CN105377309A - 荧光固体脂质纳米颗粒组合物及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了固体脂质纳米颗粒(SLN)，其包括：a)固体脂质核芯，其包括至少一种甘油酯和/或至少一种脂肪酸；b)形成围绕所述核芯a)的壳的两亲性组分的混合物；c)具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物：
Description
本发明涉及药学和诊断组合物领域，特别涉及包含荧光探针的组合物，更特别涉及包含所述探针的固体脂质纳米颗粒。
本发明还涉及仪器诊断学，特别是实时成像引导手术的领域。
发明背景
吲哚菁绿(本文中也称为ICG)是经FDA批准的荧光探针，但是遭受快的代谢清除，因为其通过肝脏快速排除。已知的是在静脉内注射之后，ICG结合至白蛋白并且随后几乎仅被肝实质细胞摄取。当以0.5mg/kg的人推荐剂量施用ICG时，正常的血液半衰期为大约3.0分钟(RosenthalE,ZinnKR编辑，OpticalImagingofCancer:ClinicalApplications.NewYork,NY,USA:Springer；2009年，第72页)。该有效的肝胆排泄防止了ICG在特定病理部位的选择性积累，限制了其可能的临床应用，所述应用实际上主要被局限于在眼部血管造影术，肝功能表征，或心输出量的测量方面的应用的血流的光学检查。
吲哚菁绿被认为是在临床上荧光成像应用方面高灵敏度肿瘤检测和淋巴结的显像的有希望的候选物。尤其希望的是在手术切除病灶或内窥镜手术治疗期间用于癌的病灶和前哨淋巴结检测的实时可视化的ICG的制剂。
然而，如以上所述，由于其在人血液中的非常低的停留时间，当以0.5mg/kg的临床推荐剂量使用时，ICG在静脉内施用之后不具有在肿瘤组织处的任何明显靶向性质。
此外，ICG在水溶液中不稳定(已经在μM浓度)，并且由于其聚集倾向而必须在6小时内使用。染料-染料相互作用随着消光系数的降低和染料激发后的荧光自猝灭效应而对ICG的光学性质有不良影响(Landsman,M.L.；Kwant,G.；Mook,G.A.；Zijlstra,W.G.Lightabsorbingproperties,stability,andspectralstabilizationofindocyaninegreen.J.Appl.Physiol.1976,40,575–83).
SaxenaV.等人(JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology74(2004)29-39)公开了用于改进ICG的水稳定性、光稳定性和热稳定性的聚(DL-乳酸共乙醇酸)和聚乙烯醇聚合物型纳米颗粒。在该工作中，即使负载ICG的纳米颗粒的稳定性由于将ICG包埋于聚合物包囊中而得以改进(在水溶液中显示2.5-3天的半衰期)，但是呈纳米颗粒的ICG就游离的ICG溶液而言仍显示出在其峰值荧光强度方面的降低。该发现连同高粒度分布(平均直径约350nm)可能导致在肿瘤靶向的体内成像方面的低效率。
WO2010/018216公开了ICG吲哚菁绿的荧光纳米乳液，其在油相ICG中包含至少一种两亲性脂质和至少一种在25℃为固体的增溶性脂质。根据该文献，纳米乳液中的液滴应当具有无定型核芯，因为结晶性被认为对有利于将经包封的分子排出至液滴或它们的聚集体外部的纳米乳液稳定性不利。
尽管通过上述纳米颗粒和纳米乳液提供了明显的进步，但将ICG用于近红外成像仍遇到问题。和Adair(WIREsNanomedicineandNanobiotechnology，第二卷，2010年九月/十月，461-477)证实了量子点(QD)在NIR成像中优异的光学和稳定性性质。然而，毒性问题阻碍了它们的使用并且仍建议NIR染料。回顾了ICG在由磷酸钙合成的纳米颗粒中的包封，并且尽管相对于QD的性能较低，但仍建议其临床应用。
Zheng等人(Mol.Pharmaceutics2011,8,447-456)，为了克服ICG的差的水稳定性、其非特异性结合至蛋白质和缺乏靶向特异性的问题，公开了利用磷脂-聚乙二醇(PL-PEG)与ICG之间的非共价自组装化学的含ICG的纳米结构。建议了该纳米结构用于靶向光学成像和光热治疗的双重功能。最近已描述了它们在体内光热治疗中的用途(Zheng等人，Mol.Pharm,2012,9(3):514-522).
Navarro等人(JournalofBiomedicalNanotechnology，第8卷，594-604和730-741,2012)公开了有利于术中荧光的ICG的脂质纳米颗粒向量化(LNP)。在所述工作中，在至多两天量化了ICG-LNP与游离染料注射相比的体内肿瘤/皮肤和体外肿瘤/肌肉荧光比例的改进(在24和48h之间为2倍)。
US2006/0083781公开了固体脂质纳米颗粒，其考虑到它们在肿瘤靶向治疗系统，温敏净荷递送系统，磁驱动靶向系统，治疗诊断系统，稳定化的油墨组合物和化妆品制剂中的应用而被官能化。此外，可修改所开发的方法以包封脂质环境中的量子点，减少它们对氧化性物质的可接近性和与Cd相关的毒性。
Sawant和Dodiya(RecentPatentsonDrugDelivery&Formulation2008,2,120-135)中提供了对待用于脂质纳米颗粒制备的所有方法的现有技术的回顾。为了使纳米颗粒的递送性质最优化，优选需要低于100nm的粒度。相反地，文献中所开发的许多方法为SLN提供了微米范围(Cortesi等人，Biomaterials2002；23:2283-2294)或不低于200nm(Garcia-Fuentes等人，ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces,2003,27:159-168；Morel等人，EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics45(1998)157–163)的平均粒度，即远高于优选的纳米尺度范围。
有利地，在本发明中，纳米悬浮液的制剂显示出低于100nm的粒度且显示出延长的血液循环半衰期和改进的光稳定性和荧光信号。
这些不可预料的结果通过最优化两亲性组分和制备方法而得以实现。
发明简述
现已不可预料地发现，将ICG以及ICG的其它荧光染料类似物连同其它化学结构引入固体脂质纳米颗粒，解决了现有技术的上述问题，还提供了另外的有利之处，其将由本发明的以下公开而明白可见。
本发明的一个目的是固体脂质纳米颗粒(下文也称为SLN或简称为纳米颗粒)，其包括：
a.固体脂质核芯，其包括至少一种甘油酯和/或至少一种脂肪酸；
b.两亲性组分的混合物；
c.以具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物存在的两亲性组分：
其中，基团将在以下说明书中定义。
d.菁家族的荧光染料和/或多杂环化合物(polyetherocycliccompound)，包括香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其药学上可接受的盐。
本发明的另一目的是用于制备所述纳米颗粒的方法。
本发明的另一目的是药物组合物，其包含上述纳米颗粒，尤其是用于诊断。
本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其用作诊断剂。
本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其中分子靶向结构部分存在于纳米颗粒表面上，实现了对所选择的靶器官、组织或细胞的相关结合亲和力。
本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其作为诊断剂用于仪器诊断学中，尤其是实时图像引导手术中。
本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其作为诊断剂用于临床荧光成像应用中的肿瘤检测和淋巴结的显像，尤其是在手术切除病灶或内窥镜/腹腔镜手术治疗期间用于癌的病灶和前哨淋巴结检测的实时可视化。
当用荧光染料负载时，本发明的SLN随着在感兴趣的病理性组织中随后的聚集由于增强的渗透和保留(EPR)效应而允许延长的血液循环半衰期。
根据本发明的SLN由于关于荧光团的游离形式的脂质基质保护效应和改进的荧光信号而显示出增强的光稳定性。
此外，脂质组分可以防止染料受取决于与猝灭剂分子的相互作用的降解因素或受由于临界生物条件(即酸性pH)的化学降解或受光暴露(光致褪色过程)的损害。
最后，将荧光染料配制到根据本发明的SLN中由于由周围组分的空间约束产生的非辐射驰豫速率的降低而改进了染料的荧光量子产率(Φ)。
这些和其它目的以及有利之处将在以下说明书中还借助附图和实施例详细公开。
附图说明
图1展现了本发明的负载ICG的SLN的典型粒度分布。
图2展现了ICG和负载ICG的SLN的光致褪色试验结果。
图3展现了负载ICG的SLN的长期稳定性。
在图4中，画面A展现了负载ICG的SLN在水溶液中于时间点为零(虚线)和在配制120天之后(黑线)的UV-Vis光谱；画面B显示了ICG在水溶液中在不同时间点(时间点为零：虚线；9天：灰色线；15天：黑线)的UV-Vis光谱。
图5展现了用于评价对负载FA-ICG的SLN(靶向的ICG-SLN)的和非靶向SLN(ICG-SLN)的抗叶酸IgG的结合亲和力的激光干涉法试验。
图6展现了在带有IGROV-1异种移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用负载ICG的SLN和负载FA-ICG的SLN之后24h的小鼠(n＝6)的体外分析。
图7展现了在带有IGROV-1异种移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用ICG-SLN(画面A)和FA-ICG-SLN(画面B)之后24h的两代表性小鼠的体外分析。
图8展现了靶向的负载ICG的SLN的光密度(750nm)。
图9展现了实施例1的负载ICG的SLN的DSC。
图10显示了实施例2的负载ICG的SLN的DSC曲线。
发明详述
