JP2013528386A - インビトロ診断、および、インビボ画像化、診断、ならびに、治療のための細菌β−ラクタマーゼの使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図18
Description
この国際出願は、2010年6月4日に出願された係属中の米国一部継続特許出願12/802,340号の合衆国法典第35巻の第120条の下で優先権の利益を主張し、該文献は、2009年8月6日に出願された係属中の米国非仮特許出願12/462,644号の合衆国法典第35巻の第120条の下で優先権の利益を主張し、該文献は、2008年12月24日に出願され、放棄された米国特許出願61/203,605号と、2008年8月6日に出願され、放棄された米国仮特許出願61/188,112号の合衆国法典第35巻の第119条(e)の下で優先権の利益を主張し、これらのすべての内容はそのまま引用されることによって本明細書に組み込まれる。
多くの細菌感染は、世界中でかなりの罹患率および死亡率を引き起こし、最も重要な細菌種の多くはβ−ラクタマーゼ陽性であり、標準的なペニシリン様抗生物質に対する耐性をつけている。これらの多くの感染症とペニシリン耐性の存在を診断することは、困難なことがしばしばあり、易罹患性の決定に先立って、診断施設での大規模な培養を必要とする。
<培養中のヒト型結核菌中のBlaの検出>
潜在的な蛍光基質化合物および既知の化合物は、ニトロセフィン(Calbiochem社)、CENTA Bla基質(Calbiochem社)、Fluorocillin Green(Molecular Probes社)、CCF2−AM(Invitrogen社)、およびCCF4−AM(Invitrogen社)を含んでおり、初期の対数的増殖期に成長した全体の細胞および全体の細胞溶解産物を使用してMtb内のBlaの検出のために比較される。顕著なシグナルを結果として生じる細菌の最小の数又は溶解産物の量を測定するために、希釈がこれらのサンプルのすべてにアッセイされる。タイタ(titre)は、完全な細胞によるアッセイの前後並びに溶解産物の溶解の前に、使用される実際のCFUの数を測定するために実行される。敏感性と再現性の両方は、15−120分から細菌培養媒体中37°Cで培養されたプレートを96−ウェルを使用して、分光光度法で4つ一組に対して評価される。最初に、化合物は、製造業者によって推奨された濃度で、かつCNIR5、2nMに対して使用される(すなわち、インビボの撮像に使用される)。最も敏感で最も再生可能な化合物の異なる濃度が、最大のシグナルに必要とされる最小の濃度を測定するために、培地において評価される。これらの実験のための対照群は、陽性対照マイコバクテリウムスメグマチスおよび市場で入手し得るBla(Sigma社)を含み、陰性対照群は、Bla(1)を欠く結核菌blaC突然変異体(ロチェスター大学のM.Pavelka博士によって提供される、PM638)である。BCGによるBlaの生成も評価される。なぜなら、いくつかの症例において、BCGがBL2におけるIVIに対して使用され、そこで広範囲の撮像装置が容易に利用可能であるからである。
2つの多コピー型ベクターと2つの単コピー型ベクターがMtbにおけるBlaの発現のために使用される。当該多コピー型ベクターは、中程度レベルに遺伝子を発現することが示されたpMV262からhsp60プロモータ(Phsp60)を運ぶpJDC89に基づく。このベクターは、またヒグロマイシン耐性、Phsp60のポリリンカー・下流、複製の大腸菌オリジンおよび複製の抗酸菌性pAL5000オリジンを運ぶ。このベクターから発現を増加させるために、Phsp60はL5プロモータ(PL5)と置換される。当該L5プロモーター(PL5)はPhsp60より50〜100倍の高位レベルに遺伝子を発現する。両方のプロモーターは比較的構成的であり、ほとんどのインビボの疾病下に発現される。もし他の方法に言及されなければ、大抵のクローニングは、In−Fusion2.0PCRクローニングシステム(Clontech社)を使用して行われ、当該In−Fusion2.0PCRクローニングシステム(Clontech社)は、関心のある領域のPCRのために使用されるプライマー上での15bp最小相同領域(homology)を使用して任意の線形化された構造への断片の直接のクローニングを可能にする。
励起と発光のスペクトルは1μMの濃度におけるPBS溶液1mLに集められる。この溶液に、精製されたBlaの10nMが加えられ、変化がそれ以上存在しないようになるまで、励起と発光のスペクトルが再び集められる。Blaの加水分解後のプローブの蛍光シグナルの増加は、ピーク放射波長である690nmにおける発光強度を比較することにより推測される。
〜690nmでの蛍光強度の上昇率(v)は、探査(probe)の加水分解の速度の基準として使用される。速度(v)は、Mtb Blaの1nMの濃度の異なる濃度5、10、20、50、80μMにおいて測定される。基質(1/v)に対して基質濃度(1/[プローブ])の加水分解速度の二重逆数プロットは、Bla加水分解のためのプローブのKcatの値およびKmの値を推測するために使用される。
また生理学的条件の下での基質の自発的な加水分解の速度は、蛍光強度の上昇率から〜690nmと推定することができる。水溶性のバッファーおよび血清中の基質の安定性は、それゆえ、室温における1時間の培養後の蛍光定量化によって容易に評価することができる。
基質は、形質移入されたBla(cmv−bla)、野生型ジャーカット、C6神経膠腫細胞系、および公開された撮像条件(3)を使用して、蛍光顕微鏡による撮像によって検査される。
野生型細胞およびcmv−blaジャーカット細胞は、5x105/mLの細胞密度における種々の比率(cmv−bla細胞の10%、20%、40%、60%および80%)で混合される。30分間の細胞の各々の混合物での基質の5μMの培養の後、各サンプルは、冷たいPBSで洗浄され、遠心分離機にかけられ、溶解される。蛍光測定は最終的な上澄みの上で得られる。BlaのmRNAおよび酵素のレベルはノーザン解析を使用して定量化される。mRNAの濃度対Cy5.5蛍光強度のプロットは、2つの間にリニアな関係があるか否かを明らかにする。
Blaの転写は、0.05のO.D.において植え付けられたMtb成長曲線の全体にわたってqRT−PCRによって検査され、安定期(O.D.=2)まで成長させた。転写レベルは同じ培養の部分標本からRNAを毎日分離することにより評価され、培養はすべて3回繰り返して成長させる。以前に記載されたように、RNA単離(4)およびqRT−PCRが、SYBRグリーン(5)を用いて実行される。RNAレベルは、成長曲線で1または2のキーポイントにおいてノーザン法によって確認される。また、測定はすべて16SrRNAに対して正規化される。データは、全細菌および全細胞溶解産物を使用して、同一の条件下で、ニトロセフィンによりBla活性の測定と比較される。blaCを誘発するβ−・ラクタムの能力が検査される。RNA転写物は、成長曲線全体に亘るのと同じ方法で、β−・ラクタムがある状態およびない状態で分析される。Bla陰性Mtbを死滅させる、カルベニシリンの50、250および500μg/mlが、Mtbと共に培養される。当該Mtbは、2時間の間は初期の対数増殖期まで成長し、blaC転写のレベルは、全体細胞および全体細胞溶解産物のBla活性と共に測定される。Blaのレベルは、市場で入手可能なBla(シグマ社)を使用して構築される標準曲線を使用して定量化され、同じ方法で成長させたMtb blaC突然変異体は、Bla活性のための陰性対照として含まれる。
基本的に、J774A.1細胞は、96−ウェルの平坦な底部プレートに1×104で播種され、37°Cで一晩培養される。初期の対数増殖期に成長させたMtbの単一細胞の懸濁液単個細胞浮遊液が、1つの細胞当たり1000から0.001の種々の細菌感染多重度で加えられ、30分間37°Cで培養される。ついで、ウェルはPBSにより2度洗浄され、200μg/mlのアミカシンと共に未使用の媒体が加えられ、37°Cで2時間培養され、細胞外の細菌を死滅させる。その後、ウェルはPBSにより洗浄され、分光測定法によるシグナルの測定前に、60〜180分間、種々の濃度の試験化合物を加えた未使用の培地で培養される。複製のウェルは、得られた測定における宿主細胞透過性の役割を評価するために、化合物を加える前に0.1%のトリトンX−100によって溶解される。
麻酔をかけられたマウス(各々の時点において3匹のマウス)は、注射後の異なる時間間隔(30分、240分、12時間、24時間、48時間および72時間)において頸椎脱臼によって殺される。血液サンプルは、心臓の穿刺によって集められ、組織(腫瘍、心臓、腎臓、肝臓、膀胱、胃、脳、膵臓、小腸および大腸、肺及脾臓)は、蛍光測定器によって近赤外線蛍光を測定するために急速に採取される。データは、組織のグラム当りの蛍光単位(FU)として発現される[FU/(g組織)]。
異種移植された腫瘍中のBlaの酵素レベルは、以下のプロトコルを使用して測定される:すなわち、冷たいPBSと採取された腫瘍を2度洗浄する;プロメガ(4mL/g組織)から溶解バッファーを加えて、組織溶液を均質化する;ホモジネートを3回凍らせて溶かし、遠心分離によって上澄みを集める;蛍光発生基質CC1を使用して、Bla活性をアッセイする。cmv−bla腫瘍中のBlaのmRNAは、Qiagen Inc.からRNA抽出プロトコルに従い、RT−PCRアッセイを実行することにより確認される。これらの測定は、cmv−bla導入された腫瘍中に観察された近赤外線シグナルがBla活性と関連しているか否かを確認する。
インビボで発現したBla RNAは、結核(6)用の標準のRNA抽出プロトコルを使用し、構成的な対照rRNA遺伝子に対するqRT−PCRを実行して抽出される。これらの測定は、観察されたIVIシグナルのレベルと比較して、すべての組織中のBlaの発現のレベルを評価する手段を提供する。採取されたRNAレベルがRT−PCRによって検知可能なレベル未満ならば、まだ量れるCFU、組織の中に存在する相補的DNAは、高い忠実性で線形的な方法でDNAを増幅する能力を有し、テンプレートポスト増幅のレベルの正確な定量化を可能にするphi29ポリメラーゼ(Fidelity Systems社)を使用してRT−PCRに先立って増幅される。
