KR101496671B1

KR101496671B1 - 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법

Info

Publication number: KR101496671B1
Application number: KR1020130045536A
Authority: KR
Inventors: 민달희; 이지언; 유수윤
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2015-03-02
Also published as: KR20130124196A; US10351904B2; US20150080251A1; WO2013162276A1

Abstract

산화그래핀에 흡착된, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브를 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법{COMPOSITION FOR DETECTING NUCLEIC ACID, AND DETECTING METHOD OF NUCLEIC ACID USING THE SAME}

본원은 산화그래핀에 흡착된, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브를 포함하는 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.

그래핀은 탄소원자가 2 차원 격자 내로 채워진 평면 단일층 구조를 가지며, 이것은 모든 다른 차원구조를 가지는 흑연의 기본 구조이다. 즉, 상기 그래핀은 0차원 구조인 풀러렌, 1 차원 구조인 탄소나노튜브, 또는 3 차원 구조로 적층된 흑연의 기본 구조가 될 수 있다. 최근 많은 연구에서 그래핀이 가지는 육각형의 결정구조, 두 개의 상호침투하는 삼각 형태의 하위 격자 구조, 및 하나의 원자 크기에 해당하는 두께 등에 의하여 그래핀이 특이한 물리적 특성, 예를 들면, 제로 밴드갭을 보이는 점을 주목하고 있다. 또한 그래핀은 특이한 전자 전달 특성을 갖는데, 이로 인하여 그래핀은 종래에는 관찰되지 않았던 독특한 현상을 보여준다. 예를 들면, 반정수 양자 홀 효과 및 바이폴라 초전류 트랜지스터 효과 등이 그 예이며, 이 또한 상기 그래핀의 특유한 구조에 기인하는 것으로 여겨진다. 이러한 그래핀의 산화된 형태인 산화그래핀(graphene oxide, GO)은 형광 공명 에너지 전달(FRET, Fluorescence resonance energy transfer)현상을 통해 유기형광염료의 형광 신호를 소광시킬 수 있다.

특정한 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 검출하는 방법은 과학연구 분야에서 기본적으로 중요한 기술이다. 특정한 핵산 또는 단백질을 검출하고 동정할 수 있게 됨으로써, 연구자들은 어떤 유전적, 생물학적 표지가 사람의 건강상태를 나타내는 지표가 되는지를 판정할 수 있게 되었다. 이러한 핵산과 단백질을 검출하는 방법을 이용하면 시료에 존재하는 병원체 유전자의 변형, 또는 특정 유전자의 발현 등을 발견할 수 있다. 또한, 20 여개의 핵산으로 구성된, 단백질을 코딩하지 않는 작은 RNA 분자인 miRNA(microRNA)는 몸 속에 존재하는 중요한 생분자 물질 중 하나로서, 세포의 증식 또는 분화를 포함한 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.

PNA(peptide nucleic acid)는 인공적으로 합성된 핵산으로서, 올리고핵산의 주 사슬이 인산이에스테르 결합이 아닌 펩티드 결합으로 이루어져 있어 전기적으로 중성을 띠고 강한 결합력을 가지며 핵산분해효소 및 단백질분해효소에 대하여 매우 안정하므로 프로브로서 사용되는 경우 안정성이 매우 높다.

최근 생물학 분야에서 miRNA를 연구하기 위하여 분자생물학적 방법 또는 생화학적 방법 등이 널리 쓰이고 있다. 가장 잘 알려진 기존의 연구 방법에는 마이크로어레이 또는 비-어레이 기술인 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있으며, 이 외에 많은 방법들의 개발이 이루어지고 있다. 예를 들어, "세포 내 타겟 분자의 탐지 및 질환 치료를 위한 바이오 이미징 프로브 (대한민국 공개특허 제 2011-0120749호)" 등의 관련 연구가 있었다. 그러나, 이러한 방법들은 다중 감지가 불가능하고 실시간 감지가 용이하지 않을 뿐만 아니라, 감지에 드는 비용이 높다는 단점이 있다.

이에, 본원은 산화그래핀의 특성을 이용하여 목적하는 핵산의 다중 감지 및 실시간 감지가 가능한, 산화그래핀에 흡착된, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브를 포함하는 핵산 검출용 조성물, 및 이를 이용한 핵산 검출 방법을 제공한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 산화그래핀에 흡착된, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브를 포함하며, 표적 물질인 핵산과 상기 PNA 프로브가 결합하면 상기 PNA 프로브가 상기 산화그래핀으로부터 분리되어 상기 형광물질로부터 형광이 발광되는 것인, 핵산 검출용 조성물을 제공할 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 산화그래핀에 흡착된, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브를 포함하는 핵산 검출용 조성물과 표적 물질인 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 단계; 및, 상기 혼합에 의하여 상기 PNA 프로브가 상기 표적 물질인 핵산과 결합함으로써 상기 PNA 프로브가 상기 산화그래핀으로부터 분리되어 상기 형광물질로부터 발광되는 형광을 측정하는 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법을 제공할 수 있다.

본원에 의한 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법을 이용하여, 시료 또는 세포 내의 표적 핵산의 존재 여부 및 상기 표적 핵산의 발현 양상을 실시간으로 관찰할 수 있고, 복수의 표적 핵산의 다중 감지가 가능하다. 또한 고속 대량 스크리닝(high-throughput screening, HTS)을 진행하여 특정 miRNA의 발현을 양성 또는 음성적으로 조절할 수 있는 저분자 물질 및 약물 후보를 도출할 수 있고, 이러한 과정에서 도출된 물질의 작용 기작 및 miRNA 발현 조절에 관한 영향을 세포 수준에서 연구할 수 있다. 추가적으로, 살아있는 세포 내의 표적 핵산의 발현 양상의 관찰이 가능하므로 보다 신뢰할 만한 저분자 물질 및 약물 후보를 도출할 수 있다.