根据本发明的纳米颗粒包括以下作为基本组分：
a)固体脂质核芯，其包括至少一种甘油酯和/或至少一种脂肪酸；
b)形成围绕所述核芯a)的壳的两亲性组分的混合物；
c)以具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物存在的两亲性组分：
其中基团如下文所定义，或其药学上可接受的盐；
d)菁家族和/或多杂环化合物的荧光染料，包括香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其药学上可接受的盐。
在本发明的另一实施方案中，所述纳米颗粒还包括：
e)具有掩蔽剂(stealthagent)功能的共价连接至所述壳b)的亲水性聚合物。
在本发明的另一实施方案中，所述纳米颗粒还包括：
f)分子靶向结构部分，用于特异性结合至一个病理学相关的生物学标记物，所述结构部分连接至所述壳b)或所述亲水性聚合物e)。
以下百分比组成涉及用于制备SLN的组分a)至f)的量而不考虑最终悬浮液基本上不含的离子型表面活性剂和低分子量醇的贡献。
在下文，组分a)至f)的每一个表示为相对于SLN干组分总重的量的重量/重量％。
固体脂质核芯a)包括至少一种甘油酯，优选甘油三酯和/或至少一种脂肪酸或其酯，或其混合物，其至少在室温(即约20-25℃)至体温(37℃)的温度范围内为固体形式。在本发明的第一实施方案中，所述固体脂质核芯a)包括至少一种甘油酯，其选自甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，具有饱和或不饱和的直链或支链C12-C24酰基链。在甘油二酯和甘油三酯的情况下，所述酰基链可以相同或不同。所述脂肪酸或其酯具有饱和或不饱和的直链或支链C12-C24碳链。出于本发明的目的还提供所述脂肪酸的酯，优选提供具有C12-C24脂肪醇的酯。
出于本发明的目的，“固体脂质核芯”意指在室温(即约20-25℃)至体温(即，约37℃)的温度为固体的脂质核芯。
可以占约30-50％(重量/重量)，优选35-45％的所述固体核芯(本文中也称为“脂质组分”)包括至少一种甘油酯(选自甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，具有长度为12-24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链烃链，具有大于37℃的熔化温度)或其混合物和/或至少一种饱和或不饱和的直链或支链C12-C24脂肪酸或其酯，条件是所选择的比例在上述条件下提供固体组合物。
所述脂质组分还可以为甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的混合物，例如以名称和优选W35、H42、E76、E85或138、142、154已知的市售混合物。
优选地，所述脂质组分由甘油三酯如三棕榈酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三花生酸甘油酯或其混合物组成。根据特别优选的实施方案，所述固体核芯包括三棕榈酸甘油酯(三棕榈精，tripalmitin)。
所述脂质组分优选包括至少一种C12-C24脂肪酸，其烃链可以是饱和或不饱和的、直链或支链的。优选地，所述脂肪酸选自：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸或其混合物。所述核芯任选地包括C12-C24脂肪酸与C12-C24脂肪醇的单酯或二酯。脂肪酸酯组分可以进一步例如通过鲸蜡基棕榈酸酯代表。
优选的脂质组合是三棕榈精和硬脂酸。
根据可选的实施方案，a)中的脂质组分可以包括在水中不溶但是在有机溶剂中可溶的其它脂质。例如，所述脂质可以为酯化的聚(丙烯酸)或酯化的聚(乙烯醇)。尤其是所述脂质可以为被一种或多种醇全部或部分酯化的聚(丙烯酸)。在一个方面，使少于全部的丙烯酸残基酯化。在另一方面，将基本上全部丙烯酸残基酯化。所述聚合物可以为均聚物或共聚物。在一个方面，所述脂质可以包含至少一种C4-C24醇。在一个方面，所述醇可以是饱和或不饱和的，可以是直链或支链的，且可以是未取代或取代的。每个丙烯酸残基处的醇可以相同或可以不同。在另一实施方案中，所述脂质可以为用一种或多种羧酸全部或部分酯化的聚(乙烯醇)。在一个方面，使少于全部的或基本上全部的乙烯醇残基酯化。所述聚合物可以是均聚物或共聚物。在各乙烯醇残基处的羧酸可以相同或不同。
在SLN中，所述脂质组分为固体和呈无定形或晶体形式。
根据特别优选的实施方案，所述固体核芯包括三棕榈精和硬脂酸且为晶体。
关于组分b)，本发明包括使用两亲性化合物作为表面活性剂组分。所述表面活性剂组分选自具有直链或支链的、饱和或不饱和的C6-C24烃链的磷脂类、溶脂类(lysolipids)和鞘脂类；任选至少一种胆固醇和类固醇衍生物、糖脂、脂肪酸、脂肪醇和二烷基醚，非离子型表面活性剂如失水山梨醇衍生物，优选聚氧亚乙基单油酸酯或单棕榈酸酯衍生物(如以商标名AlkestTWTween已知的Polysorbate20)，C6-C24个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酸衍生物的二酯或三酯及其乙氧基化类似物；单糖苷或低聚糖苷及其乙氧基化类似物，在室温和在体温为液体的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。所述表面活性剂组分占SLN的25-60％(重量/重量)。SLN组合物的优选约27-45％且更优选30-38％包含磷脂；
对此，磷脂的实例为二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酰胆碱(乙基-DSPC)、二(十五碳酰)磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PM-PC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1-棕榈酰-2-油基磷脂酰胆碱(POPC)、1-油基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DL-PG)及其碱金属盐、二花生酰磷脂酰甘油(DAPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二花生酰磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二花生酰磷脂酰乙醇胺(DAPE)、二亚油基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二花生酰磷脂酰丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)、二月桂酰磷脂酰肌醇(DLPI)、二花生酰磷脂酰肌醇(DAPI)、二肉豆蔻酰-磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二油酰磷脂酰肌醇(DOPI)或其混合物。
在本发明的一个实施方案中，所述两亲性组分b)包括磷脂，优选天然来源的磷脂。在优选的实施方案中，所述组分b)包括来自大豆卵磷脂的磷脂酰胆碱，其以Epikuron商购可得。天然来源的其它磷脂的实例为Epikuron或EpikuronS75、S100或蛋卵磷脂E80。
两亲性组分也可以包含胆汁酸或其盐，胆固醇和类固醇衍生物，如6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃甘露糖苷、糖脂、脂肪酸、脂肪醇和二烷基醚，所述酸、酯和醇具有直链或支链的C6-C24碳链，生育酚和生育酚半琥珀酸酯(emisuccinate)。
其它两亲性组分还可以包括非离子型表面活性剂，优选失水山梨醇的具有C6-C24碳原子的饱和和不饱和的脂肪酸衍生物的单酯、二酯和三酯及其乙氧基化类似物。在优选的实施方案中，所述组合物包括以Tween商购可得的聚氧亚乙基失水山梨醇单油酸酯和/或类似的化合物如Polysorbate60(60)、Polysorbate40(40)。还可以包括另外的失水山梨醇衍生物如失水山梨醇单棕榈酸酯(40)、失水山梨醇单硬脂酸酯(60)、失水山梨醇单油酸酯(80)。优选地，该组分占SLN的5-20％且甚至更优选占约8-12％。
其它两亲性组分还可以包括单糖苷或低聚糖苷及其乙氧基化类似物，在室温和在体温可溶的甘油单酯、二酯和三酯。在室温和在体温可溶的特征向本领域技术人员指示链长。
所述两亲性组分还包括离子型表面活性剂。在优选的实施方案中，优选的是阴离子型表面活性剂如胆酸、其衍生物或盐。在胆酸类中，特别优选的是：牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸或它们的衍生物或盐，如胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠。在更优选的实施方案中，制剂中包含牛磺胆酸钠盐水合物。还可以包括其它阴离子型表面活性剂如聚烷基磷酸盐、烷基磺酸盐和硫酸盐、具有6至24个碳原子的烷基磺基琥珀酸盐。
制剂中可以包含助表面活性剂试剂。在优选的实施方案中，可以包含具有C3-C8烃链的醇，优选一元醇，例如1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-庚醇和1-辛醇、3-戊醇和4-庚醇。最优选的是：1-丁醇和/或1-己醇。
根据组分c)，本发明包括两亲性化合物作为稳定剂试剂的用途。尤其是，组分c)使得颗粒随时间流逝保持其尺寸并且有助于SLN颗粒稳定性，如试验部分更好详细说明那样。所述两亲性化合物是选自配位化合物的碱土金属的配合物，其特征在于亲脂性脂族部分和配位笼状物。这样的配位笼状物主要属于两种类型：二氮杂衍生物(式I)和四氮杂环十二烷衍生物(式II)。
因此，组分c)是式(I)或式(II)的化合物：
其中：