4匹のBalb/cマウスの8つの群は、100−1000cfu/lungのエアロゾルによって感染される。細菌菌株は−80°Cストックから溶かされ、単一の細胞懸濁液を生成するために27G注射器針2xを通過させ、エアロゾル感染のために使用される。エアロゾル感染は、肺胞腔(7−10)に飛沫核を直接送達することを設計しているウィスコンシン大学に構築された「Madison」チャンバーを使用して実行される。Mtbによる感染は、有毒な結核菌株を処理するように設計された認証されたBSL3の設備で行なわれる。感染したマウスは、検死までセンター・フォア・コンパラティブ・メディシンーのABSL3抑制に収容される。CFU、肺および脾臓内でのblaCおよびBla活性のためのRNAレベルを測定するために、各々の菌株(blaCとWT)につき4匹のマウスの1つの群は、あらゆる時点(1、14、28および72日)に検死される。本明細書に記載されているように、ニトロセフィンを使用して、RNA転写物レベルおよびBla活性を測定する。
<細胞移植モデルを用いるイントラバイタル顕微鏡撮像法>
ユニバーサル・ドナーTr、CD8+T細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞が、BCGに感染した同一遺伝子型のマウスに移植され、これらの細胞の分布が、インビボの生物発光撮像(BLI)および画像誘導イントラバイタル顕微鏡法(IVM)により経時的に撮像される。ルシフェラーゼがβ−・アクチン・プロモーターによって生成される、一連の遺伝子導入(transgenic)マウスが組織と細胞のソースを提供し、当該組織と細胞のソースは遺伝子導入をしない(non−transgenic)動物(11−12)において発光する。この一連のマウス(L2G85)は、ホタル・ルシフェラーゼ(Fluc)から、明るい生物発光を示すが、GFP蛍光が弱いので、リンパ球に強いGFP発現と蛍光とを示す別々の線を伴う。ユニバーサル・ドナー幹細胞および他の細胞の空間分布は、それらが膨張し、再度分散し、或いは取り除かれると、レシピエント中のBLIが追随し、検出された細胞は、GFPを利用するIVMによって続いて視覚化され得る。
移植モデルを使用して、最も良く肉芽腫形成の視覚化を可能にする、2つの移植された細胞型が、生きているマウスで細菌と宿主細胞の両方を一緒に視覚化すべく使用するために選択される。病変が丁度視認できるようになり、充分に形成され、最も遅い時点で移植された細胞からシグナルが観察され得る、3つの時点が選択される。合計32匹のFVB/NJマウスが、食塩20μl中のIVIレポーター(例えば、tdTomato)を発現する104CFUのBCGにより鼻腔内に感染する。4匹の対照マウスの追加の群は感染していない。4匹のマウスが、肺の感染後における初期CFUを測定するために、24時間目に殺される。14日目に、感染後の4匹の追加の実験マウスは組織病理学のために殺され、肺と脾臓中のCFUを測定する。また14日目に、残りの24匹のマウスは、4つの群に分けられ、かつL2G85細胞を有しており、これが対照として細胞を有していない12匹のマウスと共に12匹のマウスへの尾静脈注射によって導入された肉芽腫形成の視覚化を可能にする。3つの時点で、4匹のマウスの2つの群(細胞を有するもの、対、細胞を有していないもの)は、D−ルシフェリンの存在下で記載されているように撮像される(12)。
収集された画像は、Xenogen Inc.から、市場で入手可能なソフトウェアである、Living Imagesを使用して、PCコンピュータ上で処理される。関心領域(ROI)は、全身の蛍光画像上の腫瘍に描かれる。IVIS画像システムの重要な特徴の1つは、National Institute of Standards and Tecnnology(NIST)に由来するスペクトル放射ソースに対抗してそれが較正されるということである。この較正は、光学および開口(f/stop)を介する損失を考慮し、撮像時間およびビニングの原因となることで、CCDカメラのカウントの被験体表面上の放射への変換を提供する。ゆえに、結果として生じる画像は、表面の放射(光子/秒/cm2/sr)の物理ユニットにおいて示される。感染したマウス、対照マウスおよび正常な組織からのROI(光子/秒の単位で)から統合シグナルは、異なるマウス(感染したマウス:対照マウス:正常組織比率)を介して比較される。統計分析は、GraphPad Prism 3.0(P<0.05、GraphPad Software、カリフォルニア州、サンディエゴ)を使用して実行される。
<結核菌BlaCおよびBlaC突然変異体酵素の結晶化>
BlaCの非常に良い結晶が、結晶化の数か月の後に得られた。ペニシリンとの共結晶化は、0.1Mのトリス−HCl、pH 8.0、20.MのNH4H2PO4の結晶化条件を使用して生成された。これらの結晶は、完全なタンパク質活性部位と中間体の視覚化を可能にしたが、初期の結合基質は結晶自体中のターンオーバーにより目に見えなかった。この障害を克服するために、Mtb BlaC突然変異体酵素は加水分解(E166A)に関係するGlu残留物中の突然変異により構築され、当該加水分解は、酵素上のアシル−中間体のトラッピングと、触媒に必要な特異的な相互作用を可能にする。この突然変異体は、ここで、Mtb BlaC突然変異体の、基質(図1A)に浸漬される準備がされた高品質結晶をもたらす急速(すなわち、約2週間)結晶化プロセスで結晶化された。基質は、一晩直接浸漬によってMtb BlaC突然変異体結晶中に取り込まれ得ることが証明される。未使用の溶液に除去後、図1BにおいてCNIR4のために示されるように、結晶は基質を保持する。直接の浸漬は、複数の基質のより速い分析を提供する。結晶化したBlaC突然変異体酵素は、鉛化合物セフォタキシム(図1C)の加水分解された中間体の構造の第1の識別を可能にした。これは、基質化合物の設計を改善するためにBlaC触媒の機序を解明するために役立つ。
<β−ラクタマーゼ検出のための蛍光発生基質:CC1、CC2、CHPQ及びCR2>
蛍光発生化合物CC1、CC2、CHPQ及びCR2は、インビトロ及び単一の培養細胞でのBla活性を検出するのに効果的である。これらプローブは、Blaによる加水分解の前は蛍光性でなく、Bla反応の後に蛍光性になる(図2A−2C)。蛍光放射の範囲は、Blaを検出するのに必要とされるように選択され得る:青であるCC1及びCC2から、緑であるCHPQ、赤であるCR2までの範囲内。これら新しい蛍光発生基質は、CCF2より小さく、作るのが容易であり、使用しやすく、Bla活性の検出に関して高感度であり、多様な生体サンプルにおけるBla活性の検出を促進する。
全身の蛍光画像化により生きている動物におけるBla発現を画像化するため、赤外線/近赤外線が、より優れた組織浸透及び可視光より少ない光散乱を有し、且つヘモグロビン(13)によってあまり吸収されないため、近赤外線/赤外線の蛍光発生基質は有益である。化合物CNIR1、CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR9、及びCNIR10は、培養細胞のBla発現を画像化するための、一連の近赤外線蛍光発生基質である(図3、6A−6B)。これら化合物は、Blaに関する細胞透過性の近赤外線蛍光発生基質を構築するための枠組みとして役立ち、細胞内又は動物内において、細菌に対するプローブの利用可能性(availability)に対する負荷の効果を検査するために使用することができる。
CNIR4に対するCNIR1は、すべてCy5に基づく。インビボでの動物画像化に関して、Cy5.5は、そのより長い発光波長のため、より好ましい。したがって、Cy5は、Cy5.5により置換され、CNIR5が合成された(図4A)。最終生産物は、HPLCによって精製され、質量分析計によって特徴付けられた(C122H123N11O39S10に関して計算された質量:2687.98;MALDI−MSで観察された(observed)[M+H]+:2687.68)。CNIR5自体は、励起されたときに690nmの弱い蛍光を発するが、Blaの処置に際して、強度は9倍以上増加する(図4D)。Blaによるその加水分解動態は、pH7.1のリン酸緩衝食塩水(PBS)において測定された:触媒定数kcat=0.62±0.2s−1、及びミカエリス定数Km=4.6±1.2μM(値は、加水分解率対基質濃度の二重逆数プロットの加重最小自乗近似から得られた)。その触媒の効果(kcat/km)は、1.36x105 M−1s−1であった。CNIR5は、1.75x10−7 s−1の自発性の加水分解率によりPBSにおいて、同様にマウス血清において非常に安定していた。すなわち、蛍光増加は、12時間のインキュベーションの後でさえ、ほとんど観察されなかった。また、CNIR5は、QSY22によりQSY21を置換することにより合成され得る(図4B)。この合成は、CNIR5のものに非常に類似しており、問題ではない。QSY22の合成は以下に考察される。CNIR6は、ペルアセチル化したD−グルコサミンの無いCNIR5のアナログであり、対照として役立つ。
CNIR7は、Blaのインビボでの画像化に対するその感受性を改善する、CNIR5の変形である。CNIR5において使用される消光基QSY21ジスルフォナートは、675nmの最大吸収を有するが、Cy5.5は、690nmにて最大に発光する。それ故、CNIR5のように、クエンチング効果はちょうど90%であり、それは観察された背景蛍光に大きく寄与する。QSY21及びCy5(CNIR1)のFRETペア(FRET pair)において、QSY21とCy5の間のより良いスペクトルの重複のため、消光効果は98%以上であった。したがって、690nmにて吸収できる消光基は、Cy5.5をより良く消光し、バックグラウンドシグナルを減少させる。QSY21に関して、インドリンがテトラヒドロキノリンによって置換されたとき、吸収極大が14nmずつ赤色移動(red−shifts)することが報告された。
図5Dで合成された消光剤QSY22は、図7Aで示される合成の模式図において描かれるように、ラクタム環に付けられてCNIR9を生成する。CNIR9は、開裂の際に非常に高い蛍光を示すが、Blaによる開裂が無い場合は非常に低い蛍光を示す。類似の化合物、CNIR10は、図7Bで示される合成の模式図で描かれるように、より短い架橋基とより少数の硫酸塩により合成された。
CNIR800は、REF画像化の感受性を改善するために、800nmのより長い波長にて蛍光を発する、新しい蛍光色素分子、IRDye800により設計された。大半の組織において、組織自己蛍光が700nm未満の波長にあるため、CNIR800のより長い波長は、CNIR5のCy5.5蛍光団よりも良く組織に浸透し、自己蛍光によりバックグラウンドを減少させる。CNIR800は、BlaCによる開裂の後に、非常に低いバックグラウンド蛍光と大きな差異(25倍)を示す。CNIR800.2(図11C)は、実施例5に記載の代替方法によって合成された異なるリンカーを備えたCNIR800プローブであり、CNIR800−3(図11D)は、ラクタム環上のR2位置に対するメトキシの置換を有するCNIR800誘導体である。加えて、CNIR800誘導体は、R2位置に対するメチル置換又はR1位置上の7−アミンに付けられたベンジル基を含み得る。
