CN103038629A - 淋巴结成像用荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有靛青类荧光色素和脂质体的近红外线荧光成像剂。由于本发明的近红外线荧光成像剂的荧光强度高、在警戒淋巴结中的滞留时间长,所以在警戒淋巴结导航手术中的警戒淋巴结的检测中有用。并且,本发明还公开了特别适合用于本发明的近红外线荧光成像剂的吲哚菁绿衍生物。
Description
技术领域
本申请要求基于日本专利申请2010-124252(2010年5月31日申请)的优先权,其内容作为参照被引入本说明书中。
本发明涉及生物体组织的近红外线荧光成像。
背景技术
所谓警戒淋巴结(sentinel lymph node),是直接接受来自肿瘤的原发病灶的淋巴流的淋巴结,一般认为此处发生最初的淋巴结转移。在早期癌的切除手术中,警戒淋巴结导航手术(navigation surgery)正被广泛采用,所述警戒淋巴结导航手术是使用色素或者放射性胶体等鉴定警戒淋巴结,在手术中将其摘除,检查是否转移,基于其结果确定切除范围。使用该方法时,在未转移至警戒淋巴结的情况下,能够避免不必要的淋巴切除,降低患者的负担,进而可以保持良好的生活品质(QOL:quality of life)。
为了鉴定警戒淋巴结,使用下述方法,即,将色素或放射性胶体等给与至肿瘤周边,用肉眼或放射线检测器对其进行监控。现有的生物体成像色素中,专利蓝、异硫蓝、及吲哚菁绿(indocyaninegreen)作为能够对作为肿瘤的转移路径最重要的警戒淋巴结进行染色的蓝色·绿色色素在临床上被使用(草野满夫编著,Overview of ICGFluorescent Navigation Surgery,Intermedica,2008)。但是,虽然使用了专利蓝、异硫蓝、或吲哚菁绿等色素的成像法简便,却无法克服下述问题:由于粒径小,所以将其给与生物体时在比较短的时间内扩散,因此难以鉴定真正的目标脏器·器官;以及由于是蓝·绿色系的色素所以难以判断被染色了的淋巴管与静脉血管。
另外,含有99mTc-S纳米粒等放射性同位素的微粒分散液能够用于淋巴流及警戒淋巴结的成像(Heiko Schoder et al,CancerMetastasis Rev(2006)25:185-201)。但是,存在下述问题:示踪物的给与部位与检测部位(淋巴结等)接近时检测精度显著降低(shinethough现象);以及需要放射线管理区域和具有资格的操作者。
另一方面,将包埋荧光量子点的粒径100nm-200nm的脂质体导入到淋巴流时,在淋巴结积聚(Maoquan Chu et al,J Nanopart Res,DOI 10.1007/s 11051-009-9593-2)。由于荧光量子点在生物体内的利用中针对安全性及毒性的评价实验不充分,并且难以应对对应于各种目标脏器·器官的各种粒径,因此使用了其的生物体成像没有达到能够普遍应用于临床上的阶段。
作为警戒淋巴结检测用的荧光探针有用的近红外线荧光色素,已知下述式所示的吲哚菁绿(ICG):
作为色素使用近红外线荧光色素时,通过照射激发光检测近红外线波长区域的荧光,能够将警戒淋巴结与其他组织相区别并进行鉴定。并且,由于近红外线在生物体组织内的透过性高,所以也能够鉴定自皮肤以下数cm的淋巴结。使用近红外线荧光色素的警戒淋巴结检测方法例如公开在日本特开2001-299676中。
吲哚菁绿以与脂蛋白形成复合体的状态被特定波长的光激发时,产生近红外线区域的强荧光(例如,参见Yoneya et al.,IOVS 39,1286-1290,1998)。但是,由于吲哚菁绿与脂蛋白的结合常数低于与其他生物体分子的结合常数,所以即使将吲哚菁绿·脂蛋白的复合体导入生物体内,也进行解离、消光。
另外,报道了从肛门导入吲哚菁绿水溶液时选择性地给与到直肠癌(Shingo Noura et al.,Ann Surg Oncol,DOI10.1245/s10434-009-0711-2)。在导入了吲哚菁绿水溶液的脏器中,对于对肿瘤的选择性、扩散性、滞留性,依存于具有肿瘤的脏器,尚未具有普遍性,因此应用范围受到限制。
进而,想要使用吲哚菁绿水溶液检测淋巴结时,由于随着时间的推移荧光强度降低,所以给与色素后可监控的时间受到限制,手术中有时必须再次给与色素。另外,由于吲哚菁绿在淋巴结留置时间短,所以随着时间的流逝,吲哚菁绿通过淋巴管流走,从位于警戒淋巴结的更下游的淋巴结也产生荧光信号。因此,有时在手术中警戒淋巴结与其下游淋巴结的区别变得困难。
因此,如果能够得到能够长时间发生高的荧光强度、并且在警戒淋巴结内滞留时间长的荧光探针,则可以实现高精度的警戒淋巴结鉴定,在警戒淋巴结导航手术中极其有用。
本说明书中引用的参考文献如下所述。所述文献中记载的内容均作为参考被引入本说明书中。
专利文献1:日本特开2001-299676
非专利文献1:Yoneya et al.,IOVS 39,1286-1290,1998
发明内容
本发明的目的在于提供用作淋巴结成像用的近红外线荧光成像剂的荧光探针、以及作为荧光探针的构成要素的、特别适合该用途的荧光色素。
本发明人等发现将靛青类荧光色素(indocyanine-based fluorescentdye)参入脂质体时,能够得到荧光强度升高、并且在警戒淋巴结中留置时间变长、对警戒淋巴结的检测有用的荧光探针。另外,合成大量与吲哚菁绿同样的具有己三烯基本骨架结构的衍生物,研究了其荧光特性,结果发现由于特定的吲哚菁绿衍生物具有高荧光强度、并且与脂质的亲和性高,所以特别适合用作本发明的荧光探针的构成要素。
即本发明提供由含有具有己三烯基本骨架结构的荧光色素的脂质体形成的、用于警戒淋巴结造影的近红外线荧光成像用的荧光探针。
优选具有己三烯基本骨架结构的荧光染料是下述化学式(I)表示的化合物、或化学式(II)表示的化合物,
[式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为选自下述基团中的基团:
-(CH2)nH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2),
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子,R3是碳原子数为1~18的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数]
[式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子、或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为-(CH2)n-SO3(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SO3(M)、-(CH2)n-COO(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-COO(M)、-(CH2)n-PO4(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-PO4(M)、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-OH、-(CH2)n-SH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SH、-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