KR20150028514A - Ｒｎａ 합성에 대한 산화 그래핀 기반 신규한 형광 분석법 - Google Patents

Ｒｎａ 합성에 대한 산화 그래핀 기반 신규한 형광 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 합성에 대한 산화 그래핀 기반 신규한 형광 분석법에 관한 것으로, 상세하게는 형광 펩타이드 핵산(PNA) 프로브를 고안하고, RNA 산물과 어닐링하고 그 PNA-RNA 하이브리드는 산화 그래핀 표면에 흡착된 PNA 프로브의 형광 강도의 회복을 유도하는 것에 관한 것이다.

Description

ＲＮＡ 합성에 대한 산화 그래핀 기반 신규한 형광 분석법{A novel graphene oxide-based fluorometric assay for RNA synthesis}
본 발명은 RNA 합성에 대한 산화 그래핀 기반 신규한 형광 분석법에 관한 것으로, 상세하게는 형광 펩타이드 핵산(PNA) 프로브를 고안하고, RNA 산물과 어닐링하고 그 PNA-RNA 하이브리드는 산화 그래핀 표면에 흡착된 PNA 프로브의 형광 강도의 회복을 유도하는 것에 관한 것이다.
산화그래핀(Graphene oxide, 이하 'GO'라 함)은 수소결합과 pi-stacking 상호작용에 의해 이중가닥핵산과 비교하여 단일가닥핵산에 더 강하게 결합하는 것으로 알려져 있으며 인접한 형광물질의 형광을 소멸시키는 것으로 알려졌다.((a) K. Andre Mkhoyan, A. W. Contryman, J. Silcox, D. A. Stewart,G. Eda, C. Mattevi, S. Miller, and M. Chhowalla, Nano Lett , 2009, 9,1058-1063; (b) J. S. Park, H. K. Na, D. H. Min, and D. E. Kim,Analyst , 2013, 138, 1745-1749; (c) H. Jang, Y. K. Kim, H. M. Kwon,W. S. Yeo, D. E. Kim, and D. H. Min, Angew Chem Int Ed Engl,70 2010, 49, 5703-5707)
RNA 중합효소(이하, 'RNAPs'라 함)은 주형 가닥을 따라서 RNA 가닥으로 ribonucleotide를 삽입하는 효소 군이고 살아 있는 세포의 주요 과정인 전사에 관여한다. 예를 들어 바이러스 RNAPs, bacteriophages T7, T3, 및 미토콘드리아 RNAPs는 단일 서브유닛 효소인 반면 다른 원핵 및 진핵 RNA 중합효소는 다중-서브유닛으로 구성된다.(N. Cermakian, T. M. Ikeda, R. Cedergren, and M. W. Gray, Nucleic Acids Res , 1996, 24, 648-654) 바이러스 기원의 단일 서브유닛 RNAPs는 프로모터 특이적이고(J. J. Dunn, and F. W. Studier, J Mol Biol , 1983, 166, 477-535), 종종 생물학적으로 활성이 있는 RNAs를 합성하는데 사용될 뿐만 아니라 바이러스 활성을 감소하기 위한 약제 타겟으로 사용된다.((a) V. Meenaa, J. Kavitha Srilakshmi, S. Sriram, and S. C, Advanced BioTech , 2011, 11, 13-15; (b) P. A. Krieg, and D. A. Melton, Nucleic Acids Res , 1984, 12, 7057-7070) 따라서, RNAP 활성을 에세이하기 위한 용이하고, 저렴한 방법의 개발이 RNAP에 의한 RNA 합성기작의 조사 및 항바이러스 약제 스크리닝에 중요하다.
RNAP-매개된 RNA 합성을 검출하기 위한 통상의 방법은 방사성동위원소 표지된 뉴크레오타이드를 이용한 젤 전기영동방법이나, 그 방법은 종종 노동집약적이고 방사성 물질의 사용이 단지 일부 실험실에서만으로 그것의 적용을 제한한다.
최근, 비색법(colorimetric assays)과 같은, 비 방사성동위원소 RNAP 에세이가 적당한 대안으로 개발되었다. 이것은 열안정 pyrophosphatase의 활성을 측정하는 것이고 이것은 무기 인산을 생성하는 기질로 인 비트로 전사 동안 형성된 pyrophosphate를 사용한다.((a) H. T. Nguyen, Y. Chong, D. K. Oh, Y. S. Heo, P. T. Viet, L. W.Kang, S. J. Jeon, and D. E. Kim, Anal Biochem , 2013, 434, 284-286;(b) B. Lee, S. Y. Park, Y. S. Heo, S. S. Yea, and D. E. Kim, Bull.Korean Chem . Soc ., 2009, 30, 2485-2488; (c) W. Vassiliou, J. B.Epp, B. B. Wang, A. M. Del Vecchio, T. Widlanski, and C. C. Kao,Virology , 2000, 274, 429-437) 그러나, 현재 비색법은 합성된 RNAs가 아니라 무기 인산을 측정하는 간접적인 방법이고, 그것은 심지어 무기인산은 RNA 합성의 부존재에서도 NTPs의 단순한 분해에 의하여도 생성될 수 있다.