본원에 의한 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법은, 저렴하고 다량 확보가 가능하며 상온에서 안정적으로 보관할 수 있는 재료인 산화그래핀을 사용하므로 비용적인 측면에서도 효과적이다. 프로브로서 사용되는 핵산이 분해효소에 대하여 안정적인 PNA이므로 검출반응이 안정적으로 일어나고, 형광을 기반으로 하므로 신호를 정량적으로 읽을 수 있으며, 기존의 형광리더기 또는 형광현미경 등에 바로 적용할 수 있다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 핵산 검출 방법의 모식도이다.
도 2a는 본원의 일 실시예에 따른 산화그래핀의 자외선-가시광선 분광스펙트럼 분석 결과이다.
도 2b는 본원의 일 실시예에 따른 산화그래핀의 화학적 구조 분석 결과이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 PNA 프로브의 산화그래핀에의 흡착 및 이에 따른 형광 소광 여부를 나타낸 그래프이다 .
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 PNA 프로브의 소광현상을 DNA 프로브의 소광현상과 비교한 그래프이다.
도 5a는 본원의 일 실시예에 따른 PNA 프로브의 miRNA에 대한 민감도를 측정한 그래프이다.
도 5b는 본원의 일 실시예에 따른 PNA 프로브의 miRNA에 대한 민감도를 측정한 그래프이다.
도 5c는 본원의 일 실시예에 따른 PNA 프로브의 miRNA에 대한 민감도를 측정한 그래프이다.
도 6a는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물에 의한 단일 또는 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 6b는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물에 의한 단일 또는 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 6c는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물에 의한 단일 또는 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 7a는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 단일 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 7b는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 단일 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 7c는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 단일 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 7d는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 단일 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 7e는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 단일 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 8a는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 8b는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 8c는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 8d는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 8e는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 세포 내 다중 표적 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 9a는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 doxycycline 유도 발현된 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 9b는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 doxycycline 유도 발현된 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 9c는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 doxycycline 유도 발현된 miRNA 검출 분석 결과이다.
도 9d는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 doxycycline 유도 발현된 miRNA 검출 분석 결과를 doxycycline 처리 시간별로 비교한 것이다.
도 9e는 본원의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물의 doxycycline 유도 발현된 miRNA 검출 분석 결과를 doxycycline 처리 시간별로 비교한 것이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 PNA 프로브의 염기서열 특이적 결합 및 표적 핵산 농도 의존적 결합에 대한 것이다.
도 11a는 본원의 일 실시예에 따른 산화그래핀에 흡착된 PNA 프로브 특이적인 세포내 도입에 관한 실험 결과이다.
도 11b는 본원의 일 실시예에 따른 산화그래핀에 흡착된 PNA 프로브 특이적인 세포내 도입에 관한 실험 결과이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로서 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~하는 단계" 또는 "~의 단계" 는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

나노크기의 산화그래핀(nanosize graphene oxide, nGO)은 세포에 유해하지 않아 생체적합성을 가지고, 화학적 기능화 과정을 통해 세포에 도입할 수 있으며, 시그널 감지에 적합할 수 있다. 산화그래핀의 표면의 소수성 부위에는 다양한 방향족 분자와 바이오 물질들이 흡착될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 특히 올리고핵산과 같은 경우 단일 가닥으로 존재할 때에는 상기 올리고핵산의 노출된 소수성 염기부분이 pi-pi 상호작용으로 산화그래핀의 표면에 흡착될 수 있으나, 상기 올리고핵산이 이중 가닥으로 존재할 때에는 상기 소수성 염기 부분이 두 가닥의 올리고핵산 사이의 수소 결합으로 인해 외부에 노출되지 않으므로 산화그래핀의 표면에 흡착이 되지 않는다. 예를 들어, 세포 내에 존재하는 생분자물질들 중 특정 서열을 가진 DNA, RNA, 또는 miRNA에 상보적인 서열을 포함하는 단일 가닥의 핵산 프로브를 제작하여 산화그래핀에 흡착시켜 세포에 처리하여 주었을 때, 상기 핵산 프로브가 세포 내에서 표적 물질인 DNA, RNA, 또는 miRNA와 결합을 이루게 되면 이중 가닥을 이루므로 상기 핵산 프로브는 상기 산화그래핀의 표면과의 흡착을 유지하지 못하고 떨어지게 된다.

본원의 일 구현예에 있어서 산화그래핀에 흡착될 프로브 올리고핵산으로는 PNA(peptide nucleic acid)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA는 단일 가닥 PNA이므로 산화그래핀의 표면에의 흡착이 용이한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. PNA는 올리고핵산의 주사슬이 펩티드 결합으로 구성되어 있어 전기적으로 중성을 띠고 있으므로 소수성인 산화그래핀에의 흡착성이 전기적으로 음성을 띠는 DNA 또는 RNA에 비하여 우수하다. 또한 PNA-RNA 결합은 DNA-RNA, 또는 RNA-RNA 결합보다 강하며 Tm 값이 염기당 약 1℃씩 높다. 따라서 표적물질로서의 핵산과의 결합력은 DNA 또는 RNA 프로브에 비하여 PNA 프로브가 우수하다. 또한, PNA는 체내에 존재하는 핵산분해효소(nuclease) 또는 단백질분해효소(protease)에 대하여 매우 안정하기 때문에 세포 내로 PNA 프로브가 도입되었을 때 PNA 프로브의 소실 가능성이 DNA, RNA, 또는 단백질 프로브에 비하여 매우 낮다. 추가적으로, PNA는 구조적으로 강한 공유결합으로 이루어져 있이 때문에 다양한 pH 범위 및 온도 조건에서 안정성을 유지할 수 있어 프로브로 사용할 올리고핵산으로서 다른 종류의 핵산에 비하여 우수한 조건을 가진다.

