CN102143763A - 吲哚菁绿荧光乳剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米乳剂形式的吲哚菁绿制剂，其包含连续水相和至少一种分散的油相，其中油相包含吲哚菁绿、至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质。本发明还涉及所述制剂的制备方法和所述制剂的应用。

Description

吲哚菁绿荧光乳剂
本发明涉及可以用作诊断试剂，特别是用于荧光成像的新吲哚菁绿制剂及其制备方法和应用。
[现有技术]
荧光成像是基于将荧光标记注入动物或人并且检测荧光标记定位的成像技术。探测仪器由此包含荧光标记激发源和用于检测该标记发射的荧光的检测器。
当前，荧光成像作为其他方法的互补成像技术出现，例如MRI(磁共振成像)、PET(正电子发射断层摄影术)、SPECT(单光子发射计算机断层摄影术)、超声回波描技术、放射摄影术或X-断层摄影术。
荧光成像具有超过其他成像技术的许多优势：
-它不使用电离射线且由此无需放射防护或放射性废弃物的复杂处置；
-探测仪器是低廉、简洁和使用简单的；
-采集时间极短；
-它是在所注射标记的浓度方面极为敏感的技术，所述标记的浓度远低于MRI并且与用于PET和SPECT的浓度类似；
-它是一种技术，当对一定等级的小动物或器官进行非侵害性成像时其分辨率与核磁成像(PET、SPECT)类似，并且在使用显微镜检查技术时可以具有细胞分辨本领。
目前，在美国荧光蛋白和吲哚菁绿是批准用于在人体内注射的荧光团。
吲哚菁绿，下文称作ICG，在名称Cardiogreen(Akorn Inc.)、Infracyanine(Serb)、ICG-Pulsion(Pulsion Medical System)下销售。该化合物具有下式：
Figure BDA0000049004980000021
它是在近红外发射的荧光团。该范围对荧光成像具有特别的意义，因为与可见光范围相比，组织吸收光更少，组织扩散光更少，且组织的自发荧光减少。
由于该原因，所以吲哚菁绿是目前用于荧光成像临床应用所选择的荧光团。
然而，ICG具有一些特性，这些特性赋予其作为荧光标记的应用存在问题。
首先，ICG是具有5-10mg/ml溶解度的两亲化合物且由此难溶于水。在较高浓度下，形成具有不同光谱特性的二聚体或聚集物。
此外，ICG在水溶液中具有极差的稳定性和低荧光量子收率，尤其是由于形成那些难以发射的二聚体。因此，FDA要求在注入患者前10小时以内制备溶液。
此外，当通过静脉内途径注射时，ICG被吸附在血浆蛋白上至相当可观的程度，这就改变了吸收和发射光谱。
此外，ICG的荧光寿命(0.5ns)极为接近于生物组织的自发荧光寿命(典型地0.3-0.4ns)。因此，使用基于脉冲发光激发的荧光装置难以区分ICG荧光与组织自发荧光。
最终，ICG不具有能够与靶生物分子或例如抗体、肽类、糖类、蛋白质、寡核苷酸或适体偶合的接枝基团。靶分子的接枝是有价值的，因为在全身注射后，能够在体内所关注的区域检测到荧光团，可以导致ICG优先在所成像的区域蓄积，且由此使检测灵敏度增加。
已经提出了大量ICG制剂来克服那些问题中的一些。
因此，为了通过光凝固法治疗损害，专利申请WO 2001/017561提出了ICG制剂，使得其溶解度和化学稳定性增加，这些制剂包含醇、缓冲液、表面活性剂、甘油、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、油、红细胞、脂肪酸和抗微生物剂。专利申请US 2004/0156782描述了冻干形式的用于血管造影术、测定肝或心脏清除率或测定血流的ICG制剂。
专利申请WO 2003/057259描述了基于脂质体并且能够增加荧光团溶解度的ICG制剂。未指定荧光团的位置。然而，由于在形成脂质体后加入荧光团，所以推定它被吸附在脂质体表面。此外，这种制剂的稳定性少于1个月。最终，脂质体是双层壳的囊泡且一般具有大于100nm直径的粒度；该粒度的颗粒溶液发散光且不允许令人满意的血液循环外渗至肿瘤组织和细胞中的内化(internalisation)。
还提出将ICG吸附在负荷分子(cargomolecules)上，尤其是为了增加其血液半衰期。例如，WO 2005/082423描述了通过血清白蛋白的非特异性吸附与ICG共轭。然而，基于非共价吸附键的制剂具有低化学稳定性且限制了可以使用的生物靶配体的选择。因此，大力研究的小靶向肽类例如cRGD即血管发生标记(Haubner等人JACS 1996，118，7461-7472)不能与ICG结合以通过那些方法产生荧光标记。
专利申请US 2005/0019265提出了聚合体(polymersome)囊泡形式的荧光团制剂。然而，这种合成脂质体在合成方面是复杂的，需要使用合成聚合物且无法直接产生适合于允许成功血液循环外渗至肿瘤组织和细胞中的内化的纳米粒，即小于100nm且甚至小于50nm。
此外，文件US 7,014,839和WO 98/48846描述了水包油型乳剂形式的ICG制剂，但未显示该乳剂的生产方法或特征。然而，该类型的制剂在大部分情况中产生乳剂，其中液滴大小过大而无法限制光发散和确保体内注射后令人满意的胶体稳定性和隐身性(furtivity)。