Y是式Y'-NH-或(Y')2-N-的基团，其中Y'(在(Y')2-N的情况下可以相同或不同)选自：直链或支链的、饱和或不饱和的C12-C20烷基；C1-C10烷基，其任选地被磷酸酯基团-O-(HO-P＝O)-O-中断或任选地被一个或多个原子或基团取代，所述原子或基团选自：OH、-COOR1、氧基羰基-(C12-C18)烷基和氧基羰基-(C12-C18)烯基；其中R1选自氢H或直链或支链的C1-C4烷基；或Y'是取代或部分取代的甘油的单磷酸酯，所述甘油的至少一个官能团被带有饱和或不饱和碳链的脂族脂肪酸酯化，且磷酸的其它两个官能团为游离的或与碱金属或碱土金属成盐；
L是二价连接基，其选自：脂族直链或支链C1-C6烷二基、烯二基或炔二基，其任选地被一个或多个原子或基团中断，所述原子或基团选自：-C＝O、-C＝S、-NR1-、-COO、-OCO、-NR1CO-或-CONR1-、-O-和-S-，其中R1如上述所定义；
RI-IV各自独立地是-R2-COOR3，其中R2是C1-C6直链或支链的烷基，R3是H或药学上可接受的阳离子。
R’-”’各自独立地是-R2-COOR3，其中R2是C1-C6直链或支链的烷基，R3是H或药学上可接受的阳离子。
Y基团优选借助Y基团的末端氮原子与存在于连接Y的末端上的羰基(-C＝O)或硫代羰基(-C＝S)之间的酰胺键连接L基团。优选地，Y基团是如下形式：(Y')2-N-，其中Y'残基相同或不同且是烷基链，其中长度为C12-C20，优选C16-C18。
或者，Y基团还可以具有下式：Y'-NH-，其中Y'为C12-C20烷基，更优选C16-C18烷基，其被一个或多个下式的磷酸酯基团中断：
根据该实施方案，Y为具有下式的磷脂：Y'-NH-，其中Y'为C16-C18烷基，其被一个或多个下式的基团中断：
进一步被至少一个且优选2个或3个包含12-20个碳原子，更优选16-18个碳原子的羧基烷基取代。
在另一可选的实施方案中，Y’是取代的或部分取代的甘油的单磷酸酯，其中所述甘油的至少一个官能团被带有饱和或不饱和碳链的脂族脂肪酸酯化，并且磷酸的其它两个官能团为游离的或与碱金属或碱土金属成盐。优选地，脂肪酸为C14-C20羧酸。
因此，根据当(Y’)2–N-时相同或不同的Y'的优选实施方案，其选自：
-直链或支链的、饱和或不饱和的C16-C18烷基；
-C4-C6烷基，其被磷酸酯基团-O-(HO-P＝O)-O-中断和/或任选地被一个或多个以下原子或基团取代：氧基羰基-(C12-C18)烷基和氧基羰基-(C12-C18)烯基；
或Y’为取代或部分取代的甘油的单磷酸酯，其中所述甘油的至少一个官能团被带有饱和或不饱和碳链的脂族脂肪酸酯化，其中所述脂族脂肪酸为具有饱和或不饱和碳链的C14-C20羧酸，并且磷酸的其它两个官能团为游离的或与碱金属或碱土金属成盐；
L、RI-IV和R’-”’如上文所定义。
甚至更优选地，当Y’为被磷酸酯基团-O-(HO-P＝O)-O-中断的C4-C6烷基时，其优选进一步被至少两个选自以下的原子或基团取代：氧基羰基-(C14-C16)烷基和氧基羰基-(C14-C16)烯基。
根据该进一步可选的实施方案，Y选自以下基团：
其中，#指示连接至连接基L的点。
连接基L是在式(I)的衍生物中将二氮杂结构部分连接至Y基团并且类似地在式(II)的衍生物中将四氮杂环十二烷连接至Y基团的二价基团。
优选地，L是直链或支链的C1-C6烷基、烯基或炔基，其在一个末端侧被硫代羰基(-C＝S)或更优选地被羰基(-C＝O)官能化，作为式(I)和(II)中的Y残基的末端氮原子的连接点。
连接基L的实例是：甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基、丁基羰基、戊基羰基和己基羰基。
对于式(I)化合物而言，连接基L更优选选自：式c’)的丁基羰基：
其中，#指示连接到式(I)的二氮杂的点。
对于式(II)的化合物而言，连接基L优选选自：式d’)的甲基羰基和式e’)的羧基丙基羰基。
其中，#指示连接至式(II)的四氮杂环十二烷的点。
如上文所指出，连接基L在一端连接至Y基团且在另一端连接至二氮杂或四氮杂环十二烷。式Y'-NH-或(Y')2-N-的Y基团具有末端氮原子，连接基L通过酰胺键连接至所述末端氮原子上。
对于式(I)化合物而言，L-Y-体系优选选自：
其中，Y'符合上述定义并且#指示连接至式(I)的衍生物的二氮杂的点。
对于式(II)化合物而言，L-Y-体系优选选自：
其中，Y'如上文所定义并且#指示连接至式(II)的衍生物的四氮杂环十二烷的点。
根据优选的实施方案，式(I)化合物选自：
其中，RI-IV如本文中所定义。
根据优选的实施方案，基团RI-IV是相同的并且优选为选自以下的羧甲基基团：–CH2-COOH和–R2-COO-M+，其中R2如上文所定义并且M+为选自Mg2+、Ca2+和Sr2+的金属。
因此，式(I)的螯合剂优选由通式(I’)限定：
或其呈具有碱土金属、优选Ca2+的配合物形式药的学上可接受的盐，其中L和Y以及它们的组合L-Y如上文的优选实施方案中所定义。
类似地和优选地，式(II)的螯合剂或其药学上可接受的盐具有通式(II’)：
其中，L和Y以及它们的组合L-Y如在它们的上述优选实施方案中定义。
因此，符合Y和L的结构，作为具有碱土金属如Ca2+、Sr2+、Mg2+，优选Ca2+的配合物或呈药学上可接受的盐的形式的优选的式(I’)化合物选自：
优选的式(II’)的配合物选自：
特别优选的是选自以下的配合物及其盐：
-c.1:[6-[[双(羧甲基)]氨基]-6-[5-(二(十八烷基)氨基)-5-氧代戊-1-基]-四氢-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸根(4-)]合钙(2-)；
-c.4:[6-[[双(羧甲基)]氨基]-6-[(13R)-10-羟基-10-氧桥-5,16-二氧代-13-(1-氧代十六烷基)氧基]-9,11,15-三氧杂-6-氮杂-10-磷酸原三十烷-1-基]-四氢-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸根(4-)]合钙(2-)；
-c.5:[10-[2-(二(十八烷基)氨基)-2-氧代乙基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸根(3-)]合钙(1-)；
-c.7:[10-[(10R)-7-羟基-7-氧桥-2,13-二氧代-10-[(1-氧代十八烷)氧基]-6,8,12-三氧杂-3-氮杂-7-磷酸三十烷-1-基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸根(3-)]合钙(1-)；最优选的是配合物c.5及其盐，优选Ca2+盐：
其通过根据在试验部分，制备3.2中详述的程序合成的螯合剂14的Ca配合而获得。
优选地，稳定化的配合物c)占总重量的4-13％，优选8-10％w/w。
式I和II的化合物的合成。一般方案
本发明的式(I)化合物可以通过包括如下的方法制备：首先形成所选择的连接基L与二氮杂结构部分之间加合物，然后活化在连接基末端侧上羧酸官能团，随后与所选择的Y基团酰胺化。最后，除去保护基(如果存在于所获得产物中)，并使衍生物任选地与所选择的碱土金属配位。
被称为合成方法的“反应物”的连接基L与二氮杂结构部分之间的加合物通过合适的硝基衍生物(是所选择的连接基的前体)与N,N’-二苄基乙二胺(这是二氮杂的前体)的反应而获得。随后典型地通过氢化和随后的在碱性条件下的N-烷基化将硝基还原并官能化。可以通过改变所选择的结构部分Y有利地制备所述连接基与二氮杂结构部分之间的加合物并且将其用作制备一系列式(I)的衍生物的模块。
因此，制备由式(I)和(II)所定义的化合物的合成包括以下步骤：
a)制备下式的加合物：
其中，RI-IV和R’-”’如上文所定义且L为包含末端羧酸官能的连接基，
b)活化所述连接基的所述末端羧酸官能团
c)步骤b)的产物与如上文所定义的Y基团之间的酰胺化反应。
d)裂解任何保护基，以产生式(I)或(II)的衍生物；
e)与碱土金属离子螯合，以产生呈金属配合物形式的式(I)或(II)的衍生物。
根据式I化合物(到化合物III，方案1)的制备的示例性实例，所述方法从作为起始加合物的化合物5出发，包括以下步骤b)至e)：
连接基与二氮杂结构部分之间的加合物5通过以下制备：N,N’-二苄基乙二胺二乙酸盐和6-硝基己酸甲酯1的醇溶液在多聚甲醛存在下反应，然后还原硝基基团2，官能化氨基衍生物3和选择性裂解末端羧基4，如方案2中所指示，如下文所示：
根据本方法的步骤b)，使一般地由化合物5表示的二氮杂衍生物经受末端羧基官能团的活化。所述活化可以根据有机化学中用于活化羧基官能团的通常已知的程序进行，典型地通过与羧基活化剂如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在碳二亚胺如二环己基碳二亚胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下，以至少1:1的摩尔比，优选对于起始原料稍微过量，例如以最多1:1.5的摩尔比，在合适的有机溶剂如非极性有机溶剂(选自CHCl3,CH2Cl2等)中反应而进行。优选地，步骤b)在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和EDC存在下，以对于起始原料1:1至1:1.1的摩尔比并在CH2Cl2存在下进行。然后根据步骤c)使如此获得的衍生物经受通常在二异丙基乙胺(DIPEA)存在下、连接基L的经活化的羧基端基与所选择的Y残基(例如二烷基胺)的氮原子之间的酰胺化反应。
优选地，所述酰胺化反应通过将在步骤b)之后获得的经活化的化合物溶于CHCl3并以该顺序以对于起始原料1:1至1:1.7的摩尔比添加例如二烷基胺和DIPEA而进行。然后将溶液在选定的温度搅拌合适的时间框架，典型地在室温(例如在15至30℃的温度)搅拌最多20-24小时的时间。然后例如通过用水洗涤或通过通常在真空下或通过蒸馏程序蒸发分离的有机相来纯化由此形成的酰胺产物。在纯化(例如通过色谱法)之后，以高收率(约80％)并以高纯度(约95-99％HPLC)获得呈经保护形式(例如优选作为叔丁酯衍生物)的式(I)的产物。
根据步骤d)，以羧基经保护的形式获得的式(I)的衍生物可以容易地在本领域已知的条件下并且例如根据在步骤a)中实际使用的保护基的类型而脱保护。对于选择可能的保护基的一般参考而言，参见“Greene’sprotectivegroupsinorganicsynthesis”，Wiley，第14版。