Mtb BlaCがTEM−1 Blaより大きな活性部位を有するため、ラクタム環の上のより大きな置換基が、TEM−1 Bla上のMtb BlaCのための蛍光基質の特異性を改善するのを支援し得ることを述べておく。ラクタム環のアミンに対する置換基の効果は、最初に評価された。合成を単純化し、スクリーニングプロセスを速めるため、蛍光基質は、蛍光団として7−ヒドロキシクマリンを発光する、アミンにより置換されたラクタム環を含む。TEM−1 Bla又はMtb BlaCの処置に際して、7−ヒドロキシクマリンが発光され、蛍光シグナルが発生する。それ故、蛍光色素分子の発光の際に基質の蛍光強度を単に監視することにより、TEM−1 Bla及びMtb BlaCの加水分解動態を得ることができる(表1)。
XHX2−81、XHX2−91、XHX3−1、XHX3−2、XHX3−26、及びXHX3−32は、TEM−1の上のミコバクテリウムのBlaCのための選択性を示す、CNIR800基質の誘導体又はアナログである(図9A−9E)。化合物XHX3−32は、構造においてCDC−5に類似し、100未満の細菌の検出の閾値を実証し、10の細菌と同じくらい低い(図9F)。XHX3−1は、マウス中のMtbのより急速な組織分布及びより敏感な検出を付与するCNIR800を合成するために使用される、ラクタム骨格に付けられるIRDye800蛍光色素分子及びIRDyeQC−1消光剤を含む。しかしながら、これは、検出用のCy5.5に基づいた蛍光色素分子システムを使用して排除しない。XHX3−2は、フェノール基の放出動態を増加させるために、改善された脱離基及び二重結合の取り込みを有している。二重結合の配置は、より大きなアリル基ため、以前のcis配置の代わりに、transである。
Bla(Bluco)のためケージに入れられた基質の構造(図10A)は、D−ルシフェリン、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)の基質、及びβ−ラクタム、Blaの基質を含む。D−ルシフェリンのフェノール基は、Flucによるその酸化に対して重大な意味を持つ。このフェノール基が、エーテル結合を介してセファロスポリンの3’位置に直接連結されるとき、結果として生じる共役は、Flucに関して乏しい基質になるが、Blaに関する基質のまま残る。Blaによるβ−ラクタム環の開口は、自発性の断片化を誘発し、3’位置にエーテル結合の開裂を引き起こし、及び光線を発生する反応においてFlucにより酸化され得る遊離D−ルシフェリンを発光する。共役の安定性を改善するために、セファロスポリン上のスルフィドは、酸化されてスルホキシドになり、最終の構造Blucoをもたらした。Blucoの調製は、複数の工程の有機合成によって達成される(図10B)。Blucoの大きさがCNIR系列プローブ(CNIR series probe)よりはるかに小さいため、それは、結核菌の細胞膜により良く浸透し得る。7つのアミノの位置で同定された置換は、TBにおけるBlaのSREL画像化のためTBに特異的なケージに入れられた発光基質を設計するために、単に本明細書において利用され得る。Blucoはまた、二重結合(Bluco2)の挿入によって、及びカルバマート連鎖(Bluco3)の使用により、改善されたKcatを有するために合成され得る。
<CNIR蛍光発生基質の代替の合成>
代替の合成の模式図において、CNIRプローブは、ユニットに基づいた手法を利用して合成することができる(図11A)。ユニット1及びユニット2は、以前の化学作用を大量に使用して調製することができる。塩基に触媒された共役を使用する代わりに、軽度の化学連結は、ラクタムユニット2に導入された、遊離したシステインとチオールエステルの間で実施される。この条件下では、異性化は期待されない。生成物3は、大量に高純度において分離することができる。3の上の遊離アミノ基は、Cy5.5とNIR800などのNIR色素に容易に結合される。標準のNHSエステルに媒介された結合によって、チオール基は、消光剤上のマレイミド基を介して結合される。両方の共役が直交性であるため、それらは、ワンポット合成で実行され得、最終生産物はHPLCによって精製される。異性化の主な源である、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)などの有機塩基の使用が排除された。加えて、脱保護化学は、消光剤QC−1がトリフルオロ酢酸を媒介とした脱保護条件における分解によって観察されてから収量を改善する、消光剤が導入された後に必要とされない。重要なことに、単に1つの最終のHPLC精製が必要とされる。
<CNIR4、CNIR5、CNIR9、及びCNIR10のためのFRET並びに蛍光取り込み動態(fluorescence incorporation kinetics)>
<インビトロのFRET:CNIR5による大腸菌及び結核菌におけるBla活性の検出>
CNIR5は、生細菌のBla活性を検出するその能力のために検出された(detested)。大腸菌はアンピシリン抵抗性のプラスミドにより形質転換され、30℃で一晩成長させた。細胞を集め、500nM CNIR5の追加の前にLB媒体により2回洗浄した。蛍光スペクトルは、間隔を置いて得られ(Ex:640nm)、データは図12Aで示された。測定(t=160min)の終わりに、精製されたBlaの溶液は、CNIR5の完全加水分解を確認するために加えられた。結果は、CNIR5が大腸菌のBlaを検出することができることを示す。比較すると、Invitrogen Inc.からの蛍光発生基質CCF2/AMが同じ条件下で使用された時、LB媒体中の生きた大腸菌中のBlaは検出されなかった。図12Bは、CNIR 5が、細菌の数の存在と蛍光のシグナルの間の優れた相関性により、100−1000Mtbの間の細菌を検知し得ることを実証する。
図13A−13Dは、10分間のBlaによる開裂の前後での、プローブCNIR4、CNIR5、CNIR9及びCNIR10の各々に関する、FRET発光スペクトルである。4つのすべてのプローブは、β−ラクタマーゼ開裂、及び開裂後の8.5倍(660nm、CNIR4)、24倍(690nm、CNIR5)、9.5倍(690nm、CNIR9)及び10倍(690nm、CNIR10)までの最大の発光の増加の前に、わずかな蛍光を示す。図13E−13Hに描かれるように、Mtbによるこれらプローブの各々の共インキュベーションが、18時間の共培養後のCNIR4に関して2倍、CNIR5に関して3倍、CNIR9に関して1.5倍、及びCNIR10に関して2倍の蛍光の増加により、細菌の直接の標識化をもたらす。
表2は、基質としてCNIR4とCNIR5を有する、大腸菌TEM−1と結核菌Bla−C β−ラクタマーゼ酵素の動態を比較する(図14A−14B)。
蛍光の共焦点の顕微鏡法は、CNIR4が、結核菌により感染したマクロファージへと細胞内に取り込まれることを実証する(図17)。DAPI染色(青)は、感染細胞の核を示し、緑の蛍光は、GFP標識化結核菌からのものであり、赤い蛍光は、開列されたCNIR4からのものである。CNIR4からの蛍光は、感染細胞内に蓄積するが、非感染細胞は蛍光を示さないことに注意する。
マウスは、様々な濃度の結核菌に皮内に感染する。下部の左の四分円は108の細菌を受け、上部の左の四分円は107の細菌を受け、上部の右の四分円は106の細菌を受けた。蛍光は、CNIR4、CNIR5、CNIR9及びCNIR10プローブの各々の存在下で測定される(図18A−18E)。CNIR5は、最も大きな蛍光シグナルのシグナルを示し、接種物の濃度がCNIR10とCNIR9の後に増加するにつれて、その中で増加した。CNIR4は、蛍光の増加を実証しなかった。また、CNIR4、CNIR5、CNIR9及びCNIR10プローブからの蛍光は、野生型の結核菌に、又はエアロゾル接種によって肺のblaC遺伝子における突然変異を有する結核菌に感染したマウスにおいて測定される(図19A−19D)。CNIR10は、CNIR9、CNIR5及びCNIR4の後に最も高い合計の蛍光を示した(図19E)。
<CNIR5によるインビボでの画像化:マウス腫瘍モデル中のCNIR5>
約1x106のC6ラット神経膠腫細胞は、ヌードマウスの左肩に注入され、cmv−blaにより安定して形質移入された同数のC6ラット神経膠腫細胞は、同じヌードマウスの右肩に注入された。腫瘍の大きさが約6mmに達した時、7.0nmolのCNIR5が、麻酔をかけたマウスに尾静脈を介して注入された。マウスは、Cy5.5フィルターセット(励起:615−665nm;発光:695−770nm)及び異なるポスト注入時間(post injection time)での1秒の収集時間により、IVIS 200イメージャーにおいてスキャンされた。
CNIR5はBalb/cマウスへ静脈注入された。マウスのグループは、器官収集及び処理のために犠牲にされる。CNIR5の存在は、各々の器官中の蛍光強度によって経時的に評価される。図24A−24Bは、4時間と24時間後の注入での、それぞれのCNIR5シグナルを示す。安定したシグナルは、24時間にわたり、CNIR5が全身性であり、この時間にわたって著しく分解されないことを示唆する、すべての組織で観察される。
4つのBalb/cマウスの6つのグループの各々は、実施例1に記載されているような100−1000cfu/肺の間で、エアロゾルによって感染する。4つのマウスの1つのグループは、全ての時点での画像化のために使用され、各々の時点で、4つのマウスのグループは、組織病理学のため、及び肺と脾臓におけるcfuを測定するために殺し、検死される。24時間、7、14、28、及び72日目に、画像化は、Xenogen IVIS200画像化ステーション(Xenogen IVIS200 imaging station)を使用して、同じABSL3の組で実行される。4つの動物の対照グループは、細菌に感染していないものを画像化するために使用されるが、未開裂の化合物からの背景蛍光を制御するために検出試薬を注入される。動物は、明るい窮屈なチャンバにおいてイソフルオランで麻酔をかけられ、640nmの励起、及び690nmで捕捉された画像により画像化される。IVIに十分であると示された5nmolのCNIR5は、尾静脈を使用して静脈内に注入される。画像は、化合物の注入、及び1、2及び4時間後の注入の前に得られる。シグナルがこれらの時点のうちの何かにて観察される場合、動物は、シグナルの散逸に従うため、24、48及び72時間後に引き続き画像化される。