[技术问题]
所提出的制剂无法行使ICG作为优化荧光成像的荧光团的性能。因此，期望拥有可得到的ICG制剂，其可以用于荧光成像并且是稳定的且能够发挥其优化的光学特性，尤其是通过防止它们受到外部环境干扰，且能够得到透明的制剂，在注射后，其显示令人满意的血液循环外渗至肿瘤组织和细胞中的内化。
[发明概述]
本发明提出了乳剂形式的制剂ICG，其包含在油相中的增溶脂质。
因此，本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的吲哚菁绿制剂，其包含连续的水相和至少一种分散的油相，其中油相包含吲哚菁绿、至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质。
两亲脂质优选是磷脂。
增溶脂质有利地包含至少一种脂肪酸甘油酯，例如至少一种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯。
油相还可以包含至少一种油，尤其是具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)的油，特别是大豆油或亚麻籽油。
水相优选还包含助表面活性剂，尤其是具有至少一种由环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链的助表面活性剂。助表面活性剂尤其选自聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺共轭物(PEG-PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类，脂肪酸和聚乙二醇酯类，和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
乳剂的连续相尤其可以包含生理学可接受的缓冲液。
本发明第二个方面涉及吲哚菁绿制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤，其中：
(i)制备包含ICG、两亲脂质和至少一种增溶脂质的油相；
(ii)在足以形成纳米乳剂的剪切作用(shearing action)下将油相分散在水相中；和
(iii)回收由此形成的纳米乳剂。
剪切作用特别可以通过超声处理发挥。
尤其可以通过将全部或一些成分溶于适合溶剂、然后蒸发掉该溶剂制备油相。
本发明的第三个方面涉及所述吲哚菁绿制剂作为诊断试剂的应用。
当如此配制时，ICG显示明显改善的光学特性(性能提高约10倍)，它能够使成像性能改善或注射剂量减少。例如，配制成0.27mg/ml纳米乳剂的2-10ml ICG发射至少与2-8ml 2.5mg/ml ICG(体重70此人的静脉内注射剂量，以测定循环血容量和心输出量)溶液相同强度的荧光信号。
此外，本发明的制剂在化学期限(chemical term)和胶体水平以及随时间变化的光学性能方面极为稳定。
不同于在下述这种介质中絮凝的悬浮液形式的ICG，本发明制剂的另一个优点在于可以用等渗介质例如154mM氯化钠制备它，由此可以在低渗介质(5％葡萄糖水溶液)中注射。
它完全适用于荧光成像，因为它优选由目前完全批准应用于人体注射的化合物构成。
本发明的ICG制剂还易于得到，极易制备且低廉。
此外，该制剂可以通过改变成分的摩尔比适合于不同药代动力学。
最终，本发明的制剂可以被官能化且由此能够使ICG被赋予可输送到所关注区域的特性，其通过与靶向生物分子或分子接枝的方式被成像，从而开启用于荧光成像的新临床应用。
[定义]
在本说明书范围内，术语“纳米乳剂”理解为具有至少两相的组合物，一般是油相和水相，其中分散相的平均大小小于1微米，优选10-500nm，且特别是20-100nm(参见文章C.Solans，P.Izquierdo，J.Nolla，N.Azemar和M.J.Garcia-Celma，Curr Opin Colloid In，2005，10，102-110)。
术语“液滴”包括液体油这样的液滴和获自水包油型乳剂的固体颗粒，其中油相是固体。在后面一种情况中，表述还通常使用固体乳剂。
在本说明书范围内，术语“脂质”表示包含存在于动物来源脂肪和植物油中的脂肪酸的全部脂肪材料或物质。它们是主要由碳、氢和氧构成并且具有低于水的密度的疏水或两亲分子。脂质在环境温度(25℃)可以是固态、如为蜡或液体形式，如为油。
术语“磷脂”意指具有磷酸酯基的脂质，特别是磷酸甘油脂类。在大部分情况中，磷脂类包含由任选取代的磷酸酯基形成的亲水端和由脂肪酸链形成的两个疏水端。在磷脂类中特别举出的是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。
术语“卵磷脂”表示磷脂酰胆碱，即由胆碱、磷酸酯、甘油和两种脂肪酸形成的脂质。更一般而言，它包括从植物或动物来源的活有机体提取的磷脂类，其程度是它们大部分由磷脂酰胆碱构成。这种卵磷脂一般由携带不同脂肪酸的卵磷脂混合物构成。
表述“脂肪酸”用于表示具有包含碳的至少4个碳原子的链的脂族羧酸。天然脂肪酸具有含碳的4-28个碳原子(一般是偶数)的链。表述长链脂肪酸是14-22个碳原子长的那些且如果存在22个以上碳原子，则是极长链脂肪酸。
