JP6227760B2 - 蛍光固形脂質ナノ粒子組成物およびその製法 - Google Patents

Description

本発明は、医薬および診断用組成物、とりわけ蛍光プローブを含有する組成物、さらに詳細には該プローブを含有する固形脂質ナノ粒子の分野に関する。

本発明はまた、特にリアルタイム式画像誘導手術にて役立つ診断剤の分野に関する。

インドシアニン・グリーン（本明細書中でＩＣＧとも称される）は、ＦＤＡ承認の蛍光プローブであるが、肝臓により速やかに排除されるため、迅速な代謝クリアランスを受ける。ＩＣＧは、静脈内注射されると、アルブミンに結合し、つづいて肝実質細胞によりほぼ例外なく吸収されることが知られている。ＩＣＧがヒト推奨用量の０.５ｍｇ／ｋｇで投与されると、通常の血中半減期はほぼ３.０分である（Rosenthal E、Zinn KR編集、がんの光画像（Optical Imaging of Cancer）：Clinical Applications. New York, NY, USA: Springer; 2009. pp 72）。この効率的な肝胆道排泄により、ＩＣＧが特定の病的部位で選択的に蓄積することが妨げられ、その臨床的使用の可能性が制限され、実際には、主に眼血管造影、肝機能の特性評価、または心拍出量の測定にて用いられる血流の光学的検査に限定される。

インドシアニン・グリーンは、臨床的蛍光画像処理の用途にて、高感度で腫瘍を検出するための、およびリンパ節をマッピングするための有望な候補物質であると考えられる。ＩＣＧの製剤は、がん病変をリアルタイムで可視化するのに、および手術による病変摘出、または内視鏡を用いる手術の間のセンチネルリンパ節の検出に用いるのに特に望ましい。

しかしながら、上記されるように、ＩＣＧは、その血液中での滞留時間が極めて短いため、０.５ｍｇ／ｋｇの臨床的推奨用量で使用されると、静脈内投与した後に腫瘍組織でいかなる有意な標的となる特性も有さない。

その上、ＩＣＧは水溶液中で不安定であり（すぐにμＭ濃度になる）、そして凝集しやすいために６時間以内に使用する必要がある。色素−色素間の相互作用は、色素励起の後の吸収係数の減少および蛍光自己消光作用として、ＩＣＧの光学特性に対して悪影響をもたらす（Landsman, M. L.; Kwant, G.; Mook, G. A.; Zijlstra, W. G.、「インドシアニン・グリーンの光吸収特性、安定性およびスペクトル安定化（Light absorbing properties, stability, and spectral stabilization of indocyanine green.）」J. Appl. Physiol. 1976, 40, 575-83）。

Saxena V.ら（Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 74 (2004) 29-39）は、水安定性、光安定性および熱安定性を改善するのにＩＣＧにポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）およびポリビニルアルコールのポリマーナノ粒子を用いることを開示する。この研究においては、たとえＩＣＧをロードしたナノ粒子の安定性が、ＩＣＧをポリマーエンベロープに封入することで改善されたとしても（水溶液における半減期が２.５−３日であるとしても）、ナノ粒子中のＩＣＧは、遊離したＩＣＧ溶液との関連で、そのピーク蛍光度の減少を示す。この知見は、高粒度分布（平均粒径約３５０ｎｍ）と相まって、腫瘍を標的とするインビボでの画像処理において低効率をもたらし得る。

ＷＯ２０１０／０１８２１６は、油性相に、ＩＣＧ、少なくとも１つの両親媒性脂質、および２５℃で固体である少なくとも１つの可溶化脂質を含む、インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）の蛍光ナノエマルジョンを開示する。この文献によれば、結晶化度は、ナノエマルジョンの安定性に害をなし、積極的に被包された分子をドロップレットの外部に排出するか、またはそれらを凝集させると考えられるため、ナノエマルジョン中のドロップレットは非晶質のコアを有するはずである。

上記したナノ粒子およびナノエマルジョンによって明白な進歩が提供されるにも拘わらず、ＩＣＧを近赤外線画像処理に使用するにはまだまだ問題がある。AltinogluおよびAdair（WIREs Nanomedicine and Nanonoptechnology, Volume 2, September/October 2010, 461-477）は、量子ドット（ＱＤ）がＮＩＲ画像処理にて優れた光学特性および安定性のあることを確認する。しかしながら、毒性問題がその使用を妨げ、未だにＮＩＲ用色素が提案されている。ＩＣＧのリン酸カルシウムより合成されるナノ粒子における被包形成が再検討されており、臨床でのＱＤに関する実績は低いにも拘わらず、その臨床への適用が提案されている。

Zhengら（Mol. Pharmaceuticals 2011, 8, 447-456）は、ＩＣＧの水安定性の乏しさ、その蛋白との結合の非特異性、および標的特異性の欠如の問題を克服するために、リン脂質−ポリエチレングリコール（ＰＬ−ＰＥＧ）とＩＣＧとの間で共有結合以外の自己組織化する化学的特性を利用するＩＣＧ含有のナノ構造物を開示する。光画像処理および光熱療法を標的とするこのナノ構造物の二元的機能性が提案されている。最近では、それらをインビボでの光熱療法にて使用することが記載される（Zhengら、Mol. Pharm., 2012, 9 (3): 514-522）。

Navarroら（Journal of Biomedical Nanotechnology, Vol.8, 594-604および730-741, 2012）は、術中に蛍光作用を提供するものとして、ＩＣＧの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をベクター化することを開示する。該研究においては、遊離色素を注射する場合と比べて、ＩＣＧ−ＬＮＰのインビボにおける腫瘍／皮膚およびエクスビボでの腫瘍／筋肉の蛍光割合の改善が２日までの間に測定された（２４時間と４８時間の間で２倍となった）。

ＵＳ２００６／００８３７８１は固形脂質ナノ粒子を開示しており、腫瘍標的の治療システム、熱応答性ペイロードデリバリーシステム、磁気駆動性標的システム、治療診断システム、安定化インク組成物および化粧品におけるその使用を考慮して、それらに機能処理を施している。その上、その開発される方法は、量子ドットを脂質環境に被包することを受け入れており、被包することで、それらが酸化種と接近すること、Ｃｄ関連の毒性を減少させている。

固形脂質ナノ粒子のあらゆる製法を取り扱う最新の報告が、SawantおよびDodiya（Recent Patents on Drug Delivery & Formulation 2008, 2, 120-135）に記載される。ナノ粒子のデリバリー特性を最適化するためには、１００ｎｍよりも小さな粒度を要求することが好ましい。対照的に、その文献で利用される多くの方法では、平均粒度がマイクロメーターの範囲にあるＳＬＮ（Cortesiら、Biomaterials 2002；23:2283-2294）または２００ｎｍよりも大きいＳＬＮ（Garcia-Fuentesら、Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2003, 27: 159-168; Morelら、European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 45（1998) 157-163）が提供され、好ましいナノの大きさの範囲よりもずっと大きい。

本発明におけるナノ懸濁液の製剤は、好都合にも、１００ｎｍよりも小さな粒度を示し、長期にわたる血液循環半減期および改善された光安定性および蛍光シグナルを示す。

これらの予期せぬ結果は両親媒性成分および製造方法を最適化することで達成される。

この度、意外にも、ＩＣＧならびにＩＣＧの他の蛍光色素アナログを他の化学物質と一緒に固形脂質ナノ粒子に組み入れることで、従来技術の上記した問題が解決され、またさらなる利点が提供されることも見出された。それらは本明細書の以下の開示より明らかであろう。

本発明の目的は、固形脂質ナノ粒子（以下、ＳＬＮ、または単にナノ粒子ともいう）であって、
ａ．少なくとも１のグリセリド、および／または少なくとも１の脂肪酸を含む固形脂質コア；
ｂ．両親媒性成分の混合物；
ｃ．式Ｉおよび／またはＩＩ：

［式中、各基は下記にて定義されるとおりである］
で示される化合物とのアルカリ土類錯体からなる両親媒性成分；
ｄ．シアニンファミリー、および／またはクマリン、ピラノ、キノリン、ピラノキノリン、インドールおよびピラノインドール誘導体を含むポリエテロサイクリック（polyetherocyclic）化合物の酸形態またはその医薬的に許容される塩での蛍光色素
を含む、固形脂質ナノ粒子を提供することである。

該ナノ粒子の製造方法を提供することが本発明のもう一つ別の目的である。

特に診断に用いるための上記したナノ粒子を含む医薬組成物を提供することが本発明のもう一つ別の目的である。

診断薬として用いるための上記したナノ粒子を提供することがが本発明のもう一つ別の目的である。

本発明のもう一つ別の目的は、上記のナノ粒子であって、そのナノ粒子の表面に分子の標的となる部分が存在し、それと選択される器官、組織または細胞との間で関連する結合アフィニティが達成されるところのナノ粒子を提供することである。

本発明のもう一つ別の目的は、特にリアルタイム式画像誘導手術において診断薬として有用な上記のナノ粒子を提供することである。

本発明のもう一つ別の目的は、腫瘍検出における診断薬として、および臨床的蛍光画像適用、特にがん病変をリアルタイムで可視化するのに、および手術による病変摘出あるいは内視鏡／腹腔鏡手術の間のセンチネルリンパ節の検出に用いるための上記したナノ粒子を提供することである。

本発明のＳＬＮは、蛍光色素と一緒にロードされる場合に、血液循環半減期を長くし、その後の浸透性および滞留性の強化（ＥＰＲ（enhanced permeability and retention））作用によって目的とする病理組織にて蓄積させることを可能とする。

本発明のＳＬＮは、遊離形態の蛍光体との関連で、脂質マトリックス保護作用に起因する光安定性の強化、および蛍光シグナルの改善を示す。

さらには、脂質成分は、色素を、失活剤分子との相互作用に応じて、分解因子より、あるいは臨界的な生物学的条件（すなわち、酸性ｐＨ）による化学分解より、または光照射（光ブリーチング工程）より保護しうる。

最後に、蛍光色素を配合した本発明に係るＳＬＮは、回りの成分の立体的束縛よりもたらされる非発光性緩和速度の減少によって該色素の蛍光量子収率（φ）を改善する。

これらおよび他の目的および利点は、以下の記載にて、さらに図面および実施例により詳細に開示される。

本発明のＩＣＧをロードしたＳＬＮの典型的な粒度分布を示す。 ＩＣＧおよびＩＣＧをロードしたＳＬＮの光ブリーチング実験の結果を示す。 ＩＣＧをロードしたＳＬＮの長期安定性を示す。 パネルＡはＩＣＧをロードしたＳＬＮの水溶液中でのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルであって、調製から０時間（点線）および１２０日（黒線）経過した後のスペクトルを示す。 パネルＢはＩＣＧの水溶液における異なる時点（０時間：点線；９日後：灰色線；１５日後：黒線）でのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。 ＦＡ−ＩＣＧをロードしたＳＬＮ（標的とされるＩＣＧ−ＳＬＮ（targeted ICG-SLN））および標的とされないＳＬＮ（non targeted SLN）（ＩＣＧ−ＳＬＮ）の抗葉酸ＩｇＧに対する結合アフィニティを評価するためのレーザー干渉実験を示す。 ＩＣＧをロードしたＳＬＮおよびＦＡ−ＩＣＧをロードしたＳＬＮをＩＧＲＯＶ−１異種移植片卵巣がんのＢａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに投与して２４時間経過した後のマウス（ｎ＝６）のエクスビボ分析を示す。 ＩＣＧ−ＳＬＮ（パネルＡ）をＩＧＲＯＶ−１異種移植片卵巣がんのＢａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに投与して２４時間経過した後のマウスのエクスビボ分析を示す。 ＦＡ−ＩＣＧ−ＳＬＮ（パネルＢ）をＩＧＲＯＶ−１異種移植片卵巣がんのＢａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに投与して２４時間経過した後のマウスのエクスビボ分析を示す。 標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮの光学密度（７５０ｎｍ）を示す。 実施例１のＩＣＧをロードしたＳＬＮのＤＳＣを示す。 実施例２のＩＣＧをロードしたＳＬＮのＤＳＣ曲線を示す。

本発明に係るナノ粒子は、必須成分として：
ａ）少なくとも１のグリセリド、および／または少なくとも１の脂肪酸を含む固形脂質コア；
ｂ）該コアａ）の回りにシェルを形成する両親媒性成分の混合物；
ｃ）式Ｉおよび／またはＩＩ：

［式中、各基は下記にて定義されるとおりである］
で示される化合物、またはその医薬的に許容される塩とのアルカリ土類錯体からなる両親媒性成分；
ｄ）シアニンファミリー、および／またはクマリン、ピラノ、キノリン、ピラノキノリン、インドールおよびピラノインドール誘導体を含むポリエテロサイクリック化合物の酸形態、またはその医薬的に許容される塩での蛍光色素
を含む。

本発明のもう一つ別の実施態様にて、該ナノ粒子は：
ｅ）ステルス剤としての機能を有する、該シェルｂ）に共有結合する親水性ポリマー
をさらに含む。

本発明のもう一つ別の実施態様にて、該ナノ粒子は：
ｆ）病理関連の一の生物学的マーカーと特異結合するための分子標的となる部分であって、シェルｂ）または親水性ポリマーｅ）のいずれかに連結する部分をさらに含む。