[선행 특허문헌]
미국특허공개번호 제20120316074
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 RNA중합효소의 활성측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 RNA중합효소의 활성측정용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인 비트로 전사반응에서 펩티드핵산(PNA) 탐침을 첨가하고, 산화그래핀을 첨가하여 RNA중합효소의 RNA 생성여부를 확인하는 단계를 포함하는 RNA중합효소 활성측정 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩티드핵산(PNA)는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하고,
상기 펩티드핵산(PNA)는 핵산의 말단에 형광물질이 표지된 것이 바람직하며,
상기 형광물질은 FAM(fluorescein amidite), HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxy fluorescein)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 RNA 생성여부 확인은 형광 강도를 측정하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 RNA중합효소는 T7 박테리오파아지 유래 중합효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 펩티드핵산(PNA)탐침 및 산화그래핀을 유효성분으로 포함하는 RNA중합효소 활성측정용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 인 비트로 전사반응에서 펩티드핵산(PNA)탐침을 첨가하고, 산화그래핀을 첨가하고, RNA중합효소 저해제 후보물질을 첨가하여 형광 강도를 측정하고, 후보물질을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 형광이 감소하는 경우에 해당 후보물질을 RNA중합효소 저해제로 판명하는 단계를 포함하는 RNA중합효소 저해제 후보물질을 동정하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 다중 웰 플레이트 내에서 전사반응을 수행하면서, 각 웰에 펩티드핵산(PNA)탐침을 첨가하고, 상기 PNA탐침이 첨가된 웰 내에 산화그래핀을 첨가하고 RNA중합효소 저해제 후보물질을 첨가하여 형광 강도를 측정하고, 후보물질을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 형광이 감소하는 경우에 해당 후보물질을 RNA중합효소 저해제로 판명하는 단계를 포함하는 RNA 중합효소 저해제 고속 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 RNA중합효소의 생성물과 상보적으로 결합하는 펩티드핵산(PNA)을 탐침(probe)으로 하여 단일가닥 PNA탐침과 RNA-PNA복합체의 산화그래핀에 대한 결합력 차이를 이용함으로써 RNA중합효소의 활성측정이 가능함을 입증하였다. 또한 96-웰 플레이트에서 손쉽게 다중측정이 가능함을 보임으로써 RNA중합효소를 표적으로 하는 약물 스크리닝이 가능함을 보였다.
본 발명은 아래와 같은 기술적 특징을 가진다.
형광의 소멸정도를 측정하여 단일가닥 PNA탐침과 RNA-PNA복합체의 산화그래핀에 대한 결합력 차이를 검증하였고,
시험관 내 전사반응에서 PNA탐침을 첨가함으로써 RNA중합효소에 의해 생성되는 RNA와 PNA탐침이 결합되며 이는 효소의 활성에 영향을 주지 않음이 확인되었으며,
PNA탐침이 첨가된 시험관 내 전사 생성물에 산화그래핀을 첨가함으로서 RNA중합효소의 RNA 생성여부 확인이 가능하며 시간에 따른 RNA 생성량 측정이 가능하고,
96-well plate에서 RNA중합효소 저해제의 저해활성을 측정하여 RNA중합효소 저해제 후보군들의 간편한 약물 고속스크리닝이 가능함을 입증하였다.
본 발명에서,본 발명자들은 GO에 이중 가닥 하이브리드 핵산(RNAP에 의하여 합성된 RNA:PNA)에 대한 단일 가닥 펩타이드 핵산의 선호적인 결합에 기한 신규한 RNAP 활성 에세이 방법을 보고한다(도 1). 본 발명에서 사용된 GO는 균질한 단일 층 쉬트이다(도 6).
