JP7219473B2 - コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブ - Google Patents

コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブ Download PDF

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Description

本発明は、コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブに関する。
コリバクチンは、大腸がんの原因因子として知られ、大腸菌の特定の一群により腸内で産生される。コリバクチンは、動物細胞中のＤＮＡを切断する活性があると考えられ、大腸患者の６７％、炎症性腸疾患患者の４０％からコリバクチン産生菌が検出されたとの報告もなされている。
コリバクチンに関しては、コリバクチンのプロドラッグモチーフとしてのミリストイルアスパラギンの構造およびＬＣ－ＭＳによる検出が報告されている（非特許文献１）。現在までのところ、コリバクチンの化学構造は決定されていない。
Ｂｒｏｔｈｅｒｔｏｎ ＣＡ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．， Ｖｏｌ．１７， Ｐａｇｅ．１５４５－１５４８ （２０１５）
本発明は、コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブを提供する。
本発明者らは、コリバクチンのプロドラッグモチーフであるミリストイルアスパラギンを利用するとコリバクチンおよびコリバクチン産生菌を糞便試料（特に乾燥糞便試料）や大腸がん組織検体から検出することができることを見出した。本発明者らはまた、コリバクチン産生菌を検出する蛍光プローブを合成することに成功した。本発明者らはさらに、これらの蛍光プローブによりコリバクチン産生酵素ＣｌｂＰを糞便試料（特に乾燥糞便試料）や大腸がん組織検体から検出することができることを見出した。本発明者らはさらにまた、同様の原理に基づいて、ＣｌｂＰを検出する蛍光プローブを各種設計できることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
本発明によれば、例えば以下の発明が提供される。
［１］以下に示される、化合物または蛍光プローブ：
（Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｆ）上記（Ａ）～（Ｅ）において、前記カルボキシル基と前記アミノ基とがアラニン（－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＯ－）で連結された化合物（それぞれアラニンとアミド結合を形成する）または蛍光プローブ；
（Ｇ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と水酸基がフリーになることで蛍光性となる蛍光基であるｏＦｌｕの水酸基とが、自己開裂性リンカーを介して連結した化合物であって、自己開裂性リンカーは、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合で連結しており、当該アミド結合が加水分解されると、分解してｏＦｌｕの水酸基をフリーにする、化合物または蛍光プローブ；および
（Ｈ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合により連結した蛍光色素を有する化合物であって、アミド結合がＣｌｂＰ依存的に開裂すると、その後、蛍光を発する、化合物または蛍光プローブ
からなる群から選択される、化合物または蛍光プローブ。
［２］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［３］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［４］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［５］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［６］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［７］上記［１］～［６］のいずれかに記載の化合物または蛍光プローブを含む、コリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出することに用いるための組成物。
［８］組織検体または糞便試料を対象とする、上記［７］に記載の組成物。
［９］組織検体または糞便試料が、ヒトの組織検体または糞便試料である、上記［８］に記載の組成物。
［１０］生体試料においてコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を検出する方法であって、
生体試料中でミリストイルアスパラギンの有無を検出することを含む、方法。
［１１］生体試料が、組織検体または糞便試料である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］生体試料が、ヒト由来である、上記［１０］または［１１］に記載の方法。
図１は、コリバクチンのプロドラッグからコリバクチンが生成される際にコリバクチンから切り離されるミリストイルアスパラギンを乾燥糞便試料中で検出した液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。 図２は、本発明の蛍光プローブにより乾燥糞便試料中のＣｌｂＰ依存的にプローブが蛍光を示したことを示す図である。 図３は、本発明の蛍光プローブにより乾燥糞便試料中のコリバクチン産生菌依存的にプローブが蛍光を示したことを示す図である。 図４は、ヒト大腸組織検体から単離された大腸菌を本発明のプローブにより検出した結果を示す。縦軸はプローブＩによる蛍光強度を示し、横軸は各サンプルを示す。図４上段は、コリバクチン陽性菌を含むことがＰＣＲ法により確認された試料に対するプローブＩの蛍光強度を示し、図４下段は、コリバクチン陽性菌を含まないことがＰＣＲ法により確認された試料に対するプローブＩの蛍光強度を示す。図４の上段および下段の最左のバーはポジティブコントロールであり、その隣はネガティブコントロールである。 図５は、ヒト糞便試料より分離した大腸菌を培養して得られた培養物に対するプローブＩの蛍光強度を示す。縦軸はプローブＩによる蛍光強度を示し、横軸は各サンプルを示す。最左のバーはポジティブコントロールであり、最右のバーはネガティブコントロールである。 図６は、凍結されたヒト大腸がん組織検体および同一患者の大腸正常組織検体を用いたコリバクチン生合成遺伝子の検出と、当該組織検体のホモジェネートを培養して得られたバクテリアにおけるコリバクチン生合成遺伝子陽性バクテリアの割合を示す。 図７は、培養して得られたバクテリアの培養物中のミリストイル－Ｄ－アスパラギンの検出結果を示す。
発明の詳細な説明
