TW202330498A - 用於腫瘤偵測及手術指引之化合物及組合物 - Google Patents

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美國康奈爾大學
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Abstract

本發明揭示具有以下結構之化合物， ， 其中 係 或 ， X係陰離子(例如生物學上適宜之陰離子，例如氯離子、碘離子及諸如此類)。Y係NH、NR 10或CR 11R 12。Z係雜原子(例如O、S或Se)。R及R 1獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。在各個實例中，R及R 1均不為氧原子(使得形成-NO 2)。R 2及R 3獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11及R 12獨立地選自氫、烷基(例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基))、及諸如此類及其組合。亦揭示組合物及使用該等化合物及組合物之方法。該等化合物或組合物可用於可視化或鑑別腫瘤。

Description

用於腫瘤偵測及手術指引之化合物及組合物
癌組織之手術切除係實體腫瘤治療之關鍵程序。手術係治療實體腫瘤最有效之途徑之一。若在程序期間可去除所有癌組織，則具有延長之無疾病時期或甚至治癒之機率均很高。然而，一些癌組織在肉眼監測中不明顯，因此手術結果可有所變化。
儘管藉由MRI、CT及PET之術前成像已顯著改良癌症診斷及治療計劃之效力，但目前之術中手術仍嚴重依賴於外科醫師之經驗、技能、徹底性及耐心。外科醫師大多使用目視檢查及觸診來鑑別可能的癌組織；然而，該兩種方法通常係不充分的。在操作期間，外科醫師大多在沒有幫助的情況下，在白光下藉由肉眼可視化來鑑別癌組織，因此，結果嚴重依賴於外科醫師之經驗。肉眼監測容易發現之大腫瘤可即時去除，但可能覺察不到之較小病灶可被留下。不完全切除可導致疾病復發且過度切除可造成手術併發症，因此一種新興技術螢光指引手術(FGS)正積極進行測試，以增加術中操作之準確性、效力及效率。FGS需要用以增強癌組織可見性之螢光探針及用於即時偵測螢光信號之螢光成像系統。儘管非靶向習用螢光染料(例如靛青綠、亞甲基藍及螢光黃)已經FDA批准用於追蹤血液、淋巴液及尿液流動，但由於其在腫瘤中積累之被動性質，故其在癌症成像中之效用有限。利用癌症獨特的生理特徵(例如，高受體表現及高酶活性)，設計各種螢光探針以突顯癌組織。將螢光團偶聯至靶向配體或反應性觸發劑，以構築腫瘤結合或酶可激活螢光探針。全身性投與螢光探針藉由優先結合或酶激活來特定地照亮癌組織而非正常組織，導致高腫瘤與正常組織對比度。幾種有希望之螢光探針目前正進行FGS臨床試驗。
對於最大信號與背景對比度，大多數探針係在成像前數小時或數天經靜脈內(IV)注射，以允許未結合探針之背景信號清除或酶可激活探針之信號生成。因此，患者必須在實際手術程序前數小時甚至數天住院進行對比劑注射，此延長其住院時間。此外，IV投與之探針對小的腫瘤(＜ 2 mm)可具有有限的敏感性，此乃因由於腫瘤之脈管系統不發達，其可能無法到達小的腫瘤。由於小的腫瘤在程序期間本來便易於被肉眼監測忽略且可係復發源，因此全身性藥劑對此情形可能無濟於事。探針之全身性投與亦需要大劑量，此可造成全身性副作用。
對腫瘤具有快速開啟速率之典型「常開(always-on)」螢光結合探針不適合「即噴即見(spray-and-see)」方法，此乃因在成像前必須清洗掉施加於正常組織上之任何額外試劑。相反，低背景酶可激活探針避免洗滌步驟，但緩慢催化酶反應阻止了立即成像可能性。腫瘤細胞通常展現增強之醣分解以維持其快速生長及增殖，且實體瘤中之需氧環境改變其代謝途徑，將葡萄糖轉化為乳酸而非丙酮酸。其主動泵出質子以減少細胞內乳酸積聚，此最終導致腫瘤中之細胞外pH自7.4顯著降低至6.2-6.9。腫瘤酸度與增強腫瘤生長、侵襲性及轉移有關。此腫瘤相關性酸度亦已藉由將pH敏感染料偶聯至腫瘤靶向基團(例如，抗體或肽)用於開發許多IV遞送之pH反應性螢光探針。其腫瘤特異性結合並內化至酸性胞內體及溶酶體(pH =4.5-5.0)使腫瘤發射強螢光。然而，此類型之探針具有與常見IV投與探針相似之缺點。
在一態樣中，本揭示內容提供化合物。該等化合物可用於在程序期間可視化(例如，突顯)癌組織。
在各個實例中，本揭示內容提供具有以下結構之化合物： ，  其中 係 或 ，  X係陰離子(例如，生物學上適宜之陰離子，例如氯離子、碘離子及諸如此類)。Y係NH、NR 10或CR 11R 12。Z係雜原子(例如O、S或Se)。R及R 1獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。在各個實例中，R及R 1均不為氧原子(使得形成-NO 2)。在各個實例中，R及R 1均不為氫原子。R 2及R 3獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11及R 12獨立地選自氫、烷基(例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基))、及諸如此類及其組合。在各個實例中，R 4及R 5可為相同烷基(例如甲基)。在各個實例中，R 6及R 7可為相同烷基(例如甲基)。
在一態樣中，本揭示內容提供包含一或多種本揭示內容化合物之組合物。組合物可包含一或多種醫藥上可接受之載劑。
在一態樣中，本揭示內容提供使用本揭示內容之一或多種化合物或組合物之方法。本揭示內容之方法可用於患有或懷疑患有癌症(例如實體腫瘤)之個體。該等方法可用於偵測、鑑別、可視化或以其他方式使實體腫瘤成像。
儘管將依據某些實例闡述所主張之標的物，但包括不提供本文中所闡釋之所有益處及特徵之實例的其他實例亦在本發明之範圍內。可在不背離本發明範圍之情況下做出各種結構、邏輯及程序步驟改變。
本文揭示值之範圍。範圍陳述下限值及上限值。除非另外陳述，否則範圍包括下限值、上限值及下限值與上限值之間之所有值，其包括(但不限於)所有值至範圍之最小值(下限值或上限值)之量值。
如本文所用，除非另外陳述，否則術語「基團」係指單價(即，具有一個可共價鍵結至其他化學物種之末端)、二價或多價(即，具有兩個或以上可共價鍵結至其他化學物種之末端)之化學實體。術語「基團(group)」亦包括基團(radical)(例如單價及多價，例如二價基團、三價基團及諸如此類)。基團之說明性實例包括： 及 。
如本文所用，除非另外指示，否則術語「烷基」係指具支鏈或不具支鏈之飽和烴基團。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、第三丁基及諸如此類。舉例而言，烷基係C 1至C 20，包括所有整數碳數及其間之碳數範圍(例如C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 7、C 8、C 9、C 10、C 11、C 12、C 13、C 14、C 15、C 16、C 17、C 18、C 19及C 20)。烷基可未經取代或經一或多個取代基取代。取代基之實例包括(但不限於)各種取代基，例如鹵素(-F、-Cl、-Br及-I)、脂肪族基團(例如烷基、烯基、炔基及諸如此類)、芳基、烷氧化物基團、羧酸酯基團、羧酸、醚基團、胺基團、及諸如此類及其組合。
本揭示內容提供適於可視化實體腫瘤之化合物及組合物。本揭示內容之化合物或包含化合物之組合物可用於在程序(例如醫療程序，例如手術(例如腫瘤切除))期間可視化(例如突顯)癌組織。可視化可用於使不期望漏看最小化並總體上達成更好的手術結果。亦提供使用化合物及組合物之方法。
在一態樣中，本揭示內容提供化合物。該等化合物可用於在程序期間可視化(例如突顯)癌組織。
在各個實例中，本揭示內容提供具有以下結構之化合物： ，  其中 係 或 ，  X係陰離子(例如生物學上適宜之陰離子，例如氯離子、碘離子及諸如此類)。Y係NH、NR 10或CR 11R 12。Z係雜原子(例如O、S或Se)。R及R 1獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。在各個實例中，R及R 1均不為氧原子(使得形成-NO 2)。在各個實例中，R及R 1均不為氫原子。R 2及R 3獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11及R 12獨立地選自氫、烷基(例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基))、及諸如此類及其組合。在各個實例中，R 4及R 5可為相同烷基(例如甲基)。在各個實例中，R 6及R 7可為相同烷基(例如甲基)。
在各個實例中，本揭示內容提供具有以下結構之化合物： ，  其中X係陰離子(例如生物學上適宜之陰離子，例如氯離子、碘離子及諸如此類)。Y係NH、NR 10或CR 11R 12。Z係雜原子(例如O、S或Se)。R及R 1獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。在各個實例中，R及R 1均不為氧原子(使得形成-NO 2)。在各個實例中，R及R 1均不為氫原子。R 2及R 3獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合。R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11及R 12獨立地選自氫、烷基(例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基))、及諸如此類及其組合。本揭示內容之化合物不具有以下結構： 。
不欲受任何特定理論約束，本揭示內容之化合物係pH敏感的。化合物在正常組織中可係非螢光的，但當被酸性癌症組織吸收時發螢光。癌症優先染色能力將使得手術程序精確且有效。醫學專業人士可準確定位腫瘤，無論其大小及形狀如何，並以適時方式精確地執行所有必須程序。
