CN103160274B - 一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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本发明涉及一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用，将Cy7荧光染料、乙酸钠溶解在无水DMF中，在Ar气保护下加热回流2-4h，得到的混合物冷却后抽滤，母液在-4～20℃低温结晶，抽滤得酮式花菁红棕色晶体；将邻甲酰基苯甲酸、草酰氯溶解在无水CH2Cl2中然后加入少量DMF，在0℃搅拌2-6h，得邻甲酰基苯甲酰氯；将酮式花菁、三乙胺溶于无水CH2Cl2，冷却至0℃，逐滴加入邻甲酰基苯甲酰氯并在0℃下搅拌10-30min，混合物加热至室温，搅拌过夜，抽滤，旋干，用色谱柱进行分离，旋干得绿色固体，结构式如下。本发明荧光探针合成简单，检测速度快，检测过程中不需要长时间的孵育，灵敏度高，可以检测到细胞内源性的硫化氢。

Description

一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种花菁类染料荧光探针、其合成方法及其在检测细胞内硫化氢的应用，属于检测技术领域。
背景技术：
长久以来，硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)这一具有臭鸡蛋气味的气体，多年来，人们一直认为H2S仅是一种有毒气体，人们对于它的研究仅限于其毒性作用。20世纪90年代中期，人们发现机体可以内源性产生H2S气体，它在体内主要由胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ一裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)，催化L-半胱氨酸产生H2S。CSE基因在主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉中均有表达，而CBS基因主要表达于中枢神经系统中。H2S具有调节神经、心血管和消化系统功能的作用，参与肺动脉高压、动脉硬化、内毒素休克、出血性休克及心肌缺血性受损等的病理生理过程，被认为是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的一种新的气体信号分子。内源性气体信号分子因其具有持续产生、传播迅速等特点。目前的硫化氢检测技术，如比色法，电化学法，气相色谱法，和金属诱导的硫化物沉淀，往往需要延后处理或破坏的组织或产生细胞裂解物。
近年用于检测体内硫化氢的荧光探针，比较少见。如荧光素为母体(Hanjing Peng,YunfengCheng,Chaofeng Dai,Adrienne L.King,Benjamin L.Predmore,David J.Lefer,and Binghe Wang,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9672-9675)的探针，选择性好，检测前后荧光增强到原来的55-70倍，但是此探针反应时间长（1h），激发波长在可见光区（488nm）；以BODOPY为母体和(Yong Qian,Jason Karpus,Omer Kabil,Shu-Yu Zhang,Hai-Liang Zhu,Ruma Banerjee,JingZhao,Chuan He,Nature Communications.2011,2,495）以罗丹明为母体的（Alexander R.Lippert,Elizabeth J.New,and Christopher J.Chang，J.Am.Chem.Soc.,2011,133:10078-10080）荧光探针，虽然选择性好，但是反应时间长（20min或1h）；部分检测硫化氢的荧光探针因为波长短，溶解性差等因素不能用于活体内，如(Hanjing Peng,Yunfeng Cheng,Chaofeng Dai,Adrienne L.King,Benjamin L.Predmore,David J.Lefer,and Binghe Wang,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9672–9675)，此探针虽是个快速反应，但是所选的丹酰为母体，激发为340nm，波长短，如果用于活体会造成损伤。总的来说以上荧光探针一般水溶性不好，而且激发发射波长多处于紫外可见光区，从而限制了它们在生物体内的应用。这就需要研制一种荧光波长长的，水溶性好的荧光探针。而花菁类荧光探针发射波长在近红外区，不易被生物介质基质吸收，对组织损伤小且穿透力强，能很好的用于活体。
发明内容：
本发明的目的在于克服目前硫化氢检测荧光探针的不足，提供一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用，该类荧光探针结构新颖、灵敏度、选择性好、光稳定性好。
本发明采取的技术方案为：
一种检测细胞内硫化氢的荧光探针，其结构式如下：
所述的检测细胞内硫化氢的荧光探针的制备方法，包括步骤如下：
（1）将Cy7荧光染料即2-[4-氯-7-（1-乙基-3（二氢吲哚-2-亚基）-2,3-二甲基]-3,5-（丙烷-1,3-二基）-1,3,5-庚三烯-1-基）-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓、乙酸钠溶解在无水DMF中，在Ar气保护下加热回流2-4h，得到的混合物冷却后抽滤，母液低温（-4～20℃）结晶，抽滤得酮式花菁红棕色晶体；