-X2-(CH2)m-NH2、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-X2-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、或-(CH2)n-X2-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3,此处,X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,此处,M为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,n和m为O~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R3为选自下述基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,R4是碳原子数为1~24的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数]。
另外,优选具有己三烯基本骨架结构的荧光色素为下述化学式(III)表示的化合物、化学式(IV)表示的化合物、化学式(V)表示的化合物、或化学式(VI)表示的化合物、或化学式(VII)表示的化合物,
[式中,n为4~18的整数]
[式中,R1,R2为己酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、油基、亚油基(linoleyl group)、亚麻基(linolenyl group)、蓖麻油基(ricinoleyl group)、香叶基(geranylgroup)、香叶基香叶基(geranylgeranyl group)、法呢基(farnesyl group)、植基(phytyl group)、或植烷基(phytanyl group)]。
在本发明的用于警戒淋巴结造影的近红外线荧光成像用的荧光探针中,优选脂质体的粒径为100~300nm,较优选为150~250nm。
在其他观点中,本发明提供近红外线荧光成像剂,其特征在于,含有下述化学式(I)表示的化合物、或化学式(II)表示的化合物或其盐,
[式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为选自下述基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子,R3是碳原子数为1~18的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数]
[式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子、或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为-(CH2)n-SO3(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SO3(M)、-(CH2)n-COO(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-COO(M)、-(CH2)n-PO4(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-PO4(M)、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-OH、-(CH2)n-SH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SH、-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-X2-(CH2)m-NH2、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-X2-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、或-(CH2)n-X2-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3,此处,X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,此处,M为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R3为选自以下基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,R4是碳原子数为1~24的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数]。
另外,在其他的观点中,本发明提供近红外线荧光成像剂,其特征在于,含有下述化学式(III)表示的化合物、化学式(IV)表示的化合物、化学式(V)表示的化合物、或化学式(VI)表示的化合物、或化学式(VII)表示的化合物,
[式中,n为4~18的整数]
[式中,R1,R2为己酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、油基、亚油基、亚麻基、蓖麻油基、香叶基、香叶基香叶基、法呢基、植基、或植烷基]。
进而在其他的观点中,本发明提供鉴定警戒淋巴结的方法,通过检测由上述本发明的荧光探针产生的荧光来鉴定警戒淋巴结。
进而,在其他的观点中,本发明提供上述化学式(I)、(II)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)表示的化合物。
附图说明
图1表示淋巴结成像用荧光探针的模式图。
图2表示ICG-8荧光探针的荧光特性。
图3A表示各种荧光探针的荧光特性。
图3B表示各种荧光探针的荧光特性。
图4表示荧光探针的粒径分布。
图5表示荧光探针在生物体内的荧光可见性。
图6表示小鼠膝下淋巴结中的荧光探针的留置性。
图7表示猪S状结肠淋巴结中的荧光探针的留置性。
图8表示猪胃幽门淋巴结中的荧光探针的留置性(左为相机像,右为荧光图像)。
具体实施方式
近红外线荧光色素
本发明的近红外线荧光成像剂由靛青类荧光色素和脂质体构成。作为本发明中能够使用的靛青类荧光色素,能够举出例如下述化学式(I)表示的化合物、或化学式(II)表示的化合物,
[式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为选自下述基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,X1或者X2为、-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子,R3是碳原子数为1~18的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数],