본원의 일 구현예에 사용되는 산화그래핀과 유기형광염료 사이에는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET)현상이 일어난다. 즉, 그래핀이 산화된 형태인 산화그래핀은 형광 공명 에너지 전달 현상을 통해 근처에 있는 형광물질의 형광신호를 소광시킬 수 있다. 이에 따라, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브가 산화그래핀에 흡착되면 상기 형광물질의 형광은 소광된다. 그러나, 상기 PNA 프로브가 표적 물질인 DNA, RNA, 또는 miRNA와 혼성화하여 이중 가닥을 이루면 상기 산화그래핀에 흡착되지 못하고 유리되므로, 상기 PNA 프로브에 함유된 상기 형광물질의 형광이 형광 공명 에너지 전달 현상에서 벗어나 발광된다. 따라서 이러한 과정에서 시료의 형광 발광을 측정함으로써 시료 내에 있는 상기 표적 물질의 실시간 검출 및 정량이 이루어질 수 있다.

예를 들어, 상기 표적 물질인 핵산과 상기 PNA 프로브의 결합은 상기 표적 물질인 핵산의 염기서열과 상기 PNA 프로브의 염기서열이 서로 상보적이어서 혼성화되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브의 염기서열은 상기 표적 물질인 핵산의 염기서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 갖는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 표적 물질인 핵산의 길이와 동일한 길이를 가지며, 상기 표적 물질인 핵산의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 갖는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 물질인 핵산의 길이보다 짧은 길이를 가질 수 있으며, 상기 표적 물질인 핵산의 일부와 상보적인 서열을 갖는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 물질인 핵산의 길이보다 긴 길이를 가질 수 있으며, 상기 표적 물질인 핵산의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 갖는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브의 염기서열과 상기 표적물질인 핵산의 염기서열 일부 또는 전부와의 상보성은 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 물질인 핵산이 miRNA인 경우, 상기 miRNA에 상보적인 서열을 가지는 PNA 프로브는 약 22 개의 염기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 서열이 정해져 상업적으로 판매되는 것, 구매자가 디자인한 서열로 제조되어 판매되는 것, 또는 비상업적으로 제조된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 파나진 사로부터 구입한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 성숙한 miRNA에 결합하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 miRNA에 결합하여 RNA interference를 유도하여 상기 miRNA의 발현 또는 작용을 억제하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 상기 PNA 프로브에 함유된 상기 형광물질은 상기 PNA 프로브의 한쪽 말단에 연결되어 있거나, 또는 상기 PNA 프로브 서열 내부에 연결되어 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브에 함유된 상기 형광물질은 상기 PNA 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 공유결합으로 연결되어 있는 것을 포함할 수 있으며, 상기 공유결합은 상기 PNA 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된 링커와 상기 형광물질 사이의 공유결합인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 공유결합은 상기 링커의 아미노기와 상기 형광물질 사이의 공유결합인 것을 포함할 수 있으며, 상기 링커는 에틸렌 글리콜 링커인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 파나진 사의 O-링커 또는 AEEA 링커인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 AEEA 링커는 약 1.3 nm의 길이를 가지고 약 9 개의 원자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 상기 PNA 프로브에 함유된 상기 형광물질은 살아있는 세포에 적용하여 형광을 측정가능한 형광물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 형광물질은, 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산, Cy5, Cy3, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 형광물질을 함유하는 상기 PNA 프로브가 상기 산화그래핀에 흡착되어 시료에 도입되면, 상기 시료 내에 표적 물질인 DNA 또는 RNA가 존재할 경우 이에 상보적인 서열을 가진 상기 PNA 프로브가 상기 DNA 또는 RNA와 혼성화됨으로써 이중 가닥 핵산이 되어 상기 산화그래핀에서 유리되고, 이에 따라 상기 PNA 프로브에 함유된 상기 형광물질이 형광 공명 에너지 전달 현상에서 벗어나 발광하게 되므로 그 형광을 측정하여 상기 시료 내에 존재하는 상기 DNA 또는 RNA를 검출할 수 있는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 DNA는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 단백질을 코딩하지 않는 DNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 RNA는 mRNA(messenger RNA), tRNA(transfer RNA), rRNA(ribosomal RNA), sRNA(small RNA), snRNA(small nuclear RNA), scRNA(small cytoplasmic RNA), siRNA(small interfering RNA), 또는 miRNA(microRNA)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 RNA는 단백질로 번역되는 RNA, 단백질로 번역되지 않는 RNA, 5'-비번역 부위, 3'-비번역 부위, 또는 조절 RNA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 RNA는 miRNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA는 생체 내 생물학적 기능에 관여하는 것일 수 있으며, 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 대장암, 골암, 피부암, 혈액암, 당뇨, 또는 알츠하이머 등의 각종 질병의 진단, 치료, 또는 예후 판단에서 중요한 바이오 마커로 사용되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA는 줄기세포에서 계통 특이적 분화(lineage specific differentiation)에 관여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 miRNA는 miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA-155, 또는 miRNA-159를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-29a, 상기 miRNA-125b, 또는 상기 miRNA-155는 인간 세포에서 발현되는 miRNA인 것일 수 있으며, 상기 miRNA-159는 식물 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-29a, 및 상기 miRNA-125b는 유방암 세포에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA-21, 상기 miRNA-29a, 상기 miRNA-125b, 또는 상기 miRNA-155는 모델질병 세포주인 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-435, 또는 MCF-7; 또는 기타 암세포 등에서 발현되는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 PNA 프로브는 약 30 염기 이하의 길이를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 약 30 염기 이하, 약 5 염기 내지 약 30 염기, 약 10 염기 내지 약 30 염기, 약 15 염기 내지 약 30 염기, 약 20 염기 내지 약 30 염기, 약 25 염기 내지 약 30 염기, 약 5 염 내지 약 25 염기, 약 5 염기 내지 약 20 염기, 약 5 염기 내지 약 15 염기, 약 5 염기 내지 약 10 염기, 약 20 염기 내지 약 25 염기의 길이를 가지는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 물질인 핵산이 miRNA인 경우, 상기 PNA 프로브는 약 22 개의 염기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단일층의 시트 형태인 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태가 아닌 산화그래핀에 비하여 동일한 질량에서 표면적이 넓어 적은 양으로도 많은 핵산 프로브를 흡착할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 산화그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 산화그래핀은 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 700 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 1 μm, 약 100 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 300 nm 내지 약 1 μm, 약 400 nm 내지 약 1 μm, 약 500 nm 내지 약 1 μm, 약 700 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 400 nm 이하인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 산화그래핀은 작은 크기 때문에 표면에 흡착된 상기 PNA 프로브와 함께 세포막을 용이하게 통과하여 세포 내로 들어갈 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 표적 물질인 핵산은 세포 내에 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 기질에 고정되어 배양되고 있는 세포, 배지 내에 부유하며 배양되고 있는 세포, 생체 내의 세포, 생체에서 분리된 세포, 또는 분석을 위해 처리된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 포함할 수 있으며, 고정액에 의해 고정된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 형광물질의 발광은 실시간으로 측정되어 상기 표적물질인 핵산이 실시간으로 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 형광물질의 발광은 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 형광이미지 분석, 또는 실시간 PCR 등의 방법으로 측정되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 검출은 고정된 세포, 고정되지 않은 세포, 살아있는 세포, 죽은 세포, 또는 검출을 위해 처리된 세포에서도 가능한 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 이상의 PNA 프로브를 포함하고 상기 표적 물질인 핵산은 상기 한 종류 이상의 PNA 프로브 각각과 결합하는 한 종류 이상의 핵산을 포함함으로써, 서로 상이한 핵산의 다중 검출이 가능한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 서로 상이한 형광물질은 서로 상이한 색상을 띠는 형광물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 또는 두 종류 이상의 프로브이고, 상기 표적 물질인 핵산은 상기 각각의 PNA 프로브와 상보적 서열을 가지는 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산인 경우, 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적 서열을 가지는 PNA 프로브만이 이중 가닥을 이루어 산화그래핀으로부터 유리되어 형광을 발광하게 된다. 이에 따라 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적인 PNA 프로브에 함유된 형광물질만이 형광을 발하게 되고, 이에 따라 발광되는 형광의 색상을 통하여 상기 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산 중 어떤 핵산이 상기 시료 내에 존재하는지 여부를 검출할 수 있게 된다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 핵산 검출 방법의 모식도이다.