术语“表面活性剂”理解为具有两亲结构的化合物，这种结构使得它们对油/水-型和水/油-型界面具有特定亲和力，使得它们能够降低这种界面的自由能并且稳定分散的系统。
术语“助表面活性剂”理解为与另一种表面活性剂一起起作用，以进一步降低界面能量的表面活性剂。
[本发明的描述]
[乳剂]
本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的吲哚菁绿制剂，其包含至少一种水相和至少一种油相，其中油相包含吲哚菁绿、至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质。
因此，该乳剂是水包油型乳剂。该乳剂可以是单相的或多相的，特别是通过在分散相中包含第二个水相。
该乳剂的特征在于油相除包含荧光团之外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质。
本发明的乳剂还在油相中包含一种或多种两亲脂质，其目的在于稳定乳剂。
这种两亲脂质包含亲水部分和亲脂部分。它们一般选自这样的化合物，其中亲脂部分包含具有8-30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的化合物。它们可以选自天然或合成来源的磷脂类、胆固醇、溶脂质(lysolipids)、鞘磷脂类、生育酚类、糖脂类、硬脂酰胺类和心磷脂类；由与亲水性基团通过醚或酯官能团偶合的脂肪酸形成的分子，例如山梨坦酯类，例如在
Figure BDA0000049004980000081
商品名下由Sigma销售的失水山梨糖醇单油酸酯和月桂山梨坦；聚合脂质；与聚氧化乙烯(PEG)短链共轭的脂质，例如在
Figure BDA0000049004980000082
商品名下由ICI Americas，Inc.销售的和在
Figure BDA0000049004980000091
下由Union Carbide Corp.销售的非离子型表面活性剂；糖酯类，例如蔗糖单月桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯；能够使用其自身或混合物形式的所述表面活性剂。
两亲脂质优选具有天然来源和生物相容性，例如磷脂类和胆固醇。
本发明的乳剂还包含增溶脂质。
该化合物的目的在于增溶在纳米乳剂油相中难溶的两亲脂质。
增溶脂质选自对两亲脂质具有足够亲和力以能够增溶的化合物。它可以是油或蜡。
就两亲脂质是磷脂的情况而言，它尤其可以是甘油衍生物，且特别是通过用脂肪酸酯化甘油得到的甘油酯类。
增溶脂质优选包含至少一种脂肪酸甘油酯。特别优选具有12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯类。
有利的是不同甘油酯的混合物。
优选得到包含至少10％重量的C12脂肪酸、至少5％重量的C14脂肪酸、至少5％重量的C16脂肪酸和至少5％重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。
优选得到包含0％-20％重量的C8脂肪酸、0％-20％重量的C10脂肪酸、10％-70％重量的C12脂肪酸、5％-30％重量的C14脂肪酸、5％-30％重量的C16脂肪酸和5％-30％重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。增溶脂质优选在环境温度(25℃)下是固体。
特别优选由Gattefossé在商品名
Figure BDA0000049004980000101
NC下销售并且批准用于人体注射的半合成甘油酯混合物。
上述举出的增溶脂质能够得到有利地稳定的纳米乳剂形式的制剂。不应限于具体理论，推定上述举出的增溶脂质能够得到具有无定形芯的纳米乳剂形式的液滴。由此得到的芯具有高的内在黏度，未显示结晶性。结晶实际上对纳米乳剂的稳定性具有不良影响，因为它一般导致液滴聚集和/或导致被包囊的分子从液滴中排出。这些物理特性由此提高了随时间推移的纳米乳剂物理稳定性和吲哚菁绿的包囊稳定性。
ICG优选是医用等级的无残留碘的ICG。
ICG可以以在适合有机溶剂(例如乙醇、DMSO或甲醇)中的浓溶液的形式使用。然而，可充分耐受的溶剂也优选用于体内施用。
优选本发明乳剂的分散油相还包含至少一种油。
优选生物相容性油。优选使用在乳剂形成前无化学或物理改变的生物相容性油。
本发明可以使用的生物相容性油可以具有天然(植物或动物)或合成来源。在这种油中特别举出的是植物来源的油，特别是大豆油、棕榈油、花生油、橄榄油、葡萄籽油和向日葵油；动物来源的油，尤其是鱼油；合成油，尤其是甘油三酯类、甘油二酯类和单酸甘油酯类；对所述油而言可以使用其自身或混合物形式。这些油可以是直馏油、精制油或酯交换的油。
根据本发明特别优选的实施方案，油选自难溶于水的油，即具有一般低于8且更优选3-6的亲水亲油平衡值(HLB)的油，例如大豆油。
更特别优选一种乳剂，其中油相包含至少一种选自大豆油和亚麻籽油的油。
当然，所述乳剂还包含连续水相。
水相优选包含水或生理学可接受的缓冲液、例如磷酸盐缓冲液、例如PBS(磷酸缓冲盐水)或氯化钠溶液，或主要由它们构成。