以下の組成パーセントは、最終懸濁液にて実質的に含まれないイオン性界面活性剤および低分子量アルコールの寄与を考慮することなく、ＳＬＮの調製に用いられるａ）ないしｆ）の成分の配合量と関連付けられる。

以下の記載において、各成分ａ）ないしｆ）は、ＳＬＮ乾燥成分の総重量に対する重量／重量％で表される。

固形脂質コアａ）は、少なくとも１つのグリセリド、好ましくはトリグリセリド、および／または少なくとも１つの脂肪酸またはそのエステルあるいはそれらの混合物（室温（すなわち、約２０−２５℃）ないし体温（３７℃）からなる温度範囲にて少なくとも固形である）を含む。本発明の第一の態様において、該固形脂質コアａ）は、飽和または不飽和で直鎖または分岐鎖のＣ_１２−Ｃ_２４アシル基を有する、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドからなる群より選択される少なくとも１つのグリセリドを含む。ジおよびトリグリセリドでは、そのアシル鎖は同じであっても異なってもよい。該脂肪酸またはそのエステルは、飽和または不飽和で直鎖または分岐鎖のＣ_１２−Ｃ_２４の炭素鎖を有する。本発明の目的を達成するのに該脂肪酸のエステルもまた提供され、好ましくはＣ_１２−Ｃ_２４脂肪族アルコールとのエステルが提供される。

本発明の目的を達成するために、「固形脂質コア」なる語は、室温（すなわち、約２０−２５℃）と体温（すなわち、約３７℃）の間からなる温度で固体である脂質コアを意図とする。

約３０−５０％（重量／重量）、好ましくは３５−４５％を構成しうる、本明細書において「脂質成分」とも称される固形コアは、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドからなる群より選択される少なくとも１つのグリセリド（飽和または不飽和で、鎖長が炭素数１２−２４の直鎖または分岐鎖の炭素水素鎖であって、融点が３７℃よりも高いグリセリド）および／または少なくとも１つの飽和または不飽和で、直鎖または分岐鎖のＣ_１２−Ｃ_２４脂肪酸またはそのエステルを含む；ただし、その選択される割合は上記される条件で固形組成物を提供するものとする。

脂質成分はまた、モノ、ジまたはトリグリセリドの混合物、例えば、SOFTISAN（登録商標）およびWitepsol（登録商標）、好ましくはWitepsol（登録商標）W35、H42、E76、E85またはSOFTISAN（登録商標）I38、I42、I54の名称で知られる市販の混合物とすることもできる。

脂質成分は、トリパルミチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、トリミリスチン酸グリセリル、トリラウリン酸グリセリル、トリアラキジン酸グリセリルまたはそれらの混合物などのトリグリセリドからなるのが好ましい。特に好ましい実施態様によれば、固形コアはトリパルミチン酸グリセリル（トリパルミチン）を含む。

脂質成分は、好ましくは、少なくともＣ_１２−Ｃ_２４脂肪酸を含み、その炭化水素鎖は飽和または不飽和で直鎖または分岐鎖とすることができる。好ましくは、脂肪酸は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸またはそれらの混合物より選択される。該コアは、所望により、Ｃ_１２−Ｃ_２４脂肪アルコールとのＣ_１２−Ｃ_２４脂肪酸のモノまたはジエステルを含んでもよい。該脂肪酸エステルの成分は、さらには、例えば、パルミチン酸セチルとすることもできる。

好ましい脂質の組み合わせは、トリパルミチンとステアリン酸との組み合わせである。

もう一つ別の実施態様によれば、ａ）の脂質成分は、水に不溶であるが、有機溶媒に可溶である他の脂質を含んでもよい。例えば、脂質は、エステル化ポリ（アクリル酸）またはエステル化ポリ（ビニルアルコール）であり得る。特に、該脂質は１または複数のアルコールで全体としてまたは部分的にエステル化されるポリ（アクリル酸）であり得る。一の態様において、アクリル酸残基のすべてがすべてエステル化されるのではない。さらなる態様において、実質的にすべてのアクリル酸残基がエステル化される。ポリマーはホモポリマーまたはコポリマーとすることができる。一の態様において、脂質は少なくとも１のＣ_４−Ｃ_２４アルコールを含み得る。一の態様にて、該アルコールは飽和または不飽和とすることができ、直鎖または分岐鎖とすることもでき、置換または非置換とすることもできる。アルコールは各アクリル酸残基で同一または異なってもよい。もう一つ別の実施態様において、脂質は１または複数のカルボン酸で完全にまたは部分的にエステル化されたポリ（ビニルアルコール）であり得る。一の態様において、ビニルアルコール残基のすべてがすべて、あるいは実質的にすべてがエステル化されるものではない。ポリマーはホモポリマーまたはコポリマーのいずれであってもよい。カルボン酸は各ビニルアルコール残基で同一または異なってもよい。

ＳＬＮにおいて、脂質成分は固体であり、非晶質または結晶の形態である。

特に好ましい実施態様によれば、固形コアはトリパルミチンおよびステアリン酸を含み、結晶形態である。

成分ｂ）に関して、本発明は、両親媒性化合物を界面活性成分として使用することを含む。界面活性成分は、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_６−Ｃ_２４炭化水素を有するリン脂質、リゾ脂質およびスフィンゴ脂質；所望により、少なくとも１つのコレステロールおよびステロイド誘導体、糖脂質、脂肪酸、脂肪族アルコールおよびジアルキルエーテル、非イオン性界面活性剤、例えばソルビタン誘導体、好ましくはポリオキシエチレンモノオレアートまたはモノパルミタート誘導体（商品名：Alkest TW 20（登録商標）、Tween 80（登録商標）で公知のポリソルベート２０等）、Ｃ_６−Ｃ_２４の炭素原子より誘導される飽和または不飽和脂肪酸のジ−およびトリ−エステル、ならびにそのエトキシ化アナログ；モノ−またはオリゴ−配糖体およびそのエトキシ化アナログ、室温または体温で液体であるグリセロールモノ−、ジ−またはトリ−エステルからなる群より選択される。界面活性成分はＳＬＮの２５−６０％（重量／重量）に相当する。ＳＬＮ組成物は、好ましくは約２７−４５％、より好ましくは３０−３８％にてリン脂質を含む。

この点において、リン脂質の例が、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、
１,２-ジステアロイル-ｓｎ-グリセロ-３-エチルホスホコリン（エチル-ＤＳＰＣ）、ジペンタデカ-ノイルホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１-ミリストイル-２-パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１-パルミトイル-２-ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭ-ＰＣ）、１-パルミトイル-２-ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１-ステアロイル-２-パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１-パルミトイル-２-オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１-オレイル-２-パルミトイルホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬ-ＰＧ）およびそのアルキル金属塩、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルキル金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルキル金属塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルキル金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルキル金属塩、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルキル金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルキル金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルキル金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルキル金属塩、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）またはそれらの混合物である。

本発明の一の実施態様において、両親媒性成分ｂ）は、リン脂質、好ましくは天然源のリン脂質を包含する。好ましい実施態様にて、成分ｂ）は、Epikuron 200（登録商標）として市販されている大豆レシチンから由来のホスファチジルコリンを包含する。天然源の他のリン脂質の例が、Epikuron 170（登録商標）またはEpikuron 100（登録商標）、Lipoid（登録商標）S 75、Lipoid（登録商標）S 100、または卵レシチンのLipoid（登録商標）E 80である。

両親媒性成分はまた、胆汁酸またはその塩、コレステロールおよびステロイド誘導体、例えば６-(５-コレステン-３β-イルオキシ)-１-チオ-β-Ｄ-ガラクトピラノシド；６-(５-コレステン-３β-イルオキシ)ヘキシル-６-アミノ-６-デオキシ-１-チオ-β-Ｄ-ガラクトピラノシド；６-(５-コレステン-３β-イルオキシ)ヘキシル-６-アミノ-６-デオキシル-１-チオ-β-Ｄ-マンノピラノシド、糖脂質、脂肪酸、脂肪族アルコールおよびジアルキルエーテルを含むことができ、該酸、エステルおよびアルコールは直鎖または分岐鎖のＣ６−Ｃ２４の炭素鎖を有するか、トコフェロールまたはトコフェロール・ヘミコハク酸である。

他の両親媒性成分はまた、非イオン界面活性剤、好ましくは炭素数６−２４の飽和または不飽和の脂肪酸誘導体のソルビタンモノ−、ジ−またはトリ−エステル、あるいはそのエトキシル化アナログを包含しうる。好ましい実施態様において、該組成物は、Tween 80（登録商標）として市販されているポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／またはポリソルベート６０（Tween（登録商標）60）、ポリソルベート４０（Tween（登録商標）40）などの類似化合物を包含する。ソルビタンモノパルミタート（Span（登録商標）40）、ソルビタンモノステアラート（Span（登録商標）60）、ソルビタンモノオレアート（Span（登録商標）80）などのさらなるソルビタン誘導体も含まれうる。好ましくはこの成分はＳＬＮの５−２０％を構成し、さらにより好ましくは約８−１２％を構成する。

他の両親媒性成分はまた、室温および体温で可溶性の、単糖類またはオリゴ糖類およびそれらのエトキシル化アナログ、グリセロールモノ−、ジ−またはトリ−エステルを包含しうる。室温および体温で可溶性であるとの特徴は当業者に鎖長を想起させる。

両親媒性成分はまた、イオン界面活性剤を包含する。好ましい実施態様において、コール酸、その誘導体または塩などのアニオン界面活性剤が好ましい。コール酸の中でも、コール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、およびタウロコール酸ナトリウムなどのタウロコール酸およびタウロデオキシコール酸あるいはその誘導体または塩が特に好ましい。より好ましい実施態様において、タウロコール酸ナトリウム・水和物がその製剤に含まれる。６ないし２４個の炭素原子を有するポリアルキルホスファート、アルキルスルホナートおよびスルファート、アルキルスルホスクシナートなどの他のアニオン界面活性剤も含められ得る。

共界面活性剤をその製剤に含めることができる。好ましい実施態様において、Ｃ_３−Ｃ_８炭化水素鎖を有するアルコール、好ましくは、例えば１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノールおよび１−オクタノール、３−ペンタノールおよび４−ヘプタノールなどのモノアルコールが含まれうる。１−ブタノールおよび／または１−ヘキサノールが最も好ましい。

成分ｃ）によれば、本発明は両親媒性化合物の安定化剤としての使用を含む。特に成分ｃ）は、実験のセクションにて詳細に記載されるように、粒子が経時的にその大きさを維持し、ＳＬＮ粒子の安定性に寄与することを可能とする。両親媒性化合物は、親油性の脂肪族の部分と配位ケージにより特徴付けられる配位化合物より選択されるアルカリ土類金属の錯体である。そのような配位ケージは主に２種：ジアゼピン誘導体（式Ｉ）およびテトラアザシクロドデカン誘導体（式ＩＩ）に属する。

かくして、成分ｃ）は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）：

［式中：
Ｙは、式：Ｙ’−ＮＨ−または（Ｙ’）_２−Ｎ−で示される基であり、ここで、Ｙ’は、（Ｙ’）_２−Ｎ−の場合には、同一または異なってもよく、直鎖または分岐鎖であって、飽和または不飽和であるＣ_１２−Ｃ_２０アルキル基と、リン酸基である−Ｏ−（ＨＯ−Ｐ＝Ｏ）−Ｏ−で所望により分断されてもよく、またはＯＨ、ＣＯＯＲ_１（ここで、Ｒ_１は、水素Ｈ、および直鎖または分岐鎖のＣ_１−Ｃ_４アルキル基からなる群より選択される）、オキシカルボニル−（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキルおよびオキシカルボニル（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルケニルからなる群より選択される１または複数の原子または基によって置換されてもよいＣ_１−Ｃ_１０アルキル基とからなる群より選択されるか；あるいはＹ’は置換または部分置換のグリセロールの一リン酸エステルであり、該グリセロールの少なくとも１の官能基が飽和または不飽和の炭素鎖を有する脂肪酸でエステル化され、リン酸の他の２つの官能基が遊離しているか、あるいはアルカリまたはアルカリ土類金属で塩化されるかのいずれかであり；
Ｌは、−Ｃ＝Ｏ、−Ｃ＝Ｓ、−ＮＲ_１−、−ＣＯＯ、−ＯＣＯ、−ＮＲ_１ＣＯ、−ＣＯＮＲ_１−、−Ｏ−および−Ｓ−（ここで、Ｒ_１は上記で定義されるとおりである）からなる群より選択される１または複数の原子または基で所望により分断されてもよい、脂肪族の直鎖または分岐鎖のＣ_１−Ｃ_６のアルカンジイル、アルケンジイル、アルキンジイルからなる群より選択される二価のリンカーであり；
Ｒ^Ｉ〜Ｒ^ＩＶは、各々独立して、−Ｒ_２−ＣＯＯＲ_３であり、ここでＲ_２は直鎖または分岐鎖のＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_３はＨまたは医薬的に許容されるカチオンであり；
Ｒ^’〜Ｒ^’’’は、各々独立して、−Ｒ_２−ＣＯＯＲ_３であり、ここでＲ_２は直鎖または分岐鎖のＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_３はＨまたは医薬的に許容されるカチオンである］
で示される化合物である。