도 1을 참조하면, 단일 가닥 PNA 프로브는 형광물질을 함유하여 표지될 수 있으며, 상기 단일 가닥 PNA 프로브는 노출된 염기와 산화그래핀의 소수성 표면 간의 pi-pi결합에 의하여 상기 산화그래핀에 흡착될 수 있다.

이 때 상기 산화그래핀은 형광 공명 에너지 전달 현상을 일으켜 상기 PNA 프로브에 함유된 상기 형광물질의 형광을 소광시킬 수 있다. 따라서, 상기 산화그래핀에 흡착되어 있는 상태의 상기 PNA 프로브는 형광을 발광하지 않는다. 상기 PNA 프로브가 흡착된 상기 산화그래핀이 시료에 적용될 경우, 상기 시료 내에 있는 상기 표적 물질인 핵산과 단일 가닥인 PNA 프로브가 혼성화될 수 있다.

특히 상기 시료가 세포인 경우, 상기 산화그래핀의 작은 크기와 상기 산화그래핀 표면의 소수성 부위 때문에, 상기 PNA 프로브가 흡착된 상기 산화그래핀은 상기 세포의 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어가 상기 표적 물질인 핵산에 접근할 수 있고, 이에 따라 상기 산화그래핀의 표면에 부착된 상기 PNA 프로브는 상기 표적 물질인 핵산과 혼성화될 수 있다. 상기 PNA 프로브가 표적 물질인 핵산과 혼성화하여 이중 가닥을 이루면 상기 산화그래핀으로부터 유리되므로, 상기 산화그래핀으로 인한 형광 공명 에너지 전달 현상으로부터 벗어나 상기 PNA 프로브에 함유된 상기 형광물질로부터 형광이 발광된다. 따라서 이러한 형광을 측정함으로써 상기 시료 내에 있는 표적 물질인 핵산의 실시간 검출 및 정량이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브에 포함된 상기 형광물질의 형광 발광은, 유세포분석기(FACS), 형광 리더기, qRT-PCR(정량 실시간 PCR), 형광 현미경, 또는 인 비보 (in vivo) 이미징 기기에 의하여 검출될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 리더기는 형광 마이크로플레이트 리더로 약 230 nm 내지 약 999 nm에 이르는 형광을 측정할 수 있는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 리더기는 형광 신호 사이의 cross-talk 현상이 최소화될 수 있도록 약 세 가지의 유기 형광 염료를 선택하여 그에 대한 형광 신호를 관찰하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 유세포분석기는 단일 세포를 튜브로 흘려주며 세포의 형광 신호를 관찰할 수 있는 기기인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 현미경은 세포 내, 세포 외, 또는 시료의 형광을 관찰할 수 있는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 인 비보 이미징 기기는 Caliper Life Science 사의 Xenogen IVIS 100인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 인 비보 이미징 기기는 CCD(charge coupled device) 카메라를 이용하여 각 형광 파장에 맞는 이미지를 수득할 수 있는 기기인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 PNA 프로브는 약 30 염기 이하의 길이를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 약 30 염기 이하, 약 5 염기 내지 약 30 염기, 약 10 염기 내지 약 30 염기, 약 15 염기 내지 약 30 염기, 약 20 염기 내지 약 30 염기, 약 25 염기 내지 약 30 염기, 약 5 염기 내지 약 25 염기, 약 5 염기 내지 약 20 염기, 약 5 염기 내지 약 15 염기, 약 5 염기 내지 약 10 염기, 약 20 염기 내지 약 25 염기의 길이를 가지는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 물질인 핵산이 miRNA인 경우, 상기 PNA 프로브는 약 22개의 염기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 시료는 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 기질에 고정되어 배양되고 있는 세포, 배지 내에 부유하며 배양되고 있는 세포, 생체 내의 세포, 생체에서 분리된 세포, 또는 분석을 위해 처리된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 포함할 수 있으며, 고정액에 의해 고정된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 형광물질의 형광 발광은 실시간으로 측정되어 상기 시료 내의 상기 표적물질인 핵산이 실시간으로 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 형광물질의 형광 발광은 유세포분석(FACS), 형광이미지 분석, 또는 실시간 PCR 등의 방법으로 측정되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 검출은 고정된 세포, 고정되지 않은 세포, 살아있는 세포, 죽은 세포, 또는 검출을 위해 처리된 세포에서도 가능한 것을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 이상의 PNA 프로브를 포함하고 상기 표적 물질인 핵산은 상기 한 종류 이상의 PNA 프로브 각각과 결합하는 한 종류 이상의 핵산을 포함함으로써, 서로 상이한 핵산의 다중 검출이 가능한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 서로 상이한 형광물질은 서로 상이한 색상을 띠는 형광물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 또는 두 종류 이상의 프로브이고, 상기 표적 물질인 핵산은 상기 각각의 PNA 프로브와 상보적 서열을 가지는 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산인 경우, 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적 서열을 가지는 PNA 프로브만이 이중 가닥을 이루어 산화그래핀으로부터 유리되어 형광을 발광하게 된다. 이에 따라 시료 내에 존재하는 핵산과 상보적인 PNA 프로브에 함유된 형광물질만이 형광을 발하게 되고, 이에 따라 발광되는 형광의 색상을 통하여 상기 한 종류 또는 두 종류 이상의 핵산 중 어떤 핵산이 시료 내에 존재하는지 여부를 검출할 수 있게 된다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