本揭示內容之化合物具有期望pKa值。化合物之pKa可在5.5-6.5之範圍內，包括所有值及其間之範圍。pKa值低於5之化合物對於局部施加(例如噴塗施加)不具有期望螢光。
本揭示內容化合物之實例包括(但不限於)： 或 。
在一態樣中，本揭示內容提供包含一或多種本揭示內容化合物之組合物。組合物可包含一或多種醫藥上可接受之載劑。
本文所述之組合物可包括一或多種標準醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑可部分地由所投與之特定組合物以及用於投與該組合物之特定方法決定。因此，存在本揭示內容醫藥組合物之眾多種適宜調配物。化合物可自由地懸浮於醫藥上可接受之載劑中或化合物可囊封於脂質體中且任何懸浮於醫藥上可接受之載劑中。載劑之實例包括溶液、懸浮液、乳液、在使用前溶解或懸浮於溶劑中之固體可注射組合物及諸如此類。注射液可藉由將活性成分中之一或多者溶解、懸浮或乳化於稀釋劑中來製備。稀釋劑之實例包括(但不限於)注射用蒸餾水、生理鹽水、植物油、醇、二甲亞碸及其組合。此外，注射液可含有穩定劑、增溶劑、懸浮劑、乳化劑、安撫劑、緩衝劑、防腐劑等。注射劑可在最後調配步驟中殺菌或藉由無菌程序製備。本揭示內容之組合物亦可藉由例如冷凍乾燥調配成無菌固體製劑，且可在即將使用前在殺菌或溶解於無菌可注射用水或其他無菌稀釋劑中之後使用。醫藥上可接受之載劑之額外實例包括(但不限於)糖，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，例如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素，包括羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可油及栓劑蠟；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，例如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱源水；等滲鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及用於醫藥調配物中之其他無毒相容物質。醫藥上可接受之載劑之額外非限制性實例可見於：Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 第21版, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins。有效調配物包括(但不限於)口腔及鼻腔調配物、局部調配物、用於非經腸投與之調配物及經調配用於延長釋放之組合物。非經腸投與包括輸注，例如肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下投與及諸如此類。
在各個實例中，組合物具有期望滲透特性及生物學上適宜之容積滲透濃度。具有期望滲透特性之載劑包括(但不限於)丙二醇、異丙醇、油酸、及聚乙二醇類似物、及諸如此類及其組合。期望組合物對細胞係非致死的。據信，可使用容積滲透濃度調節劑。容積滲透濃度調節劑之實例包括(但不限於)糖(例如單醣，例如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖、及諸如此類及其組合，二醣，例如蔗糖)；糖醇，例如甘露醇、甘油、肌醇、木糖醇、核糖醇、及諸如此類及其組合；及胺基酸，例如甘胺酸、精胺酸、及諸如此類及其組合。
在各個實例中，組合物適於局部投與。組合物可在認為受試者患有實體腫瘤或受試者患有實體腫瘤之位置處噴塗於患有實體腫瘤或懷疑患有實體腫瘤之受試者上，或作為口腔沖洗劑用於口腔及/或食管癌。噴塗亦可應用以輔助患有卵巢癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、子宮頸癌、口腔癌及其他癌症患者之內窺鏡/腹腔鏡診斷。組合物可直接自內視鏡、結腸鏡或腹腔鏡投與(例如噴塗)。在各個實例中，化合物或組合物可在所有手術切除中投與或用於驗證切除之組織。
在各個實例中，組合物可包含於pH為6.5至7.5 (包括每0.01 pH值及其間之範圍)之磷酸鹽緩衝鹽水中之0.5至10 µM之本揭示內容化合物(包括每0.01 µM值及其間之範圍)及0.1至1.0體積% DMSO (包括0.01體積%值及其間之範圍)。在各個實例中，組合物可包含於pH為6.5至7.5 (包括每0.01 pH值及其間之範圍)之磷酸鹽緩衝鹽水中之0.5至10 µM化合物(包括每0.01 µM值及其間之範圍)。
在一態樣中，本揭示內容提供使用本揭示內容之一或多種化合物或組合物之方法。本揭示內容之方法可用於患有或懷疑患有癌症(例如，實體腫瘤)之個體。該等方法可用於偵測、鑑別、可視化或以其他方式使實體腫瘤成像。
本揭示內容之方法可用於確定實體腫瘤之存在及/或位置及/或使實體腫瘤成像。該等方法可與用於鑑別或去除實體腫瘤之其他方法組合使用。
用於確定個體中實體腫瘤之存在及/或位置之方法可包含將本揭示內容之化合物或組合物投與至個體上或個體中之所關注區域。所關注區域可為其中個體患有或懷疑患有腫瘤之區域。化合物或組合物係利用電磁輻射(例如，光具有在近紅外區(NIR)中之波長(例如750至1500 nm))暴露(例如輻照)。輻照之後，所關注區域可經成像或可視化。成像或可視化可包含量測或觀察所關注區域之螢光信號。在施加化合物或組合物之後，信號可在幾分鐘內被偵測(例如少於5分鐘、少於4分鐘、少於3分鐘、少於2分鐘、少於1分鐘、少於55秒、少於50秒、少於45秒、少於40秒、少於35秒、少於30秒、少於25秒、少於20秒、少於15秒、少於10秒或少於5秒)。在各個實例中，在成像及/或可視化之前不進行洗滌。螢光信號將在贅生腫瘤組織中顯影。
本揭示內容之方法可係使實體腫瘤成像之方法。方法可包含將本揭示內容之化合物或組合物施加或投與至實體腫瘤，將所關注區域暴露於電磁輻射；及獲得實體腫瘤之影像。在各個實例中，在成像及/或可視化之前不進行洗滌。在施加化合物或組合物之後，信號可在幾分鐘內被偵測(例如少於5分鐘、少於4分鐘、少於3分鐘、少於2分鐘、少於1分鐘、少於55秒、少於50秒、少於45秒、少於40秒、少於35秒、少於30秒、少於25秒、少於20秒、少於15秒、少於10秒或少於5秒)。投與可藉由各種非靜脈內遞送方法發生，例如局部投與(例如，噴塗於所關注區域上)或腹膜內遞送(i.p.)。
腫瘤之存在、鑑別及/或成像可包含量測螢光信號。激發及發射可端視用於生成螢光信號之化合物而變。量測可包含量測背景螢光。可在各個時間點(例如1、3、5、7、10及15分鐘時間點)量測信號。量測可藉由正常區域之平均螢光強度計算腫瘤之平均螢光強度用於確定腫瘤對正常組織比率。
投與可藉由各種非靜脈內遞送方法發生，例如局部投與(例如噴塗於所關注區域上)或腹膜內遞送(i.p.)。此外，化合物或組合物可全身性投與。如本文所用，術語「全身的」包括非經腸、局部、經口、噴霧吸入、直腸、經鼻及經頰投與。如本文所用，術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內及顱內投與。在各個實例中，化合物或組合物係經由局部施加或局部投與來施加或投與。在各個實例中，將化合物或組合物噴塗於所關注區域。在各個其他實例中，組合物係口腔沖洗劑。舉例而言，方法可為「即噴即見」技術。
本揭示內容之方法可包括確定腫瘤(例如實體腫瘤)之腫瘤邊緣。舉例而言，將化合物或組合物施加至腫瘤(例如實體腫瘤)之位點並量測螢光信號。激發及發射可端視用於生成螢光信號之化合物而變。量測可包含量測背景螢光。可在各個時間點(例如1、3、5、7、10及15分鐘時間點)量測信號。信號可與所關注區域中之非癌組織之螢光信號/所關注區域之螢光信號比較，以確定腫瘤之邊緣。比較可用於確定所關注區域之哪些部分係癌性及非癌性的。信號可用於確定腫瘤邊緣以確保腫瘤完全切除。
本揭示內容之方法可用於不同個體。在各個實例中，個體係人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物之實例包括(但不限於)農場動物(例如牛、豬、綿羊及諸如此類)以及寵物或比賽用動物(例如馬、狗、貓及諸如此類)。個體之額外非限制性實例包括(但不限於)兔、大鼠、小鼠及諸如此類。本揭示內容之化合物或組合物可於(例如)醫藥上可接受之載劑中投與給個體，該等醫藥上可接受之載劑促進化合物自一個器官或身體之一部分自另一器官或身體之另一部分之輸送或可直接施加至所關注之器官或身體之一部分。
可使用本揭示內容之方法鑑別、成像或可視化各種腫瘤。舉例而言，腫瘤係實體腫瘤。腫瘤之實例包括(但不限於)卵巢腫瘤、皮膚癌、胰臟癌、泌尿生殖系統癌、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、腦瘤、食管腫瘤、子宮頸腫瘤、口腔腫瘤、及諸如此類及其組合。
在本文所揭示各個實施例及實例中所述之方法的步驟足以產生本揭示內容之化合物或實施本揭示內容之方法。因此，在各個實施例中，方法基本上由本文所揭示方法之步驟的組合組成。在各個其他實施例中，方法由該等步驟組成。
在一態樣中，本揭示內容提供套組。套組可包含組合物或製備組合物之材料(例如醫藥載劑及一或多種本揭示內容之化合物)及印刷材料。
在各個實例中，套組包含含有醫藥製劑之封閉或密封包裝。在各個實例中，包裝包含一或多個封閉或密封小瓶、瓶、泡罩(氣泡)包或任何其他用於銷售、或分配或使用化合物及包含本揭示內容化合物之組合物之適宜包裝。印刷材料可包括印刷資訊。印刷資訊可提供於標籤上或於紙質插入物上，或印刷於包裝材料自身上。印刷資訊可包括鑑別包裝中之化合物、其他活性及/或非活性成分之量及類型及服用組合物之說明書(例如，在既定時期內所服用劑量之數量)之資訊及/或針對藥師及/或另一健康照護提供者(例如醫師)或患者之資訊。在各個實例中，產品包括闡述容器之內容物及提供關於容器內容物之使用的指示及/或說明的標籤。套組可包含單一劑量或多個劑量。套組可進一步包含投與化合物或組合物所需之裝置或物件。物件或裝置可為例如噴霧瓶或霧化器或諸如此類。