（2）将邻甲酰基苯甲酸、草酰氯溶解在无水CH2Cl2中然后加入少量DMF，在0℃搅拌2-6h，得邻甲酰基苯甲酰氯；
（3）将酮式花菁、三乙胺溶于无水CH2Cl2，冷却至0℃，逐滴加入邻甲酰基苯甲酰氯并在0℃下搅拌10-30min，混合物加热至室温，搅拌过夜，抽滤，旋干，用色谱柱进行分离，旋干得绿色固体。
上述步骤（1）中所述的Cy7荧光染料、乙酸钠的质量比为2.3：1；无水DMF用量为每克乙酸钠用20-30毫升。
上述步骤（2）中邻甲酰基苯甲酸、草酰氯、无水CH2Cl2、DMF的用量比例为1.2～3.0：1.0～3.0：20～30：2～6，（g：g：mL：μL）。
上述步骤（3）中酮式花菁、三乙胺、无水CH2Cl2、邻甲酰基苯甲酰氯的用量比例为1.2～3.0：3～6：20～30：3～6，（g：g：mL：g）。
步骤（3）所述的色谱柱分离洗脱剂为V乙酸乙酯：V甲醇=2:1。
所述的荧光探针在检测细胞内硫化氢中的应用。
所述的应用方法为：
在检测细胞内硫化氢的应用，通常，
(1)将荧光探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或者培养液中，配制成储备液储存待用；
（2）加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
而用于活细胞内硫化氢检测的一般方法：
（1）将含有荧光探针分子的缓冲溶液5-10μM加入培养好的细胞放于培养箱中孵育8-12分钟；
（2）将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如果是检测内源性的物质，则是直接进行共聚焦成像，如果是外加检测物的，则是加了检测物后，再次孵育12-16分钟，进行成像。
本发明的优点是：
1.最大激发发射位于近红外区域，穿透力强，损伤小，干扰小。有利于活体组织中的检测。
2.合成简单，检测速度快，检测过程中不需要长时间的孵育。
3.两种检测信号，信噪比高。分别是780nm处的荧光信号的减弱和625nm处信号的增强。两种信号互不干扰。
4.灵敏度高，可以检测到细胞内源性的硫化氢。
附图说明：
图1是本发明的探针HS-CY的荧光强度和硫化氢浓度变化的关系；横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度；（a）为780nm处荧光光谱(b)为625nm处荧光光谱；
图2是本发明的探针HS-CY的相对荧光强度和硫化氢的浓度的工作曲线；横坐标为硫化氢浓度，纵坐标为相对荧光强度；
图3是本发明的探针HS-CY对人肝癌细胞（HepG2）的激光共聚焦显微成像；a为亮场图，b为细胞成像图，c为比率成像图，d为亮场图；
图4是本发明的探针HS-CY对人肺腺癌细胞（A549）的激光共聚焦显微成像；a为亮场图，b为细胞成像图，c为比率成像图，d为细胞成像图，e为细胞成像图，f为比率成像图，g为亮场图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
(1)取Cy7.Cl(2.3g),乙酸钠（1g）用（20mL）无水DMF溶解，在Ar气保护下加热回流3h。混合物冷却后对粗产品进行抽滤。母液低温放置过夜，有红色针状晶体析出。抽滤得酮式花菁。
核磁及质谱表征：
1HNMR(600MHz,CDCl3):δ=1.13(t,J=7.5Hz,6H,),1.37(s,2H,),1.49-1.96(m,16H),3.10(t,J=7.2Hz,4H,),5.64(d,J=13.5Hz,2H),6.0-6.5(d,J=7.8Hz,6H),6.86(t,J=7.5Hz,2H),7.24(m,2H)
ESI-MS:calculated for[M+]=493.1,found493.1。
（2）.合成邻甲酰基苯甲酰氯：邻甲酰基苯甲酸（1.5g,），草酰氯（2.0g），用（20mL）无水CH2Cl2溶解后加入（6μL）DMF，在0℃搅拌3h，得邻甲酰基苯甲酰氯。
ESI-MS:calculated for[M+]=169.00,found169.00。
（3）酮式花菁（1.2g）、三乙胺（3g），溶于（20mL）无水CH2Cl2，冷却至0℃，逐滴加入1.5g邻甲酰基苯甲酰氯并在0℃下搅拌30min，混合物加热至室温，搅拌过夜，抽滤，旋干，用色谱柱进行分离（洗脱剂：V乙酸乙酯：V甲醇=2:1），旋干得绿色固体。
核磁及质谱表征：
1HNMR(600MHz,CD3OD):δ=0.9-1.37(t,J=7.5Hz,6H),1.19(s,12H),1.37(t,J=5.7Hz,2H),5.38(d,J=13.5Hz,2H),6.23(d,J=7.8Hz,2H),7.18-7.72(m,12H),10.2(d,J=13.5Hz,1H).ESI-MS:calculated for[M+]=625.3,found625.3。
实施例2
（1）取Cy7.Cl(0.460g),乙酸钠（0.2g）用（50mL）无水DMF溶解，在Ar气保护下加热80度反应6h。混合物冷却后对粗产品进行抽滤。将滤液真空旋干，得红色油状物。用色谱柱进行分离（洗脱剂：V石油醚：V乙酸乙酯=2:1）），得红色晶体。
核磁及质谱表征：