[式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子、或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为-(CH2)n-SO3(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SO3(M)、-(CH2)n-COO(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-COO(M)、-(CH2)n-PO4(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-PO4(M)、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-OH、-(CH2)n-SH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SH、-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-X2-(CH2)m-NH2、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-X2-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、或-(CH2)n-X2-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3,此处,X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,此处,M为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R3为选自下述基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,R4是碳原子数为1~24的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数]。
上述化合物能够通过该技术领域中熟知的方法、例如使用日本特开H09-124599、WO1995/007888、日本特开H03-171136及J.Org.Chem.,60,2391(1995)中公开的方法容易地合成。上述化合物中,吲哚菁绿(ICG)作为造影剂已经被市售,能够适合用于本发明。
吲哚菁绿(ICG):
进而,本发明人等合成了大量与吲哚菁绿同样的具有己三烯基本骨架结构的衍生物,研究了其荧光特性。特别是发现下述化合物具有高荧光强度,并且在脂质体脂质双层膜上具有高稳定性,所述化合物为:
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(3-(2-羧基乙基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁烷-1-磺酸(本说明书中称为ICG-6);
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1,1-二甲基-3-十八烷基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁烷-1-磺酸(本说明书中称为ICG-8);
4-(2-((E)-2-((E)-2-(4-(二己基氨基)苯氧基)-3-((E)-2-(1,1-二甲基-3-(4-磺酸盐基丁基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)亚乙基)环己烯基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁烷-1-磺酸钠(本说明书中称为ICG-9);
下述化学式表示的化合物(本说明书中称为ICG-8-C4);
下述化学式表示的化合物(本说明书中称为ICG-8-C6);
下述化学式表示的化合物(本说明书中称为ICG-8-C8);
下述化学式表示的化合物(本说明书中称为ICG-8-C 10);
或下述化学式表示的化合物(本说明书中称为ICG-11-DOPE)。
上述化合物化合物特别适合用于本发明的近红外线荧光成像剂。
本发明的近红外线荧光成像剂中使用的新型荧光色素ICG-6及ICG-8根据WO1995/007888及日本特开H09-124599的记载,能够通过下述合成路径合成。
使市售的2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与1,4-丁烷磺内酯反应,形成化学式所示的一方的单元即2,3,3-三甲基-1-(磺基丁基)-4,5-苯并吲哚(1)。使其与戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐反应,连接至己三烯链,得到2-(6-N-乙酰苯胺-1,3,5-己三烯基)-3,3-二甲基-1-(磺基丁基)-4,5-苯并[e]吲哚(3)。对于ICG-6的化学式所示的另一单元即2,3,3-三甲基-1-(2-羧基乙基)-4,5-苯并吲哚(2)来说,能够通过使2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚与卤代丙酸反应而得到。将上述2个单元在吡啶存在下进行偶联则能够得到ICG-6。
另外,对于ICG-8的化学式所示的另一单元即1-十八烷基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚(4)来说,能够通过将2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚用卤代十八烷进行烷基化而得到。通过使其与上述2-(6-N-乙酰苯胺-1,3,5-己三烯基)-3,3-二甲基-1-(磺基丁基)-4,5-苯并[e]吲哚(3)偶联,能够得到ICG-8。
对于用于本发明的近红外线荧光成像剂的新型荧光色素ICG-9来说,能够根据日本特开H03-171136及J.Org.Chem.,60,2391(1995)的记载,通过下述的合成路径进行合成。
对于形成甲苯骨架的3-氯-2,4-亚丙基戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐(5)来说,可以通过使用三氯氧化磷将环己酮制成醛体,使其与苯胺进行偶联而得到。在三乙胺、甲醇及乙酸酐存在下,使(5)与如上所述形成的2,3,3-三甲基-1-(磺基丁基)-4,5-苯并吲哚(1)单元进行偶联,能够得到花青色素。对于甲苯骨架的修饰基团对-(二-正-己基氨基)苯酚(4)来说,通过将对氨基苯酚用卤代烷进行烷基化而得到。使其与氢化钠反应制成苯酚钠体后,与上述花青色素进行偶联,由此能够得到ICG-9。
对于本发明的近红外线荧光成像剂中使用的、磷脂修饰荧光色素ICG-11-DOPE来说,能够使用市售的二油酰磷脂酰乙醇胺(COATSOME ME-8181)通过下述的合成路径合成。
对于含有其他的磷脂成分的本发明的荧光色素来说,可以由ICG-11-DOPE通过下述方法制造:将键合于磷酸的脂肪酸在碱或酸的催化剂存在下、或者利用脂肪酶进行水解后,通过利用了碳二亚胺的脱水缩合或酰基化反应,将脂肪酸成分改变而制造。或者,也可以使用酰基转移酶将脂肪酸成分改变。上述改变方法可以通过该技术领域中熟知的方法,例如使用Jones有机化学、东京化学同人,2000及Stryer生物化学、东京化学同人、2004中所示的方法而容易地进行。
如下述实施例所示,本发明的近红外线荧光成像剂中使用的荧光色素能够在近红外线区域的波长下产生荧光,显示出与ICG同样的高摩尔吸光系数。表1示出荧光色素的摩尔吸光系数。
[表1]
名称 | λmax(EtOH) | 摩尔吸光系数(ε) |
ICG(市售*) | 787nm | 1.47×105 |
ICG-6 | 786nm | 1.86×105 |
ICG-8 | 787nm | 2.30×105 |