然而，水相还可以包含能够使连续相黏度增加并且有利于乳化的试剂，例如甘油。
本发明的乳剂有利地还包含助表面活性剂。
助表面活性剂优选具有至少一种由环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链。
有利的是，助表面活性剂选自聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺共轭物(conjugate)(PEG-PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类、脂肪酸和聚乙二醇酯类和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
[制备方法]
可通过已知乳化方法例如超声处理得到上述制剂。
然而，本发明的制剂优选通过一种方法得到，其中将ICG导入油相而不导入水溶液。
该步骤提供了对荧光团更有效的包囊且由此提供了更好的荧光量子收率且得到的制剂的稳定性更好。
因此，本发明的第二个方面提出了吲哚菁绿制剂的制备方法，该制剂包含至少一种水相和至少一种油相，该方法优选包含下列步骤，其中：
(i)制备包含至少一种增溶脂质、两亲脂质和ICG的油相；
(ii)在足以形成纳米乳剂的剪切作用下将油相分散在水相中；和
(iii)回收由此形成的纳米乳剂。
剪切作用优选通过超声处理发挥。
此外，有利地通过将全部或一些成分溶于适合溶剂、然后蒸发掉该溶剂制备油相。
当两亲化合物难溶时，关注通过混合分散相的成分、然后借助于增溶脂质将两亲化合物溶于油制备油相。
然后蒸发掉溶解ICG的有机溶剂。
然后能够加入通过混合连续相的成分制备的水相。
将水相添加到油相中优选通过加热进行，以使油相是液体。
通过强力剪切例如超声处理进行乳化，以便完成纳米乳剂形成。
根据本发明的优选实施方案，可以通过在纳米乳剂表面上接枝生物配体或所关注的分子使制剂官能化。
接枝优选对助表面活性剂进行，在连续相与分散相之间形成部分界面。
那些分子与助表面活性剂偶合可以在乳化前或乳化后进行。在乳化后，优选化学接枝反应在水溶液中和既不是过度酸性也不是过度碱性的pH(pH 5-11)下进行，使得乳剂不会不稳定。因此，当化学接枝反应难以进行时，主要优选第一种变化形式(乳化前接枝)。
可以用于使本发明乳剂官能化的所关注的分子可以是，例如：
a)生物配体：
i)生物靶向配体：生物实体(entity)(抗体、肽、糖、适体、寡核苷酸等)或化学实体(例如叶酸)，其能够特异性识别一些细胞(例如S.Achilefu，Technology in Cancer Research & Treatment，2004，3，393-408文章中所述的肿瘤细胞)或一些器官；
ii)为指定生物活性例如酶活性的标记的生物配体。例如，这种生物配体可以是可由指定蛋白酶裂解的肽，在其一端上接枝ICG荧光抑制剂。这种类型的配体能够使蛋白酶的酶活性特异性成像，正如C.H.Tung，Biopolymers，2004，76，391-403的文章中所记载的。另一个实例由具有使标记与其荧光抑制剂隔离的二硫键的生物配体构成。该生物配体能够对细胞中的探针的内在化(internalisation)进行特异性成像，例如，如法国专利申请FR 2 888 938中所述；
b)隐身剂(furtivity agent)：这是具有增加ICG在生物体内循环时间并且减慢其消除的效果的实体；
c)“装配载体”：这是能够装配荧光标记和/或生物靶向配体和/或隐身剂和/或一种或多种官能团(例如递送药物、其他成像模式、治疗功能)的实体。
所述乳剂还可以包含用于指定应用的其他试剂，例如：
-用于其他成像模式的成像剂，例如MRI(磁共振成像)、PET(正电子发射断层摄影术)、SPECT(单光子发射计算机断层摄影术)、超声回波描记术、放射摄影术或X-射线断层摄影术；或
-具有治疗效果的分子(例如DNA、寡核苷酸、化学分子等)。
可以将这种试剂导入乳剂的分散相或水相，或者其表面，或者可以通过共价或非共价键合使其吸附在分散相上。
得到的乳剂具有分散相中10-500nm、更具体地20-200nm且最具体地小于100nm的平均直径。
不希望受到任何理论约束，目前推定ICG可能被包囊在纳米乳剂内部并且嵌入其膜(或壳)。如果ICG甚至在乳化前就存在，所以它显示明显不同于ICG吸附在表面上的情况。
提出的ICG制剂显示随时间极佳的稳定性并且还显示极好的光学特性。
此外，能够允许在一些应用中用所关注的靶向配体官能化。
[乳剂的使用方法]
提出的ICG制剂特别可以用作诊断试剂。
提出的制剂中分散相的化学、光学和胶体稳定性、小平均直径和ICG稳定的荧光量子收率使得它对荧光成像而言特别有价值。
在该应用中，将乳剂注入体内，以便作为荧光探针起作用，发射的信号被适合的检测装置采集。
重要的应用在于检测前哨淋巴结。
迄今为止在临床上主要在该领域中应用的方法是闪烁显像(核成像)和染料成像(蓝色染料，例如专利蓝、亚甲蓝等)。所用标记在大部分情况中是纳米胶体形式的清蛋白缀合物，并且在其上吸附有染料，或接枝了一般基于99mTc的放射性核素螯合物。为了避免使用难以在手术室内进行的核成像技术，荧光是选择的技术，它比染色技术更灵敏且可定量。