[ 실시예 1]

산화그래핀의 제조 및 확인

본 실시예에서 산화그래핀 시트는 당업계에 공지된 방법인 수정된 Hummer's 방법에 따라 제조되었다. 먼저 0.5 g의 NaNO₃ [Junsei 사 (일본)], 및 23 mL의 H₂SO₄ [삼천 화학 (서울, 한국)]를 얼음수조 내에서 격렬하게 교반하면서 혼합하였다. 그 다음, 3 g의 KMnO₄ [Sigma-Aldrich 사 (미주리 주, 미국)]를 천천히 첨가하였다. KMnO₄의 첨가 후, 용액을 35℃의 수조에 옮겨 1 시간 동안 교반하였다. 그 다음, 40 mL의 증류수를 첨가하고 수조의 온도를 30 분 동안 90℃로 올린 뒤 100 mL의 증류수를 추가로 첨가하였다. 그 후, 3 mL의 30% H₂O₂ [Junsei 사 (일본)]를 한 방울씩 첨가하여 상기 용액의 색을 진한 갈색으로부터 노란색으로 변화시켰다. 이에 따라 합성된 산화그래핀 용액을 뷰흐너 깔대기로 여과시키고 증류수로 적어도 4 회 세척하였다. 여과 침전물을 데시케이터 내에서 건조시키고 이를 증류수 내로 재분산시켰다. 이후 산화그래핀이 분산된 용액을 4 시간 동안 초음파 처리하여 나노 크기의 산화그래핀을 얻었다. 이때 얻어진 산화그래핀의 크기는 약 0.05 nm 내지 약 300 nm였으며, 이를 1 mg/mL 농도로 만들어 보관 및 사용하였다.

상기 제조 방법에 따라 제조된 산화그래핀이 단일 층으로 분리된 산화그래핀 시트임을 원자간력 현미경 (Atomic Force Microscopy, AFM)을 이용하여 확인 및 분석하였다. 시트의 크기와 두께는 대략적인 폭이 0.05 nm 내지 300 nm이고 높이가 1.03 nm 였다. 산화그래핀의 자외선-가시광선 분광스펙트럼을 확인한 결과 기존에 알려진 바와 같이 230 nm에서 흡수 피크가 나타나는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 도 2a에 나타난 바와 같다. 산화그래핀의 화학적 구조는 적외선 및 라만분광법으로 확인하였으며, 그 결과는 도 2b에 나타나 있다. 산화그래핀에 결합한 작용기는 알콜 (3,415 cm^-1, 1,040 cm^-1), 에폭시 (1,079 cm^-1), 카르복실 (1,716 cm^-1), 산화된 sp2 탄소 (1,627 cm^-1) 등이 존재하였으며, 나노 산화그래핀의 형성과정에서 카르복실 그룹의 상대적인 세기가 감소하는 것으로 보아 약간의 환원반응이 일어난 것으로 판단되었다. 또한 표면 전하를 측정하는 제타전위 측정 결과 -17.9 mV의 음의 값을 가짐을 확인하였다. 이러한 데이터를 통하여, 단일 층의 산화그래핀 시트가 성공적으로 제조되었다는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2]

단일 가닥 PNA 프로브의 산화그래핀에의 흡착 및 이에 따른 형광 소광 확인

본 실시예 및 하기 모든 실시예에서 사용된 miRNA의 서열 및 이에 상보적인 PNA 프로브의 서열은 하기 표 1과 같다.

상기 표에서 좌측의 핵산 서열은 각각 miRNA의 염기서열이고, 우측의 핵산 서열은 상기 각각의 miRNA 서열에 상보적인 PNA 프로브의 염기서열이다. 상기 miRNA-159는 음성 대조군으로 사용되었다. 본 실시예에서 사용된 miRNA는 유방암을 포함한 몇몇 암세포에서 발현되는 것으로 알려진 miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, 및 miRNA-155이다.

본 실시예에서는 유기형광염료인 FAM, ROX, 또는 Cy5가 표지된 세 종류의 단일 가닥 PNA 프로브의 농도를 100 μM에 맞추어 핵산분해효소를 포함하지 않는 nuclease-free water에 녹였다. 세 종류의 PNA 프로브는 모델질병 세포주인 유방암 세포주 (MDA-MB-231, MDA-MB-435, 및 MCF-7)에서 각각 다른 발현 양상을 가지는 miRNA-21, miRNA-125b, 및 miRNA-155로 선정하였다. 이 때 인 비트로(in vitro) 실험 외에도 세포 실험을 고려하여 nuclease-free water에 녹였으며, 염기 서열과 길이 등에 따라 PNA 프로브의 용해도가 상이할 수 있으므로 60~70℃에서 10 분 정도 가열한 뒤 프로브를 녹였다. 이렇게 녹인 프로브 용액은 사용할 양만큼 분주하여 은박지로 싸서 냉장보관하되 사용할 때마다 앞에서 언급한 방법대로 60~70℃에서 10 분 정도 가열하였다. 이렇게 준비된 형광 표지된 PNA 프로브와 나노크기 산화그래핀 (농도 0.5 mg/mL 내지 1 mg/mL로 준비한 산화그래핀이 0.05 mg/mL 내지 0.1 mg/mL의 농도가 되도록)을 각각 혼합하여 주었다. 형광 표지된 PNA 프로브와 산화그래핀을 혼합하여 줄 때에는 PNA 프로브와 산화그래핀에 5 배로 농축된 버퍼 [250 mM Tris, pH 7.4 (Fisher 사)]를 각 혼합 용액의 전체 부피에 비례하여 첨가하여 주고 나머지 부피는 nuclease-free water를 이용하여 채워주었다.