ICG-9 | 810nm | 1.24×105 |
ICG-8-C4 | 787nm | 2.52×105 |
ICG-8-C6 | 787nm | 2.34×105 |
ICG-8-C8 | 788nm | 2.63×105 |
ICG-8-C10 | 788nm | 2.50×105 |
ICG-11-DOPE | 790nm | 1.61×105 |
*东京化成工业制(纯度80%以上)
荧光探针的制造方法
本发明中使用的近红外线荧光色素与脂质的亲和性高,通过使其与脂质体结合能够稳定地产生强荧光。在本说明书中,将近红外线荧光色素与脂质体的上述结合物(conjugate)称为“荧光探针”。图1示出本发明的荧光探针的模式图。
本发明的荧光探针能够通过使用该技术领域中已知的任意方法形成参入了近红外线荧光色素的脂质体来进行制造。例如可以将靛青类近红外线荧光色素与磷脂溶解于适合的有机溶剂中,将其干燥后分散在水性溶液中,反复通过过滤器,由此进行制造。或者,也可以如该技术领域已知的那样,通过进行超声波处理或反相蒸发法进行制造。
作为磷脂,可以使用卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、鞘磷脂、或磷脂酸等。并且,为了使脂质膜稳定化,优选加入胆固醇等脂质成分。
进而,为了使脂质体在生物体内稳定化,可以用亲水性聚合物修饰脂质体的外表面。作为所述亲水性聚合物的例子,可以举出聚乙二醇、聚甲基乙二醇(polymethylethylene glycol)、聚羟基丙二醇(polyhydroxypropylene glycol)、聚丙二醇、聚甲基丙二醇(polymethylpropylene glycol)、或聚羟基环氧丙烷(polyhydroxypropylene oxide)等。特别优选聚乙二醇。
作为一例,将靛青类近红外线荧光色素、磷脂(例如含有磷脂酰胆碱的蛋黄卵磷脂)、脂质(例如胆固醇)或亲水性聚合物的磷脂衍生物(例如聚乙二醇修饰磷脂)溶解于适当的有机溶剂中。针对磷脂的近红外线荧光色素的混合比率为约1/1000至5/100即可。接着将该溶液分散在水性溶液中。或者,也可以从混合物中除去有机溶剂形成薄膜,之后在其中加入水性溶液。作为水性溶液,只要为生理学上能够允许的缓冲液,则可以使用任意的水性溶液。为了前处理,即制作在生物体内荧光探针能够稳定的结构,优选使用含有白蛋白的缓冲液。
接着,将在缓冲液中分散有磷脂的悬浮液通过孔径0.1~0.2μm的过滤器约10~30次,这样能够形成脂质体。脂质体的粒径可以通过改变所用磷脂、脂质及/或修饰磷脂的种类、浓度、过滤器的孔大小、过滤器的材质、以及通过过滤器的次数等来适当调节。根据需要,可以按大小分划所形成的脂质体,制备具有所期望的直径的脂质体。为了长时间留置在淋巴结,脂质体的粒径优选为100~300nm、较优选为150~250nm的范围。最适当的粒径有时根据想要成像的组织及淋巴结的种类而不同,本领域技术人员可以通过简单的预实验容易地选择最适合目标淋巴结的粒径。
使用淋巴结成像用荧光探针的警戒淋巴结的鉴定
为了使用本发明的荧光探针进行警戒淋巴结的检查,针对肿瘤原发病灶的周围,向粘膜下层、肌肉层、或者浆膜下层的任一处直接注入约200~500μL的荧光探针的分散液。荧光探针的分散液的分散介质为水,另外,用于使荧光探针稳定化的必要成分为磷酸盐、炭酸盐等在10mM至200mM的浓度下从pH6.5至pH8.0具有缓冲作用的盐类、或者10mM至500mM的钠盐、钾盐。进而,含有白蛋白等的血清作为稳定剂有效。使用内窥镜进行注入时,优选使用内窥镜下处置用的穿刺针或注射针直接注入,但不限于此。在直接注入后立即用监控装置进行观察,该监控装置在内窥镜或腹腔镜等生物体观察器中安装有仅近红外线透过的过滤器,由此对积聚了本发明的荧光探针的淋巴结进行鉴定检测。
对于本发明的荧光探针来说,由于在警戒淋巴结中的滞留时间长,所以高精度的警戒淋巴结的鉴定变为可能,在警戒淋巴结导航手术中极其有用。
本说明书中使用的情况下,由“含有(comprising)……”的表达方式所表示的方案包括由“实质上由……组成(essentially consistingof)”的表达方式所表示的方案、以及由“由……组成(consisting of)”的表达方式所表示的方案。
本说明书中明确地引用的全部专利及参考文献的内容均作为参照引入本说明书中。
以下通过实施例更详细地说明本发明,但本发明不限于所述实施例。
实施例
实施例1.荧光色素ICG-6及ICG-8的合成
本发明的荧光色素ICG-6及ICG-8通过下述的合成路径合成。
2,3,3-三甲基-1-(磺基丁基)-4,5-苯并吲哚鎓内盐(1)
在25ml四颈瓶中混合2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚(3.1g,15mmol)和1,4-丁烷磺内酯(2.1g,15mmol),对容器内进行氮置换。在80℃下搅拌4小时后,放冷至室温,加入丙酮搅拌一会儿,滤出结晶,用10ml丙酮清洗后,使其风干得到灰色结晶(1.17g,23%)。
溴化2,3,3-三甲基-1-(2-羧基乙基)-4,5-苯并吲哚鎓(2)
在25ml四颈瓶中混合2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚(2.3g,11mmol)、3-溴-1-丙酸(1.5g,9.8mmol)及乙腈(10ml),在65℃下搅拌16小时后,放冷至室温,排入乙酸乙酯(50ml)中。滤出结晶,用丙酮清洗得到的结晶并滤出后,使其风干得到灰色结晶状的目标物(1.68g,47%)。
2-(6-N-乙酰苯胺-1,3,5-己三烯基)-3,3-二甲基-1-(磺基丁基)-4,5- 苯并[e]吲哚鎓内盐(3)
在25ml四颈瓶中混合吲哚鎓盐1(1.04g,3.0mmol)与戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐(0.94g,3.3mmol),在120℃下搅拌1小时。放冷至室温,搅拌1小时后,滤出结晶。用丙酮清洗得到的结晶并滤出后,使其风干得到暗紫色结晶状的目标物(0.91g,58%)。
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(3-(2-羧基乙基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲
哚-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)
丁烷-1-磺酸(ICG-6)
在25ml四颈瓶中混合化合物2(0.55g,1.5mmol)、3(0.80g,1.5mmol)和吡啶(8ml),在50℃下搅拌45分钟后,放冷至室温。减压下浓缩反应液,在残渣中加入水(20ml)并搅拌,接下来一点点地加入10%盐酸搅拌一会儿(pH3~4)。滤出结晶后,使其风干得到粗产物(1.12g)。向得到的结晶中加入甲醇/氯仿(5/1)20ml过热搅拌,放冷后滤出结晶。用甲醇/氯仿使得到的结晶进行重结晶,滤出后,使其风干得到深绿色结晶状的ICG-6(0.38g,37%)。
LC-MS的主要的分子离子峰为m/z=687(negative)。另外,在乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=786nm、ε=1.86×105。
碘化1-十八烷基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(4)