본 발명에서는, 인 비트로 RNA 합성에 널리 사용된 바이러스 코딩된 T7 RNAP를 모델 RNAP로 선택하였다. T7 RNAP는 99 kDa의 분자량을 가지는 bacteriophage T7 유래 단일 서브유닛 효소로 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 촉매한다. 본 발명자들은 T7 RNAP-특이적인 프로모터를 포함하는 이중 가닥 DNA 주형 및 RNA 산물의 5'-말단 부위에 상보적인 형광 표지된 PNA를 제조하였다 (도 7). PNA는 폴리인산 골격이 아마이드 골격에 의하여 대체된 핵산이다.(P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, and O. Buchardt, Science , 1991, 254, 1497-1500)
도 1에 나타낸 것과 같이, RNA 산물의 부존재에서, 그 PNA 프로브는 형광 신호의 소멸을 야기하면서 단일 가닥 올리고뉴크레오타이드로 유지하고 강하게 GO 상에 흡착한다. 그러나, RNAP에 의하여 합성된 RNA 가닥의 존재에서, 그 PNA 프로브는 RNA 가닥에 어닐링한다. 단일 가닥 PNA가 RNA 산물에 어닐링할 때,
GO에 대한 그것의 친화력은 자유(free) PNA 프로브에서 관찰된 것과 비교하여 형광 신호의 감소된 소멸을 야기하는 이중 가닥 하이브리드 핵산(RNA-PNA 하이브리드) 형성때문에 감소한다. 따라서, RNAP의 RNA 합성 활성은 RNA 합성 반응 혼합물에 GO 첨가 후 형광 강도를 측정하여 정량적으로 에세이될 수 있다.
단일가닥 PNA 프로브는 형광 방출 스펙트럼에 의하여 관찰된 것과 같이 RNA-PNA 하이브리드와 비교하여 GO에 더 선호적으로 결합한다(도 2). PNA 프로브를 GO와 혼합할 때, 535 nm에서 방출된 형광은 기준선까지 완전하게 소멸되는 반면, RNA-PNA 하이브리드와 GO를 가지는 반응 혼합물에서 방출된 형광의 소멸은 크게 감소된다. 고정된 양의 RNA-PNA 하이브리드에 대한 GO의 용량 의존적 소멸 효율은 형광 소멸이 증가하는 GO 농도와 RNA-PNA 하이브리드의 증가된 흡착에 의하여 야기된다는 것을 시사한다. 또한, 형광 강도는 고정된 양의 PNA 및 GO (각각 0.1 μM 및 1 μg/mL)에서 증가하는 RNA 농도에 따라 증가하였고, 그것의 쌍곡선은 K1/2 값 0.49 μM 를 보인다(도 2, 삽도). 과량의 RNA (5 μM) 존재에서, 2/3 이상의 RNA-PNA 하이브리드는 그렇지 않은 경우라면 GO 표면 상에 흡착된 단일 가닥 PNA 프로브의 형광 강도의 회복을 유도하며 GO에 흡착되지 않는 것을 유지한다(도 9).
다음 본 발명자들은 PNA 프로브가 RNAP 반응 동안에 합성된 RNA 가닥에 어닐링하는지를 증명하기 위하여 착수하였다. 도 3a에 나타낸 것과 같이, 젤 전기영동은 시간에 따라 합성된 RNA의 축적을 반영하는 감소된 형광 PNA 밴드 강도 및 증가된 RNA-PNA 밴드 강도를 나타내었다.
RNA 합성 반응 혼합물에 GO의 첨가는 단백질과 소수성 상호작용에 의하여 RNAP 반응 뿐만 아니라 자유 PNA 프로브의 형광을 소멸한다(데이터 도시 안함). 형광 소멸의 양은 GO 농도에 의하여 영향을 받으므로(도 2), 이 시스템에 대한 GO의 최적 농도가 결정되었다. 증가하는 농도의 GO를 RNAP 반응 0분(즉 RNAP 반응 전) 및 60분에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 3 μg/mL의 GO와 0.3 μM의 PNA 프로브를 RNA 산물의 존재 및 부존재에서 형광의 현저한 차이를 가지고 합성된 RNA를 검출하는 최적 농도로 선택하였다(도 3b).
RNAP에 대한 시간 경과 에세이를 GO (3 μg/mL)를 PNA 프로브(0.3 μM)의 존재에서 10분마다 반응 혼합물에 첨가하여 수행하였다. 형광에서 점차적인 시간 의존적 증가는 T7 RNAP에 의한 RNA 합성 동안 관찰되었다.
반면에, 대조군으로 사용된 동일 농도의 소 혈청 알부민(BSA)에서는 그러한 형광 강도의 증가가 없었다(도 4). 본 발명자들은 형광 이미지를 얻어서 96-웰 플레이트에서 RNAP 활성에 대한 형광 변화 측정의 실행가능성을 테스트하였다. 본 발명자들은 형광 변화의 검출은 PNA 프로브와 GO의 농도를 조절하여 조절될 수 있다. 그 PNA 프로브 농도를 0.04 μM로 감소할 때, 약 10 배 적은 양의 GO가 형광 변화를 관찰하는데 필요하다(도 10). 따라서 본 RNA 합성의 검출에 대한 에세이 방법은 RNAP 효소 활성에 의존하는 RNA 프로브와 GO 농도의 적절한 결합으로 다른 RNAP 에 적용될 수 있다.