「コリバクチン」とは、大腸がんの発生に関わる分子として知られ、腸内の大腸菌のうち特定の大腸菌により産生される低分子化合物であることが生化学的分析から分かっている。しかし、その詳細な化学構造は未だ明らかにされていない。一方で、コリバクチンは、大腸菌体内では不活性なプロドラッグとして合成され、大腸菌のペリプラズムにおいて、プロドラッグモチーフが分子内開裂により除去され、これにより大腸菌の細胞外においてコリバクチンが産生される。
「コリバクチン産生菌」とは、コリバクチンを産生する細菌を意味する。腸内では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の特定の一群がコリバクチンを産生することが知られているが、全ての哺乳動物（特にヒト）がコリバクチン産生菌を保有するわけではない。コリバクチン産生菌は、コリバクチンポリケチド合成遺伝子クラスターをゲノム上に有していることが知られている。コリバクチンポリケチド合成遺伝子クラスターには、コリバクチンの生合成経路に関わるタンパク質がコードされている。
本明細書では、「ＣｌｂＰ」とは、コリバクチンポリケチド合成遺伝子クラスター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： ＡＭ２２９６７８．１）内に存在する遺伝子の１つである。ＣｌｂＰ遺伝子は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ： ＣＡＪ７６２８４．１に登録されているタンパク質をコードする。ＣｌｂＰによりコードされるタンパク質はペプチダーゼとしての性質を有しており、標的分子であるコリバクチンプロドラッグのコリバクチンとミリストイルアスパラギンを連結するペプチド結合（アミド結合）を切断する。ＣｌｂＰは、大腸菌のペリプラズムに発現し、コリバクチンプロドラッグをペリプラズムでコリバクチンに変換していると考えられる。
本明細書では、「ＣｌｂＰ依存的に蛍光を発する」とは、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされるタンパク質によって分子内で加水分解が生じると、これにより蛍光性を獲得することを意味する。本明細書では、「蛍光性を獲得する」とは、特定波長の励起光によって特定波長の蛍光を発するようになることを意味する。例えば、「蛍光性を獲得する」という用語には、特定波長の励起光によっては特定波長の蛍光性を発しないかまたは検出閾値以下であるものが、検出閾値以上の蛍光性を有するようになることを含む意味で用いられる。
本明細書では、「対象」とは、温血動物であり、鳥類または哺乳動物であり得る。哺乳動物としては、例えば、霊長類、例えば、サル、チンパンジ、ゴリラ、オランウータン、ボノボおよびヒト、あるいは例えば、家畜、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、およびヒツジ、あるいは、ペット、例えば、イヌおよびネコが挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリが挙げられる。本明細書では、対象に対して「患者」または「者」と表現した場合、「患者」または「者」は、ヒトおよび非ヒト温血動物に向けられた用語である。本明細書では、対象は、好ましくは健常者、炎症性腸疾患患者、炎症性腸疾患が疑われる患者、大腸がん患者、または大腸がんが疑われる患者であり得る。
本明細書では、「糞便試料」とは、対象から排出された糞便を含む試料を意味する。糞便試料は、通常は肛門を介して排出された試料である。糞便試料は、乾燥または凍結乾燥された試料であってもよい。糞便試料は、粉砕された形態（例えば、粉末状）であってもよい。
本明細書では、「蛍光色素」とは、特定波長の励起光により励起され、別の特定波長の光（蛍光）を発することができる化学物質をいう。本明細書では、「蛍光プローブ」とは、ある特定の条件下で特定波長の蛍光を発する化合物またはその蛍光強度が高まる化合物をいう。従って、本明細書では、ＣｌｂＰ依存的に開裂して蛍光を発する化合物は蛍光プローブと呼ばれる。
ミリストイルアスパラギンは、以下の構造を有する。
Figure 0007219473000001
すなわち、ミリストイルアスパラギンは、ミリスチン酸のカルボキシル基とアスパラギンのアミノ基がアミド結合で連結した構造を有する。
コリバクチンプロドラッグは、コリバクチンとミリストイルアスパラギン（プロドラッグモチーフ）がアミド結合で連結した構造を有する。
Figure 0007219473000002
クマリン系蛍光色素は、以下の基本骨格（以下、「クマリン骨格」ともいう）を有する。
Figure 0007219473000003
上記化合物はそのままではほとんど蛍光を発しないが、上記クマリン骨格の７位に電子供与基を導入すると強い吸光性を示し、蛍光を発するようになる。この原理を利用して、７位に電子供与性の高い電子供与基を導入することで強い蛍光色素を得ることができる。
本発明では、７位の電子供与基（アミノ基）の電子供与性が低下するようにミリストイルアスパラギンを当該アミノ基に連結させることができる。例えば、７位の電子供与基（アミノ基）とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とをアミド結合で連結させることにより、クマリン系蛍光色素の７位の電子供与基の電子供与性を低下させることができる。一方で、本発明では、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基がアミド結合で他の化合物と連結した化合物は、ＣｌｂＰによりコードされる酵素により認識され、アミド結合の箇所でミリストイルアスパラギンと当該他の化合物とに開裂させることができる。
従って、本発明によれば、ミリストイルアスパラギン酸のカルボキシル基とクマリン系蛍光色素のクマリン骨格の７位のアミノ基とをアミド結合で連結させた化合物は、ＣｌｂＰによりコードされる酵素により認識され得、ＣｌｂＰ依存的に蛍光を発揮する。従って、このような化合物は、ＣｌｂＰによりコードされる酵素の検出、コリバクチン生合成遺伝子クラスターの検出、コリバクチン産生大腸菌の検出、および／または、コリバクチンの検出に用いることができる。
本発明では、クマリン系蛍光色素のクマリン骨格の７位にアミノ基を有する化合物の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物、および当該化合物を含む蛍光プローブが提供される。クマリン骨格は、４位に置換されていてもよいメチル（例えば、－ＣＨ３、－ＣＮ、－ＣＨ２ＯＨ、１～３個のハロゲンにより置換されたメチル、例えば－ＣＦ３および－ＣＨ２Ｂｒなど）を有していてもよい。このような化合物としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
Figure 0007219473000004
Figure 0007219473000005
Figure 0007219473000006
また、ナフタルイミド系蛍光色素も同様にしてＣｌｂＰ依存的に蛍光を発する化合物またはプローブの設計に利用できる。
Figure 0007219473000007