β−ラクタマーゼCNIRプローブは、100Mの結核細菌を検出することができ、あるいは実時間でのマウスのSREL画像化によってはあまり検出されない(図26A)。SREL画像化は、対照として未感染の生きたマウス(図26B)上で、又は結核菌に感染したマウス(図26C)上で実行された。カラーバーは、620nmでの励起の後の、680nmでの発光のレベルを示す。カラーは、Mtbに感染した肺から生じる強力なシグナルの存在を示し、感染の具体的な局在化を実証する。シュードモナス、スタヒロコッカス及びレジオネラのための検出の閾値も、測定され得る。
4つのモルモットの6つのグループは感染し、以下の例外を除いて、マウスに関して記載される同じ方法で画像化される。最初に、モルモットが後の時点にて著しい死亡率を示し始めると予測されるため、28日までの感染後の時点のみが試験される。次に、20倍以上(CNIR5に関して〜100nmol)の検出試薬が、マウスに必要とされるのと同じ血中濃度を達成するためにモルモットに必要とされ、化合物が外側の中足骨の静脈に投与される。モルモットは、ABSL3設備中のエアロゾルによって感染し、画像化まで封じ込めて維持される。画像化は、感染後24時間、7、14及び28日目に、IVIS200画像化ステーションを使用して、ABSL3の組で実行される。4つの動物の対照グループは、細菌に感染していないものを画像化するために使用されるが、未開裂の化合物からの背景蛍光を制御するために検出試薬を注入される。
<CNIR5による臨床サンプル中の結核の検出>
30の臨床分離株を、直接、臨床検査室から得、これらは、標準の臨床的な実験室試験によって測定されるように、およそ半分が結核に対して陽性であり、残り半分が陰性である(抗酸性の直接的に濃縮塗抹標本(concentrated smear)、抗酸性の培養およびミコール酸HPLC)。これらの臨床サンプルは主に痰(26のサンプル)であったが、4回の気管支洗浄検査を行った。痰サンプルは、誘発されないもの(24のサンプル)もあれば、誘発されたもの(2つのサンプル)もあった。陽性サンプル内に4つのマイコバクテリウムアビウムコンプレックス(MAC)のサンプルがあった。これらのサンプルの各々を、試験の特異性(>94%)および感受性(>86%)に関して比較可能な結果を得た、2つの独立した試験において盲目的な方法で試験した。
<CNIR7によるインビボ撮像:マウス組織中のCNIR7の生体内分布>
マウス組織中のCNIR7の生体内分布を、インビボ撮像前に評価する。CNIR7を、(100μLの緩衝食塩水中の10nmolの投与量で)3匹のマウスに静脈注射する。麻酔をかけたマウスを、注射後の異なる時間間隔(30分、240分、12時間、24時間、48時間、および72時間)で、頸椎脱臼によって殺す(各時点で3匹のマウス)。血液サンプルを、心臓穿刺によって集め、組織(心臓、腎臓、肝臓、膀胱、胃、脳、膵臓、小腸および大腸、肺、および脾臓)を、迅速に採取し、蛍光測定器によって近赤外線蛍光を測定する。データは、1グラムの組織あたりの蛍光ユニット(FU)[FU/(g 組織)]として表され、これらの組織器官中の加水分解したCNIR7の生成物の量を示す。
C6の膠腫の腫瘍異種移植片を、CNIR7を撮像するために、ヌードマウスにおいて使用した。1L/分の低速度で100%の酸素中の2%のイソフルランの吸入によって、マウスに麻酔をかける。外側の尾静脈に、100μLのPBSの緩衝液中の10nmolのCNIR7を注入する。3匹のマウスを、IVIS200 Optical CCDシステム(Xenogen Inc)を使用して、小動物のインビボの蛍光撮像系によって撮像する。このシステムは、生物発光と蛍光のインビボ撮像の両方に適しており、小齧歯類を単回の投影に対して迅速に、すなわち、蛍光撮像に対して1秒もの短い時間でスキャンすることができる。視覚化のための完全なソフトウェアツールが、このシステムとともに利用可能である。Cy5.5によるNIRF撮像に関して、励起フィルター(640±25nm)および発光フィルター(695−770nm)を有するフィルターセットを使用する。蛍光画像を、Cマウントレンズを装備した赤色光に高感度な白黒のCCDカメラによって収集する。マウスを、生体内分布の研究のために殺す。腫瘍組織のサンプルの一部分を、Bla活性の評価のために使用する。
<静脈内注入後のマウスにおけるCNIR800の生体内分布および薬物動態>
マウスは、10、20および40μMの2.5μl/gの3回の異なる投与のCNIR800で接種を受ける。1、3、5、10、24、48時間後の投与とは異なる時間間隔で接種を受ける。麻酔をかけたマウスを、頸椎脱臼によって殺す(各時点で3匹のマウス)。血液サンプルを、心臓穿刺によって集め、組織(腫瘍、心臓、腎臓、肝臓、膀胱、胃、脳、膵臓、小腸および大腸、肺、および、脾臓)を、迅速に採取し、蛍光測定器によって近赤外線蛍光を測定する。これらのサンプルを、蛍光測定のための活性化されていないプローブをすべて加水分解するための水酸化ナトリウムの付加によって処理する。したがって、活性化された及び活性化されていないプローブの生体内分布を得ることができ、データを、1グラムの組織あたりの蛍光ユニット(FU)[FU/(g 組織)]として表す。したがって、組織中の基質の最適な濃度が決定される。
5−7週齢の、1匹の感染していない対照を有する1群当たり5匹の雌のBalb/cマウスは、肺ルートによって感染する。50、500、5000、50,000および500,000のcfu/肺の接種量を用いる。マウスの2つの群が各接種量で感染する。1つの群は撮像せずに1日目に殺し、接種量を確認するために、肺をcfuのために蒔く。マウスの他の群において、CNIR800の適量を静脈内で与え、マウスを、その後すぐに、および基質送達の1、3、5、10、24、および72時間後に撮像する。
マウスは、自己蛍光を減らすための低クロロフィル食料(chow)と水で維持される、雌の5−7週齢のBalb/cである。1つの群当たり5匹の動物を感染していない対照に用い、4匹の動物を感染した対照に用いる。撮像前に2.5μl/gの20μMのCNIR800で送達された基質を動物に与える。1)100cfu x 3、 2)1000cfu x 1、 3)10,000cfu x 6、 4)100,000cfu x 1、 および、5)106cfu x 1に対応する投与量(群# x 5の群の数)は肺に残る。群1からのマウスを、7日目で最初に撮像する。シグナルが観察されると、動物を殺し、cfuを決める。シグナルが観察されなければ、シグナルが観察されるまで、動物を毎日撮像し、その日付を記入して、cfuを決める。これは、生理学的に関連する感染がREFによって目に見えるようになる時点、および、治療が始まり得る最初の時点である。他の2つの群1の数組の動物を、感染の28日後と60日後に撮像する。群2を4日目に撮像し、シグナルを観察し、cfuが決まるまで、群1と同じ方法で処理する。群3において、1組の動物を感染の1、3、5、7、14、28日後に撮像し、cfuを決定する。群4と5において、動物を1日目に撮像し、cfuを決定する。
雌の5−7週齢のBalb/cマウスを、処置の4日前にMadisonチャンバーを使用して、100−1000cfu/肺で感染させる。1つの群当たり10匹の動物を、撮像のための対照として感染されてない2匹の動物とともに用い、1つの群当たり5匹の動物を、従来のcfu研究のために用いる。1つの群の動物を処置し、第2の群をすべての実験で処置しない。すべての動物を、ベースラインを得るために3日目の処置前に撮像し、治療上の処置を4日目に開始し、感染の5、6、7、14および28日後に撮像を行う。それと平行して、標準の治療上の評価のために、5匹の動物の1つの群を感染の4、7、14および28日後に殺す。また、尾静脈による106cfuの静脈内注入のモデルにおいて、INH、RIFおよびMOXに関する5、10、25および50mg/kgで毎日処置を行う。25mg/kgのINHでの処置を用い、従来の撮像と治療上の技術に対して比較を行う。
<蛍光タンパク質:IVIのための蛍光タンパク質の可能性の評価>
蛍光タンパク質(FP)mPlumは、649nmの最長の波長と非常に好ましい59nmのストークスシフトを有し、これは、蛍光タンパク質が非常によく組織を透過し、好ましいシグナル対雑音比を有することを意味する。これは、EGFPほど明るくないが、類似した光安定性を有し、その波長およびストークスシフトは、IVIの間のこの差を十二分に補うべきであるが、これはインビトロでは同じように作用しないこともある。長波長(620nm)を有する第2FPは、mKeimaであり、これは、背景が励起波長で重なるという懸念がほとんどない180nmで、mPlumよりもさらに優れたストークスシフトを有する。しかしながら、mKeimaは、mPlumと類似した明るさを有し、これによって、どのFPがIVIの間に、よりよく作用するかを分かりにくくしている。mPlumまたはmKeimaのいずれかよりも4倍明るい比較的長い波長(610nm)を備える別のFPは、mCherryである。mCherryのためのストークスシフトはわずか23nmであり、そのため、シグナル対雑音比は、より明るいにもかかわらず依然として問題となり得る。FP tdTomatoは、最短の波長(581nm)を有するが、最も明るく、mPlumおよびmKeimaよりも20倍明るい。
FPコンストラクトは、培養中の安定性、転写および翻訳の有効性、検出限界およびイソニアジドによる処置の間/後のシグナルに関して評価される。シグナル強度およびコンストラクトの安定性のばらつきが、個々のFP形質転換体において以前に観察されているので、まず、各FPコンストラクトでの少なくとも2つの形質転換体が、評価のために選択される。その後、各FPに対する単一の最適な菌株がインビボの研究で選択される。
毒性研究において、菌株をすべて、平行して野生型と比較する。4匹のBalb/cマウスの20の群を、実施例1に記載されるような100−1000の間のcfu/肺で、エアロゾルによって感染させる。各菌株に対する4匹のマウス(野生型、FP1、FP2、FP3、FP4)の1つの群を、すべての時点(1、14、28および72日)で検死し、CFUを決定し、組織検査を行い、適切なコンストラクトの存在および肺および脾臓内の蛍光のレベルを決定する。コンストラクトを保持する細菌の個体群の割合を、CFUのタイタプレートから少なくとも20の個別のコロニーで処理される蛍光顕微鏡法によって決定する。蛍光レベルは、残りのFPの全体のレベルを評価するための、測定された均質化された組織である。
<エアロゾルによって感染したマウスにおける蛍光タンパク質>
