에 흡착되면 형광물질의 형광은 소광된다. 그러나, 프로브가 표적 물질인 핵산과 혼성화하여 이중 가닥을 이루면 그래핀에 흡착되지 못하고 유리되므로, 프로브에 함유된 형광물질의 형광이 형광 공명 에너지 전달 현상에서 벗어나 형광을 띠게 된다. 따라서 이러한 과정에서 시료의 형광 유무 및/또는 수준을 측정함으로써 시료 내에 있는 표적 물질의 검출 및/또는 정량이 빠르고 정확하게 이루어질 수 있다.
형광 변화는 그래핀 기재에 고정화된 이중나선구조에서 발생하는 형광강도(세기)에서 타겟 물질의 노출에 따른 단일나선구조 형성을 통해 발생하는 형광 소실을 말하는 것으로, 면역학적 방법, 예컨대, 효소 면역 측정법(EIA)(예, 직접 경합 ELISA, 간접 경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법(예, 웨스턴 블롯법에서의 2차 항체 대신에 사용), 면역조직 화학적 염색법, 셀 소팅(cell sorting)법 등에 의해 측정될 수 있다.
NLS가 부착된 그래핀에 흡착되는 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 이상의 프로브들을 포함할 수 있으며, 상기 프로브들은 한 종류 이상의 핵산과 각각 결합할 수 있어, 서로 상이한 핵산의 다중 검출이 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 서로 상이한 형광물질은 서로 상이한 색상을 띠는 형광물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 또는 두 종류 이상의 프로브이고, 표적 물질인 핵산은 각각의 프로브와 상보적 서열을 가지는 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산인 경우, 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적 서열을 가지는 프로브만이 이중 가닥을 이루어 그래핀으로부터 유리되어 형광을 발하게 된다. 이에 따라 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적인 프로브에 함유된 형광물질만이 형광을 발하게 되고, 발산되는 형광의 색상을 통하여 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산 중 어떤 핵산이 시료 내에 존재하는지 여부를 검출할 수 있게 된다.
프로브에 함유된 형광물질은 프로브의 한쪽 말단에 연결되어 있거나, 또는 프로브 서열 내부에 연결되어 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브에 함유된 형광물질은 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 공유결합으로 연결되어 있는 것을 포함할 수 있으며, 공유결합은 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된 링커와 형광물질 사이의 공유결합인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 공유결합은 링커의 아미노기와 형광물질 사이의 공유결합인 것을 포함할 수 있으며, 링커는 에틸렌 글리콜 링커인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 링커는 파나진 사의 O-링커 또는 AEEA 링커인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, AEEA 링커는 약 1.3 nm의 길이를 가지고 약 9 개의 원자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
프로브에 함유된 형광물질은 살아있는 세포에 적용하여 형광을 측정 가능한 형광물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광물질은, 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산, Cy5, Cy3, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광물질은 FAM (fluorescein amidite), HEX (Hexachloro-fluorescein), NEDTM, 텍사스 레드 (Texas RedTM) 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
시료는 포유류의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨; 또는, 세균 또는 세포 배양물, 배양 상등액 등에서 선택될 수 있으나, 타겟 물질의 종류, 검출 목적 등에 따라 해당 기술분야의 통상의 기술자 수준에서 적절히 채택하여 사용할 수 있다. 바람직하게 시료는 조직 및/또는 세포일 수 있다. 세포는 기질에 고정되어 배양되고 있는 세포, 배지 내에 부유하며 배양되고 있는 세포, 생체 내의 세포, 생체에서 분리된 세포, 또는 분석을 위해 처리된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 포함할 수 있으며, 고정액에 의해 고정된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 시료는 파라핀조직 또는 세포, 동결조직 또는 세포 등 공지된 방법으로 처리된 조직 및/또는 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 형광물질을 함유하는 프로브의 농도는 약 30 pmol 이상일 수 있고, 예컨대, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 및 100 pmol 중 어느 두 값 사이의 범위를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 프로브의 농도는 40 pmol일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 최대로 형광이 소광되는 그래핀의 농도는 프로브의 농도가 40 pmol일 때 0.35 ㎍ 이상일 수 있고 예컨대, 프로브의 농도가 40pmol일 때, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 ㎍ 중 어느 두 값 사이의 범위를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 최대로 형광이 소광되는 그래핀의 농도는 프로브의 농도가 40 pmol일 때 0.4 ㎍일 수 있다. 상기 범위 내로 소광이 최대로 이루어지면 타겟 물질의 검출 시 노이즈의 발생이 최소화되고, 검출 정확도가 향상될 수 있다.