給出以下實例以說明本發明。該等實例並不意欲在任何方面進行限制。
實例 A.一種化合物，其具有以下結構： ，  其中X係陰離子(例如生物學上適宜之陰離子，例如氯離子、碘離子或諸如此類)；Y係NH、NR 10或CR 11R 12；Z係雜原子(例如O、S或Se)；R及R 1獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合；R 2及R 3獨立地選自甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、及諸如此類及其組合；R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11及R 12獨立地選自氫、烷基(例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基))、及諸如此類及其組合，前提條件係化合物不具有以下結構： 。  例如，在各個實例中，R 4及R 5可為相同烷基(例如甲基)。例如，在各個實例中，R 6及R 7可為相同烷基(例如甲基)。在各個實例中，化合物具有以下結構： 或 。  在各個實例中，化合物具有以下結構： 。
實例 B.一種組合物，其包含根據實例A之化合物及醫藥上可接受之載劑。舉例而言，組合物可藉由期望之滲透特性。具有期望滲透特性之載劑包括(但不限於)丙二醇、異丙醇、油酸、及聚乙二醇類似物、及諸如此類及其組合。期望組合物對細胞係非致死的。據信，可使用容積滲透濃度調節劑。容積滲透濃度調節劑之實例包括(但不限於)糖(例如單醣，例如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖、及諸如此類及其組合，二醣，例如蔗糖)；糖醇，例如甘露醇、甘油、肌醇、木糖醇、核糖醇、及諸如此類及其組合；及胺基酸，例如甘胺酸、精胺酸、及諸如此類及其組合。可使用穩定劑。穩定劑之實例為業內已知。在各個實例中，組合物可包含於pH為6.5至7.5 (包括每0.01 pH值及其間之範圍)之磷酸鹽緩衝鹽水中之0.5至10 µM化合物(包括每0.01 µM值及其間之範圍)及0.1至1.0體積% DMSO (包括0.01體積%值及其間之範圍)。在各個實例中，組合物可包含於pH為6.5至7.5 (包括每0.01 pH值及其間之範圍)之磷酸鹽緩衝鹽水中之0.5至10 µM化合物(包括每0.01 µM值及其間之範圍)。組合物係適於局部及/或經口投與之組合物(例如可噴塗組合物)。
實例 C.一種確定需要治療之個體中實體腫瘤之存在及/或位置之方法，其包含：將根據實例A之化合物或根據實例B之組合物投與至個體上/個體中之所關注區域；將所關注區域暴露於電磁輻射(例如波長在近紅外區(NIR) (例如750至1500 nm)中之光)；及使所關注區域成像及/或可視化，其中確定實體腫瘤之存在及/或位置。在施加化合物或組合物之後，信號可在幾分鐘內被偵測(例如少於5分鐘、少於4分鐘、少於3分鐘、少於2分鐘、少於1分鐘、少於55秒、少於50秒、少於45秒、少於40秒、少於35秒、少於30秒、少於25秒、少於20秒、少於15秒、少於10秒或少於5秒)。螢光信號將在贅生腫瘤組織中顯影。投與可藉由各種非靜脈內遞送方法發生，例如局部投與(例如噴塗於所關注區域上)或腹膜內遞送(i.p.)。投與可為局部投與。局部投與可為噴塗。在各個實例中，局部投與係口腔沖洗。在各個實例中，在成像及/或可視化之前不進行洗滌。在各個實例中，實體腫瘤選自卵巢腫瘤、皮膚癌、胰臟癌、泌尿生殖系統癌、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、腦瘤、食管腫瘤、子宮頸腫瘤、口腔腫瘤、及諸如此類及其組合。施加或投與至實體腫瘤可導致化合物之質子化。在各個實例中，電磁輻射係在近IR範圍內。
實例 D.一種使實體腫瘤成像之方法，其包含：將根據實例A之化合物或根據實例B之組合物施加或投與至實體腫瘤；將所關注區域暴露於電磁輻射；及獲得實體腫瘤之影像。在施加化合物或組合物之後，信號可在幾分鐘內被偵測(例如少於5分鐘、少於4分鐘、少於3分鐘、少於2分鐘、少於1分鐘、少於55秒、少於50秒、少於45秒、少於40秒、少於35秒、少於30秒、少於25秒、少於20秒、少於15秒、少於10秒或少於5秒)。投與可藉由各種非靜脈內遞送方法發生，例如局部投與(例如噴塗於所關注區域上)或腹膜內遞送(i.p.)。施加或投與係局部施加或局部投與。局部投與可係噴塗。實體腫瘤可選自卵巢腫瘤、皮膚癌、胰臟癌、泌尿生殖系統癌、腦瘤、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、食管腫瘤、子宮頸腫瘤、口腔腫瘤、及諸如此類及其組合。電磁輻射可在近IR範圍內。
實例 E.一種用於確定實體腫瘤之邊緣的方法：將根據實例A之化合物或根據實例B之組合物投與至個體上/個體中之所關注區域；將所關注區域暴露於電磁輻射(例如波長在近紅外區(NIR) (例如750至1500 nm)中之光)；使所關注區域成像及/或可視化，及確定實體腫瘤之邊緣。在施加化合物或組合物之後，信號可在幾分鐘內被偵測(例如少於5分鐘、少於4分鐘、少於3分鐘、少於2分鐘、少於1分鐘、少於55秒、少於50秒、少於45秒、少於40秒、少於35秒、少於30秒、少於25秒、少於20秒、少於15秒、少於10秒或少於5秒)。信號可與所關注區域中之非癌組織之螢光信號/所關注區域之螢光信號比較，以確定腫瘤之邊緣。投與可藉由各種非靜脈內遞送方法發生，例如局部投與(例如噴塗於所關注區域上)或腹膜內遞送(i.p.)。施加或投與係局部施加或局部投與。局部投與可係噴塗。實體腫瘤可選自卵巢腫瘤、皮膚癌、胰臟癌、泌尿生殖系統癌、腦瘤、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、食管腫瘤、子宮頸腫瘤、口腔腫瘤、及諸如此類及其組合。電磁輻射可在近IR範圍內。
實例 F.一種套組，其包含根據實例A之化合物或根據實例B之組合物。套組可包含化合物(例如呈凍乾粉末或膜之化合物)及醫藥上可接受之載劑。兩種組分可經混合並噴塗於所關注組織上。 實例 1
以下實例顯示本揭示內容之化合物以及化合物之毒性數據及活體內數據。
圖1及2顯示本揭示內容之化合物。
圖3顯示在pH 5.0及7.5下之發射最大值及強度差異。
圖4顯示本揭示內容化合物之螢光光譜。
圖5顯示本揭示內容化合物之細胞毒性數據。CCK8 MMT分析係使用具有0.1% DMSO之1 µM之每一化合物以及RPMI實施。將細胞培育0.5或1小時，用新鮮培養基洗滌，且然後培育3天。
圖6顯示CypH-11 (2 µM，於pH 5.0磷酸鹽緩衝溶液中)之吸光度及螢光光譜。Ex max= 766 nm及Em max= 785 nm。
活體內效能研究。使用在側腹中用RFP-ovsaho細胞接種之動物用於成像研究。為模擬轉移性人類卵巢癌之形態，腫瘤大小控制在2 mm。在噴塗染料(2 μM，於鹽水中)之前去除皮膚。對腫瘤區域進行噴塗並使用Cy7濾光片組在不同時間點成像。亦獲得RFP影像用於腫瘤共配準。對比率係藉由[腫瘤信號]/[毗鄰肌肉信號]來計算。
在活體外及細胞驗證之後，吾人認為在不同pH且在細胞中具有優良螢光性質之最佳候選者CypH-11將係理想試劑，其用以增加小癌性病灶之偵測，否則外科醫師可注意不到。為驗證假設，將RFP陽性ovsaho卵巢癌細胞皮下接種於小鼠中。當腫瘤大小為約2 mm時，去除皮膚並將CypH-11溶液(2 μM，於鹽水中)噴塗於腫瘤區域上。在此噴塗施加後一分鐘內突顯腫瘤之螢光信號快速顯影。對比度繼續略微增加並在約7分鐘時迅速達到平臺期。腫瘤信號較毗鄰肌肉組織高約150%，且CypH-11信號與RFP信號共配準良好。特別地，在正常組織中未觀察到信號增加，此指示此CypH-11信號增強係腫瘤特異性的。在一組單獨實驗中，腫瘤接種有兩個腫瘤。每一腫瘤用原型染料CypH-1或CypH-11噴塗，並同時成像。CypH-11顯示近即時之信號增強，而CypH-1僅顯示最低限度之對比度。此結果強力支持吾等修改之益處。
為進一步證實信號增強係pH依賴的，在完全相同之條件下將具有相似吸收及發射性質之市售常開染料Cy7應用於腫瘤。如所預期，此pH獨立性Cy7染料在所有組織中均給出強信號。與CypH-11完全不同，Cy7未顯示明顯差異對比度。由於CypH-11之螢光性質，信號顯影可直接成像而無需洗滌步驟。該等噴塗實驗表明，pH依賴性CypH-11可用作即時腫瘤偵測之氣溶膠噴霧。
圖7顯示pH反應性CypH-11及pH不敏感Cy7之比較。
圖8顯示CypH-1及CypH-11之比較。
圖9顯示CypH-11、CypH-1及Cy7在不同時間點之腫瘤/肌肉對比率。 實例 2
以下實例顯示本揭示內容之化合物及其合成及表徵。
表徵：所有新的CypH染料均由質子NMR及質譜表徵以證實身份。NMR數據與結構一致且質譜結果給出染料之預期質量± 0.5 amu。開發HPLC方法(參見下文)並用於評價染料純度。所有染料均顯示＞ 95%之良好純度。管柱上之滯留時間通常與染料之親脂性相關，其中含有硫酸酯基團之水溶性染料較CypH-1 (在11.9 min時)更早溶析出(對於CypH-3、6、9，在10.6 min時)，且越具親脂性的染料越晚溶析。亦確定染料之光學性質、酸解離常數及溶解度。表徵數據匯總於表1中。合成中間體亦藉由質子NMR進行表徵。
用於染料純度之HPLC方法係由Phenomenex反相Luna C8(2)管柱(5μm, 100A, 250 x 4.6mm, 目錄號00G-4248-30)以及溶劑A (50%甲醇水溶液+ 0.1% TFA)及B (100% 甲醇 + 0.1% TFA)組成。溶劑梯度為0-3min (0% B)、3-10min (100% B)、10-20 min (100% B)及20-25 min (0% B)，其中流速為1 mL/min。偵測係藉由光電二極體陣列在染料之最大吸光度處進行。
表1. CypH染料之化學性質.