4匹のBalb/cマウスの6つの群を、各々、mPlum、mKeima、mCherryおよびtdTomatoのコンストラクト、および、ベクター骨格のみを保持する、100−1000の間のcfu/肺の各菌株とともにエアロゾルによって感染させる(合計30の群)。菌株を、実施例1に記載されるように、エアロゾル感染のために溶かす。1つは各FPを有し、1つはベクターを単独で有する、4匹のマウスの5つの群を、すべての時点で撮像するために使用し、各時点で4匹のマウスの別の5つの群を組織検査のために殺し、検死し、肺および脾臓内のcfuを決定する。24時間、7、14、28および72日目で、撮像を、Xenogen IVIS 200撮像ステーションを使用して、および各FPのための最適な励起および発光のフィルターを使用して、同じABSL3suiteにおいて実行する。FPが、IVISにおいて異なるセットのフィルターの使用を必要とするとき、ベクターはまた、自己蛍光のために制御する同じフィルターセットを使用して、各動物群において単独で撮像される。したがって、細菌重量(bacterial load)が、感染後の後の時点で非常に低い(100cfu/肺)実験から非常に高い(>105cfu/肺)実験の全体にわたって変化するため、IVIのための各FPを、この系の感受性と同様に有効にする。ベクター単独の使用によって、自己蛍光、およびFPの存在によってもたらされる毒性の潜在的な差の両方が制御される。
<培地中の結核の検出に関するClick beetle red(CBR)>
CBR遺伝子を、既に導入されたGateway組換え部位を使用して、Blaに関して記載される4つのコンストラクトのすべてへクローン化する。これらのプラスミドによって、L5およびhsp60プロモーターの両方からの発現が可能となる。発光検知能力を有するマルチモードのマイクロプレートリーダーにおける96ウェルのプレート、および持続的なシグナルの分解速度と同様に、D−ルシフェリンを加える間のフラッシュ発光の測定を可能にするインジェクターを使用して、成育培地で各菌株のD−ルシフェリンの存在下で光を生成する能力を比較する。アッセイをすべて、細菌の限界希釈法およびCFUの測定とともに4回繰り返して行い、生菌数と生成されるシグナルを相関させることができる。コンストラクトの安定性を、7日間、選択がない状態での成長によって評価し、その後、分光測光法および蛍光の顕微鏡検査によって評価する。シグナル/生存可能な病原菌を測定するために、これらのデータをCFUと相互に関連させ、陽性シグナルを生成する細菌の割合を計算するために、顕微鏡法を用いる。コンストラクトの細菌の生存率に対する効果を、ベクターのみの細菌と比較して、このコンストラクトを保持する細菌の成長を図示することによって、これらのアッセイにおいて評価する。
組換えCBRの毒性に対する安定性および効果を、IVIの保証(promise)を示す2つの菌株に関して試験する。毒性研究において、菌株をすべて、平行して野生型と比較する。4匹のBalb/cマウスの12の群を、実施例1に記載されているように、100−1000の間のcfu/肺でエアロゾルによって感染させる。
本実施例1に記載されるように、4匹のBalb/cマウスの6つの群を、各々、RLuc8とベクター骨格のみを保持する、100−1000の間のcfu/肺の各菌株を用いて、エアロゾルによって感染させる(合計12の群)。1つがRLuc8を有し、1つがベクターのみを有する、4匹のマウスの2つの群を、すべての時点で撮像するために使用し、各時点で、4匹のマウスの別の2つの群を、殺し、検死し、肺および脾臓内のcfuを決定する。24時間、7、14、28および72日目で、撮像を、Xenogen IVIS 200撮像ステーションを使用して、同じABSL3suiteで行う。撮像前に、IVIに十分であると示された1−5μmolのD−ルシフェリンを、尾静脈を用いて静脈内に注入する。
<IVIのためのルシフェラーゼ系の潜在性の評価>
RLuc8ルシフェラーゼを、GatewayPCRクローニングを使用して、記載されるマイコバクテリアの発現系へクローン化する。コンストラクトをMtbへ導入し、細胞全体を使用して、細菌培養培地中で、それらの光生成のために試験する。万一、インタクトな細菌がCBRに対して比較可能な光を生成すれば、細胞内の細菌系は、マウスにおけるCBRと比較することができる。グラム陽性とグラム陰性菌のルシフェラーゼ系は両方とも、基質を生成するという利点を有する。両方のオペロンを、制限消化を使用して、発現系へクローン化することで、それらを、現在のベクターから取り除き、その後、GatewayアダプターおよびGateway組換えクローニングにライゲーションする。コンストラクトを、細菌培地中でMtbからの光生成のために試験する。光生成が分光光度計のための発光設定で測定されることを除いて、生物発光のためのすべてのアッセイを、Bla系に関して記載されるように、96ウェルのプレートにおいて実行する。光生成をCFUに関連して計算することができるように、すべてのサンプル上で平行して実行される限界希釈およびCFUの決定によって感受性を評価する。
分泌と膜を標的とすることの、マクロファージ中のルシフェラーゼ活性に対する効果を試験する。マイコバクテリアからの分泌は、アミノ末端TATシグナルを、Mtb BlaC(BlaSS)からのシグナル配列に付加し、この融合を、Mtb内でCBRを最適に発現する同じコンストラクトに置くことによって、達成される。分泌は、CBR、BlaSS::CBRおよびベクターのみを発現する初期の対数期まで成長したMtb菌株からの培養濾液と細胞全体をアッセイすることによって、確認される。この菌株からの培養濾液は、CBRを発現する菌株よりはるかに高い光生成を有していなければならず、BlaSS::CBRからの細胞全体は、CBR Mtbと同じか又はより少ない光生成を有していなければならない。Blaのために使用されるCD14からのカルボキシ末端GPIアンカーを、BlaSS::CBRに付加し、融合タンパク質BlaSS::CBR::GPIを生成する。
<IVIのための化合物によるBgalの検出>
以前に記載された(17)プロモーターのないBgal遺伝子を、制限酵素消化およびGatewayアダプターへのライゲーションによって、マイコバクテリアの発現ベクターへクローン化する。これらのベクターを、以前に記載されたような(18)96ウェルのプレートにおいて、マイコバクテリアの透過性の蛍光試薬、5−アセチルアミノ−フルオレセイン(fluorexcine) ジ−ベータ−D−ガラクトピラノシド (C2FDG)を使用して、細菌培養培地中の評価のためにMtbに移す。この化合物は、Bgalによって開裂されるまで、蛍光ではなく、460nmで励起され、520nmで発光する。最も強力な蛍光シグナルを生成するベクターを、Bgalの分泌および宿主細胞の局在化を可能にする追加の融合を構築するために使用する。
組換えBgalの安定性および毒性に対する効果を、IVIの保証を示す2つの菌株に関して試験する。毒性研究において、菌株をすべて、平行して野生型と比較する。4匹のBalb/cマウスの12の群を、実施例1に記載されるように、100−1000の間のcfu/肺でエアロゾルによって感染させる。各菌株に対する4匹のマウス(野生型、Bgal1およびBgal2)の1つの群を、すべての時点(1、14、28および72日)で検死し、CFUを決定し、組織検査を行い、適切なコンストラクトの存在およびC2FDGを有する肺および脾臓内のレベルを決定する。コンストラクトを保持する細菌の個体群の割合を、CFUのタイタプレートから少なくとも20の個別のコロニーで処理されたC2FDGを使用するBgalアッセイによって決定する。Bgalレベルを、各時点で残るBgalの全体のレベルを評価するために、均質化された組織において測定する。
L2G85マウスからの細胞がすべて、ACTBプロモーターからFlucを発現するため、L2G85マウスからの骨髄由来のマクロファージを、Mtb菌株を発現するBgalによって感染させ、ベクターのみを保持する同じ菌株と比較する。マクロファージ感染を、感染したL2G85マウスからの骨髄由来のマクロファージによって、J774A.1マクロファージ中の他の細胞内の成育アッセイのための方法と同じ方法で実行する。得られた測定値における宿主細胞透過性の役割を評価するために、Lugalを加える前に、二連のウェルを、0.1%のトリトン X−100によって溶解する。すべての時点で、4つの未処置のウェルを、細胞に関係するCFUの数を測定するために使用する。シグナルの局在化を、最も有効であると示すこれらのコンストラクトのために顕微鏡法によって確認する。これらのアッセイを、類似した方法ではあるが、8ウェルのチャンバースライドを使用して実行する。顕微鏡法は、局在化、陽性シグナルを有する細菌の割合の決定、および局在化されたシグナルの強度の評価を可能にする。Lugalが検出のためのルシフェリンの代わりに使用されることを除いて、CBRのために記載されるのと同じプロトコルを使用して、IVI研究をマウスで行う。
<β‐ラクタマーゼおよび他のタンパク質の結晶構造モデルに基づいた基質プローブ設計:BlaC酵素ポケットのモデル化>
結核菌β‐ラクタマーゼ(BlaC)酵素ポケットを、プローブの設計および特異性を改善するために小分子を使用してモデル化する。小分子ライブラリでのように、小分子のハイスループットスクリーニングを、BlaCの活性部位溝に結合する化合物を確認するために使用して、結晶構造をそこから得た。候補のプローブはインビトロで合成及び試験した。
結核菌内の二つの主要なβ‐ラクタマーゼ様タンパク質(BlaX)および二つの主要なペニシリン結合タンパク質(PBP)をクローン化し、過剰発現させ、精製した。BlaXとPBPのKm及び結合定数はセフォペラゾン(ceferoperazone)、ペニシリンおよびシプロフロキサシンにより決定した。候補タンパク質の結晶構造を明らかにし、これを改善されたプローブ活性を持つ特定のプローブを設計するために使用した。
セフォペラゾンを有する、BlaCおよびTEM−1の結晶構造を解明する。セフォペラゾン(ceferperazone)に基づいたプローブをモデル化し、設計し、合成する。候補プローブはBlaCおよびTEM−1のKmを決定するために使用する。
<新規消光剤及び色素を利用したREF感受性の改善>