프로브는 형광물질 외 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 함유할 수 있다. 이러한 표지로 32P, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAS 에 이용되는 것), 바이오틴, 합텐, 항혈청, 단일 클론성 항체 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 진단키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다.
본 발명의 진단키트는 예컨대, 96-well plate의 형상을 가질 수 있으며, 이 경우 각각의 well이 진단키트일 수 있다. 구체적으로, 각각의 well은 핵이행신호가 함유된 그래핀 및 형광물질을 함유하는 프로브를 포함하고 있을 수 있으며, 조직 및/또는 세포를 각각의 well에 첨가하기만 하면 다른 추가적인 구성을 첨가하지 않아도 타겟 물질의 검출이 가능할 수 있다.
본 발명의 진단키트는 고체 형태일 수 있다. 예컨대, 핵이행신호가 함유된 그래핀과 형광물질을 함유하는 프로브가 각각 독립적으로 파라핀 형태로 굳어진 것일 수 있으며, 함께 혼합물 형태로 파라핀 형태로 굳어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 진단키트는 액체 형태일 수 있다. 예컨대, 핵이행신호가 함유된 그래핀과 형광물질을 함유하는 프로브가 액체 형태로 용기에 각각 독립적으로 담긴 것일 수 있고, 혼합물의 형태로 하나의 용기에 담긴 것일 수 있으며, 이 경우 냉동 또는 상온 보관될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼합물의 형태로 하나의 용기에 담아 냉동보관 하는 경우, 필요 시 해동하여 시료를 추가하는 것 외에는 별도의 혼합 과정이 필요하지 않으므로 핵 내 핵산 진단에 편의성 및 신속성이 증대될 수 있다.
본 발명의 진단키트는 진단키트를 이루는 구성이 각각 독립적으로 용기 (예컨대, 일회용 튜브 등)에 담겨있는 것일 수 있으며, 또한 같이 혼합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 진단키트에 포함되는 프로브는 동결 건조된 것일 수 있다. 서로 다른 핵산 또는 하나의 핵산의 다른 영역에 일부 또는 전부 상보적으로 결합하는 프로브를 포함하는 경우에는, 상기 프로브들이 혼합되어 용기에 담겨 있을 수도 있고 개별적으로 각각의 용기에 담겨 있을 수도 있다.
본 발명의 진단키트에는 Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 등의 성분 또는 이들을 변형한 화합물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 진단키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로 핵이행신호가 표면에 결합된 그래핀 및 형광물질을 함유하는 핵산을 포함하는 핵 내 핵산 검출용 나노그래핀센서 또는 진단키트와 시료를 혼합하는 단계를 포함하는 핵 내 핵산 검출방법을 제공한다.
핵이행신호, 그래핀, 형광물질, 핵산 및 시료는 전술한 나노그래핀센서 또는 진단키트에 사용되는 것일 수 있다.
그래핀의 작은 크기와 그래핀 표면의 소수성 부위 때문에, 프로브가 흡착된 그래핀은 세포의 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어갈 수 있고, 그래핀 표면에 부착되어 있는 NLS 때문에 핵 내 진입이 가능하여 프로브는 표적 물질인 핵산과 혼성화될 수 있다. 프로브가 표적 물질인 핵산과 혼성화하여 이중 가닥을 이루면 그래핀으로부터 유리되므로, 그래핀으로 인한 형광 공명 에너지 전달 현상으로부터 벗어나 프로브에 함유된 형광물질이 형광을 띠게 된다. 따라서 이러한 형광을 측정함으로써 시료 내에 있는 표적 물질인 핵산의 검출 및 정량이 이루어질 수 있다.