형광 표지된 PNA 프로브와 산화그래핀을 혼합하여 준 결과, 1 μg의 나노크기 산화그래핀(nanosize graphene oxide, nGO) 당 FAM-PNA-21(FAM 형광물질을 포함하며 miRNA-21에 상보적인 PNA 프로브)의 경우 약 190 pmol 내지 약 200 pmol, ROX-PNA-125b(ROX 형광물질을 포함하며 miRNA-125b에 상보적인 PNA 프로브)의 경우 약 135 pmol, Cy5-PNA-155(Cy5 형광물질을 포함하며 miRNA-155에 상보적인 PNA 프로브)의 경우 약 180 pmol이 흡착될 수 있음이 확인되었다.

이를 형광리더기(Biotek Synergy MX)로 분석한 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, FAM의 형광 신호는 ex/em=488/530 nm, ROX의 형광 신호는 ex/em=575/610 nm, 그리고 Cy5의 형광 신호는 ex/em=643/670 nm에서 가장 높은 발광 피크를 나타내었으므로, 본 실시예에서는 상기 범위의 스펙트럼으로 관찰을 진행하였다. 이 때 산화그래핀을 혼합하여 주지 않았을 때의 각 프로브의 형광 신호를 100%로 보았을 때 형광 신호가 소광되어 원래 신호의 4% 정도로 감소하는 정도를 최적으로 보았다. 산화그래핀과 FAM-PNA-21, ROX-PNA-125b, 또는 Cy5-PNA-155를 혼합하여 주었을 때 모두 상온에서 약 10 여분 정도면 PNA 프로브의 형광 신호가 효과적으로 소광되는 것을 형광 방출 스펙트럼 관찰을 통해 확인할 수 있었다.

[ 실시예 3]

표적 물질로서의 miRNA 의 검출을 위한, 형광물질을 함유하는 올리고핵산의 평가

세포 내에는 수많은 생체분자가 존재하므로 생체분자들과 비특이적인 흡착능이 높은 산화그래핀의 경우 표적 물질인 핵산이 없어도 프로브의 탈착이 비선택적으로 일어나 형광 신호를 나타낼 가능성이 있다. 이에 따라 본 실시예에서는 PNA가 DNA 보다 적합한 프로브인지를 알아보기 위해 표적 miRNA와 상보적인 염기서열을 지닌 PNA 프로브 또는 DNA 프로브의 miRNA 검출 효율을 비교하였다.

모델 질병 세포주로 선정한 유방암 세포주 중 하나로 miRNA-21을 발현하는 MDA-MB-231의 세포를 모아 냉동과 해동을 반복하여 세포 용해물을 수득하고, miRNA-21에 상보적인 DNA 또는 PNA 프로브에 유기형광염료 FAM을 표지하여 사용하였다.

세포의 용해를 위한 저장성 버퍼용액 [20 mM HEPES(pH 8.0), 2 mM MgCl₂, 0.2 mM EGTA, 10% 글리세롤, 및 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 사용 직전에 1 mM DTT를 첨가함]을 준비하고, 상기 버퍼 100 L에 10 만개의 세포가 들어가도록 준비하였다. 세포가 포함된 용액을 37℃와 액체질소 (약 -196℃)를 세 번 가량 오가며 냉동과 해동을 반복하여 세포를 깨어 세포의 용해물(lysate)을 얻었다. 이렇게 수득된 세포 용해물 100 μL에 3 M NaCl을 15 μL 첨가하여 최종 NaCl 농도를 4 M로 맞춘 후 4℃의 원심분리기에서 12,000 rpm으로 20 분간 원심분리하였다. 여기서 얻은 상층액을 새로운 저장 튜브에 옮겨 실험에 사용하였다. miRNA-21에 상보적인 DNA 프로브와 PNA 프로브(FAM-PNA-21) 각각을 산화그래핀에 흡착시켜 준 후 이 흡착물을 세포 용해물과 혼합하여 실험하였다. 본 실시예에서는 염(salt) 농도의 변화에 따른 프로브에 표지된 형광의 소광 정도를 테스트 하였는데, 도 4 에서 나타난 바와 같이, 염의 농도에 따라 형광 정도의 변화를 보인 DNA 프로브와는 달리 PNA 프로브는 염 농도에 상관없이 일정한 소광상태를 보임이 관찰되었다. 또한 냉동과 해동을 반복하여 세포가 용해되는 과정에서 RNA가 대부분 분해되어 존재하지 않는 상기 세포 용해물과 혼합한 이후, DNA 프로브의 경우에는 산화그래핀으로부터 쉽게 유리되어 형광의 소광이 해제됨에 반하여, PNA 프로브는 안정적으로 산화그래핀에 흡착되어 소광상태를 유지함이 확인되었다. 즉, 산화그래핀에 흡착되어 있던 DNA 프로브의 경우에는 PNA 프로브와 달리 표적이 되는 miRNA가 없음에도 불구하고 산화그래핀으로부터 쉽게 유리된다고 판단되며, 이를 통하여 PNA 프로브는 DNA 프로브보다 안정적으로 산화그래핀에 흡착됨이 증명되었다.