REF画像化に使用した前記基質で、マウスの肺結核感染の画像化に成功したことから、この方策が非常に有望であることを示唆している。しかしながら、肺内での検出の閾値が>10,000細菌数であるので、REFプローブの感受性を高めることによって検出を改善することは有益である。最近、前記化合物の改善を約束するような、新しい色素および消光剤が、800nmの範囲で働くLiCorを用いて開発された。IRDye 800CWと名づけられたこの新しい色素はCy5.5より約10倍明るく、その長波長によりCy5.5よりはるかに良く哺乳類組織の中を通過するはずである。この色素に基づく化合物およびそれによく適合したQC−1と名づけた消光剤に基づく化合物を設計する。この色素と消光剤に基づいた化合物は、現在のREF系の劇的な改善を可能にした。また、2つのIRDye800色素である、IRDye800RSおよびIRDye800CW(図27)をインビボ画像化の用途のためのFRETドナーとして検証した。両方とも780nmでの励起及び820nmでの発光と同じ蛍光スペクトルを有しているが、それらはIRDye800CWがIRDye800RSより多くのスルホン酸塩群を持つ点で異なる。この差は異なる生体内の生物分散につながる可能性があるため、その両方を検討した。IRDye800の高い消光効率を有した、対応する色素であるIRDye QC−1を、蛍光性プローブの中でFRETアクセプターとして使用した(図28)。上記のように、プローブへのこれらの分子の取り込みは、NHSエステルおよびアミンの間の共役化学作用であり、CNIR5を調製したのと同じ合成手順である。まず、IRDye800色素から作られたこれらCNIRプローブの加水分解動態は、TEM−1 BlaおよびMtb BlaCの両方によって特徴づけられ、また前記プローブを、皮下及び肺の感染でのMtbのインビボ画像化のために評価する。
これらの技術の組み合わせは、感染した組織の標識化特性および感染した宿主細胞内のプローブの取り込みについての詳細な特徴づけを可能にするために、感染したマウスモデルで試験されたすべてのプローブに適用される。
現在の基質プローブはMtb BlaC活性を検出し画像化できる一方、そのMtb BlaCに対する活性は最適ではない。Mtb BlaCへの酵素反応を改善したプローブは、検出と画像化の両方に、より高い感受性を与える。Mtb BlaCの結晶構造は、Mtb BlaCはより大きな活性部位ポケットを有するという、他のクラスAのβ−ラクタマーゼとの大きな違いを示す。この構造の差は、Mtb BlaCのために改善された動態を備えたプローブを設計できる可能性を示唆する。主要な3つのアプローチが、セフォペラゾンに基づいたBlaCプローブの構造の改善、化合物の限定されたライブラリーからのスクリーニングおよび脱離基の修飾のために利用される。確認された適切な化合物を、Mtb、細胞内の細菌、皮下及び肺の経路によるマウスへの感染を利用した生体外アッセイを使用して、さらに特徴づける。
TEM−1 BlaおよびMtb BlaCによるCNIR5の動態:
TEM−1 Bla、kcat=0.33 s−1、KM=1.9μM、kca
t/KM=1.74×105 s−1M−1;
Mtb BlaC、kcat=0.07 s−1、KM=5.9μM、kcat/
KM=1.2×104 s−1M−1。
/KM=1×103 s−1M−1;
Mtb BlaCは、kcat=2.01 s−1、KM=76μM、kcat/K
M=2.6×104 s−1M−1。
セフォペラゾンCNIRプローブを合成し試験した後に、ライブラリー・アプローチを、X線の構造の研究によるSARの改良と平行して、選択性を改善するために試みた。
フェノール類のエーテル間での二重結合の挿入がフェノール基の放出動態を大幅に増加させることは以前に示されている[JACS、2003、125、11146−11147]。例えば、kcatはフェノール類の脱離基に関して5倍から54 s−1に増加した。この所見に基づいて、二重結合をCNIRプローブに導入した。例えば、図28に示される構造について、対応するプローブを図31に示した。以前の実施例において、二重結合はシス型配置を有するが、その配置はここではるかに大きなアリル基によってトランス型になることが期待される。同様に、Blucoへの二重結合の導入は、Blucoよりも優れた反応速度を有することが期待されるBluco2をもたらす(図30)。
3’−位置での結合の第二のタイプは、加水分解後のより速い分解をもたらし、したがってよりよい感受性をもたらす。この設計はカルバマート結合、DルシフェリンおよびアミノDルシフェリンのアミノアナログを利用する。カルバマート結合は、優れた脱離基としてプロドラッグ設計の中で広く使用されてきた。Bla開裂は、カルバマートを放出し、そのカルバマートはその後二酸化炭素およびルシフェラーゼ用の基質である遊離したアミノD―ルシフェリン(図32)へと分解される。同様に、この結合は、CNIRプローブにも適用される(図32)。
組織分布研究はその存在濃度を測定するためにCNIR基質の蛍光を使用して行った。開裂によって蛍光は増加するので、非開裂基質の分布はBlaC存在下で培養され、蛍光を測定することで決定し、開裂基質濃度は直接の蛍光測定によって決定した。この方法によって組織中の基質の存在を見積もることができるが、組織試料内の自己蛍光、潜在的な阻害剤の存在および基質の自発的な加水分解が、得られたデータに影響を与えるので、それは決定的ではない。より多くの詳細な組織分布データが、放射性標識したプローブの分布による試験を通じて得られる。容易にインビボのプローブの分布を追跡できるように、CNIR5をI−125など放射性ヨウ素により標識化した。CNIR5内の芳香族基を、タンパク質中のチロシンを標識化するプロトコルを使用して、同様にヨウ素化した。標識化されたプローブを、マウスに注入し、動的なSPECTイメージングを行った。異なる期間で、放射能測定用に器官を集めるためにマウスを殺した。並行して、プローブの遊離した画分を、解剖検査の後で得られた可溶性画分を使用して、HPLCで直接評価した。(全体の及び可溶性の)組織ホモジェネートをコールドプローブを使用して蛍光によって評価し、HPLCによって可溶化し、その後ホットプローブのための画分をシンチレーション検出した。新しいMtbに特異的なプローブが開発され、組織分布を改善できる潜在性という観点を提供するために有効になる時、同じ実験をそのプローブを使って行う。
より良い酵素反応あるいは使用可能な基質に起因して、異なるSREL/REF酵素系はBlaCと比べて重要な利点を有する可能性があるので、SREL/REFをMtbについてβガラクトシダーゼ(lacZ)に蛍光を付加したもの(DDAOG)あるいは発光性基質(Lugal)を用いた。DDAOGとLugalの両方は、インビトロ画像化のために、およびLugalはマウス中の皮下感染を画像化するための利用に成功した。DDAOGはインビトロで期待できる結果を示したが、これをインビボでは評価していない。蛍光性基質の利用は、発光基質とともにルシフェラーゼが輸送される必要がある発光性基質を超えるいくつかの利点を持っているので、我々にとってDDAOGが生体内でもLugalと同様に感受性があるかどうか確認することが重要になってくる。この系はBlucoが抱えているのと類似の問題を抱えている。DDAOGまたはDDAOGに基づいて改善された修飾した化合物は、最も感受性が高い系のうちの1つであると最終的に証明するかもしれない。また、すでに多くの研究者が使用している比色分析レポーター系は多数存在し、生きている動物中の結核感染の画像化に成功すれば、これらの系は即座に結核研究分野のコミュニティーの中で有益なものとなる。
<大きなラクタムを用いたSRELとREFプローブの特異性の改善>
改善された感受性を備えたプローブを開発するために使用されるのに類似した戦略を、他の細菌の種類の中にあるβ‐ラクタマーゼ上のMtb BlaCに選択的なプローブを開発するために使用した。これらのβ‐ラクタマーゼ酵素の中で最もよく特徴づけられているのは、大腸菌TEM−1であり、それは多くの動態アッセイに使用されており、また真核生物の系の中で有益なレポーターとして使用されている。感受性を改善するためのそれと比較して、使用されるアプローチの主な違いは、動態の中でMtb BlaCと大腸菌TEM−1の間の最も大きな差異を有している化合物に焦点をあてることである。ほとんどのベータ―ラクタムはTEM−1酵素でより優れた動態を示すが、TEM−1よりMtb BlaCでより優れた動態を示す3つのベータ―ラクタムが確認されている。それらはセフォペラゾン、セフォタキシムおよびセホキシチンである。これらの化合物は、それらの動態において大きく異なるが、セフォペラゾンは、TEM−1酵素に比べてMtb酵素と10−100倍速い動態を見せるため、この酵素に特異的なプローブの開発のためのよい候補であることを示唆する。CNIR化合物をセフォペラゾンに基づいて構築し、その特異性は、精製されたBlaCおよびTEM−1を蛍光を含む96ウェルフォーマットの中でリードアウト(readout)して使用し、その酵素反応パラメーターを測定して評価される。
実施例16において開発した化合物のライブラリーもSRELとREFプローブの特異性を改善するために使用することができる。しかし、酵素反応ではなく特異性に注目する修正されたハイスループットスクリーンが使用される。基本的に、化合物はそれぞれ上記のようにBlucoに基づいた基質として合成する。また、化合物は、ハイスループット発光アッセイ中の精製されたBlaCおよびTEM−1が存在する状態で評価する。化合物はすべて、ヒットを確認するためにBlaCで探索し、また他の酵素に乏しい基質を確認するために、TEM−1 Blaにより探索した。加えて、安定した化合物のみが得たことを確認するために、化合物をすべて、37°Cの水の中での安定性によって予めふるいにかけた。複数のアッセイは並行して進め、全ての結果をTEM−1発光に対するBlaCの比率として表した。最初に、閾値は、30分間の反応の後に、BlaCとともに10倍以上速い動態を示す分子で設定された。固体構造活性相関(SAR)を構築するために、化合物をそれぞれ、BlaCおよびTEM−1酵素の結晶構造に対してコンピュータモデル化した。これらの結果をREFのために使用するCNIR基質に変換することができるという想定が、CNIR及びBlucoに基づくセフォペラゾンプローブ活性の比較により、先ず確認された。
<生きたマウス内を画像化するためのCBRの評価>
初期の研究では、click beetle red(CBR)ルシフェラーゼが、生体外および培養細胞中でMtbのレポーターとして良く機能することが発見された。CBRは生成されたシグナル及び生体外での検出の閾値の観点から、ホタル・ルシフェラーゼ(FFlux)に匹敵すると見出された。しかしながら、マウスの皮下及び肺の感染中に、CBRの検出の閾値はFFluxより著しくよかった。この予備的な観察は、生体内での細菌の代謝に対する、あるいは発光の動態に対して効果を表す、接種材料の違いによるものかもしれない。これらのパラメータの各々は肺及び皮下の感染中にMtbの存在率を示すレポーターとしてCBRの有用性を注意深く分析することで評価する。原因であるレポーターを明らかにするために、発光の動態は、同じ動物内で異なる部位に皮下移植することと、生物発光シグナルのスペクトル unmixingの使用とを組み合わせることによって、直接FFluxを評価し、比較した。肺の感染は、同等の病原菌に感染した二匹のマウスを並行して、別々に評価した。低酸素性疾病下の生体外シグナル強度の効果を評価することにより、低酸素性の病変内のCBRの潜在的な感受性への見識が得られた。生体内で遭遇するかもしれない他のストレス、例えば低pH、およびROSとRNSの存在、を試験した。