형광물질이 형광을 띠는 것을 실시간으로 측정할 수 있어 시료 내의 표적물질인 핵산이 실시간으로 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예컨대, 프로브에 포함된 형광물질의 형광은, 유세포분석기(FACS), 형광 리더기, 형광 현미경, 또는 인비보 (in vivo) 이미징 기기에 의하여 검출될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광 리더기는 형광 마이크로플레이트 리더로 약 230 nm 내지 약 999 nm에 이르는 형광을 측정할 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광 리더기는 형광 신호 사이의 cross-talk 현상이 최소화될 수 있도록 약 세 가지의 유기 형광물질을 선택하여 그에 대한 형광 신호를 관찰하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 유세포분석기는 단일 세포를 튜브로 흘려주며 세포의 형광 신호를 관찰할 수 있는 기기인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 형광 현미경은 세포 내, 세포 외, 또는 시료의 형광을 관찰할 수 있는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 인 비보 이미징 기기는 Caliper Life Science 사의 Xenogen IVIS 100인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 상기 인 비보 이미징 기기는 CCD(charge coupled device) 카메라를 이용하여 각 형광 파장에 맞는 이미지를 수득할 수 있는 기기인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 방법은 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 대장암, 골암, 피부암, 혈액암, 당뇨, 또는 알츠하이머 등의 각종 질병의 진단, 치료, 또는 예후를 판단할 수 있고, 줄기 세포의 계통 특이적 분화 관찰할 수 있으며, 전술한 판단 대상에 제한되지 않고 다양한 관찰 및/또는 판단에 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 양태로 신경계 장애 진단용 프로브를 제공한다.
신경계 장애로는 퇴행성 신경질환, 신경발달장애 등 신경 질환을 들 수 있으며, 예로 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계 (뇌신경을 포함함), 및 자율 신경계 (이의 일부는 중추 및 말초 신경계 둘 모두에 위치함) 와 관련되는 장애 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 구체적으로, 신경 질환은 신경 능선 세포 또는 슈반 세포의 기능이 손상, 변경 또는 방해되는 임의의 질환을 포함한다. 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 척수장애, 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 급성 산재성 뇌척수염 (ADEM), 감염후 또는 백신접종후 뇌척수염, 말초 신경장애, 신경초종증, 샤르코 마리 치아 질환, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경증 (CIDP) 등의 슈반 세포와 연결된 신경 질환, 뇌졸중 (stroke), 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병 (Pick's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 외상성 중추 신경계 질환 (traumatic central nervous system diseases) 및 척수 손상 질환 (spinal cord injury disease)등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신경계 장애는 퇴행성 신경질환 또는 신경발달장애일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 퇴행성 신경질환 또는 신경발달장애 진단용 프로브는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. (표 1)
서열번호 1 내지 10을 포함하는 프로브는 Gomafu lncRNA 서열의 738 내지 756번, 1583 내지 1601번, 6861 내지 6879번, 7769 내지 7787번 및 8675 내지 8693번과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브로, 상기 프로브는 Gomafu lncRNA 내 수소결합, 비공유결합 등에 의해서 형성된 2차원 이상의 구조를 형성하는 부분이 아닌 검출이 용이한 1차원 구조를 형성하고 있는 부분을 검출할 수 있으며, 서열번호 1 내지 10의 부분 외 2차원 이상의 구조를 형성하는 Gomafu lncRNA 서열부분과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브에 비해 Gomafu lncRNA 검출 정확도가 더 우수할 수 있고, 상기 부분을 검출함으로써 질병의 진행, 발병, 개선 등에 대한 정확한 정보를 얻을 수 있으며, 진단 속도를 크게 향상시킬 수 있다.
신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님은 당연하다.