在优选的实施方案中，将羧基官能团以叔丁酯形式保护，并且在酸性条件下，典型地在三氟乙酸(TFA)和有机极性溶剂如CH2Cl2存在下进行脱保护。
式(II)化合物的合成从商购可得的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸三(1,1-二甲基)乙酯11出发而进行。
如试验部分中所定义的化合物11已经受羧基官能团的活化、酰胺化反应和经保护的羧基官能团的脱保护。
在脱保护之后，如此获得的式(I)和(II)的化合物可以适宜地与碱土金属化合物反应，从而获得相应的金属配合物衍生物。所述转化典型地通过所选择的金属的无机或有机盐或氧化物的反应，在溶剂如水或有机溶剂例如CHCl3、MeOH或EtOH或其混合物存在下操作而进行。优选的金属的反离子是氯离子或乙酸根，并且优选的盐是：CaCl2、Ca(OAc)2，而氧化物中优选的是：CaO。
本发明的组合物还可以包含至少一种目的在于降低SLN的识别的具有掩蔽剂功能的亲水性聚合物e)，其包括来自网状内皮细胞系统的荧光染料。在优选的实施方案中，所述掩蔽剂为用于涂覆连接至疏水性片段的纳米颗粒表面的亲水性聚合物。所述掩蔽剂可以为官能化的泊洛沙姆、聚硅氧烷、聚烷基聚醚、聚甘油、聚乙烯醇和聚乙二醇，任选地共价连接至磷脂结构部分。还提供所述组分的混合物。掩蔽剂是本领域公知的，并且它们适合用于本发明。例如PEG本身或用烷基官能团和/或磷脂衍生化的PEG，细胞受体的特异性配体，例如具有配体功能的肽或维生素。
在优选的实施方案中，所述亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)，优选具有500-10,000道尔顿并且更优选2,000-5,000道尔顿的分子量的聚乙二醇。所述聚乙二醇可以共价地连接至磷脂结构部分。PEG化的磷脂的实例是DPPE-PEG或DSPE-PEG、DMPE-PEG、DAPE-PEG或DOPE-PEG。特别优选的磷脂是DAPC、DSPC、DPPC、DMPA、DPPA、DSPA、DMPG、DPPG、DSPG、DMPS、DPPS、DSPS和乙基-DSPC。最优选的是DPPG、DPPS和DSPC。也可以使用磷脂的混合物，例如DPPE和/或DSPE(包括PEG化的衍生物)、DPPC、DSPC和/或DAPC与DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、乙基-DSPC和/或乙基-DPPC的混合物。
优选地，制剂中包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(DSPE-PEG2000)。优选地，该组分占SLN的至多16％且甚至更优选占约6-12％。
形成本发明的固体脂质纳米颗粒的所有原料是本领域普通技术人员公知的并且通常在市场上可获得。
在本发明的一个实施方案中，组合物还包括对病变组织具有高的结合亲和力的靶结构部分。通常，靶向结构部分必须在特异性结合至疾病的靶方面有效，从而可用于提供与所述靶相关的疾病的指示。靶的实例是在疾病或病理组织中上调的呈蛋白质、酶或特定分子形式的细胞表面受体。表面活性靶向剂可以由靶向结构部分、脂质结构和在所述活性结构部分与所述脂质结构之间的聚合物间隔基组成。在本发明的范围内，“靶向结构部分”是能够以任何合适的形式(例如化学键、理化亲和力、化学反应、代谢事件)与靶建立关联的分子、化合物、物质。所述靶向结构部分与所述靶之间的该关联允许本发明的纳米颗粒与所述靶相邻存在足以被目前的诊断仪器检测的时间。
根据本发明的优选的靶向结构部分是1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000]铵盐(DSPE-PEG2000-叶酸盐)。在本文中，该结构部分由于其对叶酸受体的结合亲和力而表现为代表性实施方案。其它代表性靶向结构部分还可以包括蛋白质，适配体，肽如用于αvβ3整联蛋白靶向的Arg-Gly-Asp(RGD)和多肽，维生素，抗体如贝伐珠单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗或其片段和糖类，它们可以优选在将它们用亲脂性或两亲性成分(如烷基链或磷脂)衍生化以使它们被包括在围绕本SLN的核芯的壳结构中之后引入本发明的纳米颗粒。
使本发明的纳米颗粒靶向使得其可用作还可以通过检测一种或多种特异性标记物而诊断的那些疾病的诊断剂。肿瘤是本发明感兴趣的代表性实例。
组分d)是菁家族和/或多杂环化合物的荧光染料，包括香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其药学上可接受的盐。
这样的荧光染料的实例包括ICG、cy5、cy5.5、cy7、800、750(LI-CORBiosciences)、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa610、Alexa647、Alexa700和750(Invitrogen)、DY-682、DY-675、DY-782(DyomicsGmbH)(市场上称为Alexa)，其呈酸形式或其药学上可接受的盐。
根据本发明，菁家族或多杂环化合物的荧光染料选自：
吲哚菁绿(ICG)
以下化合物，其化学结构和商业上的通用名或通用代码报道如下：
根据本发明的优选实施方案，所述荧光染料为吲哚菁绿，其呈任意盐形式且优选呈钠盐。根据本发明的荧光染料以0.01-0.5％，优选0.05-0.15％的量存在。
通常，构成根据本发明的固体脂质纳米颗粒的不同组分之间的各自的比例可以由本领域普通技术人员通过依靠本领域公知常识容易地确定。也例如参见US2006/0083781及其中引用的文献。
作为本发明的一些示例性实施方案的指引，并且参照干SLN组合物的理论组分重量/重量％，形成核芯a)的脂质组分是甘油酯和/或脂肪酸，其占30-50％，优选35-45％的范围。表面活性剂组分b)优选由占25-60％，优选27-45％，甚至更优选30-38％的范围的磷脂构成。当使用时，PEG(组分e)优选为至多约16％，更优选6-12％。稳定化两亲性组分c)占约4-13％，优选8-10％。
根据本发明的荧光染料d)以0.01-0.5％，优选0.05-0.15％的量存在。
本发明还涉及用于制备上文所描述的纳米颗粒的方法。
该方法是改性的水/油/水(W/O/W)方法，并包括如下阶段：
i)制备有机相(O)，这通过如下进行：在水不可混溶性或低可混溶性有机溶剂中溶解：一种或多种将会形成固体脂质结晶核芯a)的脂质物质，将会形成围绕所述核芯a)的壳b)的两亲性化合物，具有上述包括优选实施方案所定义的式I和/或II的化合物的所述碱土金属配合物(组分c))，菁家族和/或多杂环化合物的所述荧光染料d)，任选的所述亲水性聚合物e)，任选的所述靶向结构部分f)；
ii)通过溶解一种或多种亲水性表面活性剂和任选的助表面活性剂组分制备第一水溶液(W)；
iii)混合步骤i)的所述有机相(O)与步骤ii)的所述第一水溶液(W)并且混合直至形成稳定的W/O微乳液；
iv)然后将在步骤iii)中获得的所述W/O微乳液添加至可以包含至少一种表面活性剂的第二水溶液(W1)，以提供W/O/W1多重乳液；
v)通过蒸发从所述多重乳液除去所述有机溶剂，以提供脂质纳米颗粒的悬浮液；
vi)冷却在步骤v)中获得的悬浮液，以提供所述固体核芯a)的完全结晶；
vii)洗涤在步骤vi)中获得的所述悬浮液，除去过量组分。如此获得的SLN悬浮液被认为不含所使用的亲水性表面活性剂组分如离子型表面活性剂和助表面活性剂。
viii)任选地将在步骤vii)中获得的所述悬浮液以水相形式储存或在除去水之后以固相形式储存。
在步骤i)中，所述有机溶剂是水不可混溶性溶剂或低水混溶性有机溶剂。该类型的有机溶剂是本领域公知的，并且是化学领域的公知常识的一部分。出于本发明的目的，所述有机溶剂可以具有20℃至70℃的低的沸点。该低的沸点可以在大气压下或在受控的真空条件下测定，如在本领域通常实践那样。在优选的实施方案中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯和甲酸乙酯或其混合物。在更优选的实施方案中使用二氯甲烷。优选将所述溶液加热至30-35℃。
在步骤ii)的优选的实施方案中，牛磺胆酸钠盐水合物和1-丁醇溶于水相。也可以通过在水相中或在有机相中溶解例如具有掩蔽剂功能的亲水性聚合物官能(参见上述组分d)和/或活性靶向剂(参见上述组分e)而将其它亲水性组分引入所述SLN。在使用靶向剂的情况下，这将会与所述掩蔽剂连接。
在步骤iii)中，将以下组分以以下浓度范围(M)溶于溶剂混合物(CH2Cl2:H2O；1:0.125,v/v)中获得所述W/O微乳液：
| 组分 | Mmin | Mmax |
| 甘油酯 | 0.10 | 0.15 |
| 脂肪酸 | 0.01 | 0.09 |
| 磷脂 | 0.10 | 0.17 |
| 稳定剂 | 0.01 | 0.04 |
| ICG | 3.4*E-05 | 1.7*E-03 |
| 掩蔽剂 | 0.00 | 0.02 |
| 表面活性剂 | 0.10 | 0.20 |
| 醇 | 0.60 | 1.20 |
在步骤iv)中，将微乳液添加至包含0.12-0.5％w/v，优选0.24％的表面活性剂的水溶液W1(比例为1:10W/O:W,v/v)。在优选的实施方案中，W1溶液包含聚氧亚乙基失水山梨醇单油酸酯。
在步骤v)中，优选在大气压或受控的压力下蒸发溶剂，通常将搅拌用于蒸发。蒸发也可以通过在大气压或在受控的真空条件下增加多重乳液的温度而获得。优选地，蒸发温度应当不超过脂质核芯组分的熔点。
步骤vi)在常规的温度进行，这还可以由本领域普通技术人员将最终固体结晶脂质核芯的组成作为函数而确定。在优选的实施方案中，在4-15℃范围内的温度实现冷却。优选地，将悬浮液以0.1至0.4℃/min，优选0.2-0.4℃/min，甚至更优选0.3℃/min的速率冷却。
步骤vii)的洗涤程序包括例如渗析、过滤、超滤或超速离心程序。在优选的实施方案中，将制剂超滤或冻干以提供“干”SLN组合物。