CBRルシフェラーゼシグナルはATPの存在に依存するので、この画像化システムは迅速に細菌の生存に対する治療上の効果を評価する、独自の機会を提供する。このシステムに関する主な疑問のうちのいくつかは、シグナルの測定可能な違いがどれくらい迅速に得られるか、また、それを、MICを決定するためにどれくらいな正確さで用いることができるかということである。このアッセイではイソニアジドとリファンピシンを使用するので、MtbのためのMICを決定できる。実験で決定されたMICを、OD及びCFUに基づくアッセイにより得られたそれと比較した。シグナルロスの動態を、全体のMtb及び細胞内でマクロファージを使用したアッセイを用いて、0.5x、1xおよび5xMICの抗生物質存在下で評価した。一度動態がインビトロで測定され、及びCFUによって生存率の違いを比較し、処置後に細菌を生育させる能力およびCFUと発光の間の優れた相関性が残るかを評価した。一旦CFUと発光の間の相関が生育した細菌の生体外で測定されると、マウス中の皮下及び肺への感染の間の処置の発光に対する効果の動態を試験した。肺および皮下の環境間で細菌へのアクセスのしやすさに差があると思われ、それによりシグナルロスの動態がまた異なる傾向があるので、両方の接種ルートを使用した。これらの研究は、マウスでの治療の迅速な評価のためのCBRの有用性に対する見識を提供する。これらの実験は結果を迅速に得られることを可能にするために、感染の急性期に注目する。しかし、この系が細菌が高い確率で複製していない可能性があるときに、治療上評価するのにも役立つかどうか確認するために、後でこの実験は、マウスで感染の慢性期の間に行う必要がある。
細菌の生存率について迅速な読み出しが可能であるはずなので、CBR系は有利である。しかし、いくつかの場合においては、このタイプの系が最適ではないかもしれない。細菌の代謝率が最大の光生成を可能にするのには十分でない状況では、ルシフェラーゼに基づいた系は最適な代謝条件下ほど敏感ではないかもしれない。CBRを使用して、治療への効果を評価した。異なる組織中の病原菌の量を測定し、また、REFを使用して、それらの細胞の位置を決定した。異なる環境中の細菌数を評価するための、これら2つの系の潜在的な有用性に対する知見を得るために、CBRおよびREFシグナルロスの両方の動態を、肺及び皮下感染の後にマウスで試験した。発光は、抗生物質の送達ですぐに減少した。また、REFシグナルはシグナルロスを観察するために24時間を要した。代謝活性に対する、CBRおよびREF間の感受性の差異は、代謝期と共同でリアルタイムの細菌数を評価する潜在的な能力を提供する。これは、Mtb感染中に動物内のすべての細菌の代謝期がどうなっているのか不明瞭なままであるので、発展させるべき重要な系である。この画像化システムは、リアルタイムでの各シグナルがある状態またはない状態で、生きている動物内の異なる環境への移動を直接観察することができる最初の手段を提供する。この能力は、治療を評価することにあたって特に重要であると分かるだろう。というのも、治療が他の環境でそうでない中、それはいくつかの環境下で殺菌性でありうるからであり、このことが前臨床研究の継続に対する重大な考慮となる。
<比色分析および化学画像化システム>
<比色分析アッセイ>
可視的なアッセイ系では、蛍光色素分子の直接の代替として有色色素を利用することができる。可視の色素としては、Texas Red、ローダミン、ブロモクレゾール色素(多色)、シアニン染料などが挙げられる。蛍光系と異なり、基質に付加したままの間は、これらのタイプの色素は目に見え、検知可能である。それ故、結合の分離と色素の遊離が必要である。遊離した色素は下流の、後に続く可視化される検出領域へ移動する。これらの色素は非常に小分子であり、それ故に遊離した色素は目で確認できる必要な分の感受性を得るためには、下流で濃縮する必要はある場合がある。
可視の化学試薬フォーマットは、可視の検出体でも利用することができる。色素の代わりに、pH変化を誘発するものなど特定の化学物質または他の化学的に色の変化を誘発するものを置換する。化学物質は結合した複合体から分離され、他の試薬との化学的な相互作用によって結果として検出可能な可視のシグナルが得られる、下流の別の検出領域へ移動する。このフォーマットは濃縮方法が必要でないかもしれないことにおいて、可視の色素フォーマットと異なる。増幅のある基準は、pH変化など変色反応の性質によって達成される。二次的な化学反応が、β‐ラクタマーゼ反応の下流で起こり、例えば、乾燥した二次的な試薬を含んでいるセルロース・パッド内で分離することができる。
可視の系は、例えば複合体をラテックス粒子またはビオチンに結合させるように、基質(検出分子から遊離した)及び/又は複合体全体(結合検出分子を含んで)を保持するよう設計している。複合体をラテックス粒子に結合させることによって、粒子はろ過膜によって保持されるので、遊離した色素のみが検出領域へ移動することが可能になる。もう一つの方法として、複合体に対するビオチンの結合によって、すなわち、色素または化学試薬を伴う基質、遊離及び結合物質は、固定されたアビジンが基質と複合体に結合する、第2の領域に移動する。遊離した色素のみが検出領域へ移動する。
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Claims (62)
- 被験体においてリアルタイムで病原性細菌を検出するための方法であって、
前記方法は、
被験体に、病原性細菌のβ−ラクタマーゼのための基質を導入する工程、または、被験体のサンプルまたは表面から得られたサンプルを、病原性細菌のβ−ラクタマーゼのための基質に接触させる工程と、
基質におけるβ−ラクタマーゼ活性からの生成物のためにサンプルまたは被験体を画像化する工程と、
β−ラクタマーゼ生成物によって発せられた波長のシグナルを獲得する工程であって、それによって、被験体の病原性細菌を検出する工程を含む、方法。 - 被験体の病原性細菌の位置を決定するために、発せられたシグナルの3D再構成を作成する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 感染細胞を定量化する工程と、生体サンプル中で非感染細胞と感染細胞を区別する工程の1つまたは両方をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 感染細胞を区別する工程および/または感染細胞を定量化する工程は、フローサイトメトリー法、共焦点顕微鏡法、または、蛍光分光法の1つ以上を用いることによって行われる、請求項3に記載の方法。
- 基質は、蛍光発生基質CDC−1、CDC−2、CDC−3、CDC−4、CDC−5、CNIR5、CNIR5.2、CNIR5−QSY22、CNIR7、CNIR7−TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800.2、CNIR800−3、XHX2−81、XHX2−91、XHX3−1、XHX3−2、XHX3−26、または、XHX3−32、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項1に記載の方法。
- 基質は、色またはpHの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項1に記載の方法。
- 基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項6に記載の方法。
- 生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または、被験体の関心領域からふき取って得られるサンプルである、請求項1に記載の方法。
- 病原性細菌は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、またはリステリア属の細菌種である、請求項1に記載の方法。
- 病原性細菌は、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスを含む、請求項9に記載の方法。
- 獲得されたシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルである、請求項1に記載の方法。
- 画像化波長は約300nm乃至約900nmであり、発光波長は約300nm乃至約900nmである、請求項1に記載の方法。
- 画像化波長は約540nm乃至約730nmであり、発光波長は約650nm乃至約800nmである、請求項12に記載の方法。
- 被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を診断するための方法であって、
前記方法は、
病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質を被験体に投与する工程、あるいは、被験体に由来する生物学的サンプルを、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質に接触させる工程、
基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物のために被験体を画像化する工程、および、
生成物によって発せられる波長のシグナル強度をリアルタイムで獲得する工程を含み、
測定された対照シグナルよりも大きなシグナル強度は、病態生理学的状態の診断と相関する、方法。 - 病原性微生物の位置を決定するために、シグナルの3D再構成を作成する工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 感染細胞を定量化する工程と、感染細胞を生物学的サンプル中の非感染細胞と区別する工程の1つまたは両方をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 感染細胞を区別するおよび/または定量化する工程は、フローサイトメトリー法、共焦点顕微鏡法、または、蛍光分光法の1以上を用いて行われる、請求項16に記載の方法。
- 病態生理学的状態を処置するのに有効な1以上の治療用化合物を投与する工程を含む、請求項14に記載の方法。
- 被験体に基質を再投与する工程、または、基質に由来する生物学的サンプルを前記基質に接触させる工程と、
治療用化合物の有効性をモニターするために被験体を画像化する工程をさらに含み、