결국, 본 발명자들은 본 발명의 GO-기반 방법을 RNA 합성의 정량화에 의한 RNAP 저해제 스크리닝을 위한 용이한 에세이 플랫폼으로 적용할 수 있다는 것을 나타내었다. 본 발명자들은 3’-deoxy-5-methyluridine triphosphate (DMUT, 도 5의 구조)를 T7 RNAP에 대한 후보 저해제로 사용하였다. DMUT는 RNA 가닥에 삽입될 수 있는 3′-hydroxyl 그룹이 결손된 리보뉴크레오타이드이고 추가적인 연장(elongation)을 억제한다.(R. C. Durk, K. Singh, C. A. Cornelison, D. K. Rai, K. B. Matzek, M.D. Leslie, E. Schafer, B. Marchand, A. Adedeji, E. Michailidis, C. A.Dorst, J. Moran, C. Pautler, L. L. Rodriguez, M. A. McIntosh, E.Rieder, and S. G. Sarafianos, PLoS One , 2010, 5, e15049)
RNA 합성 반응은 여러 농도의 DMUT의 존재에서 37°C에서 60분간 수행하였다. 예측한 것과 같이, DMUT 없는 RNAP 반응은 최고 형광을 나타내었으나, DMUT 첨가는 용량 의존적인 형태로 형광 강도를 점차적으로 감소시켰다(도 5a).
형광 감소를 표준화하여 얻어진 RNA 합성 저해 곡선의 쌍곡선은 감소하고(도 5a), T7 RNAP에 대하여 DMUT에 대한 0.17 μM 의 최대 억제 반감(half-maximal inhibitory)농도(IC50)를 제공하였다(도 5b).
본 발명은 산화그래핀의 이중가닥 핵산과 단일가닥 핵산에 대한 결합력 차이를 이용하여 RNA중합효소의 RNA합성 활성을 측정할 수 있는 새로운 기술로서 개발 가능하였다. PNA탐침의 염기서열을 조절함으로써 여러 가지 중합효소의 활성을 다중 측정하는 기술로도 응용 가능하다. 또한 RNA중합효소에 대한 여러 약물 후보군들의 효소저해활성을 96-웰 플레이트에서 간편하게 측정할 수 있는 약물 고속스크리닝 기술로도 응용 가능하다. 특정 효소의 활성을 간편하게 측정할 수 있는 저비용 고효율의 기술이다.
결론적으로, 본 발명자들은 형광 신호를 모니터하여 신규한 GO-기반 RNAP 에세이를 개발하였고, 여기서 RNA에 대하여 강한 교잡 특성을 가지는 형광 PNA 프로브를 효소 활성을 간섭하지 아니하는 프로브 RNA 산물로 사용될 수 있다.
본 방법은 기존 보고된 DNA 프로브을 사용한 GO 기반 에세이 또는 통상의 방사성표지된 방법에 비하여 우수하다(도 11 및 12). RNAP 에세이에 대한 본 플랫폼은 통상의 에세이 방법에 비하여 중요한 잇점이 있다.
먼저,GO-기반 에세이는 방사성동위원소 뉴크레오타이드과 같은 고가 시약, 추가적인 소멸제(quencher)들, 및 노동력을 요하는 젤 전기영동 방법과 같은 것이 필요한 통상적인 에세이 방법과 비교하여 비용적 측면이나 시간적 측면에서 효과적이다. 또한, 초기(nascent) RNA 가닥에 상보적인 형광 PNA 프로브의 사용은 RNA 및 PNA의 교잡을 더 강하게 하고, 버퍼 조성물 및 반응 온도와 같은 반응 환경에 독립적으로 그 에세이를 만든다. 결국, 이 에세이 플랫폼은 다용도로 사용가능하고 특정 RNAP에 의하여 합성된 관련있는 RNA 산물에 어닐링하는 특정 PNA 프로브 서열을 변화시켜 다른 RNAP에 적용가능하다. PNA 프로브를 가지는이 용이한 GO-기반 형광 방법은 단 시간에 바이러스 RNAP 중합효소 활성의 정량적인 에세이를 가능하게 하고, 따라서 RNAP-타겟된 약제 스크리닝에 적합하다.
도 1은 GO-기반 RNAP 에세이의 도식적인 설명.
도 2는 PNA 및 RNA-PNA 하이브리드에 대한 GO의 형광 소멸 효율의 비교. 삽도. GO 첨가에 대한 고정된 양의 PNA 프로브를 가지는 RNA 의존적인 형광 변화. 535 nm에서 최대 방출 형광은 여러 농도의 RNA에서 측정.
도 3(a) RNA 합성의 비-변성(denaturing) PAGE (10%) 분석.