在100ml四颈瓶中混合2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚(8.4g,40mmol)、1-碘代十八烷(16.8g,44mmol)及2-丁酮(30ml),在70℃下搅拌18小时后,放冷至室温,加入乙酸乙酯(40ml),滤出结晶。用乙酸乙酯清洗(2次)得到的结晶并滤出后,使其风干得到灰色结晶状的目标物(4.4g,19%)。
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1,1-二甲基-3-十八烷基-1H-苯并[e]吲哚
-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁
烷-1-磺酸(ICG-8)
在50ml三颈瓶中混合化合物3(1.58g,3.0mmol)、吲哚鎓盐4(1.77g,3.0mmol)及吡啶16ml使其溶解,将其在氮气氛下在50℃下反应1小时。反应后,排入水(40ml)中,滤出析出的结晶。将得到的粗结晶用乙酸乙酯溶解后滤出,用氯仿/乙酸乙酯(1/1)40ml使得到的结晶进行重结晶,得到浓绿色的结晶状目标物(1.39g,53%)。
LC-MS的主要分子离子峰为m/z=867(negative)。另外,在乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=787nm、ε=2.30×105。
实施例2.荧光色素ICG-9的合成
本发明的荧光色素ICG-9通过下述的合成路径合成。
对-(二-正-己基氨基)苯酚(4)
在25ml四颈瓶中混合对氨基苯酚(0.55g,5.0mmol)、1-碘代己烷(2.5g,11.8mmol)、碳酸钾(0.70g,5.1mmol)及二甲基甲酰胺(10ml),在75℃下搅拌3小时后,进而加入碳酸钾(0.70g,5.1mmol)搅拌6小时。放冷至室温,排入水中,加入乙酸乙酯提取。将有机层用水(3次)、饱和食盐水清洗,在无水硫酸钠上干燥后,减压下浓缩得到粗产物(1.3g)。将其用硅胶柱色谱法(甲苯/乙酸乙酯=25/1~15/1)精制,得到油状的目标物(0.81g,58%)。
3-氯-2,4-亚丙基戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐(5)
在300ml四颈瓶中加入二甲基甲酰胺(55ml),一边保持在10℃以下一边经1小时滴入三氯氧化磷(50ml,0.54mol)。缓慢加热,一边保持在45~50℃一边经1小时滴入环己酮(15g,0.15mol)和二甲基甲酰胺(35ml)的混合液。在50℃下搅拌3小时后,将反应液放冷至室温,之后排入水中,彻夜搅拌。滤出结晶,用水清洗得到的结晶并滤出后,彻夜风干得到黄色结晶状的醛体(19.4g,74%)。将该醛体(19g,0.1mol)和二甲基甲酰胺(75ml)在500ml四颈瓶中混合,一边保持在8℃以下一边滴入浓盐酸(25ml)。搅拌15分钟后,一边保持在7℃以下一边滴入苯胺(21.5g,0.23mol)和乙醇(110ml)的混合液。接下来经1.5小时返回至室温,排入水中。搅拌1小时,滤出结晶后,使其风干得到目标物(41.3g,定量的)。
4-(2-((E)-2-((E)-2-(4-(二己基氨基)苯氧基)-3-((E)-2-(1,1-二甲基
-3-(4-磺酸盐基丁基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)亚乙基)环己烯基)
乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁烷-1-磺酸钠(ICG-9)
在25ml四颈瓶中混合化合物1(0.83g,2.4mmol)、3-氯-2,4-亚丙基戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐(0.43g,1.2mmol)、三乙胺(1.1ml,7.9mmol)及甲醇(12ml),将烧瓶内进行氮置换。向反应液中经5分钟滴入乙酸酐。遮光并搅拌15小时后,向反应液中加入乙酸钠(0.49g,6.0mmol),减压下蒸馏除去溶剂。使残留物溶解在丙酮中滤除不溶成分,减压下浓缩滤液。依次用乙酸乙酯、丙酮清洗残渣并滤出后,使其风干得到花青色素的粗结晶(0.87g)。
在25ml四颈瓶中混合氢化钠(60%,0.05g,1.3mmol)和二甲基甲酰胺(2ml),向其中在氮气氛下在65℃以下经10分钟滴入苯酚衍生物4(0.30g,1.1mmol)和二甲基甲酰胺(3ml)。慢慢升温至室温,搅拌1小时制备苯酚钠体。接下来在50ml四颈瓶中混合方才合成的花青色素(0.80g,0.94mmol)和二甲基甲酰胺(9ml),在氮气氛下经10分钟向其中滴入苯酚二甲基甲酰胺溶液(phenoxidedimethylformamide)。搅拌3小时后,投入干冰(1g),将反应液用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇=30/1~3/2)精制。在得到的粗产物中加入乙酸乙酯和少量的丙酮的混合液清洗,滤出后使其风干,得到深绿色结晶的ICG-9(0.49g,48%)。
LC-MS的主要分子离子峰为m/z=1,069(positive)。另外,在乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=810nm、ε=1.24×105。
实施例2-2追加化合物的合成
ICG-8-C4
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1,1-二甲基-3-丁基-1H-苯并[e]吲哚
-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁
烷-1-磺酸(ICG-8-C4)
在实施例1的碘化1-十八烷基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(4)的合成项中,将1-碘代十八烷(16.8g,44mmol)改为1-碘代丁烷(12.1g,66mmol),除此之外,同样地得到碘化1-丁基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(10.7g,62%),进而与ICG-8的合成同样地得到目标物(1.35g,44%)。LC-MS的主要分子离子峰为m/z=673(positive)。另外,在乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=787nm、ε=2.52×105。
ICG-8-C6
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1,1-二甲基-3-己基-1H-苯并[e]吲哚
-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁
烷-1-磺酸(ICG-8-C6)
在实施例1的碘化1-十八烷基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(4)的合成项中,将1-碘代十八烷(16.8g,44mmol)改为1-碘代己烷(6.4g,30mmol),除此之外,同样地得到碘化1-丁基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(5.63g,54%),进而,与ICG-8的合成同样地得到目标物(1.18g,57%)。LC-MS的主要分子离子峰为m/z=701(positive)。另外,在乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=787nm、ε=2.34×105。