診断時のシグナルと比較した発せられたシグナルの減少は、病態生理学的状態に対する治療効果を示す、請求項14に記載の方法。 - 病態生理学的状態は結核である、請求項14に記載の方法。
- 生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または、被験体の関心領域からふき取って得られるサンプルである、請求項14に記載の方法。
- 病原性細菌は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、または、リステリア属の細菌種である、請求項14に記載の方法。
- 病原性細菌は、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスを含む、請求項22に記載の方法。
- 基質は、蛍光発生基質CDC−1、CDC−2、CDC−3、CDC−4、CDC−5、CNIR5、CNIR5.2、CNIR5−QSY22、CNIR7、CNIR7−TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800.2、CNIR800−3、XHX2−81、XHX2−91、XHX3−1、XHX3−2、XHX3−26、または、XHX3−32、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項14に記載の方法。
- 基質は、色またはpHの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項14に記載の方法。
- 基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項25に記載の方法。
- 測定されたシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルである、請求項14に記載の方法。
- 画像化波長は約300nm乃至約900nmであり、発光波長は約300nm乃至約900nmである、請求項14に記載の方法。
- 画像化波長は約540nm乃至約730nmであり、発光波長は約650nm乃至約800nmである、請求項28に記載の方法。
- 被験体のマイコバクテリア感染を検出するための診断方法であって、
前記方法は、
被験体から生物学的サンプルを得る工程と、
マイコバクテリアのβ−ラクタマーゼ酵素の基質に生物学的サンプルを接触させる工程と、
基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物のために生物学的サンプルを画像化する工程と、
生成物によって発せられた波長でシグナルの強度を測定する工程を含み、
測定された対照シグナルよりも大きなシグナルの強度は、マイコバクテリア感染の存在を示す、方法。 - 感染細胞を定量化する工程と、生体サンプル中で非感染細胞と感染細胞を区別する工程の1つまたは両方をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 感染細胞を区別するおよび/または定量化する工程は、フローサイトメトリー法、共焦点顕微鏡法、または、蛍光分光法の1以上を用いて行われる、請求項31に記載の方法。
- マイコバクテリア感染の検出後、被験体に施される治療計画の治療効果をモニターするために、前記方法の工程を1度以上繰り返す工程をさらに含み、対照と比較した測定されたシグナルの減少は、治療計画に対する肯定的な反応と相関する、請求項30に記載の方法。
- 生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または、被験体の関心領域からふき取って得られるサンプルである、請求項30に記載の方法。
- マイコバクテリア感染は、マイコバクテリウムツベルクローシス、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、マイコバクテリウムアビウム、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスによって引き起こされる、請求項30に記載の方法。
- 基質は、蛍光発生基質CDC−1、CDC−2、CDC−3、CDC−4、CDC−5、CNIR5、CNIR5.2、CNIR5−QSY22、CNIR7、CNIR7−TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800.2、CNIR800−3、XHX2−81、XHX2−91、XHX3−1、XHX3−2、XHX3−26、または、XHX3−32、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項30に記載の方法。
- 基質は、色またはpHの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項30に記載の方法。
- 基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項37に記載の方法。
- 測定されたシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルである、請求項30に記載の方法。
- 画像化波長は約300nm乃至約900nmであり、発光波長は約300nm乃至約900nmである、請求項30に記載の方法。
- 画像化波長は約540nm乃至約730nmであり、発光波長は約650nm乃至約800nmである、請求項30に記載の方法。
- 被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を処置するために有効な治療用化合物を選抜するための方法であって、
前記方法は、
病原性細菌に有力な治療用化合物を選択する工程と、
細菌細胞または細菌細胞を含む生物学的サンプルを、その細菌β−ラクタマーゼの基質に接触させる工程と、
細菌細胞または細菌細胞を含む生物学的サンプルを、有力な治療用化合物に接触させる工程と、
有力な治療用化合物の存在下および不在下で、細菌細胞によって生成された蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを測定する工程を含み、
治療用化合物の不在下でのシグナルと比べて、治療用化合物の存在下でのシグナルの減少は、病原性細菌に対する化合物の治療効果を示す、方法。 - 基質は、蛍光発生基質CC1、CC2、CHPQ、CR2、CNIR1、CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5.2、CNIR5−QSY22、CNIR7、CNIR7−TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800.2、CNIR800−3、CDC−1、CDC−2、CDC−3、CDC−4、CDC−5、XHX2−81、XHX2−91、XHX3−1、XHX3−2、XHX3−26、または、XHX3−32、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項42に記載の方法。
- 基質は、色またはpHの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項42に記載の方法。
- 基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項44に記載の方法。
- 病原性細菌は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、または、リステリア属の細菌種である、請求項42に記載の方法。
- 病原性細菌は、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスを含む、請求項46に記載の方法。
- 病態生理学的状態は結核である、請求項42に記載の方法。
- 細菌細胞によって生成されたシグナルは、約300nm乃至約900nmの波長を有する、請求項42に記載の方法。
- 細菌細胞によって生成されたシグナルは、約650nm乃至約800nmの波長を有する、請求項49に記載の方法。
- β−ラクタマーゼ活性後の検出可能な蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを生成する細菌のβ−ラクタマーゼのための基質。
- 基質は、蛍光発生基質CDC−1、CDC−2、CDC−3、CDC−4、CDC−5、CNIR5、CNIR5.2、CNIR5−QSY22、CNIR7、CNIR7−TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800.2、CNIR800−3、XHX2−81、XHX2−91、XHX3−1、XHX3−2、XHX3−26、または、XHX3−32、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項51に記載の基質。
- 基質は、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性後の色またはpHの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項51に記載の基質。
- 粒子、微粒子、または、それらに結合したビオチンをさらに含む、請求項51に記載の基質。
- 生物学的サンプル中の病原性細菌を明白に検出するためのアッセイ装置であって、
前記アッセイ装置は、
生物学的サンプルと、病原性細菌に関連するβ−ラクタマーゼ酵素用の発色基質とを含む培養混合物を収容するための手段、および、収容手段と流体連通する基質におけるβ−ラクタマーゼ活性によって生じる有色生成物を捕捉して濃縮するための手段を含む、プラットフォームを含んでいる、アッセイ装置。 - 有色生成物のみが収容手段から下流に流れることを可能にするための手段をさらに含む、請求項55に記載のアッセイ装置。
- 収容手段から下流の内部制御をさらに含む、請求項55に記載のアッセイ装置。
- 収容手段から下流の流体を吸収するための手段をさらに含む、請求項55に記載のアッセイ装置。
- 基質は、有色色素または化学試薬を含む、請求項55に記載のアッセイ装置。
- 基質は、粒子または微粒子に結合する、請求項55に記載のアッセイ装置。
- 基質は化学試薬を含み、前記アッセイ装置は、化学試薬から発色するための手段として第2の試薬を含む、請求項55に記載のアッセイ装置。
- 基質はビオチンに結合し、前記アッセイ装置はビオチンに結合した基質を捕捉するための手段としてアビジンをさらに含む、請求項55に記載のアッセイ装置。
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