本发明由此还涉及诊断方法，其包含对哺乳动物施用上述举出的制剂。所述哺乳动物优选是人。
通过实施例和附图更详细描述本发明，其中附图显示：
图1A：用CARY 300 SCAN分光光度计测定透析前后具有0μM-1000μM荷载比例的实施例1的ICG纳米乳剂在750nm的光密度。透析前线性相关线的等式为y＝0.2235x-2.8271，其中相关系数(R)为0.997；透析后的等式为：y＝0.0754x+0.0111，其中R为0.999。将ICG掺入纳米乳剂的平均比例约为35％；
图1B：制备后10-40天透析的具有0μM-1000μM荷载比例的实施例1的ICG纳米乳剂在750nm的光密度。10天后，线性相关线的等式为y＝0.0709x-0.1805，其中R为0.983；40天后的等式为：y＝0.0704x-3.7455，其中R为0.988。将来自包囊后40天的纳米乳剂的IGC损耗率估计约为7％；
图2A：在水中的ICG、在DMSO中的ICG或配制成实施例1的纳米乳剂的ICG的吸收光谱。将ICG以7.75mg/ml的比例溶于水或DMSO。用CARY 300 SCAN分光光度计测定的在水中、在DMSO中和在纳米乳剂中包囊的ICG的吸收光谱(1μM终浓度)；
图2B：用PERKIN ELMER LS 50B荧光分光计测定的相同样品的荧光发射光谱；
图3：如实施例1所述制备的乳剂分散相的平均直径的直方图：透析后10天(黑色条)和40天(白色条)。用ZeitaSizer Nano(Malvern Instrument)通过动态光散射对1ml 0.1X PBS溶液进行测定，其中已经加入了极小体积(0.5-2μl)的包含可变量ICG(荷载比例0-1500μM)的纳米乳剂；
图4A：表示透析后直接(黑色条)、透析后10天(阴影线条)和透析后40天(白色条)DMSO溶液形式、水溶液形式或包囊成实施例1纳米乳剂的ICG的荧光量子收率F的直方图。根据公式计算荧光量子收率F：F＝Fref x ((Ifluo)/(Ifluo)ref))x((1-10-Abs)ref/(1-10-Abs))x n2 ref/n2)，其中Fref是参比物的荧光量子收率(ICG的DMSO溶液；Fref＝0.13)，Ifluo是样品的荧光积分，Ifluoref是参比物的荧光积分，Abs 是在激发波长下样品的吸光度，Absref是在激发波长下参比物的吸光度，n2 ref是参比物(DMSO)的折射系数，n2是样品的折射系数。注意配制成纳米乳剂的ICG的量子收率随时间稳定，不同于ICG的水溶液形式；
图4B：表示根据上述指定公式计算的ICG的DMSO溶液和配制成纳米乳剂的具有1000μM荷载比例(如实施例1所述)的不同类型ICG(来自Sigma Aldrich的Cardiogreen或来自Serb Laboratoires的Infracyanine)的量子收率F的直方图。重要的是注意配制成纳米乳剂的ICG的光学特性改善与所用ICG的类型无关；
图5A：使用对数尺度显示作为两种溶液浓度范围函数的ICG水溶液和包囊在纳米乳剂(如实施例1所述)中的ICG的荧光水平，通过光学装置测定，该装置由在ICG吸收谱带中发射的光源和与适合的透镜结合的照相机组成。分别用超纯水和154mM氯化钠制备浓度范围(100μM-0.01μM)的ICG水溶液和包囊在纳米乳剂(透析后的荷载比例为350μM)中的ICG，并且用由PTFE制成并且具有1.9mm直径的小毛细管存留10μl的各点浓度，将其放至照相机下测量荧光水平；
图5B：在如图5A所示测量后约25分钟测定使用对数尺度显示的包含2.5nmoles ICG水溶液和如上所述配制成纳米乳剂的0.5nmolesICG的毛细管的荧光水平。注意到ICG水溶液的荧光水平和包囊在纳米乳剂中的ICG的稳定性随时间下降；
图6：用使用蓝宝石-钛激光器[Tsunami，Spectra-Physics，USA](80MHz，100飞秒)的测链测定根据实施例1制备的游离ICG的甲醇溶液或包囊在PBS混悬液(10mM，pH 7.3)中的纳米乳剂中的ICG的荧光减少，所述蓝宝石-钛激光器由连续钒酸钕激光器[Millennia Pro，Spectra-Physics，USA)](532nm，5W)泵送并且可在700nm-100nm波长调节。根据装置操作模式的不同，将激光注入用作研究样品的激发纤维的多模式光学纤维。第二种光学纤维(用于检测)通过过滤系统采集发射的荧光或激光散射。通过与TCSPC计数卡[Becker & Hickel，Germany]结合的光电倍增管[Hamamatsu，Japan]测定信号。后者由通过快速光电二极管(PD)[Becker & Hickel，Germany]从激光信号(脉冲串)中取出的部分(4％)引起，然后注入光学纤维。使用740nm脉冲激发波长进行测定。然后使用SPCImage软件(Becker Hickl GmbH)得到荧光寿命t，该软件由仪器响应函数(IRF)的去旋(deconvoluted)荧光衰减曲线的单指数下降(χr 2＝1.0)调节。将结果编辑在实施例1的表2中。