[ 실시예 4]

표적 물질로서의 miRNA 검출에 대한 PNA 프로브의 민감도 평가

하나의 세포 안에 존재하는 RNA의 총량은 대개 15 pg 정도이고 그 중에 miRNA는 훨씬 더 적은 양이 존재하고 있으므로, 본 실시예에서는 표적 물질로서의 miRNA의 검출에 대한 민감도를 평가하였다. miRNA-21, miRNA-125b, 또는 miRNA-155에 대한 PNA 프로브의 검출 민감도 평가는 하기와 같이 수행하였다. 나노크기의 산화그래핀 1 μg에 형광 표지된 PNA 프로브를 흡착시킨 용액에 표적 물질로서의 miRNA를 합성하여(바이오니아 사) 0 nM, 0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 또는 1,000 nM의 상기 miRNA를 첨가한 뒤 상온에서 10 분 정도 방치하여 준 후 형광리더기로 각 프로브에 표지된 형광물질의 형광 발광을 측정하였다. 표적 물질인 miRNA를 첨가하기 전과 첨가한 이후의 형광 발광의 변화를 측정한 결과 세 종류의 PNA 프로브를 이용한 실험에서, 도 5a 내지 도 5c 에 나타난 바와 같이, 단위량 1 μg의 나노크기 산화그래핀에 흡착되는 PNA 프로브의 양은 다르지만 약 0.1 pM 내지 1 pM 농도의 miRNA를 검출할 수 있었다.

[ 실시예 5]

시료 내에 존재하는 단일 또는 다중 표적 miRNA 의 검출

본 실시예에서는 PNA 프로브가 표적 물질인 miRNA에 염기서열 특이적으로 결합한다는 것을 증명하기 위하여, 시료 내의 한 가지 종류 내지 세 가지 종류의 miRNA를 세 가지 종류의 PNA 프로브가 정확하게 검출하여 형광 신호를 나타내는지를 측정하였다. 먼저 miRNA-21, miRNA-125b, 및 miRNA-155를 다양한 조합으로 한 종류, 두 종류, 또는 세 종류를 시료에 포함시켰다. 다음으로 FAM-PNA-21, ROX-PNA-125b, 및 Cy5-PNA-155의 세 가지 프로브를 다양한 miRNA 조합을 가진 시료에 첨가하여 이를 실시간 형광이미지 분석시스템을 이용해 관찰하였다. 그 결과, 도 6a 내지 도 6c 에서 나타난 바와 같이, 각각의 PNA 프로브는 프로브는 각각의 PNA 프로브에 상보적인 염기서열을 가진 miRNA에만 반응하여 형광 신호를 나타내었다.

[ 실시예 6]

살아있는 세포 내에서의 단일 표적 miRNA 검출

본 실시예에서는 세포가 살아있는 상태에서 세포내 miRNA를 검출하고 그 발현 양을 정량하였다. 단위량 1 μg의 나노크기 산화그래핀에 FAM-PNA-21을 섞어 상온에서 10 분 정도 방치하여 흡착을 완료한 후 이 용액에 DMEM을 섞어 총 부피 250 μL이 되도록 하였다. 세포는 모델질병 세포주인 유방암 세포주 MCF-7, MDA-MB-435, 및 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 24-well cell culture plate에 well 당 8 만 여개의 세포를 준비하였다. 상기 준비된 세포 샘플에 상기 준비된 FAM-PNA-21 250 μL을 각각 처리 후 약 14 시간 동안 방치하였다. 그 후 이들 세포를 유세포분석(FACS, BD사의 FACS Aria I), 형광 현미경(Olympus 사의 IX71) 관찰, 및 semi qRT-PCR로 분석하였다. 그 결과, 도 7a 내지 도 7e에서 나타난 바와 같이, 상기 세포주에서 발현되어 존재하는 miRNA-21가 FAM-PNA-21에 의해 탐지되어 형광이 발광되었다. 형광 발광의 세기는 당업계에 알려진 바와 같은 miRNA-21의 발현 강도의 순서(MCF-7, MDA-MB-231, 및 MDA-MB-435의 순서)대로 나타났다. 또한, 본 실시예에 의하여 세포를 고정하지 않는 유세포 분석 방법으로도 표적 miRNA의 실시간 검출 및 정량이 가능하다는 것이 확인되었다.

[ 실시예 7]

살아있는 세포 내에서의 다중 표적 miRNA 검출

본 실시예에서는 세포주로서 MDA-MB-231만을 사용한 것과 PNA 프로브로서 FAM-PNA-21, ROX-PNA-125b, 및 Cy5-PNA-155를 모두 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 세포내 miRNA의 존재와 그 발현량을 정량하였다. 그 결과, 도 8a 내지 도 8d에서 나타난 바와 같이, 상기 세포주에서 발현되어 존재하는 miRNA-21, miRNA-125b, 및 miRNA-155가 상기 PNA 프로브에 의해 탐지되어 형광이 발광되었다. 형광 발광의 세기는 당업계에 알려진 발현 양상과 같이 miRNA-21과 mi-RNA-155는 강하게 나타났으며, miRNA-125b는 약하게 나타났다.

[ 실시예 8]

Doxycycline 에 의해 발현이 유도된 miRNA 의 검출

본 실시예에서는 doxycycline의 존재하에서만 miRNA-29a가 발현되도록 유전자 조작된 HeLa 세포주에서 doxycycline의 유무에 따른 miRNA 검출 여부를 유세포분석, 형광현미경 관찰, 및 semi qRT-PCR법을 통해 확인하였다. 본 실시예에서 사용된 PNA 프로브는 FAM가 표지된 PNA 프로브로서 miRNA-29a 서열에 상보적인 FAM-PNA-29a였다.