在前述描述中，本发明借助于一个优选的实施方案即负载有吲哚菁绿的纳米颗粒描述。然而，要充分理解的是，该描述适用于本发明的全部幅度，即适用于菁家族和如实施例1至6中所描述的Alexa的全部染料。在本发明的一个实施方案中，负载荧光染料的SLN制剂导致稳定的单分散胶态悬浮液(参见图1，在负载有ICG的实施方案中)，其优选具有10至220nm的粒度分布，低于100nm的平均粒度(z-平均)和低于0.2的多分散指数。在本发明的实施方案中，负载ICG的SLN具有约60nm的z-平均和0.16的多分散指数(PdI)(参见表A，其示出了实施例1，60R012001L；实施例2，63R011013L；实施例3，60R012002L；实施例4，63R011005L；实施例5，63R011001L；实施例6，63R011002L)。
表A
靶向和未靶向的负载ICG的SLN理化特性。
对于靶向的和未靶向的负载ICG的SLN制剂，通过分析三种不同制备的批料的平均的理化参数、它们的标准偏差和它们的相对标准偏差已评价了本发明的方法的再现性。
表B
靶向的和未靶向的纳米颗粒的负载ICG的SLN制剂方法的再现性(在表A中所示的3个批料上)
表B中所列出的结果(实施例1-6)显示了制备方法的良好的再现性。此外，值得注意的是，负载ICG的SLN的最终的理化参数根据靶向结构部分的引入而不存在相关的区别。
如果与游离染料相比，根据本发明的纳米颗粒能够明显改进引入其中的染料的荧光发射效率。例如，在具有负载ICG的SLN的代表性实施方案中，在水溶液中的ICG荧光发射量子产率％(Φ％)为约2.72％，而对于靶向的和未靶向的SLN而言，根据本发明的相应SLN显示出约7.6％的荧光效率(参见表C，实施例2和4)，其在储存条件下随着时间流逝保持稳定(至少>60天)。
表C：ICG染料在水中和在引入SLN之后的Φ％。
本发明的另一有利之处在于染料相对于在水溶液中的游离染料改进的光稳定性。在水性介质中通过将游离ICG溶液和负载ICG的SLN悬浮液暴露至785nm激光辐照进行试验(参见图2，实施例8)。通过NIR荧光成像系统(LI-CORBiosciences的脉冲系统)收集荧光发射。将样品的浓度调节至显示初始参照(comparable)荧光发射信号。然后，在37℃辐照两个样品3秒钟并将样品在暗处保持1秒钟而一式两份地进行试验。该顺序连续重复1h。由图2值得注意的是，负载在SLN上的ICG显示出比游离染料更高的光稳定性，这通过荧光信号随时间的较快的降低来表征。在试验结束时，负载ICG的SLN仍然显示出初始发射荧光效率的50％，而游离ICG的荧光发射稍微高于零。
作为本发明的另一有利之处，改进了负载染料的SLN的长期稳定性。通过将样品在储存条件(4℃)下保持在暗处并通过UV-Vis分光光度计(Lambda40,PerkinElmer)测量最大吸收来分析稳定性。将负载ICG的SLN溶于有机溶剂混合物(CHCl3:CH3OH2:1)，并进一步稀释用于在800nm的UV-Vis分析。将校正曲线用于计算在SLN中配制的ICG浓度。图3中的数据(实施例9)显示了负载ICG的SLN浓度(从配制日期起在90天内的不同时间点测量)可以相对于初始值恢复至95％。
本发明的另一有利之处在于相对于水溶液中的游离ICG显著降低的聚集物形成速率。在图4中(画面A，实施例7)，报道了负载ICG的SLN悬浮液刚过配制日期之后和90和120天之后的UV-Vis光谱。显而易见的是在120天之后的聚集物(所谓的J聚集物)的存在不明显，并且负载ICG的SLN的吸光度谱在观察的光谱范围内仍然保持基本上相同。在800nm处的吸光度相对于初始值恢复至96％。此外，荧光发射性质可以通过将ICG引入SLN而在观察的时间期间内得以保留(数据未示出)。另一方面，已知μM浓度的ICG可以在几天内聚集(参见图4B，实施例7)，随之而来的是储存期间游离ICG的吸光度(在780nm)的降低和在900nm处的新的峰的产生。
本发明提供的另一有利之处在于粒度分布、表面电荷和PdI的增强的稳定性，这在将制剂于4℃保持在暗处时的不同的时间点测量，并且测量在25℃测量。表D，实施例4中列出的结果显示从配制起90天之后，理化参数没有证实任何明显改变。
表D
靶向的负载ICG的SLN理化稳定性(示于实施例4中)
在另外的方面，本发明涉及靶向的负载ICG的SLN对于特异性受体的特异性摄入。在示例性实施方案中，评价负载FA-ICG的SLN在叶酸受体上的结合性质。通过生物膜层干涉系统(instrument,Fortebio)进行试验。分析靶向的和未靶向的负载ICG的SLN的两个不同批料对涂覆有经由蛋白质A缀合的抗叶酸IgG(FA2)的生物传感器的结合性质。在图5，实施例10中，结果显示靶向的负载ICG的SLN相对于未靶向的负载ICG的SLN(没有识别经预活化的生物传感器)而言以良好的亲和力结合IgG抗叶酸。
本发明还涉及本文中所公开的负载ICG的SLN体内应用时的改进的组织靶向性质。在一个实施方案中，具体地在卵巢癌异种移植模型上使用皮下注射至Balb/Cnu/nu小鼠的右侧腹中的IGROV-1细胞系评价了负载F-ICG的SLN对于肿瘤组织的特异性摄入。在围绕肿瘤区域标明的感兴趣的区域中收集所取得的荧光信号并使其参考肌肉的背景荧光。在负载FA-ICG的SLN的情况下，所测量的体内荧光信号为5.1a.u.(SD2.9)，而在未靶向的负载ICG的SLN施用的情况下，所述荧光信号为1.7(SD0.2)。
随后杀死动物，以从体外成像分析定量每个切除器官中的荧光信号。在图6，实施例11中报道了经分析的组织的所有测量的荧光信号。值得注意的是，负载FA-ICG的SLN在肿瘤组织上的特异性摄入得到证实。尤其是，靶向的负载ICG的SLN与未靶向相比，体外荧光比例增强了3倍(测量为(肿瘤SI-肌肉SI)/肌肉SI)。此外，两种制剂看起来都遵循主要包括肝和肾代谢途径的相同的清除机理。在图7，实施例11中还报道了来自施用靶向的和未靶向的负载ICG的SLN之后24h杀死的两只代表性小鼠的体外成像分析。
根据本发明的SLN提供了关于其它载体系统的若干有利之处。例如，已建议脂肪乳液或纳米乳液作为可以容易地引入油液滴中的亲脂性药物的递送系统。这些载体系统使得副作用减少，但是它们在热力学上是不稳定的。因此，乳液经常倾向于聚集或者甚至破坏，并且一旦药物到达血流就快速释放。
关于脂质体，SLN可以以低于60nm的非常小的直径配制，所述直径不与稳定的脂质体相容，其中过度的表面曲率导致脂质体制剂的不稳定性，一定程度上抑制了它们的实践用途。
纳米颗粒的尺寸是非常重要的参数，其强烈影响它们在病理性组织中的累积。已说明的是简单地通过改变它们的尺寸，纳米颗粒在癌症组织中的分布方面可能出现大的区别。已建议对于具有低于60nm(这是对于稳定的SLN而言比对于脂质体配制剂而言更可达到的尺寸)直径的颗粒而言可以获得最优化的累积。
在负载ICG的纳米颗粒的代表性实施方案中，根据本发明的SLN与现有技术中所描述的制剂(WO2010/018216中为40天和WO2003/057259中为25天)相比，显示出非常高的光学和胶体稳定性。
实际上，在本发明的代表中，直到配制后170天测量靶向的负载ICG的SLN的光密度也导致非常稳定的观察值(在170天的OD为初始值的>95％)。采用PerkinElmerLambda40UV-Vis分光光度计进行测量(参见图8)。
在本发明的代表中，负载ICG的SLN的测量荧光发射效率对于靶向的或未靶向的SLN均等于7.6％(参见表C)。此外，荧光量子产率随时间流逝(至少>60天)保持稳定，如对在实施例2中所描述的配制的负载ICG的SLN所示。此外，负载ICG的SLN荧光量子产率比在水中的ICG高2.8倍。该性质相对于在WO2010/018216中描述的现有技术(其显示了ICG纳米乳液(400μM)的荧光量子产率仅比在水溶液中的ICG高2倍)是显著和不可预料的改进(参见表2和列标签F)。
ICG在水性介质中和在引入SLN之后的另外的光学特征(即最大吸收和发射波长、Stokes位移)报道于表E中。
表E
负载ICG的SLN制剂的光学性质(实施例4)。
显而易见的是，通过相对于水溶液中的ICG的最大发射和吸收的高度红移证实的ICG与SLN组分的相互作用极大地改进了ICG体内光学成像应用。
根据本发明的ICG-SLN还显示出相对于现有技术改进的上载。作为最终制剂中的ICG的量相对于理论量计算的上载的ICG的平均收率为高于75％直至90％(在外部相中不可检测到ICG)。WO2010/018216显示了接近35％的值。此外，Navarro等人进行了ICG包埋相对于初始ICG负载浓度的研究，随着初始浓度的增加导致包埋效率的增加(>40％)。在我们的制剂方法中，即使在初始ICG浓度低于1mM时也可以获得高的包埋效率。
以下实施例进一步阐释本发明。
试验部分
制备式(I)化合物
制备1：根据方案3制备化合物8。
制备1.1：制备化合物5。根据以下在方案2中阐述的US2006018830中描述的程序在五个步骤中制备化合物5。
使2-硝基环己酮在MeOH中在AmberlystA21存在下回流以产生6-硝基己酸甲酯1。1与N,N’-二苄基乙二胺二乙酸盐和多聚甲醛的反应产生二氮杂2，将其首先氢化成3，然后用溴乙酸叔丁酯烷基化以产生五酯4。借助在THF/H2O中的LiOH选择性水解4以产生5。总体产率13％。
制备1.2：制备化合物6
6-[双[2-[(1,1-二甲基)乙氧基]-2-氧代乙基]氨基]-6-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-5-氧代戊-1-基]四氢-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸双[(1,1-二甲基)乙基]酯
将化合物5(14.6g；0.022mol)溶于CH2Cl2(350mL)，然后添加NHS(3.75g；0.033mol)，并将混合物在冰浴中冷却至0℃。滴加EDC(6.25g；0.033mol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液，然后将反应溶液在室温搅拌24h。将混合物用H2O(3x150mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发以产生黄色油状物6(15.42g；0.020mol)。产率92％。
分析数据：