FAM-표지된 PNAs를 녹색 형광으로 UV 조사에 의하여 검출하였고, RNA를 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 육안화하였다. (b) 여러 다른 GO 농도로 RNA 합성의 산물의 형광 소멸 분석. 0 분은 효소 없는 반응 혼합물을 나타내고, 60 분은 37℃에서 60 분간 배양 후 반응 산물을 나타냄.
도 4는 RNA 산물의 축적에 의하여 야기된 형광 강도의 시간 의존적인 증가. 상단 패널은 각 시간 지점에서 RNA 합성을 반영하는 96-웰 플레이트에서 형광 이미지를 나타냄. FAM 형광을 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장에서 측정함.
도 5 (a) DMUT(3′-deoxy-5-methyluridine triphosphate)에 의한 T7 RNAP의 저해에 기이한 농도 의존적인 형광 감소. (b) DMUT의 구조 및 0.17 μM의 IC50 값을 가지는 쌍곡선 방정식.
도 6은 GO의 높이 프로파일을 가지는 AFM 이미지. 세 반복된 실험(세 다른 색으로 나타냄)은 한 원자층에 해당하는 1.176 nm의 평균 두께를 제공.
도 7은 올리고뉴크레오타이드의 서열; T7 프로모터를 포함하는 DNA 주형, RNA 산물, 및 PNA 프로브. 인 비트로 전사는 T7 프로모터의 다운스트림에서 발생한 RNA 가닥을 생성. +1는 RNA 합성의 시작 지점을 나타냄.
도 8은 PNA 또는 DNA 프로브와 RNA 교잡의 비-변성 PAGE (15%) 분석. (a) 화학양론적(Stoichiometric)인 양의 RNA 및 프로브(1:1 몰비)를 37 oC에서 20 분간 배양하였다. (b) 증가하는 양의 RNA (젤 상부에 나타낸 몰비)를 37 oC에서 20 분간 배양하여 DNA 프로브와 어닐링함.
PNA 프로브에 대해, 화학양론적 양의 RNA는 완전한 어닐링에 충분한 반면에 DNA 프로브는 어닐링 산물을 생성하기 위해서 초과량의 RNA가 필요하다(자유 DNA 프로브는 어닐링 반응에서 여전히 유지).
도 9 (a) GO-MSN-복합체화된 RNA-PNA 하이브리드로부터 자유(free) RNA-PNA 하이브리드의 분획화를 위한 실험과정. (b) 여러 다른 농도의 RNA를 가지는 각 분획의 형광강도. 상등액은 자유(free) RNA-PNA 하이브리드를 포함하고 펠릿은 GO-MSN와 RNA-PNA의 복합체를 포함. [RNA+PNA] + GO-MSN는 분획화 전에 전체 형광을 나타냄.
도 10(a) 0.4 μM PNA 프로브의 존재에서 T7 RNAP에 의한 RNA 합성의 전기영동 분석. (b) 증가하는 반응 시간 시점에서 인 비트로 전사 동안 RNA-PNA 어닐링 산물들의 검출을 위한 형광 이미지를 나타냄. 여러 다른 농도의 GO를 PNA 프로브(0.04 μM)를 포함한 반응 혼합물에 첨가함.
도 11은 (a) 10-mer DNA 프로브를 사용한 RNA 합성의 비-변성 PAGE (15%) 분석. FAM-표지된 DNA 프로브를 녹색 형광으로 UV 조사에 의하여 검출하였고, RNA를 ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 육안화. (b) GO-기반된 polymerase 에세이 시스템에서 PNA 및 DNA 프로브의 비교. 형광 증가를 시간 의존적인 형태로 PNA 프로브로 관찰한 반면 DNA 프로브는 형광 변화가 거의 없었다.
도 12는 [알파-32P]UTP를 사용한 RNA 합성의 검출을 위한 동위원소표지된 방법. 비표지된 뉴크레오타이드를 두 다른 조건; (a) 2 mM NTPs. (b) 2 mM ATP, GTP, CTP, 및 0.2 mM UTP에서 사용하였다.