상기 FAM-PNA-29a 프로브를 산화그래핀에 흡착시킨 것을 사용하여 miRNA-29a의 발현 여부를 관찰하였다. 도 9a 내지 도 9e에 나타난 바에 따르면, miRNA-29a는 doxycycline에 의해 HeLa 세포주에서 그 발현이 유도된 이후에 검출되었을 뿐 아니라 시간대 별로 발현 정도가 다르게 나타남이 확인되었다. 그러나, 상기 프로브를 이용하지 않거나, FAM으로 표지되지 않은 프로브를 사용하였거나, 산화그래핀만을 넣어준 경우, 또는 프로브의 서열이 miRNA-29a의 서열과 상보적이지 않은 무작위 서열 PNA 프로브(scrambled PNA, scPNA)인 경우에는 형광 발광이 검출되지 않았다. 즉, 핵산 프로브와 산화그래핀의 복합체는 프로브의 서열과 상보적인 서열을 가지는 표적 물질인 핵산이 존재하는 시료나 세포에 처리된 경우 그 표적 물질인 핵산의 존재 여부 내지 발현 정도에 따라 다른 수준의 형광을 발광함이 확인되었다.

[ 실시예 9]

염기서열 특이적인 PNA 프로브 결합 및 표적 물질인 핵산의 농도에 의존적인 형광 발광의 확인

본 실시예에서는 표적 miRNA의 농도 변화에 따른 PNA 프로브의 형광 발광의 변화에 대하여 관찰하였다. 본 실시예에서는 FAM-PNA-21을 산화그래핀에 흡착시킨 뒤 다양한 농도의 miRNA-21 또는 G2(miRNA-21과 관계없는 상이한 서열인 5'- UGCGCUCCUGGACGUAGCCU U-3'을 가지는 단일 가닥 RNA)에 적용하였다. 도 10 에서 나타난 바와 같이, PNA 프로브인 FAM-PNA21은 표적 핵산인 miRNA-21에만 결합하여 산화 그래핀으로부터 유리되어 형광을 발광시키며, miRNA-21의 농도에 의존적으로 형광 발광의 세기가 증가하였다. 이에 따라, PNA 프로브는 표적 핵산의 농도가 높아짐에 따라 산화 그래핀으로부터 유리되는 양이 많아지므로, 시료 내에 존재하는 표적 핵산을 정량적으로 검출할 수 있다는 것이 확인되었다.

[ 실시예 10]

산화그래핀에 흡착된 PNA 프로브에 특이적인 세포내 도입의 확인

본 실시예에서는 세포에 산화그래핀만을 처리하거나, 산화그래핀에 부착시키지 않은 형광물질 함유 PNA 프로브인 FAM-scPNA (scrambled sequence (무작위 서열)를 가진 PNA 프로브), FAM-PNA-21, ROX-PNA-125b, 또는 Cy5-PNA-155만을 처리하여 형광의 발광 여부를 확인하였다. 도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 세포 및 산화그래핀만을 처리한 세포에서는 당연히 형광의 발광이 관찰되지 않았다. 또한 형광물질을 함유한 PNA 프로브 역시 산화그래핀에 흡착되지 않은 상태로는 세포 내부에 도입될 수 없으므로, 상기 프로브만을 세포에 처리하였다 하여도 세포로부터 형광의 발광은 관찰되지 않았다.

이상, 구현예 및 실시예를 들어 본원을 상세하게 설명하였으나, 본원은 상기 구현예 및 실시예들에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있으며, 본원의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다.

Claims

산화그래핀에 흡착된, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브를 포함하며,
표적 물질인 핵산과 상기 PNA 프로브가 결합하면 상기 PNA 프로브가 상기 산화그래핀으로부터 분리되어 상기 형광물질로부터 형광이 발광되는 것이고,
상기 PNA는 단일가닥 PNA로서, 상기 산화그래핀의 표면으로의 흡착이 용이한 것을 포함하는 것인,
핵산 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하는 것인, 핵산 검출용 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 RNA는 miRNA를 포함하는 것인, 핵산 검출용 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 miRNA는 miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA-155, 또는 miRNA-159를 포함하는 것인, 핵산 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 30 염기 이하의 길이를 가지는 것인, 핵산 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인, 핵산 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 산화그래핀은 10 nm 내지 1 μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것인, 핵산 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 표적 물질인 핵산은 세포 내에 존재하는 것인, 핵산 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 형광물질의 발광은 실시간으로 측정되어 상기 표적물질인 핵산이 실시간으로 검출되는 것인, 핵산 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 이상의 PNA 프로브를 포함하고 상기 표적 물질인 핵산은 상기 한 종류 이상의 PNA 프로브 각각과 결합하는 한 종류 이상의 핵산을 포함함으로써, 서로 상이한 핵산의 다중 검출이 가능한, 핵산 검출용 조성물.
산화그래핀에 흡착된, 형광물질을 함유하는 PNA 프로브를 포함하는 핵산 검출용 조성물과 표적 물질인 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 단계; 및,
상기 혼합에 의하여 상기 PNA 프로브가 상기 표적 물질인 핵산과 결합함으로써 상기 PNA 프로브가 상기 산화그래핀으로부터 분리되어 상기 형광물질로부터 발광되는 형광을 측정하는 단계를 포함하며,
상기 PNA는 단일가닥 PNA로서, 상기 산화그래핀의 표면으로의 흡착이 용이한 것을 포함하는 것인,
핵산 검출 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하는 것인, 핵산 검출 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 RNA는 miRNA를 포함하는 것인, 핵산 검출 방법.
제 13 항에 있어서,
상기 miRNA는 miRNA-21, miRNA-29a, miRNA-125b, miRNA-155, 또는 miRNA-159를 포함하는 것인, 핵산 검출 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 30 염기 이하의 길이를 가지는 것인, 핵산 검출 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형태인, 핵산 검출 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 산화그래핀은 10 nm 내지 1 μm의 크기를 가지는 입자 형태를 포함하는 것인, 핵산 검출 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 시료는 세포를 포함하는 것인, 핵산 검출 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 형광물질의 발광은 실시간으로 측정되어 상기 시료 내의 상기 표적물질인 핵산이 실시간으로 검출되는 것인, 핵산 검출 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 형광물질을 함유하는 한 종류 이상의 PNA 프로브를 포함하고 상기 표적 물질인 핵산은 상기 한 종류 이상의 PNA 프로브 각각과 결합하는 한 종류 이상의 핵산을 포함함으로써, 서로 상이한 핵산의 다중 검출이 가능한, 핵산 검출 방법.