图7A-D：如实施例2中所述的大鼠血管系统的荧光成像照片。该照片显示在白光中光学装置成像的区域。在气体麻醉(2％异氟烷)下对大鼠颈部进行解剖并且将分离的颈动脉置于解剖套管上。然后将配制成纳米乳剂的稀释至225μM的ICG 200μl溶液(透析后荷载比例350μM)作为大丸剂(bolus)推注入尾静脉。照片B显示注射后(注射后0.5秒)即刻的颈动脉。在注射后1.5秒制取照片C并且其显示在荧光团通过时荧光信号变得比之前更强。在注射后2.5秒制取照片D并且其显示当如此配制的荧光团通过时比之前更强的荧光信号。在注射后5秒制取照片E且其显示在包囊在纳米乳剂中的ICG在头部组织血管系统中循环后，在颈静脉中观察到比之前更强的荧光信号(白色箭头)。随后由周围组织发射的轻度荧光信号可以相当于其血管化。
图8A-B：显示皮内注射ICG的5％葡萄糖水溶液(A)或包囊在纳米乳剂中的ICG(B)后裸小鼠中在白光中得到的图像与尾部淋巴结(此处是白色箭头表示的腘节结)荧光图像之间的重叠的照片。根据相同积分时间(60ms)得到白光中的照片，而根据不同积分时间(照片A为200ms且照片B为30ms)得到荧光照片。
图9A-E：通过静脉内注射包囊在纳米乳剂中的ICG(A，C)或ICG的5％葡萄糖水溶液(B，D)后两周前皮下植入裸小鼠的肿瘤的荧光成像得到的照片。使用不带有激光的光学装置在环境光下得到照片A和B，而在激光激发下使用从任意光中筛选的光学装置得到照片C和D。照片E表示切除后肿瘤的荧光成像，取自注射配制成纳米乳剂的ICG的小鼠的肿瘤位于右侧，且取自注射ICG的5％葡萄糖水溶液的小鼠的肿瘤位于左侧。
图10：温度T＝10℃和T＝60℃生产后纳米乳剂的两个1H NMR光谱(实施例6)。
图11a)和b)：使用Universal V3.8B TA装置(实施例6)通过对生产后(a)和在环境温度贮存4个月后(b)的示差扫描量热法(DSC)得到的作为以℃)计的温度函数的热分析图(热流量(W/g)。
图12：在40℃对3种纳米乳剂而言作为时间(按天计)函数的纳米乳剂液滴大小(按nm计)的改变。菱形表示不合增溶脂质并且包含油的纳米乳剂，三角形表示包含增溶脂质和油的50/50混合物的纳米乳剂，且圆形表示不含油且含增溶脂质的纳米乳剂(实施例6)。
实施例
实施例1
ICG乳剂形式的制剂
在适合的容器中，制备由0.05g大豆油(Sigma-Aldrich)、0.150g商品名
Figure BDA0000049004980000191
NC(Gattefossé)下销售的半合成甘油酯类和0.310mg和9.30mg ICG (Cardiogreen，Sigma-Aldrich或Infracyanine Serb laboratoires)的二甲亚砜(DMSO)溶液和在商品名S45下销售的0.100g大豆卵磷脂(富含45％磷脂酰胆碱)构成的预混合物。
真空蒸发DMSO后，将残余物加热至50-60℃，将液体混合物维持在该温度以乳化(在环境温度该混合物变成蜡状)。
通过混合0.05g甘油、0.331g具有50个环氧乙烷单元的ICIAmericas Inc.在商品名
Figure BDA0000049004980000194
53下销售的聚氧乙烯硬脂酸酯和154mM氯化钠溶液，使得该混合物达1.7g，制备连续相。然后将该溶液保持温热(50-60℃)，然后乳化。
然后将该水溶液加入到油/卵磷脂混合物中。然后使两相溶液接触浸入溶液约1cm的安装具有3mm直径的圆锥探头的超声发生器(Sonics，Newtown)。将该溶液超声处理5分钟，其中将超声发生器设定在25％最大功率，脉冲次序如下：10秒超声处理/30秒静置。在超声处理过程中，将该溶液维持在40℃在水浴中。
然后用具有12,000截断值(cutoff)的Spectra/
Figure BDA0000049004980000201
透析膜对154mM氯化钠溶液透析该溶液，以便除去未反应的试剂。
用0.22μm滤器过滤得到的乳剂，以便对其进行灭菌并且除去聚集物。然后在稀释后将乳剂直接用作用于体内功能成像的荧光探针。下表1概述了透析前得到的制剂的组成。
表1：实施例1制剂的组成
透析后，除去过量的荧光团(未配制成纳米乳剂)。ICG掺入纳米乳剂的平均比例为35％，如图1A所示。此外，ICG制剂极为稳定至少40天，因为在包囊后40天几乎没有荧光团损耗或损耗极少，如图1B所示。
如此配制的ICG的光谱特征与ICG的DMSO溶液相同，如图2A和2B和表2所示。
表2：ICG水溶液、甲醇溶液、DMSO溶液和配制成纳米乳剂的ICG的光学特性
  荧光团   吸收(nm)   发射(nm)   F   t(ps)
  ICG水溶液   777   802   0.042   -
  ICG甲醇溶液   783   809   0.16
  ICG的DMSO溶液   793   817   0.13   460±10
  为400μM纳米乳剂的ICG   798   820   0.086   530±40
与文献中记录的相比(WO 2003/057259中的25天)，得到的新制剂具有极高的化学、胶体和光学稳定性(至少＞40天)。
如此得到的乳剂具有通过光散射(ZeitaSizer Nano，MalvernInstrument)测定的29nm分散相平均直径并且该直径未随时间改变，如图3所示。