Ｙ基は、好ましくは、Ｙ基の末端窒素原子と、Ｙと結び付く末端に存在するカルボニル（−Ｃ＝Ｏ）またはチオカルボニル（−Ｃ＝Ｓ）との間のアミド結合によりＬ基に連結される。好ましくは、Ｙ基は、式：（Ｙ’）_２−Ｎ−（式中、Ｙ’残基は、同一または異なり、鎖長がＣ_１２−Ｃ_２０、好ましくはＣ_１６−Ｃ_１８のアルキル鎖である）で示される。

別に、Ｙ基はまた、式：Ｙ’−ＮＨ−（式中、Ｙ’は、式：

で示される１または複数のリン酸基により分断される、Ｃ_１２−Ｃ_２０アルキル基、より好ましくはＣ_１６−Ｃ_１８アルキル基である）で示されてもよい。

この実施態様によれば、Ｙは、式：Ｙ’−ＮＨ−（式中、Ｙ’は、式：

で示される１または複数の基により分断され、さらには１２−２０個の炭素原子、より好ましくは１６−１８個の炭素原子を含有する少なくとも１個の、好ましくは２または３個のカルボキシアルキル基で置換される、Ｃ_１６−Ｃ_１８アルキル基である）で示されるリン脂質である。

さらに別の実施態様において、Ｙ’は置換または部分置換のグリセロールの一リン酸エステルであり、該グリセロールの少なくとも一つの官能基が飽和または不飽和の炭素鎖を有する脂肪酸でエステル化され、リン酸の他の２つの官能基が遊離しているか、あるいはアルカリまたはアルカリ土類金属で塩化されるかのいずれかである。好ましくは、脂肪酸はＣ_１４−Ｃ_２０カルボン酸である。

したがって、好ましい実施態様によれば、（Ｙ’）_２−Ｎ−である場合に、Ｙ’は同一または異なってもよく、
− 直鎖または分岐鎖で、飽和または不飽和のＣ_１６−Ｃ_１８アルキル基；
− リン酸基である−Ｏ−（ＨＯ−Ｐ＝Ｏ）−Ｏ−で分断され、および／またはオキシカルボニル−（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキルおよびオキシカルボニル（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルケニルからなる群より選択される１または複数の原子または基によって所望により置換されてもよいＣ_４−Ｃ_６アルキル基；
からなる群より選択されるか、
あるいはＹ’は、置換または部分置換のグリセロールの一リン酸エステルであり、該グリセロールの少なくとも一つの官能基が脂肪酸でエステル化され（ここで、該脂肪酸は飽和または不飽和の炭素鎖を有するＣ_１４−Ｃ_２０カルボン酸である）、リン酸の他の２つの官能基が遊離しているか、あるいはアルカリまたはアルカリ土類金属で塩化されるかのいずれかであり；
Ｌ、Ｒ^Ｉ〜Ｒ^ＩＶ、およびＲ^’〜Ｒ^’’’は、上記と同意義である。

さらにより好ましくは、Ｙ’がリン酸基である−Ｏ−（ＨＯ−Ｐ＝Ｏ）−Ｏ−で分断されるＣ_４−Ｃ_６アルキル基である場合、そのアルキル基は、好ましくは、オキシカルボニル−（Ｃ_１４−Ｃ_１６）アルキルおよびオキシカルボニル（Ｃ_１４−Ｃ_１６）アルケニルからなる群より選択される少なくとも２つの原子または基によってさらに置換される。

このさらに別の実施態様によれば、Ｙは以下の基：

より選択され、ここで、＃はリンカーＬとの結合点を示す。

リンカーＬは、式（Ｉ）の誘導体にて、ジアゼピン部分をＹ基に連結し、同様に式（ＩＩ）の誘導体にて、テトラアザシクロドデカンをＹ基に連結する、二価の基である。

好ましくは、Ｌは、式（Ｉ）および（ＩＩ）におけるＹ残基の末端にある窒素原子の結合点として、一の末端で、チオカルボニル基（−Ｃ＝Ｓ）、またはより好ましくはカルボニル基（−Ｃ＝Ｏ）で官能性が付与されている、直鎖または分岐鎖のＣ_１−Ｃ_６アルキル、アルケニルまたはアルキニル基である

リンカーＬの例が、メチルカルボニル、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ペンチルカルボニルおよびヘキシルカルボニルである。

式（Ｉ）の化合物では、より好ましくは、リンカーＬは、式ｃ’）：

［式中、＃は式（Ｉ）におけるジアゼピンとの結合点を示す］
で示されるブチルカルボニルより選択される。

式（ＩＩ）の化合物では、リンカーＬは、好ましくは、式ｄ’）のメチルカルボニル、および式ｅ’）のカルボキシプロピルカルボニルより選択される。

［式中、＃は式（ＩＩ）におけるテトラアザシクロドデカンとの結合点を示す］

上記されるように、リンカーＬは、その一端でＹ基に結合し、他端でジアゼピンまたはテトラアザシクロドデカンに結合する。式：Ｙ’−ＮＨ−または（Ｙ’）_２−Ｎ−で示されるＹ基は、アミド結合を通してリンカーＬが結合する末端窒素原子を有する。

式（Ｉ）の化合物では、好ましくは、Ｌ−Ｙ−システムは、

より選択され、ここで、Ｙ’は上記した定義と一致し、＃は式（Ｉ）の誘導体のジアゼピンとの結合点を示す。

式（ＩＩ）の化合物では、Ｌ−Ｙ系は、好ましくは、

より選択され、ここで、Ｙ’は上記と同意義であり、＃は式（ＩＩ）の誘導体のジテトラアザシクロドデカンとの結合点を示す。

好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、

からなる群より選択され、ここでＲ^Ｉ〜Ｒ^ＩＶは本明細書中に定義されるとおりである。

好ましい実施態様によれば、基Ｒ^Ｉ〜Ｒ^ＩＶは同一であり、−ＣＨ_２−ＣＯＯＨおよび−Ｒ_２−ＣＯＯ⁻Ｍ^＋より選択されるカルボキシメチル基であるのが好ましく、ここでＲ_２は上記と同意義であり、Ｍ^＋はＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋およびＳｒ^２＋からなる群より選択される金属である。

結果として、式（Ｉ）のキレート剤は、好ましくは、一般式（Ｉ’）：

［式中、ＬおよびＹならびにＬ−Ｙのその組み合わせは上記の好ましい実施態様に記載されるとおりである］
で示されるか、あるいはアルカリ土類金属、好ましくはＣａ^２＋との錯体の形態である。

同様に、好ましくは、式（ＩＩ）のキレート剤、またはその医薬的に許容される塩は、一般式（ＩＩ’）：

［式中、ＬおよびＹならびにＬ−Ｙのその組み合わせは上記の好ましい実施態様に記載されるとおりである］
で示される化合物を有する。

従って、ＹおよびＬの構造と一致して、Ｃａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｍｇ^２＋、好ましくはＣａ^２＋などのアルカリ土類金属との錯体として、あるいは医薬的に許容される塩の形態での式（Ｉ’）の好ましい化合物は、

からなる群より選択される。

式（ＩＩ’）の好ましい錯体は、

からなる群より選択される。

特に好ましいのは、
− ｃ．１：[６-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-６-[５-(ジオクタデシルアミノ)-５-オキソペンタ-１-イル]-テトラヒドロ-１Ｈ-１,４-ジアゼピン-１,４(５Ｈ)-ジアセタート(４-)]カルシアート(２-)；
− ｃ．４：[６-[[ビス(カルボキシメチル)]アミノ]-６-[(１３Ｒ)-１０-ヒドロキシ-１０-オキシド-５,１６-ジオキソ-１３-(１-オキソヘキサデシル)オキシ]-９,１１,１５-トリオキサ-６-アザ-１０-ホスファヘントリアコンタ-１-イル]-テトラヒドロ-１Ｈ-１,４-ジアゼピン-１,４(５Ｈ)-ジアセタート(４-)]カルシアート(２-)；
− ｃ．５：[１０-[２-(ジオクタデシルアミノ)-２-オキソエチル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリアセタート(３-)]カルシアート(１-)；
− ｃ．７：[１０-[(１０Ｒ)-７-ヒドロキシ-７-オキシド-２,１３-ジオキソ-１０-[(１-オキソオクタデシル)オキシ]-６,８,１２-トリオキサ-３-アザ-７-ホスファトリアコンタ-１-イル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリアセタート(３-)]カルシアート(１-)；
からなる群より選択される錯体およびその塩であり、錯体ｃ．５およびその塩、好ましくはＣａ^２＋塩：

が最も好ましく、その塩は実験的パートの調製例３．２に詳説される操作に従って合成されるキレート剤１４をＣａ錯形成することで得られる。

好ましくは、安定化錯体ｃ）は全重量の４−１３％、好ましくは８−１０％ｗ／ｗを構成する。

式ＩおよびＩＩの化合物の合成：一般的スキーム
本発明の式（Ｉ）の化合物は、最初に、選択されたリンカーＬと、ジアゼピン部分との間でアダクツを形成し、続いて、リンカーの末端にあるカルボン酸官能性を活性化し、その後で選択されたＹ基でアミド化することを含む工程で調製され得る。最後に、得られる生成物に保護基がある場合にはそれを除去し、その誘導体を選択されたアルカリ土類金属と所望により錯形成させてもよい。

リンカーＬと、合成工程にて「試薬」と称されるジアゼピン部分との間のアダクツは、適切なニトロ誘導体（選択されるリンカーの前駆体）と、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン（ジアゼピンの先駆体）とを反応させることで得られる。その後で、典型的には水素化処理に付し、つづいて塩基性条件下でＮ−アルキル化に付すことで、ニトロ基を還元して官能性をもたせる。リンカーとジアゼピン部分との間の該アダクツは調製に好都合であり、選択される部分のＹを変えることで式（Ｉ）の一連の誘導体を調製するための基礎的要素として使用され得る。

従って、式（Ｉ）および（ＩＩ）

で定義される化合物を調製するための合成方法は、以下の工程：
ａ）式：

［式中、Ｒ^Ｉ〜Ｒ^ＩＶおよびＲ^’〜Ｒ^’’’は上記と同意義であり、Ｌは末端カルボン酸官能性を含むリンカーである］
で示されるアダクツを調製し；
ｂ）該リンカーの末端カルボン酸官能性を活性化し；
ｃ）工程ｂ）の生成物と、上記のＹ基との間でアミド化反応に付し；
ｄ）いずれの保護基も切断して、式（Ｉ）または（ＩＩ）の誘導体を得；
ｅ）アルカリ土類金属イオンでキレート化し、式（Ｉ）または（ＩＩ）の誘導体を金属錯体の形態で得る
を含む。

式Ｉの化合物（スキーム１の化合物ＩＩＩに相当する化合物）を調製する説明に基づく実例によれば、該方法は、出発アダクツとして、化合物５より出発し、次の工程ｂ）〜ｅ）から構成される。

リンカーと、ジアゼピン部分との間のアダクツ５は、以下のスキーム２に示されるように、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン・ジアセタートと、６−ニトロヘキサン酸メチルエステル１のアルコール性溶液とを、パラホルムアルデヒドの存在下で反応させ、つづいてニトロ基２を還元し、アミノ誘導体３に官能性を付与し、末端カルボン酸基４を選択的切断に付すことで調製される。

化合物５で一様に示されるジアゼピン誘導体を、該方法の工程ｂ）に示されるように、末端カルボン酸官能性の活性化に供する。その活性化は、有機化学の分野でカルボン酸官能性を活性化するのに周知の操作に従って、典型的にはカルボキシル活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ））と、カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ））の存在下、出発物質に関して少なくとも１：１のモル比で、あるいは好ましくはわずかに過剰量のモル比、例えば１：１.５までのモル比で、適切な有機溶媒（例えば、ＣＨＣｌ_３、ＣＨ_２Ｃｌ_２等より選択される非極性有機溶媒）中にて反応させることにより実施され得る。好ましくは、工程ｂ）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＥＤＣの存在下、出発物質に関して１：１〜１：１.１のモル比で、ＣＨ_２Ｃｌ_２の存在下にて実施される。こうして得られた誘導体を次に、工程ｃ）に従って、一般にはジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下で、リンカーＬの活性化されるカルボン酸末端基と、選択されるＹ残基（例えばジアルキルアミン）の窒素原子との間のアミド化反応に供する。

好ましくは、アミド化反応は、工程ｂ）より得られた活性化化合物をＣＨＣｌ_３に溶かし、例えばジアルキルアミンおよびＤＩＰＥＡをこの順序で、出発物質に関して１：１〜１：１.７のモル比で添加することで実施される。次に、該溶液を、選択された温度で適切な期間、典型的には室温（例えば、１５〜３０℃の温度）で、一般には２０−２４時間までの期間攪拌する。次にこうして形成されたアミド生成物を、例えば、水で洗浄し、分離した有機相を一般には減圧下で蒸発させるか、あるいは蒸留操作に付すことで精製する。例えば、クロマトグラフィーに付して精製した後、式（Ｉ）の生成物は、保護された形態にて、例えばtert-ブチルエステル誘導体として高収率（約８０％）および高純度（約９５−９９％ＨＰＬＣ）で得られる。

工程ｄ）によれば、そのカルボン酸保護の形態にて得られる式（Ｉ）の誘導体は、当該分野にて公知の条件下で、工程ａ）にて実際に利用された保護基の種類に応じて、容易に脱保護され得る。可能とする保護基の選択については参考までに、「Greene's protective groups in organic synthesis」Wiley 14版を参照のこと。