실시예
1. Gomafu siRNA validation
Neuro2a/gomafu stable cell (Dr. Shinichi Nakagawa (RIKEN, Japan) 제공)을 well 당 4x104 cells을 24 well plate에 접종하였다. 그리고 Gomafu long non-coding RNA(NCBI Reference Sequence: NR_003718)와 상보적으로 결합하는 표 1의 5개의 Gomafu siRNA를 서로 다른 well에 15pmol (30nM)만큼 첨가하고 48시간 동안 인큐베이션한 다음, Trizol로 RNA를 분리하고 임의의 프라이머를 상온에 처리한 다음 PCR과 Real-time PCR을 이용하여 결과를 확인하였다(도 2).
siRNA/miRNA name 서열번호 Duplex sequence MW Position (8716 bp,
NR_003718)
Mouse Gomafu (Miat) # 1 1 5’GCAGAUAAGUAUCAUUUCAUU3’ 6307 738-756
2 5’UGAAAUGAUACUUAUCUGCUU3’ 6284
Mouse Gomafu (Miat) # 2 3 5’CCAUGAUGUCGAUGAUGUAUU3’ 6339 1583-1601
4 5’UACAUCAUCGACAUCAUGGUU3’ 6282
Mouse3Gomafu (Miat) # 3 5 5’GUCAAACUCCAGAUAGAAAUU3’ 6352.1 6861-6879
6 5’UUUCUAUCUGGAGUUUGACUU3’ 6253.9
Mouse Gomafu (Miat) # 4 7 5’GAUAUAGUCUGUAAUUGUAUU3’ 6325 7769-7787
8 5’UACAAUUACAGACUAUAUCUU3’ 6251
Mouse Gomafu (Miat) # 5 9 5’GUGUAAGAUGCCAUUUCAAUU3’ 6323 8675-8693
10 5’UUGAAAUGGCAUCUUACACUU3’ 6283
Negative control 13 5’CCUCGUGCCGUUCCAUCAGGUAGUU3’ 7487.7 -
14 5’CUACCUGAUGGAACGGCACGAGGUU3’ 7636.9
표 1의 서열 중 U(우라실)를 T(티로신)로 변형하여 사용 가능하며, 표 1의 서열번호 9 및 10의 U를 T로 변형한 서열을 포함하는 서열의 예를 표 2(서열번호 12 및 서열번호 13)에 나타냈다. 도 2에 나타난 바와 같이, Gomafu siRNA가 도입되지 않은 세포 (Neuro2a parent, Neuro2a)의 경우 Gomafu 밴드가 나타나지 않았으며, Gomafu siRNA가 도입된 세포(Neuro2a parent/Gomafu, NE-4C)는 Gomafu 밴드가 나타난 것을 확인하였다. 상기 표 1의 mouse Gomafu(Miat) #1 내지 5는 도 2의 siGomafu-1 내지 5를 의미한다.
그리고 Gomafu 밴드가 나타난 세포의 n을 3으로 하여, 상기 세포에 표 1의 1 내지 6번의 siRNA (프로브)를 처리하였을 때 상대적인 Gomafu lncRNA의 발현량이 6번(대조군) 대비 감소하는지 여부를 확인하였으며, 그 중 siGomafu-5 (표 1의 5번, 표 2)을 상기 세포에 처리하였을 때 가장 낮은 Gomafu lncRNA 발현량을 나타나 나머지 siGomafu 중 가장 특이성이 높은 것으로 확인되었다. 하기 표 2의 Gomafu siRNA #5는 DNA 형태의 PNA로 제작한 프로브의 서열 및 이와 상보적인 서열을 나타낸 것이다.
Gomafu siRNA #5
(서열번호 11)		 TTGTAGCTGCCTCTGTGTAAGATGCCATTTCAATATTAAAACCGACACACACTGGA
Reverse complement
(서열번호 12)		 TCCAGTGTGTGTCGGTTTTAATATTGAAATGGCATCTTACACAGAGGCAGCTACAA
2. 산화그래핀 ( Graphene oxide, GO)의 합성
산화그래핀은 50-100 nm의 균일한 사이즈를 갖도록 선별과정을 거쳐 준비하였다. 구체적으로 흑연의 산 처리는 Hummers와 Offeman의 방법으로 실험을 하였다. 우선 0℃에서 흑연 1g를 황산(sulfuric acid)에 분산시킨 후 초산나트륨(sodium acetate) 2g을 10분간 녹였다. 황산 용액에 과망간산칼륨(potassium permanganate) 12g를 넣고 10분간 녹인 후 상온에서 12시간 동안 반응을 시켰다. 반응이 종결된 용액을 증류수 2L에 부어 교반시킨 후 과산화수소(hydroperoxide) 20 mL를 넣어 potassium permanganate를 제거하여 준다. 이 용액을 원심분리기를 이용하여 증류수와 GO를 분리시킨다. 여러 번의 세척에 걸쳐 pH 6 내지 7로 중화시킨 후 동결건조기를 사용하여 GO를 얻었다.