 上記ナフタルイミド骨格においてＲは、特に限定されないが例えば、置換されていてもよいＣ１－６のアルキル、置換されていてもよいＣ１－６のアルケニル、置換されていてもよいＣ１－６のアルキニルであり得る。
ナフタルイミド系蛍光色素に関しては、そのナフタレン環の４位にアミノ基を有し、当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とをアミド結合で連結した化合物は、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光性であるナフタルイミド系蛍光色素を生じ得る。このようなフタルイミド系のプローブとしては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
Figure 0007219473000008
同様に、アミノ基で置換されたナフタレン、アミノ基で置換されたピレン、およびアミノ基で置換されたアントラセンも、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と当該アミノ基とをアミド結合で連結させることにより、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。ナフタレン、ピレンおよびアントラセンは、好ましくはその２位においてアミド結合を形成するアミノ基を有し得る。例えば、このような化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
Figure 0007219473000009
ローダミン系蛍光色素に関しては、ローダミン系蛍光色素のキサンテン骨格の３位と９位に電子供与基（例えば、アミノ基）が存在すると強い蛍光を発し、これらの電子供与基の電子供与性を低下させることで蛍光性を低下させることができる。従って、キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基のいずれか１つまたは全部と、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と当該アミノ基とをアミド結合で連結させることにより、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。例えば、キサンテン骨格の３位および９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物が提供され得る。このような化合物としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
Figure 0007219473000010
Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光色素でも同様である。Ｂｏｄｉｐｙは、以下に示すＢｏｄｉｐｙ母核構造（４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン）を有する。
Figure 0007219473000011
上記母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の前記アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物は、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。そのような化合物としては、例えば、以下の構造を有する化合物が挙げられる。
Figure 0007219473000012
その他、例えば、以下の構造を有する化合物は、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。そのような化合物としては、例えば、以下の構造を有する化合物が挙げられる。
Figure 0007219473000013
Figure 0007219473000014
Figure 0007219473000015
なお、プローブ８では、クマリン骨格による蛍光が、分子内のピリジン環でＰＥＴにより消光しているが、ＣｌｂＰにより開裂させることで、クマリン系蛍光色素が遊離し蛍光を発するように設計されている。
また、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎなどの水酸基がフリーになることで蛍光を発するフェノール性の蛍光基（ｏＦｌｕ）を有する色素も、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。例えば、以下の化合物はそのような化合物である。
Figure 0007219473000016
Figure 0007219473000017
自己開裂性リンカー（蛍光色素部分とミリストイルアスパラギン部分とを連結するリンカーである）としては、例えば、以下のリンカーを用いることができる。以下では、左に示される構造がリンカーの構造であり、右に示される対応する構造が開裂の機構を示す。
Figure 0007219473000018
このようなリンカーを介して、ミリストイルアスパラギンとｏＦｌｕとを連結させることでＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。同様の仕組みで、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、オレゴングリーン、ＳＮＡＦＬ、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、フルオレセイン、およびフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、並びに上記ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と連結させるべきアミノ基がヒドロキシル基に置き換わった化合物などのｏＦｌｕから選択される化合物の水酸基を自己開裂性リンカーを介してミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合させた化合物が、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。
本発明では、蛍光化合物または蛍光プローブは、塩および／または溶媒和物の形態であってもよく、遊離形態に加えて塩および／または溶媒和物の形態も上記で示される化学式等で特定される化合物またはプローブには含まれるものとする。溶媒和物では、溶媒としては水、エタノールその他の溶媒が挙げられ、溶媒が水である場合には水和物と呼ばれる。
上記において、ミリストイルアスパラギンがアラニン（－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＯ－）を介して蛍光色素と連結している場合、アラニンは欠失していてもよい。上記において、ミリストイルアスパラギンがアラニンを介さずに直接蛍光色素と連結している場合は、ミリストイルアスパラギンをアラニンを介して蛍光色素と連結させてもよい。これは、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素による切断活性がアラニンの介在を許容することによる。なお、アラニンは、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基との間でアミド結合を形成し、蛍光色素のアミノ基との間でアミド結合を形成し、これによりミリストイルアスパラギンと蛍光色素とを連結することができる。