CypH # M + 計算值 . M + 觀察值 . % 純度 滯留時間 於 EtOH 中之吸光度最大值 (nm) 於吸光度最大值下之消光係數 (M -1cm -1) 溶解度
1       100 11.9 760 74,450 ＞1 mM，於EtOH中
2 612.4 612.5 99.0 12.3 764 139,100 ＞1 mM，於EtOH中
3 798.3 798.6 100 10.6 768# 164,900 ＞1 mM，於H 2O中
4 570.3 570.5 99.3 12.4 775 58,000 ＞1 mM，於EtOH中
5 598.4 598.5 100 11.5 762 134,000 ＞1 mM，於EtOH中
6 814.4 814.6 100 10.6 768# 150,400 ＞1 mM，於H 2O中
7 626.4 626.7 99.0 12.0 764 179,500 ＞1 mM，於EtOH中
8 584.4 584.5 95.6 11.8 777 72,700 ＞1 mM，於EtOH中
9 828.4 828.6 100 10.6 769# 176,300 ＞1 mM，於H 2O中
10 640.4 640.4 97.9 12.0 765 175,400 ＞1 mM，於EtOH中
11 668.5 668.8 98.0 14.1 771 233,800 ＞1 mM，於EtOH中
12 612.4 612.2 97.6 13.6 767 255,600 ＞1 mM，於EtOH中
13 696.5 696.7 96.9 14.5 774 218,100 ＞1 mM，於EtOH中
14 612.4 612.3 97.6 13.7 767 215,800 ＞1 mM，於EtOH中
15 640.4 640.9 99.0 14.4 772 251,500 ＞1 mM，於EtOH中
16 668.5 668.8 99.5 14.2 771 248,000 ＞1 mM，於EtOH中
17 654.4 654.8 96.0 14.2 770 269,100 ＞1 mM，於EtOH中
18 654.4 654.9 96.6 14.3 772 257,300 ＞1 mM，於EtOH中
19 668.5 668.5 98.5 14.7 774 240,900 ＞1 mM，於EtOH中
20 682.5 682.6 98.6 14.5 774 218,600 ＞1 mM，於EtOH中
表2. 螢光性質之匯總.
CypH # FL Max (nm) ， pH 5.0 FL 強度， pH 5.0 FL Max (nm) pH 7.5 FL 強度， pH 7.5 強度比， pH 5.0/7.5
1 787 3363 782 334 10.1
2 787 4254 786 139 30.6
3 789 4280 787 320 13.4
4 801 1924 790 83 23.2
5 786 5089 787 227 22.4
6 789 4359 791 405 10.8
7 788 5681 786 204 27.8
8 801 2816 791 68 41.4
9 793 5125 789 972 5.3
10 788 5380 781 414 13.0
11 790 5028 785 45 111.7
12 787 4285 784 493 8.7
13 796 4204 790 120 35.0
14 786 5627 784 958 5.9
15 791 4313 786 81 53.2
16 791 4847 783 182 26.6
17 791 4468 782 78 57.3
18 792 4553 782 117 38.2
19 794 3137 784 46 68.2
20 794 3646 789 104 35.1
結構最佳化：新的pH反應性染料係自先前公開之先導探針CypH-1改質，CypH-1係在中性及鹼性條件(≥ 7.0)下幾乎不展現螢光但在弱酸性條件(≤ pH 5.0)中發螢光之七甲川花青染料。CypH-1之激發及發射最大值分別為760及777 nm。pH 5對pH 7.5之信號強度比為約10。CypH-1之內消旋橋環(meso-bridge ring)大小、親脂性及電子密度經改質以提供更好的光學性質。在自10個類似物之庫中篩選第1輪時，吾等發現具有內消旋環戊烷環之染料在pH 5及pH 7.5下均具有低螢光性質，而具有-CH 2CH 2SO 3-取代之親水CypH具有良好螢光性質，但在細胞膜上之攝取較低。此群組之最佳化合物係CypH-5，其pH 5.0/pH 7.5之螢光比增加至22。基於此初始結構及性質關係，使用CypH-5作為核心設計第二輪10個新的類似物，其重點改質苯胺環及吲哚啉鎓環上之電子密度。各種烷基(例如，甲基、乙基、丙基、異丙基及其組合)應用於該兩個位置。一般合成路徑顯示於圖10中。
其螢光強度之直接量測顯示，在吲哚啉鎓環處具有甲基之CypH類似物(CypH-11至20)在pH 7.5下具有較高背景螢光。具有其他較長烷基鏈之CypH類似物具有低得多之背景螢光。其pH 5.0/pH 7.5之螢光比自10-20顯著改良至50-110。在該等中，具有甲基異丙基苯胺及吲哚啉鎓環上之異丙基之CypH-11給出112倍螢光信號增強。CypH-11分別在766 nm及785 nm處具有吸光度及發射最大值(圖4)且選擇作為先導化合物(參見下文)。
先導化合物CypH-11之合成細節及額外表徵
CypH-11係根據圖11中所示之方案使用以下試驗程序合成。
4-(N- 異丙基 , N- 甲基 ) 胺基酚起始材料之製備：將4-N-甲基胺基苯酚(1.72 g, 0.01 mol)、異丙基碘(1.70 g, 0.01 mol)及三乙胺(2.8 mL, 0.02 mol)在10 mL無水氯仿中於室溫下攪拌過夜。然後將溶液濃縮，溶解於最小體積之二氯甲烷中並藉由矽膠層析利用增加梯度之於己烷中之乙酸乙酯(25-40%，以5%增量)溶析來純化，以提供4-(N-異丙基, N-甲基)胺基苯酚(0.926 g, 56%產率)。 1H NMR (於d 6-DMSO中): 8.60 (s, 1H,-OH), 6.67-6.61 (m, 4H), 3.80 (m, 1H), 2.50 (s, 3H, -CH 3), 1.02 (d, J=6.6Hz, 6H, -(CH 3) 2)。
N- 異丙基 -2,3,3- 三甲基吲哚啉鎓碘化物 (2) 之合成。將2,3,3-三甲基假吲哚(1) (4 g, 0.025 mol)及2-碘丙烷(14 mL, 0.140 mol)在140℃下一起加熱72 h。冷卻後，將所得稠油狀物用二乙醚洗滌以去除過量起始材料，且然後將油狀物置於高真空下以去除殘留揮發物。粗製材料(4.08 g, 49.6%)藉由質子NMR分析並用於下一反應。 1H NMR (CDCl 3): 7.86-7.84 (m, 1H), 7.61-7.56 (m, 3H), 5.51 (m, 1H, N-CH), 3.31 (s, 3H, -CH 3), 1.92 (d, 6H, J= 6.9 Hz, -(CH 3) 2), 1.67 (s, 6H, -(CH 3) 2)
2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氫-1-異丙基-3,3-二甲基-2H-吲哚-2-亞基)-亞乙基]-1-環己烯-1-基]-乙烯基]-1-異丙基-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓碘化物(4)之合成。將N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-1-環己烯-1-基)亞甲基]苯胺單鹽酸鹽(3) (0.281 g, 0.78 mmol, Millipore Sigma, St Louis)及N-異丙基-2,3,3-三甲基吲哚啉鎓碘化物(0.575 g, 1.75 mmol)在回流下在含有無水乙酸鈉(0.158 g, 1.93 mmol)之乙醇(20 mL)中加熱3 h。將反應混合物濃縮並藉由矽膠層析利用增加量之於二氯甲烷中之甲醇(2-5%，以1%增量)溶析來純化，以提供呈綠色固體之(4) (0.25 g, 48%)。 1H NMR (CDCl 3): 8.38 (d, J =14.0 Hz, 1H), 7.41-7.37 (m, 3H), 7.26 (m, 1H), 6.43 (d, J= 14Hz, 1H), 5.10 (m, 1H), 2.81 (t, J=6.2Hz, 2H), 2.02 (m, 1H), 1.80-1.60 (m, ~12H)。