好ましい実施態様において、カルボン酸官能性はtert-ブチルエステルとして保護され、その脱保護は、酸性条件、典型的にはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在下で、ＣＨ_２Ｃｌ_２などの有機非極性溶媒中で実施される。

式（ＩＩ）の化合物の合成は、市販されている１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７,１０-テトラ酢酸トリス(１,１-ジメチル)エチルエステル１１より出発して実施された。

実験的パートにて規定される化合物１１を、カルボン酸官能性の活性化、アミド化反応、および保護されたカルボン酸官能性の脱保護に供する。

脱保護の後で、そうして得られた式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、対応する金属錯体の誘導体を得るために、アルカリ土類金属の化合物と適宜反応させることができる。当該変形は、典型的には、選択された金属の無機または有機塩あるいはオキシドと、水または有機溶媒、例えばＣＨＣｌ_３、ＭｅＯＨまたはＥｔＯＨあるいはその混合液などの溶媒の存在下で操作して反応させることで実施される。その金属の好ましい対イオンはクロリドまたはアセタートであり、好ましい塩はＣａＣｌ_２、Ｃａ（ＯＡｃ）_２であり、それに対して好ましいオキシドはＣａＯである。

本発明の組成物はまた、蛍光色素を含むＳＬＮの細網内皮系からの認識を減少させることを目的とするステルス剤の機能を有する少なくとも１つの親水性ポリマーｅ）を含有しうる。好ましい実施態様において、ステルス剤は、疎水性セグメントに連結するナノ粒子表面をコーティングするための親水性ポリマーである。ステルス剤は、官能化ポロキサマー、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテル、ポリグリセリン、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールとすることができ、所望によりリン脂質部分と共有結合してもよい。該成分の混合物も供給される。ステルス剤は当該分野にて周知であり、本発明における使用に適する。例えば、ＰＥＧそれ自体、あるいはアルキル官能性を有するように誘導されたＰＥＧ、および／またはリン脂質、例えばリガンド機能を有するビタミンまたはペプチドなどの細胞受容体に対する特異的リガンドが挙げられる。

好ましい実施態様において、親水性ポリマーは、好ましくは分子量が５００−１００００ダルトンの、より好ましくは２０００−５０００ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールはリン脂質部分と共有結合し得る。ペグ化リン脂質の例が、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＥ−ＰＥＧまたはＤＯＰＥ−ＰＥＧである。特に好ましいリン脂質がＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳおよびエチル−ＤＳＰＣである。ＤＰＰＧ、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＣが最も好ましい。例えば、ＤＰＰＥおよび／またはＤＳＰＥ（ペグ化誘導体を含む）、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣ＋ＤＳＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル−ＤＳＰＣおよび／またはエチル−ＤＰＰＣの混合物などのリン脂質の混合物も使用され得る。

好ましくは、１,２-ジステアロイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン-Ｎ-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２０００）を製剤に配合する。好ましくは、この成分がＳＬＮの１６％までを構成し、さらにより好ましくは約６−１２％を構成する。

本発明の固形脂質ナノ粒子を形成する材料はすべて当業者に周知であり、一般に市販されている。

本発明の一の実施態様において、該組成物はさらに、疾患組織に対して高い結合アフィニティを有する標的とする部分を含む。一般に、標的とする部分は、疾患の標的に特異的に結合するのに効果的であり、該標的と関連する疾患の徴候を提供するのに有用でなければならない。標的の例が、疾患または病理学的組織にてアップレギュレートされる、蛋白、酵素または特異的分子の形態の細胞表面受容体である。表面活性な標的化剤は、標的とする部分と、脂質構造と、活性部分および脂質構造の間のポリマースペーサーとにより構成され得る。本発明の範囲にて、「標的とする部分」は、標的との関係を、いずれか適当な形態にて、例えば化学結合、物理化学親和性、化学反応、代謝性事象にて確立する能力を有する分子、化合物、物質である。該標的とする部分と標的との間のこの関係が、本発明のナノ粒子が最新の診断装置により検出されるのに十分な時間にわたって標的付近に存在させることを可能とする。

本発明の好ましい標的とする部分は、１,２-ジステアロイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン-Ｎ-[ホラート(ポリエチレングリコール)-２０００]アンモニウム塩（ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２０００-ホラート）である。この部分は、本明細書にて、ホラート受容体とのその結合アフィニティについての代表的な実施態様として提示される。他の代表的な標的とする部分はまた、蛋白、アプタマー、αｖβ３インテグリンを標的とするためのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）などのペプチド、およびポリペプチド、ビタミン、ベバシズマブ、トラスツズマブおよびセツキシマブまたはそれらのフラグメントなどの抗体、好ましくは、本発明のＳＬＮのコアの回りのシェル構造にそれらを配合するのに、親油性または両親媒性成分、例えばアルカリ鎖またはリン脂質でそれらを誘導化した後に、本発明のナノ粒子に配合され得る炭水化物を包含しうる。

本発明のナノ粒子を標的とすることで、該ナノ粒子は１または複数の特異的マーカーを検出することによっても診断され得る疾患の診断剤として有用なものとなる。腫瘍が本発明にとって関心のある代表例である。

成分ｄ）はシアニンファミリーおよび／またはポリエテロサイクリック化合物（クマリン、ピラノ、キノリン、ピラノキノリン、インドールおよびピラノインドール誘導体を含む）の酸形態またはその医薬的に許容される塩での蛍光色素である。

かかる蛍光色素の例として、ＩＣＧ、ｃｙ５、ｃｙ５.５、ｃｙ７、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７５０（LI-ＣＯR Viosciences）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００およびＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０（Invitrogen）、ＤＹ−６８２、ＤＹ−６７５、ＤＹ−７８２（Dyomics GmbH）（商業的にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）として知られている）であって、酸形態またはその医薬的に許容される塩のものが挙げられる。

本発明によれば、シアニンファミリーおよび／またはポリエーテロサイクリック化合物の蛍光色素は、インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）

および以下の化合物（その化学構造、および商品または一般名あるいは共通コードを以下に報告する）

からなる群より選択される。

本発明の好ましい実施態様によれば、蛍光色素は、いずれかの塩の形態の、好ましくはナトリウム塩としてのインドシアニン・グリーンである。本発明に係る蛍光色素は、０.０１−０.５％、好ましくは０.０５−０.１５％の量で配合される。

一般に、本発明に係る固形脂質ナノ粒子を製造する異なる成分の間での個々の割合は、この分野における常識に訴えかけることにより当業者であれば容易に決定することができる。例えば、ＵＳ２００６／００８３７８１、その中に引用されている参考文献も参照のこと。

本発明のある典型的な実施態様に対する指針として、乾燥ＳＬＮ組成物の理論上の成分を重量／重量％で言及すると、コアａ）を形成する脂質成分は３０−５０％、好ましくは３５−４５％の範囲で配合されるグリセリドおよび／または脂肪酸である。界面活性成分ｂ）は、好ましくは、２５−６０％の範囲、より好ましくは２７−４５％、より一層好ましくは３０−３８％の範囲で配合されるリン脂質でできている。使用されるなら、ＰＥＧ（成分ｅ）は、好ましくは、約１６％まで、より好ましくは６−１２％である。両親媒性の安定化成分ｃ）は約４−１３％、好ましくは８−１０％に相当する。

本発明に係る蛍光色素ｄ）は、０.０１−０.５％、好ましくは０.０５−０.１５％の量で配合される。

本発明はまた、上記のナノ粒子の製造方法にも関する。

この方法は、水／油／水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）方法を修飾したものであり、以下の工程：
ｉ）固形脂質結晶性コアを形成するであろう脂質物質ａ）、該コアの周囲にシェルを形成するであろう両親媒性化合物ｂ）、好ましい実施態様を構成する上記の式Ｉおよび／またはＩＩの化合物とのアルカリ土類錯体（成分ｃ））、シアニンファミリーおよび／またはポリエテロサイクリック化合物の蛍光色素ｄ）、所望により親水性ポリマーｅ）、所望により標的とする部分ｆ）を、水非混和性または水低混和性有機溶媒に溶かすことで有機相（Ｏ）を調製し；
ｉｉ）１または複数の親水性界面活性剤を、所望により共界面活性成分を溶かすことで、第１水溶液（Ｗ）を調製し；
ｉｉｉ）工程ｉ）の有機相（Ｏ）を工程ｉｉ）の第１水溶液（Ｗ）と混合し、安定したＷ／Ｏミクロエマルジョンが形成されるまで混合し；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られたＷ／Ｏミクロエマルジョンを、その後で、少なくとも界面活性剤を含有しうる第２水溶液（Ｗ_１）に添加してＷ／Ｏ／Ｗ_１の多重エマルジョンを得；
ｖ）蒸発により多重エマルジョンから有機溶媒を取り去り、脂質ナノ粒子の懸濁液を得；
ｖｉ）工程ｖ）で得られた懸濁液を冷却し、固形コアａ）を完全に結晶化させ；
ｖｉｉ）工程ｖｉ）にて得られた懸濁液から過剰量の成分を洗浄し（そうして得られたＳＬＮの懸濁液は使用されたイオン性界面活性剤などの親水性界面活性成分および共界面活性剤を含まないと考えられる）；
ｖｉｉｉ）工程ｖｉｉ）にて得られた懸濁液を水相にて、あるいは水を除去した後に固相にて所望により貯蔵してもよい
工程を含む。

工程ｉ）にて、有機溶媒は水非混和性または水低混和性有機溶媒である。この有機溶媒の種類は当該分野にて周知であり、化学の分野では常識の範囲である。本発明の目的のために、該有機溶媒は２０℃〜７０℃の低沸点を有し得る。この低沸点は、この分野における常套手段として、大気圧または制御された減圧の条件下で決定され得る。好ましい実施態様において、有機溶媒は、塩化メチレン、１,２-ジクロロエタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、およびギ酸エチル、あるいはその混合液からなる群より選択される。より好ましい実施態様において、塩化メチレンが使用される。該溶液は優先的に３０−３５℃に加熱される。

工程ｉｉ）の好ましい実施態様において、タウロコール酸ナトリウム・水和物および１−ブタノールを水相に溶かす。例えば、ステルス剤の機能を有する親水性ポリマー官能基（上記の成分ｄを参照のこと）および／または活性な標的剤（上記の成分ｅを参照のこと）を水相または有機相に溶かすことで、他の親水性成分をＳＬＮに導入できる。

工程ｉｉｉ）にて、Ｗ／Ｏミクロエマルジョンは、以下の成分を、次の濃度範囲（Ｍ）で溶媒混合液（ＣＨ_２Ｃｌ_２：Ｈ_２Ｏ（１：０.１２５）ｖ／ｖ）に溶かすことで得られる：

工程ｉｖ）にて、ミクロエマルジョンを、界面活性剤を０.１２−０.５％ｗ／ｖの範囲、好ましくは０.２４％にて含有する水溶液Ｗ１（割合１：１０ Ｗ／Ｏ：Ｗ、ｖ／ｖ）に添加する。好ましい実施態様において、Ｗ１溶液は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートを含有する。

工程ｖ）にて、溶媒は、好ましくは、大気圧で、または制御された減圧下で蒸発し、都合よくは蒸発させるのに攪拌を用いる。多重エマルジョンの大気圧での、または制御された減圧下での温度を上げることで蒸発させることもできる。好ましくは、蒸発温度は、脂質コア成分の融点を越えてはならない。

工程ｖｉ）は、当業者が決定することができ、最終の固形結晶性脂質コアを組成するのにも作用する、都合のよい温度で実施される。好ましい実施態様において、冷却は４−１５℃の範囲の温度でなされる。好ましくは、懸濁液は０.１−０.４℃／分、好ましくは０.２−０.４℃／分、より一層好ましくは０.３℃／分からなる速度で冷却される。

工程ｖｉｉ）の洗浄操作は、例えば、透析、濾過、限外濾過または超遠心分離操作を含む。好ましい実施態様において、製剤を限外濾過または凍結乾燥に付し、「乾燥」ＳＬＮ組成物を得る。

上記において、本発明は、一の好ましい実施態様により、すなわちインドシアニン・グリーンをロードしたナノ粒子を用いて記載される。しかしながら、この記載が本発明のあらゆる態様に、すなわちシアニンファミリーおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）のあらゆる色素（実施例１〜６に記載される色素）に適用できることは十分に理解される。本発明の一の実施態様において、蛍光色素をロードしたＳＬＮ製剤において、好ましくは粒度分布が１０〜２２０ｎｍであり、平均粒度（ｚ−アベレージ）が１００ｎｍより小さく、多分散指標が０.２より低い、安定した単分散コロイド懸濁液が得られる（ＩＣＧをロードした実施態様での、図１を参照のこと）。本発明の実施態様において、ＩＣＧをロードしたＳＬＮは、ｚ−アベレージが約６０ｎｍで、多分散指標（ＰｄＩ）が０.１６である（実施例１、６０Ｒ０１２００１Ｌ；実施例２、６３Ｒ０１１０１３Ｌ；実施例３、６０Ｒ０１２００２Ｌ；実施例４、６３Ｒ０１１００５Ｌ；実施例５、６３Ｒ０１１００１Ｌ；実施例６、６３Ｒ０１１００２ＬのＳＬＮを示す表Ａを参照のこと）。