ICG-8-C8
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1,1-二甲基-3-辛基-1H-苯并[e]吲哚
-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁
烷-1-磺酸(ICG-8-C8)
在实施例1的碘化1-十八烷基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(4)的合成项中,将1-碘代十八烷(16.8g,44mmol)改为1-碘代辛烷(15.8g,66mmol),除此之外,同样地得到碘化1-辛基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(11.7g,59%),并且与ICG-8的合成同样地得到目标物(0.93g,59%)。LC-MS的主要分子离子峰为m/z=727(positive)。另外,在乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=788nm、ε=2.63×105。
ICG-8-C10
4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1,1-二甲基-3-癸基-1H-苯并[e]吲哚
-2(3H)-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁
烷-1-磺酸(ICG-8-C10)
在实施例1的碘化1-十八烷基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(4)的合成项中,将1-碘代十八烷(16.8g,44mmol)改为1-碘代癸烷(17.7g,66mmol),除此之外,同样地得到碘化1-癸基-2,3,3-三甲基-4,5-苯并[e]吲哚鎓(4.83g,23%),并且与ICG-8的合成同样地得到目标物(0.79g,46%)。
ICG-11-DOPE
修饰的磷脂中使用NOF CORPORATION制COATSOMEME-8181。
在25mL四颈瓶中投入ICG-6(0.5g,0.73mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(0.17g,1.5mmol)、乙腈(3mL)和氯仿(10mL),对容器内进行氮置换。一边保持2℃一边经10分钟滴入二环己基碳二亚胺(0.30g,1.5mmol)和氯仿(2mL)的混合液。慢慢升温至室温,搅拌30分钟后,将反应液过滤。将滤液一边保持在25℃以下一边减压浓缩,残渣用乙酸乙酯溶解并过滤收集结晶后,用丙酮洗涤,由此得到ICG-11的粗结晶(0.66g)。接下来,将得到的结晶(0.66g,ca.0.73g)和氯仿(10mL)投入25mL四颈瓶中,在氮气氛下经20分钟滴入ME-8181(0.54g,0.73mmol)、三乙胺(0.10g,1.0mmol)和氯仿(5mL)的混合液。室温下搅拌2.5小时,将反应液过滤后,浓缩滤液,残渣用闪蒸塔(SiO2,CHCl3/MeOH=4/1~3/1)精制,由此得到ICG-11-DOPE(0.37g,36%)。
实施例3.荧光探针的制作
将来自蛋黄的磷脂酰胆碱(7.3mg)、胆固醇(0.4mg)、磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇5000-二油酰-甘油基铵盐(3.2mg)及荧光色素(ICG、ICG-6、ICG-8或ICG-9)(3.2~3.2×10-4mM)溶解于氯仿/甲醇(体积分率9∶1)。在减压下蒸发有机溶剂,形成薄膜。向其中添加5%人白蛋白(CSLBehring GmbH公司制)的水溶液1mL,在室温下静置数小时。使该悬浮液通过安装在膜支架(Millipore公司制)上的聚碳酸酯制过滤器(孔径0.1~0.2μm、Millipore公司制)约10次,形成脂质体。
对如上所述得到的含有ICG-8的荧光探针的荧光特性进行测定。荧光光谱在738nm下进行激发并测定。另外,在850nm下对在600~800nm的各波长下激发时的荧光进行检测,由此测定激发光谱。结果示于图2。图3A及3B中示出了在激发波长738nm下的、各荧光探针分散液的荧光光谱(ICG衍生物的浓度:3.2×10-2mM)。
另外,使用动态光散射型粒度分布计(日机装公司制)测定得到的脂质体的粒径分布。结果示于图4。
实施例4-1.生物体外的荧光探针的荧光可见性
对于如上所述制作的含有荧光色素的脂质体及作为对照的ICG的水溶液,测定近红外线荧光强度。将含有规定浓度的色素的脂质体悬浮液或ICG水溶液100μL加入96孔板中,照射激发光(LED光源、<780nm),用黑白照相机检测所产生的荧光(>810nm),基于图像处理软件Image J进行亮度评价。
结果示于表2。表中,数值表示基于Image J的亮度评价点(最大值:255),括弧内的数值表示标准差。
[表2]
根据本发明将近红外线荧光色素掺入脂质体中所得的荧光探针与使用了ICG水溶液的情况相比,显示出非常高的荧光强度。
实施例4-2.荧光探针的荧光寿命
测定本发明的荧光探针的荧光寿命。测定使用堀场制作所制荧光寿命光度计TemPro。表3表示各近红外荧光色素3.2×10-2mM浓度的氯仿溶液的值,其中,用作对照的ICG表示水溶液的值,表4表示在脂质体中配合了各近红外荧光色素3.2×10-2mM时的值。对于激发光来说使用740nm的半导体激光,对在816nm的荧光波长得到的寿命光谱进行2成分解析。结果示于表3及表4。
[表3]
[表4]
由此可知,荧光探针分散液与ICG水溶液相比荧光寿命均延长,在近红外荧光成像的灵敏度方面均优异。并且,取代基的烷基链的不同不很影响荧光团的荧光寿命,因此,在本荧光探针中显示出近红外荧光色素的化合物设计的有用性。
实施例5.荧光探针在生物体内的荧光可见性
为了研究荧光探针在生物体内的荧光可见性,从小鼠的前肢(图5的黄色箭头符号)注射含有ICG-8的荧光探针分散液(0.2mL、以磷脂换算浓度计为10mM)。荧光探针分散液的分散介质为5%人白蛋白(CSLBehring GmbH公司制)的水溶液。另外,由制备时使用的脂质的总量、添加的分散介质的容积,求出分散液中的磷脂的浓度,将其以磷脂换算浓度的形式表示,来表示脂质体型荧光探针的每单位体积的量。10分钟后,将表皮组织剥离后,照射激发光(LED光源、<780nm),用黑白照相机检测所产生的荧光(>810nm)。可见光的图像示于图5A,荧光图像示于图5B。由图5B可知,确认到荧光探针分散液的注入部位产生荧光,以及能够检测到留置在膝下淋巴结(○符号)的荧光探针。
实施例6.在小鼠膝下淋巴结的荧光探针的留置性
为了研究荧光探针的淋巴结留置性,与实施例5同样地从小鼠的前肢注射含有ICG-8的荧光探针分散液(脂质体平均粒径240nm)(0.2mL,磷脂换算浓度10mM)或作为对照的ICG水溶液(0.2mL.3.2mM)(图6A)。10分钟后,剥离表皮组织后,照射激发光(LED光源、<780nm),用黑白照相机检测所产生的荧光(>810nm)。