CypH-11 之合成 .將4-(N-異丙基, N-甲基)胺基苯酚(0.081 g, 0.491 mmol)於無水N,N-二甲基甲醯胺(5 mL)中之溶液在RT下攪拌並添加氫化鈉(0.022 g, 60%於油中, 0.55 mmol)，隨後再攪拌15分鐘，以形成苯酚鈉鹽。然後添加染料(2) (0.150 g, 0.225 mmol)並將混合物在RT下攪拌過夜。在真空下去除DMF並將殘餘物溶解於小體積之二氯甲烷中並藉由矽膠層析利用增加梯度之於二氯甲烷中之甲醇(0-6%，以1%增量)溶析來純化，以提供呈綠色固體之CypH-11 (51.0 mg, 28.5%)。 1H NMR (500 MHz, CDCl 3) δ7.99 (d, J= 14.1 Hz, 2H), 7.33-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 2H), 6.95 (d, J= 9.1 Hz, 2H), 6.82 (d, J= 9.1 Hz, 2H), 6.21 (d, J= 14.1 Hz, 2H), 4.96-4.87 (m, 2H), 3.94-3.86 (m, 1H), 2.76 (t, J= 6.0 Hz, 4H), 2.63 (s, 3H), 2.10-2.00 (m, 2H), 1.66 (d, J= 7.0 Hz, 12H), 1.35 (s, 12H), 1.07 (d, J= 6.6 Hz, 6H)。 13C NMR (126 MHz, CDCl 3) δ171.81, 165.23, 152.98, 146.18, 142.71, 141.85, 141.05, 128.22, 124.54, 123.07, 122.26, 116.84, 114.98, 112.76, 100.48, 50.97, 48.94, 48.75, 30.63, 28.19, 24.77, 21.22, 19.72, 18.83。 實例 3
以下實例顯示本揭示內容之化合物、其合成及表徵及方法。
近紅外pH反應性螢光染料CypH-11經設計以作為敏感性癌症噴霧劑以在手術操作期間突顯癌組織，最小化外科醫師之主觀判斷。CypH-11 (pKa 6.0)在中性pH下幾乎不發射螢光，但在酸性環境(癌細胞增殖之普遍結果)中發出明亮的螢光。在局部施加後，CypH-11被快速吸收，且其在癌性組織中之螢光信號在1分鐘內顯影。信號背景比在1及10 min時分別為1.3及1.5。螢光性質及近瞬時信號顯影能力使「即噴即見」概念成為可能。此快速作用之CypH-11噴霧劑可作為螢光指引手術之方便有效工具，即時鑑別小的癌性病灶以最佳切除而無全身毒性。
pH 反應性螢光 CypH-11 之設計及表徵. 腫瘤微環境中由增強之醣分解造成之酸性pH係廣泛用於腫瘤診斷及療法開發之靶標。pH反應性螢光染料CypH-1先前係藉由將pH敏感性胺基部分安裝於NIR花青螢光團上來製得(圖12A)。在生理pH (pH = 7.4)下，二甲基胺基苯酚基團未質子化且CypH-1由於光誘導之電子轉移(PeT)淬滅而展現極低螢光。而在酸性條件下，CypH-1上之胺基經質子化且PeT淬滅被阻斷，導致高螢光恢復(圖12)。當藉由IP注射在鼠類卵巢癌模型中測試時，CypH-1在微小病灶中之螢光顯著高於正常組織，但藉由噴塗未能偵測到卵巢腫瘤，此可能係由於其低pK a(pK a= 4.7)。因此，此螢光探針之pK a不適於藉由噴塗最佳成像。慮及腫瘤中之pH為約6.2-6.9且正常組織中之pH為7.4，因此pK a接近6.2-6.9窗之螢光探針將係較佳的。因此，CypH-1之4-(二甲基胺基)苯酚部分經更富電子之4-( N-異丙基, N-甲基)胺基苯酚基團取代，且吲哚啉鎓環上之甲基經推電子異丙基替換，以提供更優化染料CypH-11 (圖12B)。
CypH-11係藉由使4-( N-異丙基, N-甲基)胺基苯酚與螢光團1在鹼性條件下反應來合成(圖17A)。各別吸收及發射峰分別集中於765 nm及785 nm (圖17B)，且CypH-11在pH 4.0下之量子產率( Φ)為3.3%。如所設計，CypH-11顯示顯著較CypH-1 (pK a= 4.7)高之pK a值(pK a= 6.0)。CypH-11及CypH-1二者在中性及鹼性溶液中均顯示低螢光，但在酸性溶液中顯示強螢光(圖12C及12D)。在不同pH溶液中之滴定曲線及影像證實CypH-11在生理環境(pH 5.0-7.0)中對pH變化更敏感。具有相似激發及發射波長之市售pH不敏感螢光團Cy7作為參考包括在生物研究中。Cy7在所有pH下均發出明亮的螢光且未展現pH依賴性(圖18)。
在癌細胞中評估 CypH-11.使用卵巢癌細胞系OVASAHO來評估CypH-11、CypH-1及Cy7之性能。OVASAHO細胞與各別探針(2 µM)一起培育1 hr，並在含染料之培養基的存在下擷取細胞螢光影像(圖13A)。在CypH-11及CypH-1處理之細胞中觀察到強細胞內螢光及低培養基螢光，但Cy7處理之細胞顯示過飽和螢光。此顯著差異係由於CypH-11及CypH-1之pH敏感性。二者在細胞培養基(pH = 7.4)中均具有低螢光，但其螢光在進入細胞酸性隔室時啟動。與此相比，Cy7在生理pH範圍內顯示持續高螢光。用新鮮培養基洗滌之後，再次擷取細胞影像(圖19)。CypH-11及CypH-1處理之細胞二者均顯示高螢光，此指示其顯著細胞滲透及滯留，但Cy7觀察到極暗淡螢光，此指示其差的細胞滲透或滯留。染料之細胞內分佈係藉由利用粒線體、溶酶體及核追蹤劑共染色來研究(圖13B)。CypH-11及CypH-1二者均顯示與粒線體追蹤劑之重疊(Pearson值：分別為0.70及0.90)遠多於溶酶體追蹤劑。此外，利用OVASAHO細胞之細胞毒性研究顯示，利用2 µM CypH-11或CypH-1處理1 hr不會顯著影響細胞存活率，細胞存活率分別為91.0 ± 4.6%及95.5 ± 6.9% (圖13C)。
藉由噴塗偵測皮下腫瘤 .為經由「即噴即見」技術評估螢光探針之活體內性能，使用OVASAHO皮下腫瘤模型。為實現容易的信號共配準，首先將細胞工程化以表現紅色螢光蛋白(RFP)。將OVASAHO/RFP-Luc細胞皮下接種於兩側側腹中後2週，腫瘤大小達到約5 mm。去除腫瘤區域之皮膚，然後將CypH-11或Cy7溶液(2 µM，於PBS中)一次性噴塗於暴露區域。在不洗滌之情況下在不同時間點連續捕獲全身螢光影像(圖14A)。腫瘤組織藉由其固有RFP螢光便捷地進行描畫。由CypH-11生成之NIR螢光在腫瘤區域中展現近瞬時顯影(＜ 1 min)，但在相鄰正常區域中不顯影，且在10 min內達到其平臺期。與此相比，Cy7由於其pH不敏感之「常開」性質而在整個噴塗區域中顯示強螢光。
將CypH-11及CypH-1噴塗於腫瘤兩側上用於並排比較。CypH-11僅在腫瘤上顯示高螢光，但在正常組織上不顯示，而CypH-1在腫瘤及相鄰正常組織二者中均顯示極差的螢光增強(圖14B)。然後利用PBS洗滌噴塗區域，且發現信號保留於腫瘤上，此指示CypH-11由腫瘤組織吸收且信號係自內部顯影(圖14B)。在切除之腫瘤及相鄰正常組織上觀察到類似結果(圖14C)。將該三種染料之腫瘤對肌肉信號比相對於時間進行繪圖(圖14D)。在噴塗CypH-11之後立即在腫瘤中偵測到顯著位準之螢光信號，且信號持續增加直至10 min。在1、5及10 min時之信號背景比分別為1.3、1.4及1.5。與此相比，暗CypH-1與常開Cy7之腫瘤與肌肉比保持約1.0，此指示其無法偵測到腫瘤。
在第二皮下腫瘤模型SKOV3/GFP-Luc進一步評估CypH-11，以確認OVASAHO腫瘤染色並非單一發生。在手術區域噴塗CypH-11後，觀察到腫瘤周圍之快速信號顯影(圖15A)。與指示腫瘤確切位置之GFP信號相比，NIR信號在SKOV3腫瘤之邊界處最高。感興趣地，信號模式與在OVASAHO腫瘤中所見者不同，OVASAHO腫瘤之信號在該區域內相當一致。SKOV3腫瘤中信號增加之趨勢與在OVASAHO腫瘤中所見者相似(圖15B)，信號背景比在1、5及10 min時分別達到1.3、1.4及1.6。如前所述，PBS洗滌不能洗掉螢光信號，此支持經噴塗CypH-11之內化(圖15A)。
為評估噴塗後腫瘤中之CypH-11分佈，將腫瘤切除並切成14 µm厚切片。切片用H&E及DAP核染色劑染色。在螢光顯微鏡下，GFP及DAPI螢光信號均勻分佈於整個腫瘤中，但CypH-11信號主要在腫瘤之外層(圖15C)。高倍影像顯示NIR信號深度為約2-3層細胞(圖20A)。此淺表面滲透可歸因於與所噴塗CypH-11之短暫且有限接觸。
在所收集之組織上探索CypH-11之使用。若成功，則使用CypH-11可應用於術後組織評估。當將CypH-11噴塗於活體動物之組織上時，信號快速顯影並留在腫瘤中(圖21A)。儲存後數週至數月仍可偵測到切除組織中之信號。相反，當首先收集腫瘤及肌肉組織，且然後將CypH-11噴塗於該等20 min前之「死」組織上時，未偵測到NIR信號(圖21B)，此指示僅活組織可吸收並局部轉化所應用螢光CypH-11。