表Ａ
標的とされる、および標的とされないＩＣＧをロードしたＳＬＮの物理化学特性評価

本発明の方法の再現性は、調製した異なる３つのバッチについて、平均した物理化学パラメータ、その標準偏差、およびその相対的標準偏差を分析することで、標的とされる、および標的とされないＩＣＧをロードしたＳＬＮ製剤について評価された。

表Ｂ
標的とされる、および標的とされないナノ粒子に関するＩＣＧをロードしたＳＬＮ製剤の再現性（表Ａに示される３つのバッチでの再現性）

表Ｂに列挙される結果（実施例１−６）は製造方法にて良好な再現性のあることを示す。さらには、標的となる部分を組み込むことに応じて、ＩＣＧをロードしたＳＬＮの最終物理化学パラメータにおいて関連する差異のないことは注目に値する。

本発明に係るナノ粒子は、遊離色素の場合と比べて、その中に配合される色素の蛍光発光効率を有意に改善する能力を有する。例えば、ＩＣＧをロードしたＳＬＮでの代表的な実施態様において、水溶液中でのＩＣＧ蛍光発光収量％（Φ％）は約２.７２％であるのに対して、本発明の対応するＳＬＮは、標的とされる、および標的とされないＳＬＮのいずれにおいても、約７.６％の蛍光発光効率を示し（表Ｃ、実施例２および４を参照のこと）、貯蔵条件で経時的に（少なくとも＞６０日にて）安定したままである。

表Ｃ
ＩＣＧ色素の水中での、およびＳＬＮに組み入れた後でのΦ％

本発明のさらなる利点は、水溶液中での遊離色素との関連で、色素の光安定性が改善されることにある。遊離ＩＣＧ溶液およびＳＬＮにロードさせたＩＣＧ懸濁液を７８５ｎｍのレーザー照射に暴露することで水性媒体での実験を行った（図２、実施例８を参照のこと）。ＮＩＲ蛍光画像システム（LI-COR BiosciencesによるPearl（登録商標）インパルスシステム）により蛍光発光を集めた。試料の濃度は比較可能な最初の蛍光発光シグナルを表示するように調整された。次に、両方の試料に光を３秒間照射し、その試料を暗闇に１秒間保持する実験を３７℃で二重に重複して行った。この一連の実験を連続して１時間繰り返した。図２から、ＳＬＮにロードさせたＩＣＧが、遊離色素（経時的に蛍光発光シグナルを迅速に減少させることにより特徴付けられる）よりも高い光安定性を示すことは注目に値する。実験の終わりの時点で、ＳＬＮにロードさせたＩＣＧはまだ、最初の蛍光発光効率の５０％の効率を示すのに対して、遊離ＩＣＧの蛍光発光は０よりもほんの少し上にあるに過ぎない。

本発明のもう一つ別の利点として、色素をロードしたＳＬＮの長期安定性が改善される。安定性は試料を暗闇にて貯蔵条件（４℃）で保持し、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Lambda４０、Perkin Elmer）で吸収極大を測定することにより分析された。ＩＣＧをロードしたＳＬＮを有機溶媒の混合液（ＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ ２：１）に溶かし、８００ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ分析のためにさらに希釈した。ＳＬＮにて処方されたＩＣＧの濃度を計算するのに検量線を用いた。図３のデータ（実施例９）は、処方した日から９０日間の異なる時点で測定される、ＩＣＧをロードしたＳＬＮの濃度が、初期値との関連で９５％でリカバーされ得ることを示す。

本発明のもう一つ別の利点は、水溶液中の遊離ＩＣＧとの関連で、凝集体を形成する速度が著しく低下することである。図４（パネルＡ、実施例７）にて、処方した直後、および処方した日から９０日および１２０日後のＩＣＧをロードしたＳＬＮの懸濁液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルが報告される。１２０日後で凝集体（いわゆるＪ−凝集体）の存在は有意ではなく、観察されるスペクトルの範囲でＳＬＮにロードさせたＩＣＧの吸収スペクトルはなおも実質的に同じままであるのは明らかである。８００ｎｍでの吸光度は初期値との関連で９６％でリカバーされる。加えて、蛍光発光特性は、ＩＣＧをＳＬＮに取り込むことで、観察される期間にわたって保持され得る（図示せず）。他方において、ＩＣＧは、μＭ濃度にて、数日で凝集し、その結果として貯蔵期間の間に遊離ＩＣＧの吸光度（７８０ｎｍ）が減少し、９００ｎｍで新たなピークを生成し得ることが知られている（図４Ｂ、実施例７を参照のこと）。

本発明により提供されるもう一つ別の利点は、粒度分布の安定性、表面荷電およびＰｄＩの強化であり、それらの強化は製剤を暗闇中にて４℃に維持し、２５℃で測定を行う様々な時点で測定された。表Ｄに列挙される結果、実施例４は、処方から９０日経過した後では、その物理化学的パラメータはいかなる有意な変数でもないことは明白である。

表４
標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮの物理化学安定性（実施例４に示される）

さらなる態様において、本発明は、標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮの特異的受容体に対する特異的摂取を取り扱う。具体的な実施態様において、ＦＡ−ＩＣＧ−ロードのＳＬＮを葉酸受容体との結合特性の点から評価した。実験をバイオレイヤー干渉システム（Octet（登録商標）装置、Fortebio）で実施した。標的とされる、および標的とされないＩＣＧをロードしたＳＬＮの２つの異なるバッチを、プロテインＡを通してコンジュゲートされる、抗葉酸ＩｇＧ（ＦＡ２）で被覆されたバイオセンサーとのその結合特性について分析した。図５において、実施例１０の結果は、標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮが、予め活性化されたバイオセンサーを認識しない、標的とされないものとの関連で、ＩｇＧ抗葉酸と強いアフィニティで結合したことを示す。

本発明はまた、本明細書のインビボ適用にて開示されるＩＣＧをロードしたＳＬＮの組織標識化特性の改善に関する。一の実施態様において、Ｆ−ＩＣＧをロードしたＳＬＮの腫瘍組織に対する特異的摂取を、ＩＧＲＯＶ−１細胞系統を用い、Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの右側面に皮下注射した卵巣悪性腫瘍の異種移植片実験で具体的に評価した。腫瘍域周辺で示される関心のある領域にて獲得される蛍光シグナルを集め、それは筋肉では筋肉の背景蛍光とも称される。ＦＡ−ＩＣＧをロードしたＳＬＮの場合には、測定されるインビボの蛍光シグナルは５.１ａ.ｕ.（ＳＤ２.９）であり、それに対して標的とされないＩＣＧをロードするＳＬＮを投与する場合には、蛍光シグナルは１.７ａ.ｕ.（ＳＤ０.２）であった。

その後で、エクスビボでの画像分析から、切除された各臓器における蛍光シグナルを定量するために動物を殺した。図６にて、実施例１１の分析組織の測定されるすべての蛍光シグナルが報告される。ＦＡ−ＩＣＧをロードしたＳＬＮの腫瘍組織への特異的摂取が確かめられることは注目に値する。特に、標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮと、標的とされないものとで比較したエクスビボでの蛍光割合は３倍に強化された（腫瘍ＳＩ−筋肉ＳＩ）／筋肉ＳＩで測定した）。さらには、両方の製剤は、主に肝臓および腎臓の代謝経路を含め、同じクリアランス機構に準ずるようである。図７にて、実施例１１の、標的とされる、および標的とされないＩＣＧをロードするＳＬＮの投与の２４時間後に殺した代表の２匹のマウスから得られるエクスビボ画像分析も報告される。

本発明に係るＳＬＮは、他のキャリアシステムに関して数種の利点を提供する。例えば、脂肪エマルジョンまたはナノエマルジョンは、油滴に容易に組み込むことのできる親油性薬物のためのデリバリーシステムとして提案される。これらのキャリアシステムは副作用を減少させることができるが、熱力学的に不安定である。従って、エマルジョンは凝集しやすく、あるいは破壊したとしても、薬物が血流に達するや否や迅速に放出されることがしばしばである。

リポソームに関して、ＳＬＮは、安定したリポソームとは両立しない、６０ｎｍより小さい、極めて小さな直径で処方され得、面曲率の超過はリポソーム製剤の不安定性を生じさせ、その実戦利用をある程度まで阻害する。

ナノ粒子の大きさは、病理組織におけるその蓄積に強く影響を及ぼす極めて重要なパラメータである。大きな違いが、その大きさを変えることで、がん組織におけるナノ粒子の分布にて簡単に発生しうることが証明される。最適な蓄積が、リポソーム製剤についてよりも、安定したＳＬＮについてより到達可能な大きさである、６０ｎｍよりも小さな直径の粒子で得られ得ることが示唆された。

本発明に係るＳＬＮは、ＩＣＧをロードしたナノ粒子の典型的な実施態様において、先行文献に記載の製剤と比べて（ＷＯ２０１０／０１８２１６で４０日、およびＷＯ２００３／０５７２５９で２５日）、極めて高い光学およびコロイド安定性を示す。

実際に、発明の典型例において、標的とするＩＣＧをロードするＳＬＮの光学密度を処方から１７０日目まで測定し、極めて安定した観測値がもたらされた（１７０日目のＯＤは初期値に対して＞９５％であった）。測定はパーキン・エルマー・ラムダ（Perkin Elmer Lambda）４０ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて実施された（図８を参照のこと）。

発明の典型例において、ＩＣＧをロードするＳＬＮの蛍光発光効率の測定値は、標的とする、または標的とされないＳＬＮのいずれにおいても７.６％に等しかった（表Ｃを参照のこと）。その上、蛍光量子収率は、実施例２に記載されるように処方したＩＣＧをロードするＳＬＤについて示されるように、経時的に（少なくとも＞６０日）安定したままである。さらには、ＩＣＧをロードしたＳＬＮの蛍光量子収率はＩＣＧ／水よりも２.８倍高い。この特性は、ＷＯ２０１０／０１８２１６に記載の先行技術（ＩＣＧナノエマルジョン（４００μＭ）の蛍光量子収率がＩＣＧの水中溶液よりも２倍高いに過ぎない（表２およびカラムラベルＦを参照のこと））との関連で、有意かつ予期せぬ改善である。

水性媒体中の、およびＳＬＮに組み込まれた後のＩＣＧのさらなる光学特性（すなわち、最大吸収および発光波長、ストークスシフト）を表Ｅにて報告する。

表Ｅ
ＩＣＧをロードするＳＬＮ製剤の光学特性（実施例４）

ＩＣＧの水中溶液との関連で、吸収および発光最大波長の高レッドシフトにより示されるように、ＩＣＧとＳＬＮとの成分の相互作用が、ＩＣＧのインビボにおける光学画像用途を改善することは明らかである。

本発明に係るＩＣＧ−ＳＬＮも従来技術との関連で改善されたアップロードを示す。アップロードされたＩＣＧの平均収率は、理論的な量との関連で最終処方中のＩＣＧの量として計算した場合に、７５％よりも高く、９０％までであった（外部相ではＩＣＧは検出できなかった）。ＷＯ２０１０／０１８２１６は３５％に近い値を示す。さらには、初期のＩＣＧのローディング濃度に対するＩＣＧ封入の実験がNavarroらによってなされ、初期濃度が増加するに従って、封入効率も増加した（＞４０％）。本発明者らの処方工程においては、ＩＣＧの初期濃度が１ｍＭよりも低い場合であっても、高い封入効率を得ることが可能であった。

次に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明する。

実験的パート
式（Ｉ）の化合物の調製

調製１：スキーム３に係る化合物８の調製

調製１.１：化合物５の調製
化合物５は、下記のスキーム２にて説明されるように、ＵＳ２００６０１８８３０に記載の操作に従って、５つの工程で調製された。

２−ニトロシクロヘキサノンをアンバーライトＡ２１の存在下にてＭｅＯＨ中で還流させて６−ニトロヘキサン酸メチルエステル１を得た。１と、Ｎ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン・ジアセタートおよびパラホルムアルデヒドとを反応させてジアゼピン２を得、それをまず水素化して３とし、次にブロモ酢酸ｔ−ブチルでアルキル化してペンタエステル４を得た。４をＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ中にてＬｉＯＨで選択的加水分解に付して５（全収率１３％）を得た。

調製１.２：化合物６ ６-[ビス[２-[(１,１-ジメチル)エトキシ]-２-オキソエチル]アミノ]-６-[(２,５-ジオキソ-１-ピロリジニル)オキシ]-５-オキソペンタ-１-イル]テトラヒドロ-１Ｈ-１,４-ジアゼピン-１,４(５Ｈ)-ジ酢酸ビス[(１,１-ジメチル)エチル]エステルの調製
化合物５（１４.６ ｇ；０.０２２モル）をＣＨ_２Ｃｌ_２（３５０ｍＬ）に溶かし、次にＮＨＳ（３.７５ｇ；０.０３３モル）を加え、該混合物を氷浴中にて０℃に冷却した。ＥＤＣ（６.２５ｇ；０.０３３モル）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）中溶液を滴下して加え、次に該反応溶液を室温で２４時間攪拌した。該混合物をＨ_２Ｏ（３ｘ１５０ｍＬ)で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて６を黄色油（１５.４２ｇ；０.０２０モル；収率９２％）として得た。