本発明によれば、上記化合物を含む蛍光プローブが提供される。本発明によればまた、上記化合物または蛍光プローブを含む、コリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出することに用いるための組成物が提供される。これらの組成物は、糞便試料において、コリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出する（またはコリバクチンの存在を推定する）ことに用いるための組成物であり得る。
本発明のプローブは、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素の存在下で切断され、蛍光を発する。従って、本発明のプローブは、その蛍光の強度を指標として、接触させた試料中にＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素の有無を評価することに用いることができ、または、コリバクチン陽性菌の有無を評価することに用いることができる。ある態様では、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度、および／または、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度と比較して、評価する試料に対する蛍光強度を評価してもよい。例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の平均値、第３四分位値、または第１四分位値よりも蛍光強度が高い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていると評価してもよい。また例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の第１四分位値よりも蛍光強度が低い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていないと評価してもよい。また例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の平均値、第３四分位値、または第１四分位値よりも蛍光強度が低い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていないと評価してもよい。また例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の第三子分位値よりも蛍光強度が高い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていると評価してもよい。
この意味では、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、最大値と平均値との間のいずれかの数値であり得、最大値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、または第３四分位値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得る。あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値、第１四分位値、平均値および第３四分位値からなる群から選択される１つの値とコリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値または第３四分位値との間のいずれかの数値であり得る。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
また、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、最大値と平均値との間のいずれかの数値であり得、最大値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、または第３四分位値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得る。あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値、第１四分位値、平均値および第３四分位値からなる群から選択される１つの値とコリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最低値または第１四分位値との間のいずれかの数値であり得る。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値とすることができる。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最低値とすることができる。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最低値とコリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値との間のいずれかの値とすることができる。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
また、コリバクチン陽性菌が検出された患者群および、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群は、ＰＣＲ法によりコリバクチン生合成遺伝子が試料から検出されるか否かや、ミリストイル－Ｄ－アスパラギンが試料から検出されるか否かにより予め決定しておくことができる。
当業者であれば、上記の判定のための閾値を高めれば、偽陽性率が低下する一方で、偽陰性率が高まり、閾値を低くすれば、偽陽性率が高まる一方で、偽陰性率が低下することを理解し得、これにより、そのときの目的に応じて閾値を設定することができるであろう。
本発明によれば、
生体試料においてコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を予測する方法であって、
生体試料中でミリストイルアスパラギンの有無を検出することを含む、方法
が提供される。
本発明の方法のある態様では、生体試料は糞便試料であり、例えば、ヒトの糞便試料である。本発明の方法のある態様では、生体試料はがん組織またはがんであると疑われる組織を含む組織検体であり、例えば、ヒトの組織検体である｛ここで、組織検体は凍結された検体であってもよい｝。ミリストイルアスパラギンが検出されたということは、不活性型であるプロドラッグ形態から活性化型であるコリバクチンが産生されたことを意味する。従って、生体試料にミリストイルアスパラギンが検出されたことは、当該生体試料にコリバクチンが含まれることを意味する。生体試料にコリバクチンが含まれているということからは、糞便試料にコリバクチン産生菌（例えば、大腸菌）が存在していることが分かる。すなわち、本発明の方法で糞便試料中にミリストイルアスパラギンが検出されたということは、生体試料が由来する対象（例えば、ヒト）の大腸に、コリバクチンおよび／またはコリバクチン産生菌（例えば、大腸菌）が存在することを示す。コリバクチンは、大腸がんの原因として知られている。従って、本発明の方法は、対象（例えば、ヒト）が大腸がんに罹患する素因を有しているかを判定することに用いることができる。本発明の方法は、医師によるヒトに対する医療行為を含まない方法（すなわち、産業上利用可能な方法）であり得る。