2 mM NTPs의 경우에, 대부분의 동위원소 표지된 UTP가 약한 산물 신호를 가지고 RNA로 대부분 삽입되지 않았다(패널 a에 나타냄). 반면, 낮은 농도의 비표지된 UTP는 증가된 RNA 밴드 방사성에 의하여 관찰된 RNA 합성에 대한 더 좋은 신호를 제공한다(패널 b에 나타냄). 따라서 낮은 UTP 농도는 통상적인 동위원소 표지된 방법에 필요하고 그것은 RNA 합성에 대한 자연스런 조건(즉 모든 뉴크레오타이드가 동일 농도)과는 거리가 먼 반응 조건을 만든다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명의 T7 RNA polymerase는 Epicentre Technologies Corporation(Madison, WI, USA)으로부터 구입하였다. 94-mer RNA (Fig. S1에 나타낸 서열)를 T7 RNA polymerase (0.5 mM)를 사용하여 2 mM NTPs (Genenmed로부터 구입, Seoul, Korea) 및 DNA 주형(20 ng/mL, Fig. S1에 나타냄)으로 전사 버퍼[40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM spermidine, 10 mM dithiothreitol (DTT)]에서 인 비트로 전사에 의하여 합성하였다. 6-FAM(fluorescein amidite)-표지된 10-mer PNA 및 DNA 프로브들(Fig. S1에 나타낸 서열)을 사용자지정 합성하고 각각 PANAGENE(Daejeon, Korea), 및 Cosmogenetech(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. Hummer 방법(W. S. Hummers, and R. E. Offeman, J. Am. Chem. Soc., 1958, 80, 1339) 에 의하여 제조된 Graphene oxide (GO)는 벤더(cat#. SKU-HCGO-W-175, Graphene Supermarket® Graphene Laboratories, Inc., Ronkonkoma, NY, USA)로부터 구입하였고, GO-코팅된 다공성 실리카 나노입자(GO-MSN)는 전에 기재된 것과 같이 합성하였다(J. S. Park, H. K. Na, D. H. Min, and D. E. Kim, Analyst, 2013, 138, 1745-1749).
실시예 1: 원자간 력 현미경(AFM) 측정
AFM 이미지를 NanoScope V 콘트롤러(Model: Bruker Multimode 8, Bruker AXS Inc., Madison, WI, USA)를 구비한 원자간 력 현미경을 사용하여 상온에서 스프링 상수 40 N/m 및 팁 반경 = 8 nm를 가지는 탭핑 모드에서 상온에서 수집하였다. 10 ㎕의 graphene oxide 용액(10 ㎍/mL)을 사용한 후 piranha 세척 방법에 의하여 세척된 신선하게 세척된 실리콘 웨이퍼 상에 위치시켰다. 그 샘플을 상온에서 건조하였다. 스캐닝 속도는 1.0 Hz의 주사선 주파수이었고, 오리지널 이미지는 256 x 256 픽셀의 해상도에서 샘플링되었다.
실시예 2: 전기영동 이동 쉬프트 에세이
FAM-표지된 PNA (1 μM) 또는 DNA (1 μM) 프로브를 전사 버퍼에서 RNA (1 μM)와 37oC에서 20 분간 배양하여 교잡하였다. 동일한 실험을 DNA (1 μM)를 여러 다른 양의 RNA (1, 2, 및 3 μM)와 혼합하여 수행하였다. 그 다음 혼합물을 37oC에서 20 분간 전사버퍼에서 배양하였다. 그 혼합물을 15% 비-변성 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 분석하였다. 프로브들의 형광 이미지들(녹색)을 UV 조사에 의하여 얻고, RNA를 ethidium bromide (오렌지 색)로 염색하고, UV 조사를 수반하여 동정하였다.
실시예 3: GO-MSN로부터 RNA-PNA 하이브리드의 분획화
1 μM의 PNA를 전사 버퍼에서 여러 다른 농도의 RNA (0, 5, 및 10 μM)와 37oC에서 20 분간 배양하여 교잡하였다.5μL의 RNA-PNA 하이브리드 반응 용액을 5 μL of 1 mg/mL GO-MSN, 10 μL의 5x 전사 버퍼, 및 30 μL의 증류수를 포함한 혼합물에 첨가하였다. 상온에서 10분간 추가 배양한 후, 그 혼합물을 원심분리하고(12,470 g에서 10 분), 그 프리(free) RNA-PNA 하이브리드를 그 상등액을 분획화하여 얻었다. GO-MSN 표면 상에 흡착된 RNA-PNA 하이브리드를 포함한 펠릿을 증류수로 재부유하고, 각 분획(펠릿과 상등액)의 형광 강도를 485 nm의 여기 파장과 535 nm의 방출 파장에서 다중표지 플레이트 리더(VICTOR X3; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.
실시예 4: RNA-PNA 하이브리드 및 PNA 프로브의 형광 방출 측정
RNA (1 μM) 및 PNA (1 μM)를 전사 버퍼에서 37oC에서 20 분 배양하여 교잡하였다. 50 μL의 RNA-PNA 하이브리드 반응 혼합물을 1, 5, 및 10 μL의 of 50 μg/mL GO-MSN, 100 μL의 5x 전사 버퍼를 포함한 용액에 첨가하고 증류수로 전체 부피 500 μL로 맞추었다. 상온에서 10분간 추가 배양 후, 그 혼합물의 방출 스펙트럼을 분광형광 광도계(모델 RF-5301PC; Shimadzu Inc., Kyoto, Japan)을 사용하여 500-650 nm의 파장 범위에서 485 nm에서 여기 상에서 측정하였다.