分析データ：
分子量：７６８.９４（Ｃ３８Ｈ６４Ｎ４Ｏ１２)
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳは構造式と矛盾しない。

調製１.３：化合物７ （６-[ビス[２-[(１,１ジメチル)エトキシ]-２-オキソエチル]アミノ]-６-[(１３Ｒ)-１０-ヒドロキシ-１０-オキシド-５,１６-ジオキソ-１３-(１-オキソデシル)オキシ]-９,１１,１５-トリオキサ-６-アザ-１０-ホスファノナコス-１-イル]-テトラヒドロ-１Ｈ-１,４-ジアゼピン-１,４(５Ｈ)-ジ酢酸・ビス[(１,１-ジメチル)エチル]エステル)の調製
化合物６（１.９２ｇ；２.５０ミリモル）をＣＨＣｌ_３（１９０ｍＬ）に溶かした。ジパルミトイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）（１.７３ｇ；２.５０ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１.７当量）をこの順序で添加した。該溶液を室温で３時間ないし２４時間攪拌した。該混合物をＨ_２Ｏ（１ｘ５０ｍＬ）、酸性Ｈ_２Ｏ（ＨＣｌを用いてｐＨ４-５とした；１ｘ５０ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１ｘ５０ｍＬ）で順次洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過して蒸発させた。こうして得られた粗物質をフラッシュクロマトグラフィーに付して精製し、化合物７（２.７９ｇ；２.０７ミリモル）を白色固形物質（収率８３％）として得た。

分析データ：
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：１００％（エリア％）；分子量：１３４５.８２（Ｃ７１Ｈ１３３Ｎ４Ｏ１７Ｐ）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳは構造式と矛盾しない。

調製１.４：化合物８ （６-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-６-[(１３Ｒ)-１０-ヒドロキシ-１０-オキシド-５,１６-ジオキソ-１３-(１-オキソデシル)オキシ]-９,１１,１５-トリオキサ-６-アザ-１０-ホスファノナコス-１-イル]-テトラヒドロ-１Ｈ-１,４-ジアゼピン-１,４(５Ｈ)-ジ酢酸）の調製
化合物７（２.７９ｇ；２.０７ミリモル）をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）に溶かし、該溶液を攪拌して０℃に冷却し、ついでＴＦＡ（６当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。該溶液を蒸発させ、残渣を新たなＴＦＡ（３０当量）に溶かした。この溶液を室温で８０時間攪拌し；その反応をＭＳ分析およびＨＰＬＣ−ＥＬＳＤでモニター観察した。混合物を蒸発させ、残渣をジイソプロピルエーテルで処理して白色固体を得、それを遠心分離に付し、ジイソプロピルエーテル（２ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。得られた固体をＨ_２Ｏに懸濁させ、５％水性ＮａＨＣＯ_３を添加することによりｐＨ６−７で溶かし、１Ｍ ＨＣｌを添加することによりｐＨ２で沈殿させた。固体を濾過し、減圧下で乾燥させ（Ｐ_２Ｏ_５）、リガンド８（１.７７ｇ；１.５８ミリモル）を白色固形物質（収率７６％）として得た。

分析データ：
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：９５.３％（エリア％）
分子量：１１２１.３９（Ｃ５５Ｈ１０１Ｎ４Ｏ１７Ｐ）
錯滴定値：９５.７％
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳは構造式と矛盾しない。

調製２：スキーム４による化合物１０の調製

調製２.１：化合物９ （６-[ビス[２-[(１,１-ジメチル)エトキシ]-２-オキソエチル]アミノ]-６-[５-(ドデシルアミノ)-５-オキソペンタ-１-イル]-テトラヒドロ-１Ｈ-１,４-ジアゼピン-１,４(５Ｈ)-ジ酢酸・ビス[(１,１-ジメチル)エチル]エステル）の調製
調製１.２に従って調製した化合物６（３.１３ｇ；４.０７ミリモル）を、ジドデシルアミン（１.４４ｇ；４.０７ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（１.７当量）を含むＣＨＣｌ_３（２００ｍＬ）に溶かした。反応溶液を室温で２４時間攪拌し、Ｈ_２Ｏ（１ｘ５０ｍＬ）、酸性化Ｈ_２Ｏ（ＨＣｌでｐＨ４-５とした水；１ｘ７０ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１ｘ５０ｍＬ）で連続して洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過して蒸発させた。そうして得られた生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物９（４.３０ｇ、４.２７ミリモル）を油状物（定量収率）として得た。

分析データ：
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：８９.７％（エリア％）
分子量：１００７.５３（Ｃ５８Ｈ１１０Ｎ４Ｏ９）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳは構造式と矛盾しない。

調製２.２：化合物１０ （６-[ビス[(カルボキシメチル)アミノ]-６-[５-(ドデシルアミノ)-５-オキソペンタ-１-イル]-テトラヒドロ-１Ｈ-１,４-ジアゼピン-１,４(５Ｈ)-ジ酢酸]の調製
化合物９（４.３０ｇ、４.２７ミリモル）をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）に溶かし、そうして得られた溶液を攪拌し、０℃に冷却し、次にＴＦＡ（６当量）を滴下して加えた。該反応混合物を室温で１時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残渣を新たなＴＦＡ（５０当量）に溶かした。この溶液を８０時間攪拌した。混合物を蒸発させ、残渣をジイソプロピルエーテル（７０ｍＬ）で処理して白色沈殿物を得、それを濾過または遠心分離に付し、ジイソプロピルエーテル（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させ（Ｐ_２Ｏ_５；ＮａＯＨペレット）、粗リガンドを白色固体として得た。粗生成物をＨ_２Ｏに再び懸濁させ、２Ｎ ＮａＯＨを添加することによりｐＨ６−７で溶かし、１Ｍ ＨＣｌを添加することによりｐＨ２で沈殿させ、リガンド１０（２.８３ｇ、３.６１ミリモル）を白色固体（収率：８５％）として得た。

分析データ：
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：８２.４％（エリア％）
分子量：７８３.１０（Ｃ４２Ｈ７８Ｎ４Ｏ９）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳは構造式と矛盾しない。

１.１ 式（ＩＩ）の化合物の調製
１.２ 調製３：スキーム５による化合物１３の調製：

調製３.１：化合物１２ （１０-[２-(ジドデシルアミノ)-２-オキソエチル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリ酢酸・トリス[(１,１-ジメチル)エチル]エステル）の調製
ＨＢＴＵ（１.８９ｇ；４.９５ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（１.０９ｇ；８.４１ミリモル）を、化合物１１（２.８４ｇ；４.９５ミリモル）のＣＨ_３ＣＮ（２００ｍＬ）中懸濁液に連続して添加し、その混合物を攪拌しながら室温で３０分間放置し、ジドデシルアミン（１.７５ｇ；４.９５ミリモル）を加え、その混合物を攪拌しながら室温で２４時間保持した。

反応混合物を蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ_３に溶かし、Ｈ_２Ｏ（１００ｍＬ）、酸性Ｈ_２Ｏ（ＨＣｌでｐＨを４−５とした水；１００ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１００ｍＬ）で連続して洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過して蒸発させ、得られた粗物質をフラッシュクロマトグラフィーに付して精製し、化合物１２を無色油（３.５５ｇ；３.９１.ミリモル；収率７９.％）として得た。

分析データ：
分子量：９０８.４０（Ｃ５２Ｈ１０１Ｎ５Ｏ７）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳは構造式と矛盾しない。

調製３.２：化合物１３および１４ （１０-[２-(ジドデシルアミノ)-２-オキソエチル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリ酢酸；化合物１３）の調製
ＴＦＡ（６当量）を、化合物１２（４.４０.ｇ；４.８４ミリモル）の０℃に冷却したＣＨ_２Ｃｌ_２（７０ｍＬ）中溶液に滴下して加え；その得られた溶液を室温で１時間攪拌し、次に蒸発させた。残渣を新たなＴＦＡ（５０当量）に溶かし、そうして得られた溶液を攪拌しながら室温で９６時間保持した。

反応混合物を蒸発させ、残渣をｉＰｒ_２Ｏ（１５０ｍＬ）で処理して白色固形物質を得、それを遠心分離に付し、ｉＰｒ_２Ｏ（２ｘ４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させてリガンド１３を白っぽい固形物質（２.４４.ｇ；３.３０ミリモル；収率６８％）として得た。

分析データ
錯滴定値：９９.４％
分子量：７４０.０８（Ｃ４０Ｈ７７Ｎ５Ｏ７）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳはその構造と矛盾しない。

MAGMA 2001. 12 (2-3), 114-120に開示の操作に従って化合物１４を合成した。

調製４：化合物１５ａ−ｂの調製

調製４.１ 化合物１５ａ−ｂの調製 −一般的操作
ＨＢＴＵ（１当量）およびＤＩＰＥＡ（１.７当量）を、化合物１１のＣＨ_２Ｃｌ_２中懸濁液（濃度１％ｗ／ｖ）に連続して添加し、その混合物を攪拌しながら室温で３０分間放置し、次にホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ ｎ＝１０またはＤＭＰＥ ｎ＝１２）（１当量）を加え、その混合物を攪拌しながら室温で２４時間維持した。反応混合物を
Ｈ_２Ｏ（１００ｍＬ）、酸性Ｈ_２Ｏ（ＨＣｌでｐＨを４−５とした水；１００ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１００ｍＬ）で連続して洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過して蒸発させ、そうして得られた粗物質をフラッシュクロマトグラフィーに付して精製し、化合物１５ａ−ｂを得た。

調製４.１ａ １０-[(１０Ｒ)-７-ヒドロキシ-７-オキシド-２,１３-ジオキソ-１０-[(１-オキソドデシル)オキシ]-６,８,１２-トリオキサ-３-アザ-７-ホスファテトラコス-１-イル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリ酢酸・トリス[(１,１-ジメチル)エチル]エステル；化合物１５ａの調製
試薬：化合物１１（９６８ｍｇ；１.６９ミリモル)；１,２-ジドデカノイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン（９８０ｍｇ；１.６９ミリモル）；
化合物１５ａ（６０５ｍｇ、０.５３ミリモル）；収率３２％

分析データ
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：４０.６％（エリア％）
分子量：１１３４.４８（Ｃ５７Ｈ１０８Ｎ５Ｏ１５Ｐ）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳはその構造と矛盾しない。

調製４.１ｂ １０-[(１０Ｒ)-７-ヒドロキシ-７-オキシド-２,１３-ジオキソ-１０-[(１-オキソテトラデシル)オキシ-６,８,１２-トリオキサ-３-アザ-７-ホスファエサコス-１-イル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリ酢酸・トリス[(１,１-ジメチル)エチル]エステル；化合物１５ｂの調製
試薬：化合物１１（１.４３ｇ；２.３６ミリモル）、１,２-ジテトラデカノイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン（１.５０ｇ；２.３６ミリモル)；
化合物１５ｂ（２.１８ｇ；１.９７ミリモル；収率７８％）

分析データ
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：８２.４％（エリア％）
分子量：１１９０.４９（Ｃ６１Ｈ１１６Ｎ５Ｏ１５Ｐ）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳはその構造と矛盾しない。

調製４.２ 化合物ａ−ｂの調製−一般的操作
ＴＦＡ（６当量）を化合物１５ａ−ｂの０℃に冷却したＣＨ_２Ｃｌ_２中溶液（濃度１％ｗ／ｖ）に滴下して加え、該溶液を室温で１時間攪拌し、次に蒸発させた。残渣を新たなＴＦＡ（３０当量）に溶かし、その新規な溶液を攪拌しながら室温で９６時間保持した。

反応混合物を蒸発させ、残渣をｉＰｒ_２Ｏ（１５０ｍＬ）で処理して白色固形物質を得、それを遠心分離に付し、ｉＰｒ_２Ｏ（２ｘ４０ｍＬ）で洗浄した。

粗生成物１６ａを次の方法に従って精製した。粗生成物をＨ_２Ｏに懸濁させ、５％水性ＮａＨＣＯ_３を添加することによりｐＨ６−７で溶かし、その後で１Ｍ ＨＣｌを添加することによりｐＨ３で再び沈殿させた。そうして得られた固形物質を遠心分離に付し、乾燥させてリガンド１６ａを得た。

粗生成物１６ｂを次の方法に従って精製した。粗生成物をＨ_２Ｏに懸濁させ、１Ｍ ＮａＯＨを添加することによりｐＨ６−７で溶かし、そうして得られた溶液を、溶出液としてＨ_２Ｏ／ＣＨ_３ＣＮのグラジエントを用いて、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ１６００樹脂上のパーコレーションに供することで精製した。所望の生成物を含有するフラクションを合わせ、凍結乾燥させてリガンド１６ｂを得た。

調製４.２ａ １０-[(１０Ｒ)-７-ヒドロキシ-７-オキシド-２,１３-ジオキソ-１０-[(１-オキソドデシル)オキシ]-６,８,１２-トリオキサ-３-アザ-７-ホスファテトラコス-１-イル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリ酢酸；化合物１６ａの調製
試薬：化合物１５ａ（６００ｍｇ；０.５３ミリモル）
化合物１６ａ（５０１ｍｇ；０.５３ミリモル）；収率９８％

分析データ
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：６１.３％（エリア％）
分子量：９６６.１６（Ｃ４５Ｈ８４Ｎ５Ｏ１５Ｐ）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳはその構造と矛盾しない。