Mr：768.94(C38H64N4O12)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构
制备1.3：制备化合物7(6-[双[2-[(1,1-二甲基)乙氧基]-2-氧代乙基]氨基]-6-[(13R)-10-羟基-10-氧桥-5,16-二氧代-13-(1-氧代癸基)氧基]-9,11,15-三氧杂-6-氮杂-10-磷杂二十九烷-1-基]-四氢-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸双[(1,1-二甲基)乙基]酯)
将化合物6(1.92g；2.50mmol)溶于CHCl3(190mL)。以该顺序添加二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺DPPE(1.73g；2.50mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(1.7当量)。将溶液在室温搅拌3h至24h。将混合物连续用H2O(1x50mL)、酸化的H2O(pH4-5，用HCl酸化；1x50mL)和H2O(1x50mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。将由此获得的粗物质通过快速色谱法纯化以产生白色固体物质状化合物7(2.79g；2.07mmol)。产率83％。
分析数据：
HPLC-ELSD：100％(面积％)；Mr：1345.82(C71H133N4O17P)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构。
制备1.4：制备化合物8(6-[双[(羧甲基)氨基]-6-[(13R)-10-羟基-10-氧桥-5,16-二氧代-13-(1-氧代癸基)氧基]-9,11,15-三氧杂-6-氮杂-10-磷杂二十九烷-1-基]-四氢-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸)
将化合物7(2.79g；2.07mmol)溶于CH2Cl2(100mL)，并将溶液搅拌和在0℃冷却，然后滴加TFA(6当量)。将反应混合物在室温搅拌1h。蒸发溶液并将残余物溶于新制TFA(30当量)。将该溶液在室温搅拌80h；通过MS分析和HPLC-ELSD监控反应。将混合物蒸发并将残余物用异丙醚处理以获得白色固体，将其离心并用异丙醚(2x30mL)洗涤。将该固体悬浮在H2O中，通过添加5％NaHCO3,水溶液在pH6-7溶解并通过添加1MHCl在pH2沉淀。将固体过滤，并在降低的压力下干燥(P2O5)，以获得白色固体物质状配体8(1.77g；1.58mmol)。产率76％。
分析数据：
HPLC-ELSD：95.3％(面积％)
Mr：1121.39(C55H101N4O17P)
配位滴定法滴定量：95.7％
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构。
制备2：根据方案4制备化合物10
制备2.1：制备化合物9(6-[双[2-[(1,1-二甲基)乙氧基]-2-氧代乙基]氨基]-6-[5-(十二烷基氨基)-5-氧代戊-1-基]-四氢-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸-双[(1,1-二甲基)乙基]酯)
将根据制备1.2所制备的化合物6(3.13g；4.07mmol)与二(十二)胺(1.44g；4.07mmol)和DIPEA(1.7当量)溶于CHCl3(200mL)。将反应溶液在室温搅拌24h并且随后用H2O(1x50mL)，酸化的H2O(pH4-5，用HCl酸化；1x70mL)和H2O(1x50mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。将如此获得的产物通过快速色谱法纯化以产生油状化合物9(4.30g,4.27mmol)。定量产率。
分析数据：
HPLC-ELSD：89.7％(面积％)；
Mr：1007.53(C58H110N4O9).
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构。
制备2.2：制备化合物10(6-[双[(羧甲基)氨基]-6-[5-(十二烷基氨基)-5-氧代戊-1-基]-四氢-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸]
将化合物9(4.30g,4.27mmol)溶于CH2Cl2(50mL)，并将所获得溶液搅拌并冷却至0℃，然后滴加TFA(6当量)。将反应混合物在室温搅拌1h。蒸发溶剂，并将获得的残余物溶于新制TFA(50当量)。将该溶液搅拌80h。蒸发混合物并将残余物用异丙醚(70mL)处理以获得白色沉淀，将其过滤或离心，用异丙醚(2x20mL)洗涤并在降低的压力下干燥(P2O5；NaOH颗粒)以获得白色固体状粗配体。将粗产物再悬浮于H2O中，通过添加2NNaOH在pH6-7溶解，并通过添加1MHCl在pH2沉淀以产生白色固体状配体10(2.83g,3.61mmol)。产率：85％。
分析数据：
HPLC-ELSD：82.4％(面积％)。
Mr：783.10(C42H78N4O9)。
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构。
1.1制备式(II)化合物
1.2制备3：根据方案5制备化合物13：
制备3.1：制备化合物12(10-[2-(二(十二烷基)氨基)-2-氧代乙基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸三[(1,1-二甲基)乙基]酯)
连续将HBTU(1.89g；4.95mmol)和DIPEA(1.09g；8.41mmol)添加至化合物11(2.84g；4.95mmol)在CH3CN(200.mL)中的悬浮液中，并将混合物在搅拌下在室温保持30min；添加二(十二)胺(1.75.g；4.95mmol)，并将混合物在搅拌下在室温保持24h。
蒸发反应混合物并将残余物溶于CHCl3，并连续用H2O(100mL)，酸化的H2O(pH4-5，用HCl酸化；100mL)和H2O(100mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发，并将产生的粗物质通过快速色谱法纯化，以获得无色油状化合物12(3.55.g；3.91.mmol)。产率79.％。
分析数据：
Mr:908.40(C52H101N5O7)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构
制备3.2：制备化合物13和14(10-[2-(二(十二烷基)氨基)-2-氧代乙基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸，化合物13)
将TFA(6当量)滴加至冷却至0℃的化合物12(4.40.g；4.84.mmol)在CH2Cl2(70.mL)中的溶液中；将产生的溶液在室温搅拌1h然后蒸发。将残余物溶于新制TFA(50当量)并将如此获得的溶液在搅拌下在室温保持96h。
蒸发反应混合物并将残余物用iPr2O(150mL)处理以产生白色固体物质，将其离心，用iPr2O(2x40mL)洗涤并干燥以产生偏白色固体物质状配体13(2.44.g；3.30.mmol)。收率68％。
分析数据：
配位滴定法滴定量：99.4.％
Mr：740.08(C40H77N5O7)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构。
根据MAGMA2001.12(2-3),114-120中所公开的程序合成化合物14。
制备4:制备化合物15a-b
制备4.1：制备化合物15a-b–一般程序
连续将HBTU(1当量)和DIPEA(1.7当量)添加至化合物11在CH2Cl2(浓度：1％w/v)中的悬浮液中，并将混合物在搅拌下在室温保持30min；然后添加磷酰乙醇胺(DLPEn＝10或DMPEn＝12)(1当量)，并将混合物在搅拌下在室温保持24h。将反应混合物连续用H2O(100mL)，酸化的H2O(pH4-5，用HCl酸化；100mL)和H2O(100mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发，将如此获得的粗物质通过快速色谱法纯化以获得化合物15a-b。
制备4.1a：制备10-[(10R)-7-羟基-7-氧桥-2,13-二氧代-10-[(1-氧代十二烷基)氧基]-6,8,12-三氧杂-3-氮杂-7-磷杂二十四烷-1-基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸三[(1,1-二甲基)乙基]酯，化合物15a
反应物：化合物11(968mg；1.69mmol)；1,2-二(十二酰基)-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(980mg；1.69mmol).
化合物15a(605mg,0.53mmol)；产率32％。
分析数据：
HPLC-ELSD：40.6％(面积％)
Mr：1134.48(C57H108N5O15P)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构。
制备4.1b：制备10-[(10R)-7-羟基-7-氧桥-2,13-二氧代-10-[(1-氧代十四烷基)氧基-6,8,12-三氧杂-3-氮杂-7-磷杂二十六烷(phosphaesacos)-1-基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸三[(1,1-二甲基)乙基]酯，化合物15b
反应物：化合物11(1.43g；2.36mmol),1,2-二(十四酰基)-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(1.50g；2.36mmol).
化合物15b(2.18g,1.97mmol)。收率78％.