3. 환원형 산화그래핀 (Reduced graphene oxide, rGO )의 합성
앞서 만들어진 GO 1g를 1000mL의 증류수에 초음파 처리로 완전히 분산시킨다. 분산된 용액에 hydrazine hydrate 10mL를 첨가 후 100℃에서 24시간 동안 반응을 진행한다. 반응이 종결되면 걸러서 물과 에탄올 1:1 비율로 섞인 용매에 2, 3회 세척한다. 80 ℃에서 진공 건조하여 rGO를 얻는다.
4. 산화그래핀 및 환원형 산화그래핀의 소광능 비교
앞서 제조한 산화그래핀 또는 환원형 산화그래핀을 0, 10, 20, 40 또는 80ng의 농도로 BC1 PNA (서열번호 15, GGTCTTTTTGTTATTTTGTCTT) 4㎍(40pmol) (FAM-OO-GGTCTTTTTGTTATTTTGTCTT)과 혼합하고, 형광 강도를 Fluorometer로 측정하여 비교하였다. 상기 OO는 o-linker를 의미한다.
도 8에 나타난 바와 같이, 환원형 산화그래핀의 소광능이 더 우수한 것을 확인하였다.
5. NLS가 부착된 그래핀의 제조
NLS가 부착된 그래핀은 carboxyl group을 활성화 시킨 후 NHS와 EDC를 이용하여 아마이드 결합을 형성시켜 제조하였으며, 상세한 방법은 도 4에 나타내었다.
6. NLS가 부착된 그래핀의 소광 테스트
하기 표 3의 FAM-PNA-Gomafu 4㎍ (40pmol), NLS가 부착된 산화그래핀(GO-NLS) 0 내지 50㎍을 혼합하고 총 100㎍가 되도록 1M Tris-HCl (pH 7.5)를 첨가하여 나노그래핀센서가 포함된 조성물을 제조하였다. 그리고 상온에서 10분간 인큐베이션한 후 Fluorometer를 이용하여 형광을 측정하였다(FAM은 o-linker를 이용하여 PNA의 5'말단에 결합시킴). 도 5에 나타난 바와 같이, GO-NLS 30㎍과 FAM-PNA-Gomafu 4㎍(Gomafu PNA 서열 ATTGAAATGGCATCTTACACAG(서열번호 16))를 혼합한 경우에서 소광 효율이 최대가 된 것을 확인하였다.
Probe Sequence Length GC (%)
FAM-PNA-Gomafu FAM-OO-ATTGAAATGGCATCTTACACAG 22 36.36
도 6에 나타난 바와 같이, 비특이적인 올리고머 400pmol을 상기 제조된 조성물에 넣었을 때는 형광이 측정되지 않았으나, FAM-PNA-Gomafu와 상보적인 올리고머 400pmol을 상기 조성물에 넣었을 때는 형광이 측정된 것을 확인하였다. 즉, 상기 제조된 나노그래핀센서는 타겟 물질을 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다. 상기 OO는 o-linker를 의미한다.
7. 세포핵 내 진입 테스트
FAM-PNA-Gomafu를 포함하는 산화그래핀 또는 NLS(서열번호 17, CGGGPKKKRKVED)가 결합된 산화그래핀을 3개의 NE-4C 세포 (Gomafu 발현세포)에 각각 처리하였으며, 그 후 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색을 실시하였다. TAT 펩타이드가 결합된 그래핀의 제조는 도 4에 나와있는 방법과 동일한 방법으로 실시하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 산화그래핀을 포함하는 센서를 NE-4C 세포에 처리하였을 때는 세포핵 내로 침투되지 않았으나, NLS가 결합된 그래핀을 포함하는 나노그래핀센서의 경우 세포핵 내로 침투된 것을 확인하였다(화살표 표시).