調製４.２ｂ １０-[(１０Ｒ)-７-ヒドロキシ-７-オキシド-２,１３-ジオキソ-１０-[(１-オキソテトラデシル)オキシ]-６,８,１２-トリオキサ-３-アザ-７-ホスファエサコス-１-イル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリ酢酸；化合物１６ｂの調製
試薬：化合物１５ｂ（２.０ｇ；１.６８ミリモル）
化合物１６ｂ（１.１ｇ；１.０７ミリモル）収率６３％

分析データ
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ：９９.９％（エリア％）
分子量：１０２２.２６（Ｃ４９Ｈ９２Ｎ５Ｏ１５Ｐ）
^１Ｈ−および^１３Ｃ-ＮＭＲならびにＭＳはその構造と矛盾しない。

調製５ [[１０-[２-(ジオクタデシルアミノ)-２-オキソエチル]-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７-トリアセタート (３-)]カルシアート(１-)]カルシウム（２：１)

酸化カルシウム ＣａＯ（４６４ｍｇ；８.３０ミリモル；１.５当量）をエタノール（３００ｍＬ）中で１時間還流させ、次にリガンド１４（５ｇ；５.５ミリモル；１当量）を添加し；その反応混合物を２６時間還流させ、次に濾過して不溶物を除去した。透明な溶液を（最終容量が約３０ｍＬとなるまで）濃縮し、黄色がかった固体の沈殿物を得、それを濾過し、冷ＥｔＯＨおよびＨ_２Ｏで洗浄し、乾燥させ（２０ｍｂａｒ；３０℃）、錯体１７を黄色がかった固体（３.１２ｇ；１.７１ミリモル；収率６２％）として得た。

錯体１７をＮＭＲ、ＭＳおよびＩＣＰで特徴付けた。

実施例１． ＩＣＧｏｙｏｂｉＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００を含有するＳＬＮ（６０Ｒ０１２００１Ｌ）の調製
有機相（Ｏ）は、エピクロン（Epikuron）２００（登録商標）（Cargill Deutschland GmbH, Krefeld, Germany）（４０１ｍｇ）、[１,２-ジステロイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン-Ｎ-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-２０００）アンモニウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）（１００ｍｇ）、錯体１７（１１０ｍｇ）、トリパルミチン（４５０ｍｇ）、ステアリン酸（５０ｍｇ）およびＩＣＧ（１.１ｍｇ）をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶かすことで調製された。該有機相を３５℃に加熱し、全ての成分が完全に可溶化するまで攪拌下で保持した。タウロコール酸ナトリウム（３８０ｍｇ）、１−ブタノール（０.４ｍＬ）および水（０.５ｍＬ）を含有する水相（Ｗ）を該有機相に添加した。安定した透明のミクロエマルジョン（Ｗ／Ｏ）が得られるまで、該溶液を３５℃で３０分間攪拌した。同時に、０.２４％（重量／容量）ツゥーン（Tween）８０（登録商標）（Serva, Heidelberg, Germany）を含有する水溶液Ｗ_１（５０ｍＬ）を調製し、３０℃に加熱した。ミクロエマルジョンＷ／Ｏを３０℃に保持した水相Ｗ_１に滴下して加え、多重エマルジョンＷ／Ｏ／Ｗ_１を得た。次に、該多重エマルジョンを攪拌下で４５分間維持しながら、有機溶媒を大気圧で蒸発させた。ついで、該懸濁液の温度を１０℃にまで下げ（０.２５℃／分）、ＳＬＮの脂質コアを結晶化させた。調製後に、Labscale（登録商標）ＴＦＦシステムおよびペリコンＸＬフィルター（Pellicon XL Filter）、３０ｋＤａ ０.００５ｍ^２（Merck Millipore, Billerica, MA）で、グルコース５.５％ｗ／ｖの等張溶液（１Ｌ）を用いる限外濾過操作に付すことで、懸濁液から過剰量の成分を除去した。さらには、室温、減圧下で蒸発させることで、残っている可能性のある微量な溶媒を除去した。最後に、該懸濁液を約８.５ｍＬにまで濃縮し、０.２２μｍのステライル・ミレックス（Sterile Millex）（登録商標）-GS SyringeフィルターＭＣＥ（Millipore, Ireland）を用いて２回濾過した。

懸濁液の特徴付け
最終の懸濁液中にあるリンの量は、試料を６５％硝酸にマイクロ波システム（ＭＤＳ−２０００ＣＥＭコーポレーション）で消化させた後に、ＩＣＰ−ＭＳ ＥＬＡＮ６１００（Perkin Elmer, Waltham, MA）を用いて測定された。データを表Ｇにおいて報告する。

最終の懸濁液中のＩＣＧの量は、デュアルビーム式ラムダ（Lambda）４０ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Perkin Elmer, Waltham, MA）を用いて測定された。ＳＬＮ成分を同じモル比で含有する脂質マトリックスにおける検量線を、ＩＣＧを用いて、ＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（２：１）中標準液として作製した。その検量線から、ＩＣＧのモル吸光係数はその最大波長（８００ｎｍ）で２２９０００Ｍ^−１＊ｃｍ^−１と算定された。分析用溶液は、７％（ｖ／ｖ）のＩＣＧ−ＳＬＮ懸濁液をＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ（２：１）の混合溶媒に溶かすことで調製された。

ＩＣＧのＳＬＮへの取り込み効率は、最終懸濁液中のＩＣＧを理論的な取り込み量と比べた割合（＊１００）として計算された。ＩＣＧの取り込みは＞９０％と推定される。平均流体力学直径（ｚ−アベレージ）および多分散指標（ＰｄＩ）などの分散したナノ粒子の物理化学特性を、マルバーン・ゼータ・サイザー・ナノインストルメント（Malvern Zeta Sizer Nanoinstrument）（NanoZS, Malvern, UK）を用いる動的光散乱（ＤＬＳ）によりＰ＝２ｍＭの濃度で、ＮａＣｌ（１ｍＭ）中で測定した。表面帯電電位（ζ−電位）を電気泳動光散乱（ＥＬＳ）により同じ装置によって同じ条件で測定した。ＩＣＧ／Ｐ％モル比は０.２７％であると算定された。データを表Ｆに報告する。球体アクセサリーと一体となったＦ−３０１８を装着したＦｌｕｏｒｏＬｏｇ−３ １ＩＨＲ−３２０分光蛍光計（Horiba Jobin Yvon, Edison NJ）を用いて蛍光量子収率％（φ％）の測定を行った。光電子増倍管ＰＭＴ−ＮＩＲ Ｒ５５０９冷却検出器（日本国、浜松市、浜松ホトニクス）を用いて検出を行った。φ％は３回繰り返し７.７の平均％（ＳＤ０.１５）で測定された。

熱量計ＤＳＣ４０００パーキン・エルマーを用いて示差走査熱量（ＤＳＣ）測定を行った。ＩＣＧ−ＳＬＮ分散体（２９.０ｍｇ）を正確に秤量してアルミニウム製るつぼに入れ、その後で密閉した。るつぼでの水分照合の測定を行った。３０℃から８０℃まで５℃／分の走査速度で熱曲線を記録した。実験結果を図９にて報告する。オンセット値が４５.７８℃であり、その製剤のデルタＨは６.７４Ｊ／ｇであった。融点（ＤＳＣで測定されるオンセット値）はトリグリセリドの正確に規定された多形的結晶形（α）の温度と非常に近く（±２℃）（Chapman D.、「グリセリドの多形性（The polymorphism of glycerides）」１９６２およびWindbergsら、ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ、２００９、１０：１２２４−１２３３を参照のこと）、ＳＬＮの固形コア中に結晶構造のあることを定性的に規定しうる。

表Ｆ． ＤＬＳおよびＥＬＳ特性評価

表Ｇ． 最終製剤中のリンおよびＩＣＧの配合量

実施例２
ＩＣＧおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００を含有するＳＬＮ（６０Ｒ０１１０１３Ｌ）の調製
調製方法は実施例１に記載の方法を繰り返した。
粒度、ζ−電位およびＰｄＩに関する懸濁液の物理化学的特性評価は実施例１に記載されるようになされ、そのデータを表Ａにおいて報告する。

実施例３
ＩＣＧおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００を含有するＳＬＮ（６０Ｒ０１２００２Ｌ）の調製方法
調製方法は実施例１に記載の方法を繰り返した。
粒度、ζ−電位およびＰｄＩに関する懸濁液の物理化学的特性評価は実施例１に記載されるようになされ、そのデータを表Ａにおいて報告する。

実施例４
ＩＣＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００、および１,２−ジステアリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ホラート（ポリエチレングリコール）−２０００］アンモニウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ホラート）を含有するＳＬＮ（６３Ｒ０１１００５Ｌ）の調製
標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮを実施例１と同じ操作に従って処方し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ホラート（２ｍｇ）を標的剤として有機相に添加した。その調製にて、エピクロン（Epikuron）２００（登録商標）（４０２ｍｇ）、[１,２-ジステロイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン-Ｎ-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-２０００）アンモニウム塩 ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（９９ｍｇ）、錯体１７（１１１ｍｇ）、トリパルミチン（４５０ｍｇ）、ステアリン酸（５０ｍｇ）およびＩＣＧ（１.２ｍｇ）をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶かした。水相（Ｗ）はタウロコール酸ナトリウム（３８２ｍｇ）、１−ブタノール（０.４ｍＬ）および水（０.５ｍＬ）を含有した。懸濁液を約８.５ｍＬに濃縮した。

懸濁液の物理化学的特性評価は実施例１に記載されるようになされ、そのデータを表ＨおよびＩにて報告する。ＩＣＧ／Ｐのモル比は０.２６％であると算定された。ＩＣＧの取り込み％は約９０％と推定される。蛍光量子収率％は７.６（ＳＤ ０.３）であった。ＤＳＣ分析は３１.２ｍｇの製剤に対して行われた。オンセット値は４５.５６℃であるのに対して、その製剤のデルタＨは７.１３Ｊ／ｇであった。

表Ｈ． ＤＬＳおよびＥＬＳの特性評価

表Ｉ． 最終製剤中のリンおよびＩＣＧの配合量

図１０はこの実施例のＳＬＮのＤＳＣ曲線を示す。融点（ＤＳＣで測定されるオンセット値）はトリグリセリドの正確に規定された多形的結晶形（α）の温度と非常に近く（±２℃）（Chapman D.、「グリセリドの多形性」, Ｃｈｅｍ. Ｒｅｖ., １９６２，６２：４３３−４５６およびWindbergsら、ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ、２００９、１０：１２２４−１２３３を参照のこと）、ＳＬＮの固形コアに結晶構造のあることを定性的に規定しうる。

製剤の、表面荷電、ＰｄＩおよびζ−電位に関するコロイド安定性は、９０日に達するまで、該製剤を暗闇にて４℃で維持しながら測定された。測定は、試料をＮａＣｌ（１ｍＭ）中に希釈しながら、マルバーン装置（Zetasizer Nano ZS）を用いて２５℃で実施された。データを表Ｄに列挙する。

実施例５
ＩＣＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００、および１,２−ジステアリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ホラート（ポリエチレングリコール）−２０００］アンモニウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ホラート）を含有するＳＬＮ（６３Ｒ０１１００１Ｌ）の調製
標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮを実施例１と同じ操作に従って処方し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ホラート（１ｍｇ）を標的剤として有機相に添加した。その調製にて、エピクロン２００（登録商標）（２０２ｍｇ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（５０ｍｇ）、錯体１７（５６ｍｇ）、トリパルミチン（２２５ｍｇ）、ステアリン酸（２５ｍｇ）およびＩＣＧ（２ｍｇ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）に溶かした。水相Ｗ（０.２５ｍＬ）はタウロコール酸ナトリウム（１７５ｍｇ）、１−ブタノール（０.２ｍＬ）を含有した。水相Ｗ_１（２５ｍＬ）はツィーン（Tween）８０（登録商標）０.２４％ｗ／ｖを含有した。懸濁液を約１０ｍＬに濃縮した。

粒度、ζ−電位およびＰｄＩに関する懸濁液の物理化学的特性評価は実施例１に記載されるようになされ、そのデータを表Ａにて報告する。

実施例６
ＩＣＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００、および１,２−ジステアリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ホラート（ポリエチレングリコール）−２０００］アンモニウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ホラート）を含有するＳＬＮ（６３Ｒ０１１００２Ｌ）の調製
標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮを実施例１と同じ操作に従って処方し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ホラート（１ｍｇ）を標的剤として有機相に添加した。その調製にて、エピクロン２００（登録商標）（２０２ｍｇ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（５２ｍｇ）、錯体１７（５６ｍｇ）、トリパルミチン（２２５ｍｇ）、ステアリン酸（２５ｍｇ）およびＩＣＧ（２ｍｇ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）に溶かした。水相Ｗ（０.２５０ｍＬ）はタウロコール酸ナトリウム（１９０ｍｇ）、１−ブタノール（０.２ｍＬ）を含有した。水相Ｗ_１（２５ｍＬ）はツィーン８０（登録商標）０.２４％ｗ／ｖを含有した。懸濁液を約８ｍＬに濃縮した。