멀티-웰 플레이트 실험을 위하여, PNA (1 μM)를 전사 버퍼에서 여러 농도의 RNA (0~20 μM)와 37oC에서 20 분 배양하여 교잡하였다. 5 μL의 RNA-PNA 하이브리드 반응 용액을 1 μL의 50 μg/mL GO-MSN, 10 μL의 5x 전사 버퍼 및 34 μL의 증류수를 포함한 용액과 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 그 혼합물을 상온에서 10분간 추가 배양 후, FAM 형광을 멀티레이블 플레이트 리더(VICTOR X3)로 측정하였다. 그 여기 파장은 485 nm, 방출 파장은 535 nm이었다.
실시예 5: T7 RNAP에 의한 RNA 합성의 분석
In vitro RNA 합성을 2 mM NTPs, 3 μM PNA, 및 DNA 주형(20 ng/mL, shown in Fig. S1)를 포함하는 전사 버퍼에서 수행하였다. T7 RNA polymerase (1 U/μL, 14 nM에 해당)를 RNA 합성에 사용하였다. 그 반응 혼합물을 37oC에서 1 시간 배양하였다. 각 RNA 산물을 정지 버퍼[50 mM Tris (pH 6.8), 0.2% (w/v) SDS, 1 mM EDTA, 10% (w/v) glycerol]를 여러 시간 지점에서 첨가하여 정지하였다. 각 반응 산물을 10% 비-변성 PAGE로 분석하였다. 프로브 PNA의 형광 이미지(녹색)를 UV 조사로 얻었고; RNA (오렌지 색) 및 RNA-PNA 하이브리드(황색)을 ethidium bromide (오렌지 색)으로 염색하여 동정하였다.
여러 다른 농도의 GO에서 형광 소멸 분석을 위하여, 그 인 비트로 전사 혼합물을 37oC에서 60분간 배양하고, RNAP 첨가 전에 0분 대조군을 제조하였다. 그 반응 혼합물(5 μL)을 96-웰 플레이트에서 최종 부피 50 μL로 전사버퍼에서 여러 농도로 GO 용액에 직접적으로 첨가하였다. 상온에서 10분간 추가 배양 후, FAM 형광을 멀티레이블 플레이트 리더(VICTOR X3)로 측정하였다. 그 여기 파장은 485 nm, 방출 파장은 535 nm이었다.
실시예 6: 96-웰 플레이트에서 RNA 합성의 형광 분석
T7 RNA polymerase (1 U/μL, 14 nM에 해당)를 상기 기재된 것과 같이 인 비트로 RNA 합성에 사용하였고, 14 nM BSA(bovine serum albumin)를 음성 대조군으로 사용하였다. 10분 마다, 5 μL의 각 반응 산물을 96-웰 플레이트에서 3 μL의 50 μg/mL GO (3 μg/mL의 최종 농도), 10 μL의 전사 버퍼, 및 32 μL의 증류수를 포함하는 용액에 첨가하였다. 상온에서 10분간 추가 배양 후, FAM 형광을 멀티레이블 플레이트 리더(VICTOR X3)로 측정하였다.블랙 96-웰 플레이트(SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea)에서 RNA 합성 반응의 형광 이미지를 형광 이미지 시스템(IVIS-Lumina II; Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA, USA)을 사용하여 얻었다.
RNAP 저해 에세이를 위하여, 여러 농도의 3'-deoxy-5-methyluridine triphosphate (DMUT)를 1 U/μL T7 RNAP를 가지는 RNA 합성 반응 혼합물에 첨가하였다. 37oC에서 60 분 배양 후, 5 μL의 각 반응 혼합물을 96웰 플레이트에서 3 μL of 50 μg/mL GO (3 μg/mL의 최종 농도), 10 μL의 전사 버퍼 및 32 μL의 증류수를 포함한 용액을 첨가하여 정지시켰다. 형광 강도를 멀티레이블 플레이트 리더(VICTOR X3)를 사용하여 여기 파장 485 및 방출 파장 535 nm에서 측정하였다. 블랙 96-웰 플레이트에서 형광 이미지를 형광 이미지 시스템(IVIS-Lumina II; Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA, USA)을 사용하여 얻었다.
실시예 7:GO-기반 중합효소 에세이 시스템에서 프로브로 DNA 및 PNA의 비교
FAM-표지된 10-mer DNA 프로브(3 μM)를 2 mM NTPs, 및 DNA 주형(20 ng/μL)을 포함하는 전사 버퍼에서 혼합하였다. T7 RNA polymerase (1 U/μL)를 RNA 합성을 위하여 그 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 37 oC에서 1시간 배양하였다. RNA 합성 반응을 여러 시간 지점에서 중지 버퍼를 첨가하여 중지시켰다. 각 반응 산물을 15% 비-변성 PAGE로 분석하였다.