8. 결론
기존 환자의 조직검체에서 FISH로 핵산을 검출할 경우, 탐침용 프로브 제작에서부터 다양한 시약의 처리 등 시간과 비용을 많이 소모하고 있다. 또한 핵 내에 있는 핵산을 검출하기 위해 세포 분열기를 활용하는 등과 같은 시간과 비용이 추가로 들어가는 문제점이 있다.
본 발명은 발생과정 전반에 걸쳐 특정 유전자의 발현 양상을 기존의 FISH 기법에 비해 적은 시간, 적은 비용으로 관찰할 수 있는 장점이 있으며, 특히 NLS를 그래핀에 결합시킴으로써 핵 내 핵산 발현 여부를 판단할 수 있어, 핵 내 핵산 존부 및 발현 여부로 판단할 수 있는 질병의 발병 여부 등을 간편하고, 빠른 시간 내 정확하게 진단할 수 있으며, 최근 대두되고 있는 유전자가위 같은 기법의 작동 여부를 조직 수준에서 관찰할 수 있는 등 생명과학 전반에 활용될 수 있다.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Nanographene-sensor or diagnose kit comprising nuclear localizing signal(NLS) conjugated graphene for detecting nucleotide located in nuclea <130> 16P11033 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 1 <400> 1 gcagauaagu aucauuucau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 1 <400> 2 ugaaaugaua cuuaucugcu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 2 <400> 3 ccaugauguc gaugauguau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 2 <400> 4 uacaucaucg acaucauggu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 3 <400> 5 gucaaacucc agauagaaau u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 3 <400> 6 uuucuaucug gaguuugacu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 4 <400> 7 gauauagucu guaauuguau u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 4 <400> 8 uacaauuaca gacuauaucu u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 5 <400> 9 guguaagaug ccauuucaau u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Gomafu (Miat) # 5 <400> 10 uugaaauggc aucuuacacu u 21 <210> 11 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gomafu siRNA #5 <400> 11 ttgtagctgc ctctgtgtaa gatgccattt caatattaaa accgacacac actgga 56 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gomafu siRNA #5 Reverse complement <400> 12 tccagtgtgt gtcggtttta atattgaaat ggcatcttac acagaggcag ctacaa 56 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative control <400> 13 ccucgugccg uuccaucagg uaguu 25 <210> 14 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative control <400> 14 cuaccugaug gaacggcacg agguu 25 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC1 PNA <400> 15 ggtctttttg ttattttgtc tt 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gomafu PNA <400> 16 attgaaatgg catcttacac ag 22 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuclear localizing sequence <400> 17 Cys Gly Gly Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp 1 5 10 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating seqeucne <400> 18 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5

Claims (15)

  1. 핵이행신호가 함유된 그래핀; 및
    형광물질을 함유하는 프로브를 포함하는 세포핵 내 핵산 검출용 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 그래핀은 산화그래핀 또는 환원형 산화그래핀인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 그래핀은 폴리에틸렌글리콜 및 세포 투과성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나가 더 함유된 그래핀인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 핵이행신호는 CGGGPKKKRKVED, KR-PAATKKAGQA-KKKK, AVKRPAATKKAGQAKKKKLD, MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, GRKKRRQRRRPQ 및 KIPIK로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 프로브는 DNA, RNA 및 PNA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 long non-coding RNA인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 Gomafu long non-coding RNA인, 나노그래핀센서 또는 진단키트.
  9. 청구항 1의 나노그래핀센서 또는 청구항 1의 진단키트와 시료를 혼합하는 단계를 포함하는 세포핵 내 핵산 검출방법.
  10. 핵이행신호가 함유된 그래핀; 및
    서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 프로브;
    를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 나노그래핀센서 또는 키트.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 퇴행성 신경질환 진단용 나노그래핀센서 또는 키트.
  12. 핵이행신호가 함유된 그래핀; 및
    서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 프로브;
    를 포함하는 신경발달장애 진단용 나노그래핀센서 또는 키트.
  13. 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 프로브.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 퇴행성 신경질환 진단용 프로브.
  15. 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 신경발달장애 진단용 프로브.
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KR20150028514A (ko) 2013-09-06 2015-03-16 건국대학교 산학협력단 Ｒｎａ 합성에 대한 산화 그래핀 기반 신규한 형광 분석법

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