粒度、ζ−電位およびＰｄＩに関する懸濁液の物理化学的特性評価は上記の実施例に記載されるようになされ、そのデータを表Ａにて報告する。

実施例７
Ｊ−凝集体を評価するためのＩＣＧをロードしたＳＬＮ懸濁液および遊離ＩＣＧ溶液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトル
実施例４の記載に従って調製したＩＣＧをロードしたＳＬＮ懸濁液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを、処方した日の最後に、その懸濁液を貯蔵条件で維持しながら９０日および１２０日経過した後に記録した。１２０日後には、吸光度は最初の値との関連で９６％をリカバーした（図４Ａ）。

ＩＣＧ（０.１４ｍｇ／ｍＬ）溶液をグルコサート（glucosate）（５.５％）溶液中にて調製した。ＵＶ−Ｖｉｓ分析の前に試料を希釈し、吸光度の動きを３００〜９５０ｎｍで１５日間にわたって評価した（図４Ｂ）。

実施例８
光退色実験
遊離ＩＣＧ水溶液およびＩＣＧをロードしたＳＬＮ懸濁液を７８５ｎｍのレーザー照射に暴露することで光退色実験を行った。ＮＩＲ蛍光画像システム（LI-COR BiosciencesによるPearl（登録商標）インパルスシステム）により蛍光発光を集めた。ＩＣＧの配合量（０.２３ナノモルのＩＣＧおよび０.０３６ナノモルのＩＣＧをロードしたＳＬＮは５.６％の蛍光量子収率を有する）を調整し、初期の比較可能な蛍光発光シグナルを表示させた。

次に、両方の試料に光を３秒間照射し、その試料を暗闇に１秒間保持する実験を３７℃で二重に重複して行った。この一連の実験を連続して１時間繰り返した。結果を図２に示す。

実施例９
ＵＶ−Ｖｉｓによりその最大吸収波長で測定されるＩＣＧをロードしたＳＬＮの長期安定性
最終製剤中のＩＣＧの配合量はデュアルビーム式ラムダ４０ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Perkin Elmer, Waltham, MA）を用いて実施例１に記載されるように測定された。熱安定性は、ＩＣＧをロードしたＳＬＮの試料を暗闇にて貯蔵条件（４℃）で９０日間保持し、その試料（実施例４に記載されるように調製）を有機溶媒混合液（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ；２：１）に溶かした後で、８００ｎｍでの吸収最大値を測定することにより分析された。

実施例１０
バイオレイヤー干渉による標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮの標的とする特性の証明
葉酸に拮抗する抗体（ＭａｂＦＡ２）に対する、標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮおよび標的とされないＩＣＧをロードしたＳＬＮ（各々、実施例５および実施例２に記載されるように調製した）の２つの異なるバッチについてバイオレイヤー干渉方法（OCTET QK, ForteBio）を実施した。該実験において、バイオセンサーは、室温で６分間インキュベートすることにより、プロテインＡの相互作用を通して、葉酸に拮抗するモノクローナル抗体（Ｍａｂ ＦＡ２）で被覆された。分析を行う前に、バイオセンサーをＰＢＳ液で洗浄し、標的とされるＩＣＧをロードしたＳＬＮの、混合下で保持される、希釈懸濁液を含有する９６−マルチウェルのプレートに直ちに浸した。３００秒間インキュベートした後、センサーをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）含有のウェルに移し、解離曲線を作製した。ＭＡｂ ＦＡ２とＦ−ＩＣＧをロードしたＳＬＮとの間の結合特異性は、同様にして行われた標的とされないＩＣＧをロードしたＳＬＮ（負対照）分析と比較することで確かめられた。この実験結果を図５にて報告する（点線は結合曲線と解離曲線とを分ける）。

実施例１１
蛍光画像処理による腫瘍標的のインビボおよびエクスビボにおける評価
実施例５および実施例２の各々で処方されたＦ−ＩＣＧ−ＳＬＮおよびＩＣＧ−ＳＬＮを、Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの右側面に皮下注射したＩＧＲＯＶ−１細胞系統を用いる卵巣悪性腫瘍の異種移植片実験で評価した。血管の新生度を評価するためにマウス（ｎ＝６）を遊離ＩＣＧ色素で予め処理することで選択した。このようにして、動物を一貫して２群に配分した。腫瘍域周辺にある関心のある領域における後発的蛍光シグナルを集め、筋肉の場合にその背景蛍光は（腫瘍ＳＩ−筋肉ＳＩ）／筋肉ＳＩで表される。マウスに付き１５ナノモルのＩＣＧを注射した３０分、４時間および２４時間後のインビボでのデータ解析により、ＩＣＧ−ＳＬＮとの関連で、Ｆ−ＩＣＧ−ＳＬＮにてより高い強度の腫瘍シグナルが得られた。２４時間後に測定される蛍光シグナルは５.１ａ.ｕ.（ＳＤ２.９）であり、それに対して標的とされないＩＣＧをロードしたＳＬＮを投与する場合には、蛍光シグナルは１.７ａ.ｕ.（ＳＤ０.２）であった。臓器を摘出し、エクスビボでの蛍光定量のために組織を分析した（図６および７）。

Claims (22)

1. ａ）少なくとも１のグリセリド、および／または少なくとも１の脂肪酸を含む固形脂質コア；
   ｂ）コアａ）の回りにシェルを形成する両親媒性成分の混合物；
   ｃ）式Ｉおよび／またはＩＩ：
   

   

   ［式中：
   Ｙは、式：Ｙ’−ＮＨ−または（Ｙ’）_２−Ｎ−で示される基であり、ここで、Ｙ’は、（Ｙ’）_２−Ｎ−の場合には、同一または異なってもよく、直鎖であって、飽和であるＣ_１２−Ｃ_２０アルキル基、またはリン酸基である−Ｏ−（ＨＯ−Ｐ＝Ｏ）−Ｏ−で分断され、１または複数のオキシカルボニル−（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキル基によって置換されたＣ_１−Ｃ_１０アルキル基であり；
   Ｌは、メチルカルボニル、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ペンチルカルボニルおよびヘキシルカルボニルからなる群より選択される二価のリンカーであり；
   Ｒ^Ｉ〜Ｒ^ＩＶは、各々独立して、−Ｒ_２−ＣＯＯＲ_３であり、ここでＲ_２は直鎖のＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_３はＨまたは医薬的に許容されるカチオンであり；
   Ｒ^’〜Ｒ^’’’は、各々独立して、−Ｒ_２−ＣＯＯＲ_３であり、ここでＲ_２は直鎖のＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_３はＨまたは医薬的に許容されるカチオンである］
   で示される化合物とのアルカリ土類錯体；
   ｄ）シアニン蛍光色素、および／またはクマリン、ピラノ、キノリン、ピラノキノリン、インドールおよびピラノインドール誘導体より選択されるポリエテロサイクリック化合物からなる群より選択される、酸形態またはその医薬的に許容される塩での少なくとも１つの蛍光色素
   を含む、固形脂質ナノ粒子。
2. 式Ｉおよび／またはＩＩの化合物とのアルカリ土類錯体が請求項１に記載されるとおりであり、ここで：
   Ｙ’が、（Ｙ’）_２−Ｎ−の場合には、同一または異なってもよく、直鎖であって、飽和であるＣ_１６−Ｃ_１８アルキル基、またはリン酸基である−Ｏ−（ＨＯ−Ｐ＝Ｏ）−Ｏ−で分断され、２つのオキシカルボニル−（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキル基によって置換されたＣ_４−Ｃ_６アルキル基であり；
   Ｌ、Ｒ^Ｉ〜Ｒ^ＩＶおよびＲ^’〜Ｒ^’’’が上記のとおりである、
   ところの請求項１に記載のナノ粒子。
3. ｅ）シェルｂ）と共有結合し、ステルス剤の機能を有する親水性ポリマー官能基をさらに含む、ところの請求項１または２に記載のナノ粒子。
4. ｆ）病理関連の一の生物学的マーカーと特異結合するための分子標的となる部分であって、コアシェルｂ）または親水性ポリマー官能基ｅ）のいずれかに連結する部分をさらに含む、ところの請求項１−３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
5. 固形脂質コアａ）が、少なくとも１つのグリセリド、および／または少なくとも１つの脂肪酸あるいはそれらの混合物を含み、その少なくとも１つのグリセリド、あるいはその脂肪酸またはエステルが、室温および体温で固形状態である、ところの請求項１−４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
6. グリセリドが、飽和または不飽和で直鎖または分岐鎖のＣ_１２−Ｃ_２４アシル鎖を有する、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドからなる群より選択され、ジグリセリドまたはトリグリセリドの場合、アシル鎖は同じであっても異なってもよく、該脂肪酸またはそのエステルが飽和または不飽和で直鎖または分岐鎖のＣ_１２−Ｃ_２４の炭素鎖を有し、該コアがＣ_１２−Ｃ_２４脂肪酸とＣ_１２−Ｃ_２４脂肪族アルコールとのエステルを含んでもよい、ところの請求項５に記載のナノ粒子。
7. コアａ）がトリパルミチンおよび／またはステアリン酸を含む、ところの請求項６に記載のナノ粒子。
8. 両親媒性成分ｂ）の混合物が、直鎖または分岐鎖で飽和または不飽和のＣ_６−Ｃ_２４炭化水素鎖を有するリン脂質、リゾ脂質およびスフィンゴ脂質；任意で、少なくとも１つのコレステロールおよびステロイド誘導体、糖脂質、脂肪酸、脂肪族アルコールおよびジアルキルエーテル、非イオン性界面活性剤（好ましくは、ソルビタン誘導体より選択される）、炭素数６−２４の飽和または不飽和脂肪酸のジ−またはトリ−エステル誘導体、およびそのエトキシ化アナログ；モノ−またはオリゴ−配糖体およびそのエトキシ化アナログ、室温および体温で可溶性のグリセロールモノ−、ジ−またはトリ−エステルからなる群より選択される成分を含む、ところの請求項１−７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
9. 両親媒性成分の混合物が、大豆レシチンから由来のホスファチジルコリンを含む、ところの請求項８に記載のナノ粒子。
10. 非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートである、ところの請求項８−９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
11. 親水性ポリマーｅ）が、官能化ポロキサマー、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテル、ポリグリセリン、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択され、リン脂質の部分と共有結合してもよい、ところの請求項３−１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
12. 蛍光色素が、式：
    

    

    で示されるインドシアニン・グリーンである、ところの請求項１−１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
13. 分子標的となる部分ｆ）が、細胞表面レセプター、蛋白、アプタマー、ペプチドおよびポリペプチド、ビタミン、抗体またはそのフラグメント、および炭水化物からなる群より選択される腫瘍標的となるリガンドである、ところの請求項４−１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
14. 式Ｉおよび／またはＩＩの化合物とのアルカリ土類錯体が、
    

    

    からなる群より選択される、ところの請求項１−１３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
15. 診断剤として使用されるための請求項１−１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
16. リアルタイム式画像誘導手術、腫瘍検出および臨床的蛍光画像処理用途におけるリンパ節マッピングより選択される診断画像処理方法において使用されるための請求項１５に記載のナノ粒子。
17. 請求項１−１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む医薬／診断用組成物。
18. 請求項１−１４のいずれか一項に記載のナノ粒子の製造方法であって、以下の工程：
    ｉ）固形脂質結晶性コアを形成するであろう脂質物質ａ）、該コアの周囲にシェルを形成するであろう両親媒性化合物ｂ）、式Ｉおよび／またはＩＩ：
    

    

    の化合物とのアルカリ土類錯体ｃ）、蛍光色素ｄ）、任意の親水性ポリマーｅ）、および／または標的となる部分ｆ）を、水非混和性または水低混和性有機溶媒に溶かすことで有機相（Ｏ）を調製し；
    ｉｉ）１または複数の親水性界面活性剤を、任意で共界面活性成分を溶かすことで、第１水溶液（Ｗ）を調製し；
    ｉｉｉ）工程ｉ）の有機相（Ｏ）を工程ｉｉ）の第１水溶液（Ｗ）と混合し、安定したＷ／Ｏミクロエマルジョンが形成されるまで攪拌し；
    ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られたＷ／Ｏミクロエマルジョンを、その後で、少なくとも界面活性剤を含有しうる第２水溶液（Ｗ_１）に添加してＷ／Ｏ／Ｗ_１の多重エマルジョンを得；
    ｖ）蒸発により多重エマルジョンから有機溶媒を取り去り、懸濁液を得；
    ｖｉ）工程ｖ）で得られた懸濁液を冷却し、固形コアａ）を完全に結晶化させ；
    ｖｉｉ）工程ｖｉ）にて得られた分散液から過剰量の成分を洗い流し；
    ｖｉｉｉ）工程ｖｉｉ）にて得られた分散液を水相にて、あるいは水を除去した後に固相にて貯蔵してもよい
    工程を含む、方法。
19. 工程ｉ）で使用される有機溶媒が２０℃ないし７０℃の沸点を有する、ところの請求項１８に記載の方法。
20. 溶媒が、塩化メチレン、１,２-ジクロロエタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、およびギ酸エチル、あるいはその混合液からなる群より選択される、ところの請求項１９に記載の方法。
21. 工程ｉｉ）にて、親水性界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、あるいはその塩または誘導体からなる群より選択され、共界面活性剤が、１−ブタノールおよび１−ヘキサノールからなる群より選択される、ところの請求項２０に記載の方法。
22. 工程ｉｖ）にて、界面活性剤がソルビタン誘導体である、ところの請求項１８に記載の方法。

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