本発明のある態様では、糞便試料は、大腸菌の増殖に適した条件下で培養し、その後分析してもよい。本発明者らによれば、培養によりコリバクチン産生大腸菌の量が増えるため、コリバクチンやコリバクチン産生菌の検出感度が向上した。本発明では、コリバクチン陽性菌の単離は必須ではない。
本発明によれば、
生体試料においてコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を予測する方法であって、
生体試料中でＣｌｂＰによりコードされる酵素の酵素活性の有無を検出することを含む、方法
が提供される。
ＣｌｂＰによりコードされる酵素の酵素活性の有無は、ＣｌｂＰ依存的に開裂して蛍光性を獲得する蛍光化合物または蛍光プローブを用いて決定することができる。
本発明によれば、ＣｌｂＰによりコードされる酵素の活性は、糞便試料（特に乾燥された糞便試料）を用いても検出することができた。従って、本発明によれば、生体試料は、糞便試料または乾燥された糞便試料とすることができる。
実施例１：コリバクチンの検出
本実施例は、生体試料からのコリバクチンの検出を試みた。
具体的には、コリバクチンは、構造未知の化学物質である。コリバクチンは、コリバクチン産生系を有する大腸菌の菌体内でプロドラッグとして産生されることが知られている。このコリバクチンのプロドラッグは、大腸菌のペリプラズムにおいて内膜上の酵素により、ミリストイルアスパラギン（プロドラッグモチーフ）とコリバクチンとに開裂し、活性型コリバクチンを産生する。本実施例では、プロドラッグモチーフを生体試料中で検出することを試みた。
本実施例では、生体試料として、大腸に病変を認めないボランティアから採取されたヒトの糞便（２３例）を用いた。まず、糞便試料から大腸菌ゲノムＤＮＡを抽出し、精製した。その後、コリバクチン産生系を有する大腸菌が試料中に存在するか否かを確認するため、ＰＣＲによりコリバクチン生合成遺伝子クラスターの遺伝子のうち、ｃｌｂＡ遺伝子、ｃｌｂＪ遺伝子およびｃｌｂＱ遺伝子を増幅し、その有無を確認した。
各遺伝子の増幅に用いたプライマーは以下の通りであった：
clbAフォワードプライマー GTTCAATATCGACACCAAGCTCGCAGT
clbAリバースプライマー ACCCGTTATCTCTGCGTGAAAGACAAGTATTG
clbJフォワードプライマー TGGCCTGTATTGAAAGAGCACCGTT
clbJリバースプライマー AATGGGAACGGTTGATGACGATGCT
clbQフォワードプライマー CTGTGTCTTACGATGGTGGATGCCG
clbQリバースプライマー GCATTACCAGATTGTCAGCATCGCC
２３例中、２例において、ｃｌｂＡ遺伝子、ｃｌｂＪ遺伝子およびｃｌｂＱ遺伝子の増幅が確認され、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する大腸菌が糞便中に存在することが示された。
そのうち、一例について、糞便から以下の手順によりプロドラッグモチーフを抽出、精製し、ＬＣ－ＭＳに供した。具体的には、乾燥後の約４０ｍｇの糞便をｍｉｌｌｉＱ水に懸濁した。次いで、８００μＬの酢酸エチルを加えて攪拌した。４℃で１０分間遠心し、酢酸エチル層を採取し、さらに遠心濃縮した。沈殿を５０μＬのＤＭＦに溶かし、さらに遠心して上清をＬＣ－ＭＳ解析（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）に供した。菌体試料を用いる場合には、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃で２４時間振とう培養した大腸菌に対して１０ｍＬの酢酸エチルを加え、攪拌した後に遠心分離し、酢酸エチル層を採取した。遠心濃縮して沈殿を５０μＬのＤＭＦに溶かし、さらに遠心して上清をＬＣ－ＭＳ解析（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）に供した。
ＬＣ－ＭＳ条件は以下の通りであった。
カラム条件：
ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ
２．１×５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ
溶媒条件：
Ａ： Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＝９５／５ （０．０５％ ＦＡ）
Ｂ： ＭｅＣＮ （０．０５％ ＦＡ）
ＨＰＬＣ条件：
（１） Ｂ １０％→５０ ％ グラジエント（０ ～ ５ ｍｉｎ）
（２） Ｂ ５０％ イソクラティック （５ ～ ７．５ ｍｉｎ）
（３） Ａ １００ ％ （７．５ ～ １１ ｍｉｎ ）
ネガティブコントロールとして大腸菌ＤＨ５αを用い、ポジティブコントロールとしてＮｉｓｓｌｅ １９１７を用い、菌体培養試料としてコリバクチン生合成遺伝子をコードしていることが確かめられた我々が分離した大腸菌を用いた。結果は、図１に示される通りであった。
図１に示されるように、上記患者の糞便から、ポジティブコントロールや菌体培養試料と同じ保持時間を有し、プロドラッグモチーフに固有の質量電荷比（ｍ／ｚ＋ ３４３．２５９１）を示すピークが検出された。このことから、コリバクチンのプロドラッグモチーフは糞便試料から直接的に検出し得ることが明らかとなった。このプロドラッグモチーフはコリバクチンに固有であることから、糞便試料においてプロドラッグモチーフが検出されたということは、糞便試料に構造未知のコリバクチン（活性型）が存在することを示す。このようにして、本実施例では、糞便試料においてプロドラッグモチーフを検出することにより、コリバクチンの存在を検出することができることが明らかとなった。
実施例２：コリバクチン産生系を有する大腸菌を検出するプローブの設計
本実施例では、コリバクチン産生系を有する大腸菌を検出することができるプローブを設計した。
蛍光色素であるアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）のアミノ基にミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合により連結した構造を有する化合物（プローブ１）を設計し、合成した。この化合物は、ＡＭＣの７位のアミノ基の電子供与性がミリストイルアスパラギンの連結により低下しており、蛍光を発しない。しかし、コリバクチン生合成遺伝子クラスターのＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素によりペプチド結合部分が開裂し、蛍光色素であるＡＭＣを生成すれば、蛍光によりＣｌｂＰによりコードされる酵素の有無を判定することができ、これによりコリバクチン生合成遺伝子クラスターを検出するプローブとなり得る。
