CN103604783B - 一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法，具体涉及一类选择性、高灵敏、可逆检测次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的发光检测方法及其应用。一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法，为利用发光探针分子进行检测的方法，所述发光探针分子为具有通式I结构的金属配合物：(L1L2)M-L3Y3。该类金属配合物可做为一类选择性、高灵敏、循环、可逆检测次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环过程的发光探针分子。利用该类发光探针分子可以实现对次氯酸根和硫化氢及其氧化还原过程的循环、可逆检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法，具体涉及一类选择性、高灵敏、可逆检测次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的发光检测方法及其应用。
背景技术
次氯酸根离子广泛应用在人们的日常生活中，例如家用消毒剂和漂白剂等。同时，次氯酸根离子也是生物体内的一种重要活性氧物种。在髓过氧化物酶(MPO)的催化下，过氧化氢和氯离子发生反应，产生次氯酸。正常情况下，生物体内次氯酸根离子的量维持在一个平衡标准水平上，但是当体内髓过氧化物酶的量发生变异后，生物体内次氯酸根离子的量就会失衡，从而诱发各种疾病的产生。例如：心血管疾病（S.Sugiyama,Y.Okada,G.K.Sukhova,R.Virmani,J.W.Heinecke,P.Libby,Am.J.Pathol.2001,158,879–891;S.Sugiyama,K.Kugiyama,M.Aikawa,S.Nakamura,H.Ogawa,P.Libby,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2004,24,1309–1314）、神经元退变(Y.W.Yap,M.Whiteman,N.S.Cheung,Cell.Signalling2007,19,219–228.)、关节炎(M.J.Steinbeck,L.J.Nesti,P.F.Sharkey,J.Parvizi,J.Orthop.Res.2007,25,1128–1135.)，甚至可能诱发癌症等(S.A.Weitzman,L.I.Gordon,Blood1990,76,655–663.)。因此寻找快速、灵敏、专一检测次氯酸根离子的方法，近年来在医学、生物学、生物化学和环境化学等相关领域引起了高度重视。
在生物体及细胞内存在各种各样的信号途径，由于气体信号分子具有可连续产生、传播迅速、快速弥散等特点，引起了人们的广泛关注。自从20世纪90年代以来，人们逐渐认识到硫化氢是存在于生物体内的一种新型的内源性气体信号分子（H.Kimura,Y.Nagai,K.Umemura and Y.Kimura,Antioxid.Redox Signaling,2005,7,795；B.Predmore,D.Lefer and G.Gojon,Antioxid.Redox Signaling,2012,17,119.）。该气体可以通过酶的催化作用，在生物体内的很多器官中产生。尽管硫化氢的代谢途径仍然不是很清楚，但是近年来越来越多的研究结果证实，H2S在自发性高血压、慢性阻塞性肺气肿、脓毒血症或出血性休克、阿尔茨海默病、胃黏膜损伤以及肝硬化等多种疾病的产生过程中发挥着非常重要的病理生理学效应（Geng B.Yang J.Qi Y H2S generated by heart in ratand effects on cardiac function2004(02）.Geng B.Chang L.Pan CS Endogenous hydrogensulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol2004(03）。因此迫切需要寻找到能够灵敏检测体内硫化氢含量的检测方法，实现对硫化氢的有效监控。
目前，关于检测次氯酸根（Lin Yuan,Weiying Lin,Jizeng Song,Yueting Yang.,Chem.Commun.2011,47,12691–12693;Zhangrong Lou,Peng Li,Qiang Pan,Keli Han.,Chem.Commun.,2013,49,2445-2447）和硫化氢（H.Peng,Y.Cheng,C.Dai,A.King,B.Predmore,D.Lefer,B.Wang,Angew.Chem.,Int.Ed.,2011,50,9672;Y.Qian,J.Karpus,O.Kabil,S.Zhang,H.Zhu,R.Banerjee,J.Zhao and C.He,Nat.Commun.,2012,2,495）的荧光探针都分别已有相关报道。鉴于次氯酸根和硫化氢可以在生物体内共存，研究具有可逆氧化还原活性，既能够被次氯酸根氧化，又能够被硫化氢还原的荧光探针分子，从而实现对次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的选择性、高灵敏、循环、可逆检测，开发新型荧光探针分子及其应用方法，具有十分重要的理论和实用价值。
总结发现，现有报道中都是采用有机化合物作为荧光探针，而大部分有机化合物的缺点就是氧化还原稳定性差，无法实现可逆、循环检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法。本发明利用三联吡啶钌金属配合物具有光稳定性好，斯托克斯位移大，发光量子产率适中，且该类金属配合物具有良好的可逆氧化还原活性的特点，将其用于对次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环的选择性、高灵敏、循环、可逆检测。
一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法，包括下述步骤：
①将已知次氯酸根浓度标准样品和发光探针分子溶于缓冲溶液中，测定体系发光强度，建立次氯酸根浓度与发光探针分子发光强度关系；
②将已知硫化氢浓度标准样品加入步骤①所得被氧化的发光探针分子缓冲溶液中，测定体系发光强度，建立硫化氢浓度与发光探针分子发光强度关系；
③将待测次氯酸根样品和发光探针分子溶于缓冲溶液中，测定体系发光强度，根据步骤①所得次氯酸根浓度与体系发光强度关系，确定待测次氯酸根样品中次氯酸根的浓度；
④将待测硫化氢样品加入步骤③所得溶液中，测定体系发光强度，根据步骤②所得硫化氢浓度与体系发光强度关系，确定待测硫化氢样品中硫化氢的浓度；
其中，所述发光探针分子为具有通式I结构的金属配合物：
(L1L2)M-L3Y3
I
式I中，M为Ru或Os；
Y为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -或OTs-；
L1和L2各自独立地选自如下配体：