藉由腹膜內遞送之 CypH-11 偵測微小彌漫性卵巢腫瘤. 在CypH-11之有希望局部「即噴即見」應用之後，瞭解此快速反應之螢光染料是否可用於快速偵測腹膜內彌漫性小卵巢腫瘤亦令人感興趣。為模擬腹膜彌漫性卵巢癌，將SKOV3/GFP-Luc細胞直接注射於小鼠腹腔中且然後藉由監測D-螢光素誘導之生物發光來追蹤腫瘤生長。需要約兩週以達到強生物發光信號，此指示腫瘤生長。CypH-11 (2 µM, 200 µL於PBS中)經腹膜內投與，且1小時後手術暴露腹腔，且在不洗滌之情況下立即擷取亮場及NIR螢光影像。GFP信號指示腫瘤位置，且NIR螢光係由CypH-11產生(圖16A)。由於CypH-11之螢光性質，背景信號在正常組織及器官中極低，因此不需要洗滌步驟。觀察到CypH-11產生之螢光與腫瘤GFP信號之間之良好重疊。在僅可報告腹腔上之大表面腫瘤(＞3 mm)之全身成像後，收集組織及主要器官(脾、胃、肝及腸)以鑑別小及經遮蔽腫瘤。放大視圖亦顯示腫瘤與CypH-11信號之間之期望相關性(圖16B)。所有可變大小之腫瘤均被突出顯示，且信號為腹膜、肝及腸道之背景的3至4倍(圖16C)。更重要地，清晰地偵測對外科醫師而言係巨大挑戰之小至1 mm之腫瘤。組織學分析亦顯示，CypH-11主要在腫瘤外層中，但信號在1小時內下降至6-7層細胞(圖16D及20B)。與藉由噴塗施加相比，此處觀察到之更深CypH-11滲透可能係由於與較大體積之CypH-11溶液的較長時間接觸。
討論
FGS由於其即時可視化能力而係新興技術。借助於腫瘤特異性螢光探針，在激發光下，外科醫師能夠藉助攝影機「看到」螢光腫瘤。局部可噴塗探針在手術程序期間可極其有價值，特別地對於小腫瘤鑑別及腫瘤邊緣確認而言。在需要時，可將探針噴塗於可疑區域，以突顯是否存在任何癌組織以進行切除，或其是否係欲避免之正常組織，由此改良安全性。最近，至少兩種局部藥物β-半乳糖苷酶敏感之SPiDER-βGal及γ-麩胺醯基轉肽酶敏感之gGL-HMRG已報告可偵測腫瘤，但其應用僅限於表現靶向酶之腫瘤。為獲得用於瞬時腫瘤可視化之通用「即噴即見」探針，探針應靶向一般癌症標誌且信號轉換應係腫瘤特異性及近瞬時的。由於腫瘤酸中毒係癌細胞增殖及生長之普遍結果，且質子化反應係瞬時的，因此設計腫瘤pH敏感之螢光CypH-11以使癌組織成像，而無需洗掉過量染料。
CypH-11係衍生自先前開發之NIR花青染料CypH-1。儘管CypH-1係pH反應性的，但其pKa並未針對腫瘤環境中之pH進行最佳化。不欲受任何特定理論約束，pKa更接近腫瘤環境pH之染料將係用於腫瘤偵測之經改良染料。推電子基團之引入將CypH-11之pKa升高至6.0。在鹼性條件下，由於異丙基-甲基胺基上之孤對電子與CypH-11之花青主鏈之間之PeT效應，螢光被猝滅(圖12B)。在酸性條件下，胺基經質子化且孤對電子被掩蔽，產生強烈螢光信號。溶液中探針螢光輸出之量測顯示，CypH-11在pH 6.0-6.5下之正規化螢光為CypH-1的約3.4倍(圖12C及12D)。
細胞成像實驗證實螢光性質之益處(圖13)。CypH-11及CypH-1在中性培養基中均給出極低之背景信號(pH = 7.4)，因此其在細胞內酸性隔室之分佈清晰地可視化而無需洗滌步驟，而高度螢光pH不敏感之Cy7在細胞培養及活體內均壓製一切。CypH-1在噴塗於腫瘤區域上時顯示最小信號增強，此可能係由於其低pKa導致無效螢光開啟。與此相比，CypH-11突顯腫瘤並以最小背景信號描繪腫瘤邊緣(圖14及15)。由於質子化步驟幾乎係瞬間反應，故腫瘤中之CypH-11螢光啟動迅速(＜ 1 min)，幾乎不需要等待時間。立即可視化原位螢光轉換之能力係噴塗劑之關鍵特徵。
先前已證實，與IV投與者相比，IP投與之基於聚合物之蛋白酶可激活探針使得更好的偵測小型卵巢腫瘤，且IP投與之CypH-1有效偵測小的腫瘤。在此研究中，顯示IP注射之CypH-11能夠在1小時內標記極小之卵巢腫瘤(＜1 mm)，且在成像前不需要洗滌步驟(圖16)。基於此快速反應率及腫瘤選擇性，IP遞送之CypH-11可容易地轉化為臨床用於最佳細胞減滅術。
腫瘤中CypH-11螢光信號顯影係藉由與腫瘤組織直接接觸。由於局部噴塗遞送及有限的探針溶液，NIR信號限制於頂層細胞係合理的(圖20)。由於酸性pH係通用癌症標幟物，因此pH敏感之噴塗技術可用於多種類型之表淺性腫瘤，例如卵巢癌、宮頸癌及結腸癌。利用最大程度細胞減滅術(無眼觀殘留病灶)治療之III或IV卵巢癌患者之研究證實，最佳細胞減滅術之每10%增加與中位存活期之5.5%增加相關。與具有殘留腫瘤之患者相比，在最佳細胞減滅術後無殘留腫瘤之患者中報告多於13個月之延長中位存活期，此指示徹底的手術細胞減滅術係存活期之最重要預後指標。遺憾地，當前手術係不充分的，此乃因在40%之時間下不能去除所有腫瘤以及殘留微小及未偵測到之腫瘤結節。如CypH-11一樣可增強外科醫師之在術中程序期間可視化、然後切除疾病組織之能力的噴塗劑可係有力的。
結論
CypH-11係簡單的pH敏感螢光基團，其在中性pH下展現可忽略之螢光，但在溫和酸性條件下開啟快速明亮螢光。其6.0之pKa值極適於偵測腫瘤相關之pH變化。已使用皮下腫瘤模型證明其作為噴霧劑偵測腫瘤及確定腫瘤邊緣之成像潛力。其偵測小型卵巢腫瘤之能力藉由在彌散性腫瘤模型中IP投與CypH-11進一步證實。
材料及方法
化學合成之一般資訊 .用於合成之所有化學品及溶劑均購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)或Fisher Scientific (Waltham, MA)。用於合成CypH-11之4-( N-異丙基, N-甲基)胺基苯酚及化合物1係經由所報告程序在適當修改之情況下下進行合成。化合物CypH-1係如先前所報告合成且Cy7係自GE Healthcare (Chicago, IL)購買。二者均用於與CypH-11比較其成像能力。將化合物及中間體分離並利用矽膠急速層析純化。 1H及 13C NMR光譜係在Bruker Ascend-500光譜儀上收集及高解析度質譜(HRMS)係在PE Sciex API 100質譜儀上收集。
CypH-11 之合成及表徵 .向4-( N-異丙基, N-甲基)胺基苯酚(81 mg, 0.491 mmol)於無水 N,N-二甲基甲醯胺(DMF, 5 mL)中之溶液中添加氫化鈉(NaH, 22 mg, 60%於油中，0.55 mmol)。將反應攪拌15分鐘以形成苯酚鈉鹽。然後添加化合物1 (150 mg, 0.225 mmol)並將混合物在室溫下攪拌過夜。完成後，在真空下去除DMF溶劑。殘餘物使用矽膠層析利用增加梯度之於二氯甲烷中之甲醇(0 - 6%)來純化。獲得呈綠色固體之CypH-11化合物(0.051 mg, 28.5%)。 1H NMR (500 MHz, CDCl 3) δ7.99 (d, J= 14.1 Hz, 2H), 7.33-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 2H), 6.95 (d, J= 9.1 Hz, 2H), 6.82 (d, J= 9.1 Hz, 2H), 6.21 (d, J= 14.1 Hz, 2H), 4.96-4.87 (m, 2H), 3.94-3.86 (m, 1H), 2.76 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 2.63 (s, 3H), 2.10-2.00 (m, 2H), 1.66 (d, J = 7.0 Hz, 12H), 1.35 (s, 12H), 1.07 (d, J = 6.6 Hz, 6H)。 13C NMR (126 MHz, CDCl 3) δ 171.81, 165.23, 152.98, 146.18, 142.71, 141.85, 141.05, 128.22, 124.54, 123.07, 122.26, 116.84, 114.98, 112.76, 100.48, 50.97, 48.94, 48.75, 30.63, 28.19, 24.77, 21.22, 19.72, 18.83. ESI-HRMS：對於[C 46H 58N 3O] +：預期值 m/z= 668.4580 [M] +；實驗值 m/z= 668.4557 [M] +；3.4 ppm誤差。
光譜分析 .將CypH-11、CypH-1及Cy7之原液(1 mM於DMSO中)儲存於-30℃冰箱中並用於隨後試驗。對於pKa量測，將各別化合物於20 mM磷酸鹽緩衝溶液(PBS, pH 2.0-11.0)中稀釋至2 µM之最終濃度。螢光強度( λ ex= 725 nm及 λ em= 785 nm)係在讀板儀(Tecan Infinite M1000 Pro)上量測，且螢光影像係利用螢光成像系統(Bruker In-vivo F Pro)記錄。對於量子產率量測，使用靛青綠(ICG, Φ= 1.2%於水中)作為標準化合物。於PBS溶液(pH = 4.0及pH = 7.4)中之各別化合物(0.4、0.8、1.2、1.6及2.0 µM)係使用Cary 60 UV-Vis分光光度計及Cary Eclipse螢光分光光度計(Agilent)量測。將螢光對吸光度之斜率與ICG之斜率進行比較以計算相對量子產率。