プローブ１の合成
Figure 0007219473000019
５０ ｍＬナスフラスコにＢｏｃ－Ｄ－Ａｓｎ－ＯＨ ３００ ｍｇ（１．３ ｍｍｏｌ）、７－Ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ （ＡＭＣ）１７６ ｍｇ（１．０ ｍｍｏｌ）、Ｏ－（７－Ａｚａ－１Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＨＡＴＵ） ４００ ｍｇ（１．１ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－４－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ （ＤＭＡＰ）一欠片（触媒量）を量り取り、窒素置換後にＤｒｙ Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ （ＤＭＦ） ５ ｍＬに溶かした。Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ （ＤＩＥＡ） １５０ μＬ（０．９ ｍｍｏｌ）を加え、室温で４日間撹拌した。飽和重曹水 ３５ ｍＬを加え、よく撹拌後、不溶物をろ別して回収し、真空ラインで減圧濃縮し、アミド１を２６ ｍｇ（０．０６７ ｍｍｏｌ， 収率６．７％）得た。
Figure 0007219473000020
２６ ｍｇ（０．０６７ ｍｍｏｌ）のアミド１を５０ ｍＬナスフラスコに取り、ジクロロメタン １ ｍＬ及びｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ＴＦＡ） １ ｍＬを加えて室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエンで２回共沸した。得られた粗脱Ｂｏｃ体２はそのまま次の反応に用いた。
Figure 0007219473000021
５０ ｍＬナスフラスコに粗脱Ｂｏｃ体２、ミリスチン酸 ２０ ｍｇ（０．０８８ ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ ３０ ｍｇ（０．０７８ ｍｍｏｌ）を量り取り、窒素雰囲気下にした後、Ｄｒｙ ＤＭＦ １ ｍＬ、ＤＩＥＡ １００ μＬ（０．５７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応液に飽和重曹水 １０ ｍＬを加え、酢酸エチル５０ ｍＬで３回抽出した。得られた有機層をまとめて濃縮し、得られた生成物をＨＰＬＣ［５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（φ２０ ｘ ２５０ ｍｍ），アセトニトリル－Ｈ２Ｏ グラジエント７０－１００％ １ ｈ］で精製し、６ ｍｇ（０．０１２ ｍｍｏｌ， 二段回収率１８％）のプローブ１を得た。
プローブ２の合成
Figure 0007219473000022
３０ ｍＬナスフラスコにＢｏｃ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ ９８ ｍｇ（０．５２ ｍｍｏｌ）、ＡＭＣ ６０ ｍｇ （０．３４ ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ ３８０ ｍｍｏｌ（１．０ ｍｍｏｌ）を量り取り、窒素置換後にＤｒｙ ＤＭＦ ２ ｍＬ、ＤＩＥＡ ２００ μＬ（１．１５ ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ 一欠片（触媒量）を加え、室温で１日撹拌した。反応液に飽和重曹水 ８ ｍＬを加え、酢酸エチル／ヘキサン（４／１） ５ ｍＬで３回抽出した。有機層をあわせて、飽和食塩水５ ｍＬで一度洗浄した後、減圧濃縮して粗生成物を２４０ ｍｇ得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［関東化学株式会社シリカゲル６０Ｎ １００－２１０ μｍ ５ ｇ， （クロロホルム／メタノール＝１／０→３０／１→１５／１）］、及びＨＰＬＣ［５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（φ２０ ｘ ２５０ ｍｍ）， ４５％アセトニトリル－Ｈ２Ｏ］で精製し、９１ ｍｇ （０．２６ ｍｍｏｌ， 収率７６％）のアミド３を得た。
Figure 0007219473000023
３０ ｍＬナスフラスコにアミド２ ２１ ｍｇ （０．０６２ ｍｍｏｌ）を量り取り、ジクロロメタン ０．５ ｍＬとＴＦＡ ０．５ ｍＬを加えて室温で一時間撹拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、トルエン共沸を５回行い、粗脱Ｂｏｃ体４を得た。得られた粗脱Ｂｏｃ体４はそのまま次の反応に用いた。
Figure 0007219473000024
３０ ｍＬナスフラスコに粗脱Ｂｏｃ体４、Ｂｏｃ－Ｄ－Ａｓｎ－ＯＨ ２０ ｍｇ（０．０８８ ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ ２５ ｍｇ（０．０６７ ｍｍｏｌ）を加え、窒素置換後にＤｒｙ ＤＭＦ １ ｍＬに溶かした。ＤＩＥＡ １００ μＬ（０．５８ ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１１時間撹拌した。得られた反応液に飽和重曹水 ５ ｍＬを加え、酢酸エチル ５ ｍＬで４回抽出した。得られた有機層をまとめて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。さらにＨ２Ｏ ５ ｍＬを加えて凍結乾燥し、粗アミド５を３９ ｍｇ得た。得られたアミド５はそのまま次
の反応に用いた。
Figure 0007219473000025
３０ ｍＬナスフラスコに粗アミド５ ３９ ｍｇ、ジクロロメタン０．５ ｍＬ、ＴＦＡ ０．５ ｍＬを量り取り、室温で一時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエン共沸を２回行った。得られた粗脱Ｂｏｃ体６はそのまま次の反応に用いた。
Figure 0007219473000026
３０ ｍＬナスフラスコに粗脱Ｂｏｃ体６、ミリスチン酸 ２０ ｍｇ（０．０８７ ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ ２５．１ ｍｇ（０．０６６ ｍｍｏｌ）を量り取り、窒素置換後、Ｄｒｙ ＤＭＦ １ ｍＬを加えた。ＤＩＥＡ １００ μＬ（０．５８ ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。反応液に飽和重曹水１０ ｍＬを加え、不溶物をろ別し、飽和重曹水と水で洗浄した。残った不溶物を集め、ＤＭＦ可溶部をＨＰＬＣ［５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（φ２０ ｘ ２５０ ｍｍ）， アセトニトリル－Ｈ２Ｏ グラジエント５０－１００％ １ ｈ］で精製し、ＣｌｂＰ ｐｒｏｂｅ ＩＩ ３．８ ｍｇ （６．７ μｍｏｌ， ４段階収率１１％）を得た。