分析数据
HPLC-ELSD：82.4％(面积％)
Mr：1190.49(C61H116N5O15P)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构。
制备4.2：制备化合物16a-b–一般程序
将TFA(6当量)滴加至冷却至0℃的化合物15a-b在CH2Cl2(浓度：1％w/v)中的溶液中，并将溶液在室温搅拌1h，然后蒸发。将残余物溶于新制TFA(30当量)，并将新的溶液在搅拌下在室温保持96h。
蒸发反应混合物，并将残余物用iPr2O(150mL)处理，以产生白色固体物质，将其离心并用iPr2O(2x40mL)洗涤。
根据以下方法纯化粗产物16a。将粗产物悬浮于H2O中，并通过添加5％NaHCO3水溶液在pH6-7溶解，随后通过添加1MHCl在pH3再次沉淀。将如此获得的固体物质离心并干燥，以获得配体16a。
根据以下方法纯化粗产物16b。将粗产物悬浮于H2O中，并通过添加1MNaOH在pH6-7溶解，并将如此获得的溶液通过在XAD1600树脂上使用H2O/CH3CN梯度作为洗脱液渗滤而纯化。将包含期望的产物的级分合并并冻干，以获得配体16b。
制备4.2a：制备10-[(10R)-7-羟基-7-氧桥-2,13-二氧代-10-[(1-氧代十二烷基)氧基]-6,8,12-三氧杂-3-氮杂-7-磷杂二十四烷-1-基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸，化合物16a
反应物：化合物15a(600mg，0.53mmol)
化合物16a(501mg,0.53mmol)。产率98％。
分析数据
HPLC-ELSD：61.3％(面积％)
Mr：966.16(C45H84N5O15P)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构
制备4.2b：制备10-[(10R)-7-羟基-7-氧桥-2,13-二氧代-10-[(1-氧代十四烷基)氧基]-6,8,12-三氧杂-3-氮杂-7-磷杂二十六烷-1-基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸，化合物16b
反应物：化合物15b(2.0g,1.68mmol)
化合物16b(1.1g；1.07mmol)。产率63％。
分析数据：
HPLC-ELSD：99.9％(面积％)
Mr：1022.26(C49H92N5O15P)
1H-和13C-NMR和MS符合所述结构
制备5：[[10-[2-(二(十八烷基)氨基)-2-氧代乙基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸根(3-)]合钙(1-)]钙(2:1)
将氧化钙CaO(464mg；8.30mmol；1.5当量)在乙醇(300mL)中回流1h，然后添加配体14(5g；5.5mmol；1当量)；将反应混合物回流26h，然后过滤以除去不溶物。浓缩清澈的溶液(最终体积约30mL)，获得淡黄色固体沉淀物，将其过滤，用冷EtOH和H2O洗涤并干燥(20mbar；30℃)，以产生淡黄色固体状配合物17(3.12g；1.71mmol)，收率62％。
通过NMR、MS和ICP表征配合物17。
实施例1制备包含ICG和DSPE-PEG-2000的SLN(60R012001L)
通过将401mg的Epikuron(CargillDeutschlandGmbH,Krefeld,Germany)，100mg的[1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)-2000)铵盐DSPE-PEG-2000，110mg的配合物17，450mg三棕榈精，50mg硬脂酸和1.1mg的ICG溶于CH2Cl2制备有机相(O)。将所述有机相加热至35℃，并保持在搅拌下直至全部组分完全溶解。将包含380mg的牛磺胆酸钠，0.4mL的1-丁醇和0.5mL水的水相(W)添加至所述有机相。将该溶液在35℃搅拌30min直至获得稳定和透明的微乳液(W/O)。同时制备包含0.24％(重量/体积)Tween(Serva,Heidelberg,Germany)的水溶液W1(50mL)并加热至30℃。将微乳液W/O滴加至保持在30℃的水相W1，产生多重乳液W/O/W1。然后在大气压下蒸发有机溶剂，将多重乳液在搅拌下保持45min。然后将悬浮液的温度降低至10℃(0.25℃/min)以使得SLN的脂质核芯结晶。在制备之后，通过超渗滤程序在LabscaleTMTFF系统和PelliconXL过滤器，30kDa0.005m2(MerckMillipore,Billerica,MA)上使用葡萄糖5.5％w/v等渗溶液(1L)从悬浮液中除去过量组分。此外，通过在真空下于室温蒸发除去可能的痕量残余溶剂。最后，将悬浮液浓缩至约8.5mL，并使用0.22μmSterile-GSSyringefiltersMCE(Millipore,Ireland)过滤两次。
悬浮液的表征
在65％硝酸中用微波系统(MDS-2000CEMCorporation)消化样品之后，采用ICP-MSELAN6100(PerkinElmer,Waltham,MA)测量存在于最终悬浮液中的磷的量。数据报道于表G中。
使用双波束Lambda40UV-Vis分光光度计(PerkinElmer,Waltham,MA)测量最终悬浮液中的ICG量。在包含相同摩尔比的SLN组分的脂质基质中，使用呈在CHCl3:CH3OH(2:1)中的标准溶液形式的ICG建立校准曲线。从所述标准曲线，将ICG的摩尔消光系数在其最大波长(800nm)处计算为229000M-1*cm-1。将7％(v/v)的ICG-SLN悬浮液溶于CHCl3:CH3OH(2:1)溶剂混合物制备经分析的溶液。
ICG在SLN中的引入效率计算为最终悬浮液中的ICG相比于理论量之间的比例*100。估计ICG引入为>90％。通过DynamicLightScattering(DLS)使用MalvernZetaSizerNanoinstrument(NanoZS,Malvern,UK)，在NaCl1mM中以P＝2mM的浓度测量经分散的纳米颗粒的理化性质，如平均流体力学直径(z-平均)和多分散性指数(PdI)。在相同的条件下通过ElectrophoreticLightScattering(ELS)由相同的仪器测量表面电荷电位(ζ-电势)。ICG/P％摩尔比计算为0.27％。数据报道于表F中。
在配备有F-3018积分球附件的FluoroLog-31IHR-320分光荧光计(HoribaJobinYvon,EdisonNJ)上进行荧光量子产率％(Φ％)。通过光电倍增管PMT-NIRR5509冷却的探测器(Hamamatsuphotonics,HamamatsuCity,Japan)进行检测。所述Φ％采用7.7(SD0.15)的％平均值一式三份地测量。
差示扫描量热法(DSC)测量在量热计DSC4000PerkinElmer上进行。将ICG-SLN分散体精确称重(29.0mg)到铝坩埚中，随后密封封闭。相对于水参比坩埚进行测量。使用5℃/min的扫描速率从30℃至80℃记录热曲线。试验报道于图9中，起始值为45.78℃且制剂的ΔH为6.74J/g。熔化温度(通过DSC测量的起始值)非常接近于甘油三酯的明确定义的多晶型(α)(±2℃)(参见ChapmanD.“Thepolymorphismofglycerides”1962andWindbergs等人，AAPSPharmSciTech,2009,10:1224-1233)并且允许定性定义SLN的固体核芯中的晶体结构的存在。
表F.DLS和ELS表征
表G.最终制剂中的磷和ICG量。
实施例2
制备包含ICG和DSPE-PEG-2000的SLN(60R011013L)
如实施例1中所描述重复制备方法。
如前述实施例中所描述进行悬浮液的关于粒度、ζ电势和PdI的化学-物理表征，并且数据报道于表A中。
实施例3
制备包含ICG和DSPE-PEG-2000的SLN(60R012002L)的方法
如实施例1中所描述重复制备方法。
如实施例1中所描述进行悬浮液的关于粒度、ζ电势和PdI的化学-物理表征，并且数据报道于表A中。
实施例4
制备包含ICG、DSPE-PEG-2000和1,2-二硬脂基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000]铵盐(DSPE-PEG-2000-叶酸盐)的SLN(63R011005L)
按照实施例1中所描述的相同程序配制靶向的负载ICG的SLN并将DSPE-PEG-2000-叶酸盐作为靶向剂(2mg)添加至有机相中。在制备中，将402mg的Epikuron99mg的[1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)-2000)铵盐DSPE-PEG-2000，111mg的配合物17，450mg三棕榈精，50mg硬脂酸和1.2mg的ICG溶于CH2Cl2。水相(W)包含382mg的牛磺胆酸钠，0.4mL的1-丁醇和0.5mL水。将悬浮液浓缩至约8.5mL。
如实施例1中所描述进行悬浮液的理化表征并且数据报道于表H和I中。ICG/P摩尔比计算为0.26％。估计％ICG引入为～90％。荧光量子产率％为7.6(SD0.3)。对31.2mg制剂进行DSC分析。初始值为45.56℃，而制剂的ΔH为7.13J/g。
表H.DLS和ELS表征。
表I.最终制剂中的磷和ICG量。
图10显示了该实施例的SLN的DSC曲线。熔化温度(通过DSC测量的起始值)接近于甘油三酯的明确定义的多晶型(α)(±2℃)(参见ChapmanD.“Thepolymorphismofglycerides”,Chem.Rev.,1962,62:433-456andWindbergs等人，AAPSPharmSciTech,2009,10:1224-1233)并且允许定性定义SLN的固体核芯中的晶体结构的存在。
测量制剂的关于表面电荷、PdI和ζ电势方面的胶体稳定性直至将制剂在暗处于4℃保持90天。在25℃采用MalvernInstrument(ZetasizerNanoZS)在NaCl1mM中稀释样品进行测量。结果列于表D中。
实施例5制备包含ICG和DSPE-PEG-2000和1,2-二硬脂基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000]铵盐(DSPE-PEG-2000-叶酸盐)的SLN(63R011001L)
按照实施例1中所描述的相同程序配制靶向的负载ICG的SLN并将DSPE-PEG-2000-叶酸盐作为靶向剂(1mg)添加至有机相中。在制备中，将202mg的Epikuron50mg的DSPE-PEG-2000，56mg的配合物17，225mg三棕榈精，25mg硬脂酸和2mg的ICG溶于CH2Cl2(2mL)。水相W(0.25mL)包含175mg的牛磺胆酸钠，0.2mL的1-丁醇。水相W1(25mL)包含Tween0.24％w/v。将悬浮液浓缩至约10mL。
如实施例1中所描述进行悬浮液的关于粒度、ζ电势和PdI方面的化学物理表征并且数据报道于表A中。
实施例6制备包含ICG和DSPE-PEG-2000和1,2-二硬脂基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000]铵盐(DSPE-PEG-2000-叶酸盐)的SLN(63R011002L)
按照实施例1中所描述的相同程序配制靶向的负载ICG的SLN并将DSPE-PEG-2000-叶酸盐作为靶向剂(1mg)添加至有机相中。在制备中，将202mg的Epikuron52mg的DSPE-PEG-2000，56mg的配合物17，225mg三棕榈精，25mg硬脂酸和2mg的ICG溶于CH2Cl2(2mL)。水相W(0.250mL)包含190mg的牛磺胆酸钠，0.2mL的1-丁醇。水相W1(25mL)包含Tween0.24％w/v。将悬浮液浓缩至约8mL。
如前述实施例中所描述进行悬浮液的关于粒度、ζ电势和PdI方面的化学物理表征并且数据报道于表A中。
实施例7用于J聚集物评价的负载ICG的SLN悬浮液和游离ICG溶液的UV-Vis光谱