GO-기반된 형광 시스템에서 RNA 합성에 대한 각 DNA 및 PNA 프로브의 비교를 위하여, 인 비트로 RNA 합성을 2 mM NTPs, 및 DNA 주형(20 ng/μL)을 포함하는 전사 버퍼에서 수행하였다. T7 RNA polymerase (1 U/μL)를 RNA 합성을 위하여 사용하였고, 그 반응 혼합물(50 μL)을 37oC에서 배양하였다. 10 분 마다, 반응 혼합물을 각 프로브(PNA 또는 DNA, 최종 농도 0.3 μM)를 포함하는 용액과 혼합하였다. 37 oC에서 10분간 배양 후, 5 μL의 각 어닐링된 산물을 1 μL의 50 μg/mL GO(최종 농도 1 μg/mL), 10 μL의 5 전사 버퍼 및 34 μL의 증류수를 포함한 용액에 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 그 혼합물을 상온에서 10분간 추가 배양 후, FAM 형광을 멀티레이블 플레이트 리더(VICTOR X3)로 측정하였다. 블랙 96-웰 플레이트에서 RNA 합성의 형광 이미지를 형광 이미지 시스템(IVIS-Lumina II; Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA, USA)을 사용하여 얻었다.
실시예 8: RNA 중합효소 에세이를 위한 동위원소표지 방법
인 비트로 전사를 DNA 주형(20 ng/μL) 및 T7 RNA polymerase (1 U/μL)를 포함한 전사 버퍼에서 수행하였다. 동위원소표지된 뉴크레오타이드[알파-32P]UTP (3,000 Ci/mmol, GE Healthcare)를 두 다른 UTP 농도; 1) 2 mM의 네 뉴크레오타이드; 2) 2 mM의 ATP, GTP, CTP 및 0.2 mM UTP를 포함하는 뉴크레오타이드 혼합물에 스파이크하였다(최종 농도 2 nM). 그 반응 혼합물을 꺼내서 37 oC에서 1시간 까지 여러 다른 시간에 중지 버퍼를 혼합하였다. 그 산물을 10% (w/v) 변성 PAGE로 해상하고, 그 산물 밴드들을 육안화하고 Cyclone PhosphorImager (Packard Instruments, Meriden, CT) 상에서 정량화하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A novel graphene oxide-based fluorometric assay for RNA synthesis <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 1 tcgtcctccc 10

Claims (12)

  1. 인 비트로 전사반응에서 펩티드핵산(PNA) 탐침을 첨가하고, 산화그래핀을 첨가하여 RNA중합효소의 RNA 생성여부를 확인하는 단계를 포함하는 RNA중합효소 활성측정 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드핵산(PNA)는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드핵산(PNA)는 핵산의 말단에 형광물질이 표지된 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 형광물질은 FAM(carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxy fluorescein)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 RNA 생성여부 확인은 형광 강도를 측정하여 수행하는 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 RNA중합효소는 T7 박테리오파아지 유래 중합효소인 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정 방법.
  7. 펩티드핵산(PNA)탐침 및 산화그래핀을 유효성분으로 포함하는 RNA중합효소 활성측정용 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 펩티드핵산(PNA)는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정용 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 펩티드핵산(PNA)는 핵산의 말단에 형광물질이 표지된 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정용 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 형광물질은 FAM(fluorescein amidite), HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxy fluorescein)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것인 것을 특징으로 하는 RNA중합효소 활성측정용 조성물.
  11. 인 비트로 전사반응에서 펩티드핵산(PNA)탐침을 첨가하고, 산화그래핀을 첨가하고, RNA중합효소 저해제 후보물질을 첨가하여 형광 강도를 측정하고, 후보물질을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 형광이 감소하는 경우에 해당 후보물질을 RNA중합효소 저해제로 판명하는 단계를 포함하는 RNA중합효소 저해제 후보물질을 동정하는 방법.
  12. 다중 웰 플레이트 내에서 전사반응을 수행하면서, 각 웰에 펩티드핵산(PNA)탐침을 첨가하고, 상기 PNA탐침이 첨가된 웰 내에 산화그래핀을 첨가하고 RNA중합효소 저해제 후보물질을 첨가하여 형광 강도를 측정하고, 후보물질을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 형광이 감소하는 경우에 해당 후보물질을 RNA중합효소 저해제로 판명하는 단계를 포함하는 RNA 중합효소 저해제 고속 스크리닝 방법.
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