実施例３：生体試料におけるコリバクチン産生系を有する大腸菌の検出
生体試料としては、実施例１でコリバクチン生合成遺伝子クラスターを有することが分かった患者の糞便を用いた。
凍結乾燥後の糞便（異なるヒト対象から得られた４サンプル）を、サジ１０杯分（推定４０ｍｇ）すくい、ｍｉｌｌｉＱ水 ２００ μｌに懸濁し、さらにプローブ１の２０ ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を終濃度が２０ μＭになるように加えた（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。その後、３７ ℃， １００ ｒｐｍで２４時間以上振盪した。反応後、反応液２００ μＬを取り、遠心した上清２００ μＬをそのままλｅｘ３８０ ｍｍ／λｅｍ４６０ ｍｍで検出した（未抽出）。またさらに反応液２００ μＬを取り、酢酸エチル５００ μＬを加えてよく懸濁後、遠心して上清の酢酸エチル層を４５０ μＬ回収し、濃縮した。濃縮物にｍｉｌｌｉＱ水２００ μＬを加え、よく懸濁後に遠心し、上清２００ μＬをλｅｘ３８０ ｍｍ／λｅｍ４６０ ｍｍで検出した（抽出後）。結果は、図２に示される通りであった。図２においては、４つの糞便試料の検出結果は、それぞれ「糞便あり＿１」～「糞便あり＿４」に分けて図示された。
図２に示されるように、糞便と接触させることによりプローブの蛍光が回復することが示された。これは、糞便中にＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素が存在し、この酵素によりプローブが切断され、蛍光性のＡＭＣが生成したことを意味するものである。このことから、上記のように設計したプローブの蛍光強度を指標として、糞便試料中にコリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する大腸菌の存在を検出することができることが明らかとなった。図２の結果は、未抽出の糞便試料においても同様であった。このことから、糞便試料の分析においては、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素の抽出は、してもしなくてもよいことが分かった。実施例１で作製したプローブ２でも同様の結果であった。
糞便試料は、大腸菌の増殖に適した条件下で培養し、その後分析してもよい。本実施例によれば、培養によりコリバクチン産生大腸菌の量が増えるため、コリバクチンやコリバクチン産生菌の検出感度が向上した。
実施例４：培養した大腸菌を用いたアッセイ
本実施例では、コリバクチンを産生する大腸菌と産生しない大腸菌から、上記プローブがコリバクチンを産生する大腸菌のみを判定することができるかを検討した。
コリバクチンを産生しない大腸菌としては、１２４６株および１６４９Ｔ株を用い、コリバクチンを産生する大腸菌としては、５２６３株、５４９１株およびＮｉｓｓｌｅ株を用いた。
一晩培養した大腸菌をＬＢ培地（２～４ ｍＬ）に２０ μＬ播種し、さらにプローブ１の２０ ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を終濃度が２０ μＭになるように加えた（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７ ℃， １００ ｒｐｍで２４時間以上振盪した。反応後、反応液２００ μＬを取り、遠心した上清２００ μＬをそのままλｅｘ ３８０ ｍｍ／λｅｍ ４６０ ｍｍで検出した（未抽出）。またさらに反応液２００ μＬを取り、酢酸エチル５００ μＬを加えてよく懸濁後、遠心して上清の酢酸エチル層を４５０ μＬ回収し、濃縮した。濃縮物にｍｉｌｌｉＱ水２００ μＬを加え、よく懸濁後に遠心し、上清２００ μＬをλｅｘ ３８０ ｍｍ／λｅｍ ４６０ ｍｍで検出した（抽出後）。結果は図３に示される通りであった。
図３に示されるように、上記検出系を用いることにより、特に抽出後の試料において、プローブの蛍光強度を指標として、コリバクチンを産生する大腸菌を検出することができることが明らかとなった。実施例１で作製したプローブ２でも同様の結果であった。
実施例５：大腸組織検体から分離された大腸菌からのコリバクチン陽性菌の検出
本実施例では、ＰＣＲ法によりコリバクチン生合成遺伝子が検出された大腸組織検体（ｎ＝１００）およびコリバクチン生合成遺伝子が検出されなかった大腸組織検体（ｎ＝１００）から分離した大腸菌に対してプローブＩを適用することでコリバクチン陽性菌の検出を試みた。
大腸菌は、ヒト大腸組織検体を生理食塩水中でホモジナイズし、これをマッコンキー平板培地上に塗布し、培養することにより分離した。コリバクチン産生系を有する大腸菌が試料中に存在するか否かを確認するため、ＰＣＲによりコリバクチン生合成遺伝子クラスターの遺伝子のうち、clbBを下記プライマーを用いて増幅し、増幅断片の有無を指標としてコリバクチン陽性菌か否かを評価した。
clbBフォワードプライマー tgttccgttttgtgtggtttcagcg
clbBリバースプライマー gtgcgctgaccattgaagatttccg
プローブＩによるコリバクチン陽性菌の検出感度および精度を評価するため、上記ＰＣＲ法によってコリバクチン陽性菌が検出された大腸組織検体とコリバクチン陽性菌が検出されなかった大腸組織検体から上記の通り分離された大腸菌をそれぞれ１００検体ずつ用意した。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＭプローブを含むＬＢ液体培地１００μＬ（アッセイＡ）、ならびにプローブを含まないＬＢ液体培地１００μＬ（アッセイＢ）を分注した。平板培地上の一つの大腸菌株コロニーのごく微小量（爪楊枝の先に付着する程度）を、アッセイＡとアッセイＢのそれぞれのウェルに加えた。プレートを３７℃にて２４時間静置培養した後に、蛍光を測定した。λｅｘ ３８０ ｍｍ／λｅｍ ４６０ ｍｍをプレートリーダーを用いて測定し、アッセイＡとアッセイＢ（バックグラウンド）との蛍光強度の差を求め、閾値を１００として、当該比が１００以上である場合に陽性とし、１００未満である場合に陰性と評価した。
結果は、図４に示される通りであった。図４では、上段にＰＣＲでコリバクチン陽性菌が検出された１００検体が表示され、下段にＰＣＲでコリバクチン陽性菌が検出されなかった１００検体が表示されている。また、縦軸は、蛍光強度（λｅｘ ３８０ ｍｍ／λｅｍ ４６０ ｍｍ）を表し、横軸は各検体を表す。図４に示されるように、プローブＩは、コリバクチン陽性菌を精度１００％で検出し、陰性菌を陽性と判定した比率（偽陽性率）は１％未満であった。なお、図４の上段および下段の最も左のバーは、ポジティブコントロールであり、その隣のバーは、ネガティブコントロールである。
この結果から、本発明のプローブは、コリバクチン陽性菌の検出において有用であることが確認された。
実施例６：糞便試料を用いたコリバクチン陽性菌の検出