在配制日期结束，稍后将悬浮液保持储存条件下90和120天之后记录如实施例4中所描述制备的负载ICG的SLN悬浮液的UV-Vis光谱。在120天之后，吸光度相对于初始值恢复至96％(图4A)。
在葡糖酸盐(5.5％)溶液中制备ICG的溶液(0.14mg/mL)。在Uv-Vis分析之前稀释样品并从300至950nm评价吸收行为直至15天(图4B)。
实施例8光致褪色试验
通过将游离ICG水溶液和负载ICG的SLN悬浮液暴露至785nm激光辐照进行光致褪色试验。通过NIR荧光成像系统(LI-CORBiosciences的Impulse系统)收集荧光发射。将ICG的量(0.23nmol的ICG和0.036nmol的负载ICG的SLN，其具有5.6％的荧光量子产率)调节至显示初始参照荧光发射信号。
然后，以两份为一组地在37℃将两个样品辐照3秒钟并将样品在暗处保持1秒钟而进行试验。该顺序连续重复1h。
结果示于图2中。
实施例9通过UV-Vis在其最大吸收波长处测量负载ICG的SLN的长期稳定性
如实施例1中所描述，使用双波束Lambda40UV-Vis分光光度计(PerkinElmer,Waltham,MA)测量最终制剂中的ICG量。在将负载ICG的SLN(如实施例4中所描述制备)溶于有机溶剂混合物(CHCl3:MeOH；2:1)之后通过将样品在储存条件(4℃)下在暗处保持90天并通过测量在800nm处的最大吸收来分析热稳定性。
实施例10通过生物膜层干涉法说明靶向负载ICG的SLN的靶向性质
对靶向和未靶向的负载ICG的SLN(分别如实施例5和2中所描述制备)的两个不同的批料相对于抗体(MabFA2)抗叶酸进行生物膜层干涉法(OCTETQK，FortéBio)。在试验中，经由与单克隆抗体(MabFA2)抗叶酸相互作用的蛋白质A通过在室温孵育6分钟涂覆生物传感器。在分析之前，将生物传感器用PBS溶液洗涤并立即浸入保持在混合下的包含靶向的负载ICG的SLN的稀释悬浮液的96孔多孔板。在孵育300s之后，将所述传感器移至包含经磷酸盐缓冲的盐水(PBS)溶液的孔，以使解离曲线可视化。对比以相同的方式进行的未靶向负载ICG的SLN(阴性对照)分析，确认了MAbFA2与负载F-ICG的SLN之间的结合的特异性。试验报道于图5中(虚线分开了与离解曲线的关联)。
实施例11通过荧光成像的肿瘤靶向的体内和体外评价
在卵巢癌异种移植模型上使用皮下注射至Balb/Cnu/nu小鼠的右侧腹中的IGROV-1细胞系评价了分别在实施例5和2中配制的F-ICG-SLN和ICG-SLN。通过用游离ICG染料预处理选择所述小鼠(n＝6)，用于评价血管形成的程度。以该方式，将动物连贯地分配成两组。在围绕肿瘤区域标明的感兴趣的区域中收集所取得的荧光信号并使其参考肌肉的背景荧光，记为(肿瘤SI–肌肉SI)/肌肉SI。在每只小鼠注射15纳摩尔的ICG之后30min、4h和24h时的体内数据分析产生相对于未靶向的而言的F-ICG-SLN的较高的肿瘤信号强度。在24h之后，测量的荧光信号为5.1a.u.(SD2.9)，而在未靶向的负载ICG的SLN施用的情况下，荧光信号为1.7(SD0.2)。切除器官并分析组织的体外荧光定量(图6和7)。
Claims (23)
1.固体脂质纳米颗粒，其包括
a)固体脂质核芯，其包括至少一种甘油酯和/或至少一种脂肪酸；
b)形成围绕所述核芯a)的壳的两亲性组分的混合物；
c)具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物：
其中：
Y是式Y'-NH-或(Y')2-N-的基团，其中Y'在(Y')2-N-的情况下可以相同或不同，Y'选自：直链或支链的、饱和或不饱和的C12-C20烷基；C1-C10烷基，其任选地被磷酸酯基团-O-(HO-P＝O)-O-中断或任选地被一个或多个选自以下的原子或基团取代：OH、-COOR1、氧基羰基-(C12-C18)烷基和氧基羰基-(C12-C18)烯基；其中R1选自氢H和直链或支链的C1-C4烷基；或Y'是取代或部分取代的甘油的单磷酸酯，其中所述甘油的至少一个官能团被带有饱和或不饱和碳链的脂族脂肪酸酯化，且磷酸的其它两个官能团为游离的或与碱金属或碱土金属成盐；
L是二价连接基，其选自：脂族C3-C10或直链或支链C1-C6烷二基、烯二基、炔二基，其任选地被一个或多个选自以下的原子或基团中断：-C＝O-、-C＝S-、-NR1-、-COO-、-OCO-、-NR1CO-或-CONR1-、-O-和-S-，其中R1如上文所定义；
RI-IV各自独立地是-R2-COOR3，其中R2是C1-C6直链或支链的烷基，R3是H或药学上可接受的阳离子；
R’-”’各自独立地是-R2-COOR3，其中R2是C1-C6直链或支链的烷基，R3是H或药学上可接受的阳离子；
d)至少一种荧光染料，选自：菁荧光染料和/或多杂环化合物，选自香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中式I和/或II的化合物的所述碱土金属配合物如权利要求1中所定义，并且其中：
Y'在(Y')2-N-的情况下可以相同或不同，Y'选自：直链或支链的、饱和或不饱和的C16-C18烷基；C4-C6烷基，其被磷酸酯基团-O-(HO-P＝O)-O-中断和/或任选地被一个或多个选自以下原子或基团取代：氧基羰基-(C12-C18)烷基和氧基羰基-(C12-C18)烯基；或Y’为取代或部分取代的甘油的单磷酸酯，其中所述甘油的至少一个官能团被带有饱和或不饱和碳链的脂族脂肪酸酯化，其中所述脂族脂肪酸为具有饱和或不饱和碳链的C14-C20羧酸，并且磷酸的其它两个官能团为游离的或与碱金属或碱土金属成盐；
L、RI-IV和R’-”’如上文所定义。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，在具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物中，其中Y’为被磷酸酯基团-O-(HO-P＝O)-O-中断的C4-C6烷基，其进一步被至少两个选自以下的原子或基团取代：氧基羰基-(C14-C16)烷基和氧基羰基-(C14-C16)烯基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒，还包括：
e)具有掩蔽剂功能的共价连接至所述壳b)的亲水性聚合官能团。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒，还包括：
f)分子靶向结构部分，用于特异性结合至一个病理学相关的生物学标记物，所述结构部分连接至所述核芯壳b)或所述亲水性聚合官能团e)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述固体脂质核芯a)包括至少一种甘油酯和/或至少一种脂肪酸或其混合物，所述至少一种甘油酯或脂肪酸或其酯在室温或在体温时呈固体形式。
7.根据权利要求6所述的纳米颗粒，其中所述甘油酯选自甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，它们具有饱和或不饱和的、直链或支链的C12-C24酰基链，其中在甘油二酯和甘油三酯的情况下，所述酰基链可以相同或不同；所述脂肪酸或其酯具有饱和或不饱和的、直链或支链的C12-C24碳链；和所述核芯任选地包括C12-C24脂肪酸与C12-C24脂肪醇的酯。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述核芯a)包括三棕榈精和/或硬脂酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的纳米颗粒，其中两亲性组分b)的所述混合物包括选自以下的组分：具有直链或支链的、饱和或不饱和的C6-C24烃链的磷脂类、溶脂类和鞘脂类；任选至少一种胆固醇和类固醇衍生物、糖脂、脂肪酸、脂肪醇和二烷基醚，非离子型表面活性剂，优选选自失水山梨醇衍生物，C6-C24个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酸衍生物的二酯和三酯及其乙氧基化类似物；单糖苷或低聚糖苷及其乙氧基化类似物，在室温和在体温时可溶的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。
10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中两亲性组分的所述混合物包括来自大豆卵磷脂的磷脂酰胆碱。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的纳米颗粒，其中所述非离子型表面活性剂是聚氧亚乙基失水山梨醇单油酸酯。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的纳米颗粒，其中所述亲水性聚合物e)选自官能化的泊洛沙姆、聚硅氧烷、聚烷基聚醚、聚甘油、聚乙烯醇和聚乙二醇，任选地共价连接至磷脂结构部分。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的纳米颗粒，其中所述荧光染料是下式的吲哚菁绿
14.根据权利要求5-13所述的纳米颗粒，其中所述分子靶向结构部分f)是肿瘤靶向配体，选自细胞表面受体、蛋白质、适配体、肽和多肽、维生素、抗体或其片段和糖类。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的纳米颗粒，其中具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物选自：
16.根据权利要求1-15中任一项所述的纳米颗粒，用作诊断剂。
17.根据权利要求16所述的纳米颗粒，用于选自以下的诊断成像方法：临床荧光成像应用中的实时成像引导手术、肿瘤检测和淋巴结显像。
18.药物/诊断组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的纳米颗粒。
19.用于制备根据权利要求1-15中任一项所述的纳米颗粒的方法，包括如下步骤：
i.制备有机相(O)，这通过如下进行：在水不可混溶性或低可混溶性有机溶剂中溶解一种或多种将会形成固体脂质结晶核芯a)的脂质物质，两亲性组分b)，和如权利要求1-3中任一项所定义的具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物c)，荧光染料d)，任选的亲水性聚合物e)和/或所述靶向结构部分f)：
ii.通过溶解一种或多种亲水性表面活性剂和任选的助表面活性剂组分制备第一水溶液(W)；
iii.混合步骤i)的所述有机相(O)与步骤ii)的所述第一水溶液(W)并且搅拌直至形成稳定的W/O微乳液；
iv.然后将在步骤iii)中获得的所述W/O微乳液添加至可以包含至少一种表面活性剂的第二水溶液(W1)，以提供W/O/W1多重乳液；
v.通过蒸发从所述多重乳液除去所述有机溶剂，以提供悬浮液；
vi.冷却在步骤v)中获得的悬浮液，以提供所述固体核芯a)的完全结晶；
vii)洗涤在步骤vi)中获得的分散体，除去过量组分；
viii)任选地将在步骤vii)中获得的所述分散体以水相形式储存或在除去水之后以固相形式储存。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤i)中的所述有机溶剂具有20℃至70℃的沸点。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述溶剂选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯和甲酸乙酯或其混合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在所述步骤ii)中，所述亲水性表面活性剂选自：胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸，或其盐或衍生物，和所述助表面活性剂选自1-丁醇和1-己醇。
23.根据权利要求19所述的方法，其中在所述步骤iv)中，所述表面活性剂是失水山梨醇衍生物。
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