細胞系及培養 .卵巢癌OVASAHO細胞系係自JCRB細胞庫(Osaka, Japan)購得，OVSAHO/RFP-Luc細胞經FLus-F2A-RFP-IRES-Puro慢病毒屬(Biosettia, San Diego, CA)轉導並利用嘌呤黴素進行選擇，且SKOV3/GFP-Luc細胞係自Cell Biolabs (San Diego, CA)購得。OVASAHO及OVASAHO/RFP-Luc細胞係在37℃在5% CO 2下維持於補充有10%胎牛血清(FBS)及1%青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基中，且SKOV3/GFP-Luc細胞係在37℃在5% CO 2下維持於補充有10%胎牛血清(FBS)及1%青黴素/鏈黴素之McCoy’s 5A培養基中。
活體外螢光顯微鏡術 .使用OVASAHO細胞以比較CypH-11、CypH-1及Cy7之細胞性能及細胞分佈。將OVASAHO細胞(1.0 × 10 4)接種於96孔黑板(Corning, NY)上並在補充培養基中培育24 hr。添加化合物(2 μM)並將細胞培育1 hr。在PBS洗滌之前，利用螢光顯微鏡(Cy7濾光片，激發：690-730 nm及發射：770-850 nm)擷取細胞螢光影像。PBS洗滌(3×)之後，再次擷取細胞影像。對於共定位實驗，將OVASAHO細胞(5.0 × 10 3)在具有透明且平坦底部之96孔板(ibiTreat, 180 µm蓋玻片, ibidi)上培育。用CypH-11 (2 µM)或CypH-1 (2 μM)處理1 hr後，將細胞用培養基(3×)洗滌。將細胞用Mitoview Green (Biotium, Parkway Fremont, CA)染色15 min或Lysoview 488 (Biotium)染色30 min。在用培養基(3×)洗滌之後，細胞進一步用DAPI (Invitrogen)染色10 min。在用新鮮細胞培養基更換該培養基之後，使用螢光顯微鏡(EVOS)擷取螢光影像。CypH-11及CypH-1影像係利用Cy7濾光片獲得，DAPI影像利用DAPI濾光片(激發：352-402 nm及發射：417-477 nm)獲得，Mitoview Green及Lysoview 488影像係利用GFP濾光片(激發：457-487 nm及發射：502-538 nm)獲得。
細胞存活率 .CypH-11及CypH-1之細胞存活率係使用來自Dojindo (Rockville, MD)之細胞計數套組-8 (CCK-8)評估。將OVASAHO細胞(5.0 × 10 3)接種於96孔板上並培養24 hr。然後將細胞利用CypH-11 (2 µM)及CypH-1 (2 µM)處理1 hr。用新鮮細胞培養基更換該培養基之後，將細胞再培育72 hr。細胞存活率係藉由利用CCK-8溶液將其處理3 hr且然後使用讀板儀在450 nm下讀取吸光度來檢查。
皮下植入物及腹膜植入物之腫瘤模型 .所有動物程序均按照威爾康奈爾醫學院(Weil Cornell Medical College)動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准之動物協議及指南實施。小鼠(雌性，SCID無毛遠親雜交小鼠)係自Charles River (Wilmington, MA)購得。為建立皮下植入物，將OVASAHO/RFP-Luc細胞(5.0 × 10 6)或SKOV3/GFP-Luc細胞(5.0 × 10 6)於100 µL PBS中之懸浮液在兩側接種於雌性裸小鼠之每一側腹。兩週後，腫瘤植入物生長至大小為約5 mm並用於噴塗實驗。為建立腹膜植入物，將懸浮於200 µL PBS中之SKOV3/GFP-Luc細胞(5.0 × 10 6)注射於雌性裸小鼠之腹腔中。兩週後，利用活體內生物發光成像系統檢查腫瘤生長，隨後腹膜內注射D-螢光素鉀溶液(200 µL, 15 mg/mL)達10 min。通常，使用具有直徑為5 mm大小之多個彌漫性腹膜植入物之小鼠用於實驗。
皮下腫瘤之活體內螢光成像 .使用兩個皮下腫瘤模型(OVASAHO/RFP-Luc及SKOV3/GFP-Luc)來比較CypH-11、CypH-1及Cy7之成像能力。將具有皮下植入物之小鼠在吸氣室中使用2%異氟醚進行麻醉，並利用1.5-2.0%異氟醚經由鼻錐維持麻醉。使用無菌手術工具以去除腫瘤周圍之皮膚。使用來自PerkinElmer (Waltham, MA)之IVIS SpectrumCT系統擷取小鼠影像。OVASAHO/RFP-Luc及SKOV3/GFP-Luc腫瘤分別在RFP通道(激發：520-550 nm及發射：570-590 nm)及GFP通道(激發：450-480 nm及發射：510 530 nm)下擷取。施加Cy7通道(激發：730-760 nm及發射：790-810 nm)以評估由CypH-11、CypH-1及Cy7產生之螢光。在皮膚去除後，首先在Cy7通道下量測腫瘤區域及背景螢光。將CypH-11、CypH-1及Cy7之溶液(各自2 µM)噴塗於手術區域上，並在每一時間點(1、3、5、7、10及15 min)連續量測Cy7通道之螢光。分別使用十個、五個及三個OVASAHO腫瘤用於評估CypH-11、CypH-1及Cy7。使用六個SKOV3腫瘤用於評估CypH-11。為評估腫瘤對正常組織比，繪製整個腫瘤區及毗鄰裸露皮膚區域，並藉由IVIS軟體獲得其螢光強度。腫瘤對正常組織比值計算為腫瘤之平均螢光強度除以正常區域之平均螢光強度。而且，藉由二氧化碳吸入或高劑量之異氟醚(5%)使攜帶腫瘤之小鼠安樂死。然後提取皮下腫瘤及毗鄰肌肉，並將CypH-11 (2 µM)噴塗於其上。隨後在GFP/RFP/Cy7通道下擷取影像。
彌漫性腹膜腫瘤之活體內螢光成像 .為進一步評估CypH-11突顯腹腔中彌漫性微小轉移之成像能力，植入SKOV3/GFP-Luc腫瘤並使其在小鼠腹腔中生長並彌漫，此類似於卵巢癌患者中之彼等。攜帶腫瘤之小鼠經腹膜內注射於PBS中之CypH-11溶液(200 µL, 2 µM)。1 hr後，小鼠在吸氣室中使用2%異氟醚進行麻醉，並利用1.5至2%異氟醚經由鼻錐維持麻醉。使用無菌手術工具打開腹部腔室。在GFP及Cy7兩個通道下擷取整個腔室之螢光影像。成像之後，利用高劑量之異氟醚(5%)使小鼠安樂死。並收集彌漫性腫瘤及所關注之主要器官(即，心臟、肝、肺、腎臟、脾、胃及腸)。將所收集器官放置於玻璃板上並在GFP及Cy7兩個通道下成像。繪製腹腔中腫瘤結節內及毗鄰正常區域中之所關注區(ROI, n = 6，且平均面積= 0.28 ± 0.1 cm 2)並計算腫瘤對正常組織比。
組織學 .為在經由噴塗及i.p.注射投與後獲得關於CypH-11在腫瘤中之分佈的資訊，將腫瘤切除並進行分析。首先將腫瘤嵌入具有最佳切割溫度(OCT)化合物(Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA)之模具中，置於乾冰上達20 min。使用低溫切片機將冷凍組織切片至期望厚度(14 µm)。將切片儲存於-80℃下，直至進一步使用。首先利用螢光顯微鏡(EVOS, Thermofisher Scientific, Waltham, MA)使切片成像，且隨後用蘇木素及伊紅Y溶液(H&E)染色，以在光學顯微鏡下評估其組織學改變。
統計分析 .將細胞毒性、螢光比率及組織學分析應用於未配對t測試。所有p值均為雙尾型，且p值＜ 0.05視為顯著的。所繪製值以平均值±標準偏差代表。統計分析係使用GraphPad Prism (GraphPad Software Inc, San Diego, CA)實施。
儘管已關於一或多個特定實施例及/或實例闡述本發明，但應理解，可做出本發明之其他實施例及/或實例而不背離本發明之範圍。
為更全面理解本發明之性質及目的，應參考結合附圖做出之以下詳細說明。
圖1顯示本揭示內容之化合物。
圖2顯示本揭示內容之化合物。
圖3顯示在pH 5.0及7.5下之發射最大值及強度差異。
圖4顯示本揭示內容化合物之螢光光譜。
圖5顯示本揭示內容化合物之細胞毒性數據。CCK8 MMT分析係使用具有0.1% DMSO之1 µM之每一化合物以及RPMI實施。將細胞培育0.5或1小時，用新鮮培養基洗滌，且然後培育3天。
圖6顯示CypH-11 (2 µM於pH 5.0磷酸鹽緩衝溶液中)之吸光度及螢光光譜。Ex max= 766 nm及Em max= 785 nm。
圖7顯示pH反應性CypH-11及pH不敏感Cy7之比較。
圖8顯示CypH-1及CypH-11之比較。
圖9顯示CypH-11、CypH-1及Cy7在不同時間點之腫瘤/肌肉對比率。
圖10顯示本揭示內容化合物之一般合成方案。
圖11顯示CypH-11之合成方案。
圖12顯示CypH-11及CypH-1之化學結構及表徵。(A) CypH-1之結構 (B) CypH-11藉由質子化之螢光激活示意圖。(C) CypH-11及CypH-1之pKa值之量測(分別為6.0及4.7)。使用讀板儀量測其在pH範圍(2.0-11.0)中之螢光強度(λ ex= 725 nm及λ em= 785 nm)。(D) CypH-11及CypH-1在96孔板中在不同pH下之螢光影像。