本実施例では、糞便試料を水に溶解後、培養して得られた培養物に対してプローブＩを適用し、コリバクチン陽性菌を検出できることを確認した。
ヒトから得られた糞便試料を水に溶解し、マッコンキー培地を含むプレートへと塗布して３７℃で１２時間培養した。得られた赤紫色のコロニーについて、100μＭのプローブＩを含むＬＢ液体培地に植菌し、２４時間培養して、プレートリーダーで蛍光（λｅｘ ３８０ ｍｍ／λｅｍ ４６０ ｍｍ）を測定した。これらの試料それぞれについて、実施例５と同様にコリバクチン陽性菌の有無をＰＣＲ法で検出し、プローブＩによる蛍光強度との相関を調べた。結果は、図５に示される通りであった。
図５に示されるように、プローブＩは、糞便試料中に存在するコリバクチン陽性菌を高感度および高精度に検出することができた。
実施例７：凍結状態で保存されたがん患者組織におけるコリバクチン陽性菌の検出
本実施例では、凍結状態で保存されていた大腸がん組織およびその周辺組織を含む組織について、ＰＣＲ法によってコリバクチン生合成遺伝子を調べた。その後、組織のホモジェナイズ液を培養し、得られた培養物に含まれるミリストイル－Ｄ－アスパラギンを定量した。
その結果、全１４名の被験者由来サンプル中、がん組織において８検体（５７．１％）、正常組織において１検体（７．１％）でコリバクチン生合成遺伝子が検出された（図６参照）。また、上記の組織由来のホモジナイズ液をマッコンキー寒天培地へと塗布し、そこから得られる可培養性バクテリアを獲得した。コロニーＰＣＲ法にて、得られたコロニー中のコリバクチン生合成遺伝子の有無を確認したところ、がん組織由来の全コロニー２２０個のうちの３６個がコリバクチン生合成遺伝子陽性であった（１６．４％）（図６参照）。一方で、正常組織由来１０３個のコロニーのうち、１つのコロニーのみがコリバクチン生合成遺伝子陽性であった（０．９％）。
以上のことから、大腸がん組織には、多くのコリバクチン生産菌が集積していることが示唆された。獲得されたコリバクチン生合成遺伝子陽性株計３７株については、試験管内での培養を行い、ミリストイル－Ｄ－アスパラギンの定量を通じて、コリバクチン生産能を評価した。結果は図７に示される通りであった。図７に示されるように、全３７株の菌株のうち、検出限界以下であったH13-3310T-16以外の３６株においてミリストイル－Ｄ－アスパラギンの生産が確認された。その生産量には菌株間で明確な差があり、生産量が多い株は少ない株に比べて１０，０００倍程度高い生産性を示した。
本発明は、以下の実施形態を包含する。
［１］以下に示される、化合物または蛍光プローブ：
（Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｆ）上記（Ａ）～（Ｅ）において、前記カルボキシル基と前記アミノ基とがアラニン（－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＯ－）で連結された化合物（それぞれアラニンとアミド結合を形成する）または蛍光プローブ；
（Ｇ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と水酸基がフリーになることで蛍光性となる蛍光基であるｏＦｌｕの水酸基とが、自己開裂性リンカーを介して連結した化合物であって、自己開裂性リンカーは、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合で連結しており、当該アミド結合が加水分解されると、分解してｏＦｌｕの水酸基をフリーにする、化合物または蛍光プローブ；および
（Ｈ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合により連結した蛍光色素を有する化合物であって、アミド結合がＣｌｂＰ依存的に開裂すると、その後、蛍光を発する、化合物または蛍光プローブ
からなる群から選択される、化合物または蛍光プローブ。
［２］［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
である、化合物または蛍光プローブ。
［３］［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
である、化合物または蛍光プローブ。
［４］［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
である、化合物または蛍光プローブ。
［５］［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
である、化合物または蛍光プローブ。
［６］［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
である、化合物または蛍光プローブ。
［７］［１］～［６］のいずれか一項に記載の化合物または蛍光プローブを含む、試料中のコリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出することに用いるための組成物。
［８］試料が生体から取り出した組織検体または糞便試料である、［７］に記載の組成物。
［９］生体から取り出した組織検体または糞便試料が、ヒトの組織検体または糞便試料である、［８］に記載の組成物。
［１０］試料中のコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を検出する方法であって、試料中にふくまれるミリストイルアスパラギンの有無を検出することを含む、方法。
［１１］試料が、生体から取り出した組織検体または糞便試料である、［１０］に記載の方法。
［１２］試料がヒト由来である、［１０］または［１１］に記載の方法。

Claims (4)

  1. 下記式Ｉ～ＩＩＩのいずれかで表される、化合物または蛍光プローブ：
    Figure 0007219473000027
     …（Ｉ）
    ［式中、R 1 は、－CR 2 R 3 R 4 、－CH 2 OH又は-CNであって、R 2 、R 3 及びR 4 はそれぞれ独立して、水素又はハロゲンである］；
    Figure 0007219473000028
     …（ＩＩ）
    ［式中、R 5 は、－CR 6 R 7 R 8 、－CH 2 OH又は-CNであって、R 6 、R 7 及びR 8 はそれぞれ独立して、水素又はハロゲンである］；
    Figure 0007219473000029
     …（ＩＩＩ）
    ［式中、R 9 は、－CR 10 R 11 R 12 、－CH 2 OH又は-CNであって、R 10 、R 11 及びR 12 はそれぞれ独立して、水素又はハロゲンである］。
  2. 請求項１に記載の化合物または蛍光プローブを含む、試料中のコリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出することに用いるための組成物。
  3. 試料が生体から取り出した組織検体または糞便試料である、請求項２に記載の組成物。
  4. 生体から取り出した組織検体または糞便試料が、ヒトの組織検体または糞便試料である、請求項３に記載の組成物。
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