尽管ICG在包囊时的荧光量子收率F与在DMSO中测定的相比轻微下降，但是仍然保持比在水中测定的值大，如表2和图4A所示。此外，量子收率随时间仍然保持稳定，不同于在水中游离的ICG，如图4A所示，无论使用哪种ICG类型(来自Sigma Aldrich的Cardiogreen或来自Serb laboratoires的Infracyanine)，如图4B所示。
优化的光学特性允许在适合测量装置中的检测阈值减小，该装置由在ICG吸收谱带中发射并且其激发能约有几个mW/cm2的光源和与适合于观察样品的透镜结合结合的照相机构成，如图5A和5B所示。
此外，当包囊时，ICG的荧光寿命t增加，如图6和表2所示。这种特性极为有价值，因为它允许考虑将本发明制剂用于时间-分辨测量装置。
图7A-7E的照片显示本发明ICG制剂特别在荧光成像中的价值。
鉴于所有那些特性，由此能够销售备用形式的本发明制剂。
实施例2
血管化成像
通过异氟烷吸入(4％诱导且2％维持)麻醉Sprague Dawley品系的雄性大鼠(Harlan France)，然后将其放至成像装置下。该装置由如下构成：1)在ICG激发谱带中发射并且其激发能具有约几个mW/cm2的光源；和2)与适合于观察样品结合的CCD照相机。给该装置安装允许激发光和避免闪光且仅采集荧光的滤器。然后对颈部区域解剖，以便分离颈动脉和颈静脉。然后静脉内注射如实施例1所述制备的透析后具有350μM荷载比例的ICG制剂。然后如图7所示通过首先显示颈动脉、然后显示颈静脉对该区域中的血管系统进行荧光成像。这种荧光成像系统允许在手术过程中引导和/或控制外科医生的动作。
实施例3
前哨淋巴结成像
通过异氟烷吸入(4％诱导且2％维持)麻醉Nude品系(Janvier)的雌性小鼠，然后将其放至上述成像装置下。
通过皮内将10μl的如实施例1中所述制备的ICG制剂(注射0.5nmole)或溶于葡萄糖水的ICG(注射1nmole)注入右后爪。
然后通过荧光成像对接受注射的小鼠进行短暂监测。注意到配制成纳米乳剂的ICG示踪物快速蓄积(从前5分钟开始)并且优先蓄积在接近注射部位的淋巴结中。此外，与使用配制成5％的葡萄糖水溶液的ICG得到的结果相比，使用配制成纳米乳剂的ICG示踪物的应用允许对淋巴结进行更灵敏的检测，如图8A和8B所示。
实施例4
肿瘤成像
将鼠来源的Ts/Apc肿瘤细胞经皮下注入(106个细胞)Nude品系(Janvier)雌性小鼠背部，并且在成像期前的整个期限监测注射部位区域中的肿瘤生长。
2周后，小鼠在接近注射部位处具有肿瘤，然后将其通过异氟烷吸入(4％诱导且2％维持)麻醉，然后放至上述成像装置下。
在每种情况中，将200μl体积如实施例1中所述制备的ICG制剂(7nmoles)或ICG的5％葡萄糖水溶液(7nmoles)静脉内注入3只小鼠。1天后，对麻醉小鼠(异氟烷，2.5％)进行新的成像过程，对如实施例1所述的ICG制剂观察到了通过荧光成像对肿瘤的更好监测，如图9所示例的。
作为纳米乳剂的ICG制剂由此构成了优于ICG的葡萄糖水溶液的荧光示踪物，特别是用于肿瘤的显影。
实施例5
具有接枝cRGD的乳剂
在安装搅拌装置的适合容器中，通过在1ml甲醇与5μl三乙胺中混合25mg磷脂酰乙醇胺(PE，Sigma)和100mg SCM-PEG 5000-马来酰亚胺(Creative Biochem)并且在环境温度下进行搅拌制备PE-PEG(5000)-马来酰亚胺。
3小时后，蒸发掉溶剂和三乙胺，然后将得到的产物PE-PEG(5000)-马来酰亚胺溶于1ml甲醇。
如实施例1所述制备包囊ICG的乳剂，但除上述125mg大豆油、375mg Suppucire、350mg卵磷脂和1.5mg荧光团外还将上述制备的25mg PE-PEG(5000)-马来酰亚胺加入分散相。
靶向在内皮细胞表面上超表达的αVβ3整联蛋白的环肽，即Ansynth Service BV(Netherlands)销售并且在下文称作cRGD的c(RGDf[ε-S-乙酰基硫代乙酰基])K具有以巯基乙酸形式被保护的硫氢基。通过在与纳米乳剂偶合前30分钟添加4μl 0.5M TCEP(Sigma)使以水(500μl)稀释的2mg肽脱保护。
为了官能化，用pH 7.4的HEPES/EDTA缓冲液稀释乳剂，然后加入cRGD肽的溶液。将该反应混合物在室温混合1小时。在反应结束时加入4μmol 2-巯基乙醇以使未与肽反应的任何马来酰亚胺基团猝灭。
然后用具有12,000截断值的Spectra/
Figure BDA0000049004980000241
透析膜对PBS透析该溶液，以便除去未反应的试剂。用0.22μm滤器过滤预先得到的乳剂，以便除去聚集物并且还对其进行灭菌。然后在稀释后将乳剂直接用作用于体内功能成像的荧光探针。
实施例6
纳米乳剂稳定性的显示
进行下列实验以显示增溶脂质赋予纳米乳剂的稳定性。
实施例6a：通过NMR证实液滴的高内在黏度
按照实施例1的方案制备包含255mg
Figure BDA0000049004980000251
NC(Gattefossé)(增溶脂质)、85mg大豆油(Sigma Aldrich)(油)、345mg(ICI Americas Inc.)(助表面活性剂)、65mg
Figure BDA0000049004980000253