注入ICG水溶液时,从前肢开始第一个膝下淋巴结、以及从前肢开始第二个髂外淋巴结均产生荧光(图6B及图6C的实线白圈)。另一方面,注入含有ICG-8的荧光探针分散液时,检测到来自膝下淋巴结的荧光,但在髂外淋巴结未检测到荧光(图6B及图6C的点线白圈)。需要说明的是,图6C表示从背侧检测与图6B相同部位所得的图像。由此表明含有ICG-8的荧光探针分散液与ICG水溶液相比,在膝下淋巴结的留置时间长。需要说明的是,可知使用脂质体平均粒径120nm的含有ICG-8的荧光探针分散液时,在膝下淋巴结与髂外淋巴结两处均检测到荧光,对于在膝下淋巴结的留置时间来说,脂质体平均粒径240nm时在膝下淋巴结的留置时间长。
与上述同样地,对小鼠给与ICG-8荧光探针分散液或ICG水溶液,研究经过规定时间后的一次淋巴结滞留率。结果用(仅初级淋巴结观察到荧光的小鼠的数目/实验小鼠的数目)表示。需要说明的是,通过Fisher确切检验计算p值。
[表5]
上述结果表明,在给与后1小时,ICG-8荧光探针与ICG相比对初级淋巴结的滞留率显著增高。给与后3小时或6小时时,ICG-8荧光探针也具有滞留率高的倾向。
实施例7.在猪S状结肠淋巴结中的荧光探针的留置性
向猪的S状结肠的肠管注射含有ICG-8的荧光探针分散液(脂质体平均粒径240nm)0.2mL(图7的黄色箭头符号)。30分钟后,使用变阻器内装型内窥镜和荧光观测型腹腔镜,以激发光:<800nm、检测光:>810nm)检测荧光。不仅检测到来自外观能够判断的肠管膜的初级淋巴结(图7B的点线白圈)的荧光,而且还检测到来自外观无法判断的程度的被埋藏的肠管膜的初级淋巴结(图7B实线白圈)的荧光。即,注入含有ICG-8的荧光探针分散液时,多个肠管膜淋巴结中,仅从注入部位开始最接近的初级淋巴结(2个)产生荧光,未确认到来自除此之外的淋巴结的荧光。因此,含有ICG-8的荧光探针分散液对于警戒淋巴结的荧光检测来说有用。
实施例8.在猪胃幽门淋巴结中的荧光探针的留置性
向猪的胃幽门的胃壁中,注射使用生理盐水进行过调整·分散的含有ICG-8的荧光探针分散液(脂质体平均粒径160nm)0.2mL(图8A)。30分钟后,使用变阻器内装型内窥镜和荧光观测型腹腔镜,以激发光:<800nm、检测光:>810nm检测荧光。在外观上检测到来自与胃幽门连接的胃的初级淋巴结(图8B的点线白圈)的荧光。即,利用了对生物体影响小的生理盐水的、含有ICG-8的荧光探针分散液,对胃的警戒淋巴结的荧光检测来说有用。
产业上的可利用性
本发明的近红外线荧光成像剂对于癌等的手术中的警戒淋巴结的检测来说有用。
Claims (15)
1.一种用于警戒淋巴结造影的近红外线荧光成像用的荧光探针,由含有具有己三烯基本骨架结构的荧光色素的脂质体形成。
2.如权利要求1所述的用于警戒淋巴结造影的近红外线荧光成像用的荧光探针,其中,具有己三烯基本骨架结构的荧光染料为下述化学式(I)表示的化合物或化学式(II)表示的化合物,
式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n经-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为选自以下基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子,R3是碳原子数为1~18的链烷或链烯或炔、n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数;
式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子、或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为-(CH2)n-SO3(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SO3(M)、-(CH2)n-COO(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-COO(M)、-(CH2)n-PO4(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-PO4(M)、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-OH、-(CH2)n-SH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SH、-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-X2-(CH2)m-NH2、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-X2-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、或-(CH2)n-X2-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3,此处,X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,此处,M为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R3为选自以下基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,R4是碳原子数为1~24的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数。
4.如权利要求1~3中任一项所述的用于警戒淋巴结造影的近红外线荧光成像用的荧光探针,其中,脂质体的粒径为100~300nm。
5.如权利要求1~3中任一项所述的用于警戒淋巴结造影的近红外线荧光成像用的荧光探针,其中,脂质体的粒径为150~250nm。
6.一种近红外线荧光成像剂,其特征在于,含有下述化学式(I)表示的化合物或化学式(II)表示的化合物或其盐,
式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为选自下述基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子,R3是碳原子数为1~18的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数;
式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子、或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为-(CH2)n-SO3(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SO3(M)、-(CH2)n-COO(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-COO(M)、-(CH2)n-PO4(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-PO4(M)、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-OH、-(CH2)n-SH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SH、-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-X2-(CH2)m-NH2、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-X2-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、或-(CH2)n-X2-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3,此处,X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,此处,M为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R3为选自以下基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,R4是碳原子数为1~24的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数。