1HNMR(600MHz,CDCl3):δ=1.13(t,J=7.5Hz,6H,),1.37(s,2H,),1.49-1.96(m,16H),3.10(t,J=7.2Hz,4H,),5.64(d,J=13.5Hz,2H),6.0-6.5(d,J=7.8Hz,6H),6.86(t,J=7.5Hz,2H),7.24(m,2H)
ESI-MS:calculated for[M+]=493.1,found493.1。
（2）.合成邻甲酰基苯甲酰氯：邻甲酰基苯甲酸（1.5g,），氯化亚砜（2.0g），用30mL无水CH2Cl2溶解后加入（5μL）DMF，在0℃搅拌3h，得邻甲酰基苯甲酰氯。
ESI-MS:calculated for[M+]=169.00,found169.00。
（3）酮式花菁（1.2g）、三乙胺（2g），溶于20mL无水CH2Cl2，冷却至0℃，逐滴加入1.5g邻甲酰基苯甲酰氯并在0℃下搅拌30min，混合物加热至室温，搅拌24h，抽滤，旋干，用色谱柱进行分离（洗脱剂：V二氯甲烷：V甲醇=2:1），旋干得绿色固体。
核磁及质谱表征：
1HNMR(600MHz,CD3OD):δ=0.9-1.37(t,J=7.5Hz,6H),1.19(s,12H),1.37(t,J=5.7Hz,2H),5.38(d,J=13.5Hz,2H),6.23(d,J=7.8Hz,2H),7.18-7.72(m,12H),10.2(d,J=13.5Hz,1H).ESI-MS:calculated for[M+]=625.3,found625.3。
效果试验：
1.本发明实施例1的探针HS-CY的荧光强度和硫化氢浓度变化的关系；横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度。探针激发波长为700nm，发射波长为780nm，测试结果显示于如图1，可以看出，在780nm处随着硫化氢浓度增大，荧光逐渐减弱。在625nm处荧光逐渐增强。说明本探针可以用于硫化氢的检测
2.本发明实施例1的探针HS-CY的相对荧光强度和硫化氢的浓度的工作曲线；横坐标为硫化氢浓度，纵坐标为相对荧光强度。
3.本发明实施例1的探针HS-CY对人肝癌细胞（HepG2）的激光共聚焦显微成像；
探针HS-CY对细胞内的荧光成像。HepG2细胞由高糖的DMEM培养液培养，成像前，细胞贴壁于盖玻片上，然后加入1μM探针的PBS缓冲液中，37℃中孵育10分钟，加入20Μm NaHS,然后进行激光共聚焦显微成像。a为亮场图，b为细胞成像图，c为比率成像图，以表明细胞在整个实验过程中仍保持良好的细胞活力。
4.本发明实施例1的探针HS-CY对人肺腺癌细胞（A549）的激光共聚焦显微成像将探针HS-Cy用于的可视化成像检测。图a、图b是将1μM探针孵育在没有经刺激的细胞，细胞荧光很弱；图c、图d是将细胞用100mΜSNP刺激1.5小时后加入，细胞显示出强的荧光。
如上所述，对本发明的实施例进行了详细地说明，但是只要实质上没有脱离本发明的发明点及效果可以有很多的变形，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，这样的变形例也全部包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测细胞内硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，所述的荧光探针结构式如下：
包括步骤如下：
(1)将Cy7荧光染料即2-[4-氯-7-(1-乙基-3(二氢吲哚-2-亚基)-2,3-二甲基]-3,5-(丙烷-1,3-二基)-1,3,5-庚三烯-1-基)-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓、乙酸钠溶解在无水DMF中，在Ar气保护下加热回流2-4h，得到的混合物冷却后抽滤，母液在-4～20℃低温结晶，抽滤得酮式花菁红棕色晶体；
(2)将邻甲酰基苯甲酸、草酰氯溶解在无水CH2Cl2中然后加入少量DMF，在0℃搅拌2-6h，得邻甲酰基苯甲酰氯；
(3)将酮式花菁、三乙胺溶于无水CH2Cl2，冷却至0℃，逐滴加入邻甲酰基苯甲酰氯并在0℃下搅拌10-30min，混合物加热至室温，搅拌过夜，抽滤，旋干，用色谱柱进行分离，旋干得绿色固体。
2.根据权利要求1所述的检测细胞内硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤(1)中所述的Cy7荧光染料、乙酸钠的质量比为2.3：1；无水DMF用量为每克乙酸钠用200-300毫升。
3.根据权利要求1所述的检测细胞内硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤(2)中邻甲酰基苯甲酸、草酰氯、无水CH2Cl2、DMF的用量比例为1.2～3.0：1.0～3.0：20～30：2～6，g：g：mL：μL。
4.根据权利要求1所述的检测细胞内硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤(3)中酮式花菁、三乙胺、无水CH2Cl2、邻甲酰基苯甲酰氯的用量比例为1.2～3.0：3～6：20～30：3～6，g：g：mL：g。
5.根据权利要求1所述的检测细胞内硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤(3)所述的色谱柱分离洗脱剂为V乙酸乙酯：V甲醇＝2:1。
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