圖13顯示CypH-11、CypH-1及Cy7之細胞成像及細胞內定位。(A) OVASAHO細胞與CypH-11、CypH-1及Cy7 (各自2 µM)一起培育1 hr並在不洗滌之情形下擷取細胞影像。比例尺：50 µm。(B) CypH-11及CypH-1與粒線體及溶酶體之共定位。OVASAHO細胞與CypH-11及CypH-1 (各自2 µM)一起培育1 hr，然後細胞利用細胞器追蹤劑(粒線體或溶酶體追蹤劑)進一步染色10 min。利用NIR通道(激發：690-730 nm及發射：770-850 nm)及GFP通道(激發：457-487 nm及發射：502-538 nm)擷取細胞影像。比例尺：50 µm。(C) CypH-11及CypH-1之細胞存活率。OVASAHO細胞首先利用CypH-11或CypH-1 (各自2 µM)處理1 hr，且然後在利用新鮮細胞培養基替換舊培養基之後使細胞再生長72 hr。細胞存活率係利用CCK分析評估。每一行代表三個單獨實驗之平均值。
圖14顯示CypH-11、CypH-1及Cy7在皮下OVASAHO/RFP-Luc腫瘤模型中之活體內及離體影像。(A) 在手術區域(10個腫瘤用於CypH-11且3個腫瘤用於Cy7)上噴塗CypH-11及Cy7 (各自2 µM)之前及之後，裸小鼠在不同時間點之代表性白光及螢光複合影像。RFP影像指示腫瘤大小及位置，且NIR影像顯示噴塗後CypH-11及Cy7螢光變化。比例尺 = 1 cm。(B) 在噴塗CypH-11 (2 µM, 右側腹)及CypH-1 (2 µM, 左側腹)之前及之後之白光及螢光複合影像。比例尺 = 1 cm。(C) 噴塗探針之後切除之腫瘤及肌肉之離體螢光影像。比例尺 = 1 cm。(D) 在手術區域上噴塗探針之後在不同時間點之腫瘤對正常組織之螢光比率。
圖15顯示CypH-11在皮下SKOV3/GFP-Luc腫瘤模型中之活體內影像。(A) 裸小鼠在噴塗CypH-11 (2 µM, 6個腫瘤)之前及之後不同時間點之代表性白光及螢光複合影像。GFP影像指示腫瘤位置及大小，且CypH-11影像指示CypH-11產生之NIR螢光。比例尺 = 1 cm。(B) 在手術區域上噴塗CypH-11之後在不同時間點之腫瘤對正常組織之螢光強度比率。N = 6. (C) 腫瘤之螢光信號與CypH-11信號之組織學相關性。GFP及DAPI信號貫穿整個腫瘤切片，且CypH-11之NIR信號僅在邊緣處。比例尺=100 μm。
圖16顯示在IP投與CypH-11之後在腹腔中彌漫性SKOV3/RFP-Luc腫瘤之活體內及離體白光及螢光複合影像。(A) 三個代表性小鼠在IP投與CypH-11 (200 µL 2 µM溶液)後1 h成像。GFP指示彌漫性腫瘤之位置及大小(頂部列)，且CypH-11影像指示由CypH-11產生之螢光信號(底部列)。比例尺 = 1 cm。(B) 切除之攜帶腫瘤之器官(腫瘤、脾、胃、肝及腸)之離體白光及螢光複合影像。比例尺 = 5 mm。(C) IP投與後SKOV3小鼠之組織對腹膜之螢光強度比率。(D) 腫瘤之螢光信號與CypH-11信號之組織學相關性。比例尺=100 μm。
圖17顯示CypH-11之化學合成及光譜。(A) CypH-11之合成方案 (B) CypH-11於pH=5 PBS緩衝液中之正規化吸收及發射光譜，Ex max= 765 nm；Em max= 785 nm。
圖18顯示來自GE Healthcare之Cy7之化學結構及光學性質。(A) Cy7之結構。(B) Cy7使用讀板儀在不同pH下之螢光強度量測(λ ex= 725 nm及 λ em= 785 nm)。(D) Cy7在96孔板中在不同pH下之螢光影像。
圖19顯示OVASAHO細胞與CypH-11、CypH-1及Cy7 (各自2 µM)一起培育1 hr，用PBS洗滌且然後成像。比例尺：50 µm。細胞影像係利用NIR通道(激發：690-730 nm及發射：770-850 nm)擷取。
圖20顯示在噴塗及IP注射腫瘤中CypH-11信號之深度測定(40X)。(A) 細胞核DAPI染色顯示噴塗之CypH-11在15 min內僅可穿透2-3層細胞。(B) IP注射之CypH-11在1小時內能夠達到6-7層細胞。比例尺 = 50 µm。
圖21顯示在活及死組織中CypH-11信號顯影。(A) 活體內噴塗。首先將CypH-11噴塗於活體動物之組織上且然後20 min後切除組織。觀察到腫瘤GFP與NIR信號之良好相關性。(B) 離體噴塗。將組織切除，保持20 min且然後用CypH-11噴塗。在腫瘤或肌肉中未觀察到CypH-11信號，此指示死組織不能生成CypH-11信號，可能係由於探針之差攝取。比例尺 = 5 mm。
圖22顯示CypH-11之表徵數據。(A) 1H NMR；(B) 13C NMR；及(C) 質譜分析。

Claims (26)

  1. 一種化合物，其具有以下結構： ， 其中 X係陰離子； Y係NH、NR 10或CR 11R 12； Z係選自O、S或Se之雜原子； R及R 1獨立地選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、正丁基、第三丁基及其組合； R 2及R 3獨立地選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、正丁基、第三丁基及其組合； R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11及R 12獨立地選自氫、烷基及其組合， 前提條件係該化合物不具有以下結構： 。
  2. 如請求項1之化合物，其中該化合物具有以下結構： 。
  3. 如請求項2之化合物，其中該化合物具有以下結構 或 。
  4. 如請求項3之化合物，其中該化合物具有以下結構： 。
  5. 一種組合物，其包含如請求項1之化合物及醫藥上可接受之載劑。
  6. 如請求項5之組合物，其中該化合物之濃度係0.5至10 µM。
  7. 如請求項5之組合物，其中該組合物係可噴塗組合物或口腔沖洗劑。
  8. 一種用於確定需要治療之個體中實體腫瘤之存在及/或位置之方法，其包含： 將如請求項1之化合物或包含該化合物之組合物投與或施加至該個體上/該個體中之所關注區域； 將該所關注區域暴露於近紅外電磁輻射；及 成像及/或可視化該所關注區域， 其中確定該實體腫瘤之該存在及/或位置。
  9. 如請求項8之方法，其中自該暴露生成信號且該信號係在少於5分鐘內偵測到。
  10. 如請求項9之方法，其中該信號係在少於1分鐘內偵測到。
  11. 如請求項8之方法，其中該投與/施加係局部投與/施加。
  12. 如請求項11之方法，其中該局部投與/施加係噴塗或口腔沖洗。
  13. 如請求項8之方法，其中該實體腫瘤選自卵巢腫瘤、皮膚癌、胰臟癌、泌尿生殖系統癌、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、腦瘤、食管腫瘤、子宮頸腫瘤、口腔腫瘤及其組合。
  14. 如請求項8之方法，其中該投與/施加至該實體腫瘤導致該化合物之質子化。
  15. 一種使實體腫瘤成像之方法，其包含： 將如請求項1之化合物施加或投與至該實體腫瘤； 將所關注區域暴露於近紅外電磁輻射；及 獲得該實體腫瘤之影像。
  16. 如請求項15之方法，其中在施加或投與該化合物之後，自該暴露生成信號且該信號係在少於5分鐘內偵測到。
  17. 如請求項16之方法，其中該信號係在少於1分鐘內偵測到。
  18. 如請求項17之方法，其中該投與/施加係局部投與/施加。
  19. 如請求項16之方法，其中該局部投與/施加係噴塗或口腔沖洗。
  20. 如請求項16之方法，其中該實體腫瘤選自卵巢腫瘤、皮膚癌、胰臟癌、泌尿生殖系統癌、腦瘤、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、食管腫瘤、子宮頸腫瘤、口腔腫瘤及其組合。
  21. 一種用於確定實體腫瘤之邊緣的方法，其包含： 將如請求項1之化合物施加或投與至該實體腫瘤； 將所關注區域暴露於近紅外電磁輻射； 成像及/或可視化該所關注區域；及 確定該實體腫瘤之該邊緣， 其中確定該實體腫瘤與非癌性組織之該邊緣。
  22. 如請求項21之方法，其中該施加或投與係噴塗或口腔沖洗。
  23. 如請求項21之方法，其中自該暴露生成信號且該信號係在少於5分鐘內偵測到。
  24. 如請求項23之方法，其中該信號係在少於1分鐘內偵測到。
  25. 如請求項21之方法，其中該實體腫瘤選自卵巢腫瘤、皮膚癌、胰臟癌、泌尿生殖系統癌、腦瘤、結腸腫瘤、膀胱腫瘤、食管腫瘤、子宮頸腫瘤、口腔腫瘤及其組合。
  26. 一種套組，其包含如請求項1之化合物。
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