s75(卵磷脂，两亲脂质)和磷酸盐缓冲液(PBS)的纳米乳剂。
通过质子核磁共振对10℃和60℃的纳米乳剂进行分析。相对于参比物(在0ppm的4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸DSS)，用1H NMR光谱观察到的与纳米乳剂液滴的核心成分(油/增溶脂质和两亲脂质)相关的峰(0.9；1.5；1.6；2.0；2.2；4.1；4.2ppm)扩大，全部峰更是如此，因为温度低，从而显示了液滴的高内在黏度。与助表面活性剂
Figure BDA0000049004980000254
相关的峰(3.7ppm)未发生任何扩大，这显示助表面活性剂仍然保留在液滴表面上，其中聚氧乙烯链溶于水性缓冲液(图10)。
实施例6b：通过示差扫描量热法证实液滴中不存在结晶
按照实施例1的方案制备包含150mg
Figure BDA0000049004980000255
NC(Gattefossé)(增溶脂质)、50mg大豆油(Sigma Aldrich)(油)、228mg(ICI Americas Inc.)(助表面活性剂)、100mg
Figure BDA0000049004980000257
s75(卵磷脂，两亲脂质)和磷酸盐缓冲液(PBS)的纳米乳剂。
通过对制备后和在环境温度下贮存4个月后纳米乳剂的示差扫描量热法得到的热分析图显示生产后或在环境温度贮存4个月后未观察到融合峰(fusion peak)，这表明液滴未结晶(图11)。
实施例6c：纳米乳剂组成对其物理稳定性影响的显示
按照实施例1的方案制备包含228mg
Figure BDA0000049004980000261
(ICI AmericasInc.)(助表面活性剂)、100mg
Figure BDA0000049004980000262
s75(卵磷脂，两亲脂质)、1600μl磷酸盐缓冲液(PBS)、表3中指定量的NC(Gattefossé)(增溶脂质)和大豆油(Sigma Aldrich)(油)的3种纳米乳剂。
表3：纳米乳剂中
Figure BDA0000049004980000264
NC和大豆油的量
Figure BDA0000049004980000265
对三种得到的纳米乳剂在40℃进行加速稳定性试验。监测纳米乳剂随时间变化的大小/多分散性显示增溶脂质的稳定效果。尽管不含增溶脂质的纳米乳剂的大小在40℃约170天后显著增加，但是包含增溶脂质的纳米乳剂在液滴大小方面未显示任何明显的变化(图12)。结果显示向纳米乳剂组份中添加增溶脂质对液滴和纳米乳剂赋予了更好的物理稳定性。

Claims (14)

1.纳米乳剂形式的吲哚菁绿制剂，其包含连续的水相和至少一种分散的油相，其中油相包含吲哚菁绿、至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，所述增溶脂质在25℃下为固体并且包含至少一种具有12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯。
2.权利要求1的吲哚菁绿制剂，其中两亲脂质是磷脂。
3.权利要求1或权利要求2的吲哚菁绿制剂，其中油相还包含至少一种油。
4.权利要求3的吲哚菁绿制剂，其中油具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)。
5.权利要求1-4任一项的吲哚菁绿制剂，其中油相包含选自大豆油和亚麻籽油的至少一种油。
6.权利要求1-5任一项的吲哚菁绿制剂，其中水相还包含助表面活性剂。
7.权利要求6的吲哚菁绿制剂，其中助表面活性剂包含至少一种由环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链。
8.权利要求7的吲哚菁绿制剂，其中助表面活性剂选自共轭物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类，脂肪酸和聚乙二醇酯类和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
9.权利要求1-8任一项的吲哚菁绿制剂，其中乳剂的连续相包含生理学可接受的缓冲液。
10.吲哚菁绿制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤，其中：
(i)制备包含ICG、两亲脂质和至少一种增溶脂质的油相，该增溶脂质在25℃下为固体并且包含至少一种具有12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯；
(ii)在足以形成纳米乳剂的剪切作用下将油相分散在水相中；和
(iii)回收由此形成的纳米乳剂。
11.权利要求10的制备方法，其中通过超声处理发挥剪切作用。
12.权利要求10或11的制备方法，其中通过将全部或一些成分溶于适合的溶剂且然后蒸发掉溶剂制备油相。
13.权利要求1-9任一项的吲哚菁绿制剂作为诊断试剂的应用。
14.诊断方法，其包含对哺乳动物施用权利要求1-9任一项的制剂。
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