8.一种鉴定警戒淋巴结的方法,通过检测由权利要求1~5中任一项所述的荧光探针发生的荧光来鉴定警戒淋巴结。
9.化学式(I)表示的化合物,
式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH--S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为选自以下基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,X1或者X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子,R3是碳原子数为1~18的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数。
10.化学式(II)表示的化合物,
式中,Y为-C(CH3)2-、O或S,Z1及Z3为氢或-OCH3,Z2及Z4为氢,或者,Z1与Z2、及Z3与Z4分别连接在一起形成苯环,所述苯环与它们所键合的环进行缩合,R1为-(CH2)n-SO3、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SO3、-(CH2)n-COO、-(CH2)n-X1-(CH2)m-COO、-(CH2)n-PO4、-(CH2)n-X1-(CH2)m-PO4、-(CH2)n-OH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-OH(A)、-(CH2)n-SH(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-SH(A)、-(CH2)n-NH2(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-NH2(A)、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H(A)、-(CH2)n-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、-(CH2)n-X1-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A)、或-(CH2)n-X1-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3(A),此处,X1为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,A为作为一价的阴离子的氯化物离子、溴化物离子、或碘化物离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R2为-(CH2)n-SO3(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SO3(M)、-(CH2)n-COO(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-COO(M)、-(CH2)n-PO4(M)、-(CH2)n-X2-(CH2)m-PO4(M)、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-OH、-(CH2)n-SH、-(CH2)n-X2-(CH2)m-SH、-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-X2-(CH2)m-NH2、-(CH2)n-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-X2-(CH2)m-(CH2CH2O)x-H、-(CH2)n-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-PO4-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-PO3(OClH2l+1)-(CH2)m-CH3(M)、-(CH2)n-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-X2-(CH2)p-CON(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3、或-(CH2)n-X2-(CH2)p-N(ClH2l+1)-(CH2)m-CH3,此处,X2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,此处,M为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数,x为2~2000的整数,R3是选自以下基团中的基团:
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)n-SO3(B) -(CH2)nCOO(B) -(CH2)n-PO4(B)
-(CH2)n-(CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCH3 -(CH2)nX1(CH2)mSH
-(CH2)nX1(CH2)mOH -(CH2)nX1(CH2)mNH2
-(CH2)nX1(CH2)m-(CH2 CH2O)xH -(CH2)nX1(CH2)mCOO(B)
-(CH2)nX1(CH2)m-SO3(B) -(CH2)nX1(CH2)m-PO4(B)
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(B)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nX1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nX1(CH2)p-N3
此处,B为作为一价的阳离子的氢离子、锂离子、钠离子、或钾离子,X1或者X2为、-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-,R4是碳原子数为1~24的链烷或链烯或炔,n和m为0~22的整数,l为1~22的整数,p为0~17的整数。
15.一种脂质体,含有权利要求9~14中任一项所述的化合物。
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