其中，R1和R2各自独立地选自H、C1-18烷基、CHO、COOH、NH2、C1-6烷基氨基、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6酰胺基、C1-6烷基取代或未取代的苄基、卤素或C1-6卤代烷基。
L3选自如下配体：
其中，R3为H、CH3或R4；
R4选自具有通式PTZ1、PTZ2或PTZ3的基团，
式中：n=1～18，m=0～18
上述方法中，优选所述缓冲溶液为磷酸、硼酸或Tris-HCl缓冲溶液；
上述方法中，优选所述缓冲溶液的浓度为0.01～1M；
上述方法中，优选缓冲溶液的pH=7.4。
上述方法中，发光探针分子发光强度的测定可于任意商业购得的荧光检测仪器中进行，如美国Pekin-Elmer LS55型荧光检测器。
上述方法中，优选所述发光探针分子发光强度按下述方法确定：对溶液进行荧光光谱扫描，激发光波长为450nm，发射波长扫描范围为470nm～700nm。
上述方法中，优选所述发光探针分子在缓冲溶液中的浓度为1×10-5mol/L。
本发明所述L1、L2和L3配体中的两个N原子与M形成配位键。
本发明所述可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法优选所述L1和L2各自独立地选自如下配体：
其中，R1和R2各自独立地选自H和C1-6烷基。
本发明所述可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法优选所述L3选自如下配体：
其中，R3为H或CH3；R4选自具有通式PTZ2或PTZ3的基团，式中，m=0，n=2～6。
本发明所述可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法最优选所述发光探针分子选自下述金属配合物中的一种：
本发明所述发光探针分子优选按下述文献公开的方法制备：中国发明专利，公开号101531683A，分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇ECL标记物。
以Ru-PTZ为例，本发明发光探针分子的工作原理是：
发光探针分子中吩噻嗪基团上的S原子可以被ClO-氧化成S=O，使体系的发光显著增强。而H2S可以将S=O还原，使探针分子回到初始状态，体系的发光被淬灭。只要探针分子中带有吩噻嗪基团，就可以进行上述可逆氧化还原循环反应，通过体系发光强度的变化实现对次氯酸根和硫化氢的检测。
本发明的有益效果是：本发明所述发光探针分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇金属配合物具有氧化还原可逆性。该类配合物可以选择性、高灵敏检测次氯酸根，过程中伴随显著的发光增强。达到平衡时，整个体系还可以对硫化氢产生专一性、高灵敏响应，使发光淬灭并恢复到初始状态。上述过程可不断循环往复，因此该类金属配合物可做为一类选择性、高灵敏、循环、可逆检测次氯酸根和硫化氢及其氧化还原循环过程的发光探针分子。利用该类发光探针分子可以实现对次氯酸根和硫化氢及其氧化还原过程的循环、可逆检测。
附图说明
图1是实施例1，1×10-5mol/L的Ru-PTZ分别和相同浓度的（1×10-4mol/L）次氯酸钠、钼酸钠、H2O2、·OH，在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针对各活性氧物种的响应情况。
其中横坐标为响应时间；纵坐标为加入不同的活性氧物种后探针的发光强度减去加入不同的活性氧物种前探针的发光强度，即混合溶液的发光强度减去探针空白溶液的发光强度。
图2是实施例2，1×10-5mol/L的Ru-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的变化情况。
其中横坐标为波长，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对其响应的发光强度值。
图3是实施例2，1×10-5mol/L的Ru-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强，并逐渐达到平衡的情况。
其中横坐标为所加入次氯酸钠的浓度，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对其响应的发光强度值。
图4是实施例2，1×10-5mol/L的Ru-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强的线性关系情况。
其中横坐标为所加入次氯酸钠浓度的对数，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对次氯酸钠浓度响应后的发光强度值。
图5是实施例3，验证1×10-5mol/L的Ru-PTZ在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，对次氯酸钠的高选择性图示。
其中横坐标为向检测体系中所加入的被检测组份，纵坐标为加入被检测组份后探针的发光强度减去加入被检测组份前探针的发光强度的差值，即混合物的发光强度减去Ru-PTZ空白溶液的发光强度的差值。
图6是实施例4，1×10-5mol/L的Ru-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的变化情况。
其中横坐标为波长，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对其响应的发光强度值。
图7是实施例4，1×10-5mol/L的Ru-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强，并逐渐达到平衡的情况。
其中横坐标为所加入的次氯酸钠的浓度，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对其响应的发光强度值。
图8是实施例5，1×10-5mol/L的Ru-A-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的变化情况。
其中横坐标为波长，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对其响应的发光强度值
图9是实施例5，1×10-5mol/L的Ru-A-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强，逐渐达到平衡的情况。
其中横坐标为所加入的次氯酸钠的浓度，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对其响应的发光强度值。
图10是实施例5，1×10-5mol/L的Ru-A-PTZ和次氯酸钠在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随次氯酸钠浓度的增加而增强的线性关系情况。
其中横坐标为所加入次氯酸钠浓度的对数，纵坐标为加入次氯酸钠后，探针对次氯酸钠响应后的发光强度值减去加入次氯酸钠前探针空白溶液的发光强度值，即混合溶液的发光强度减去探针空白溶液的发光强度的差值。
图11是实施例6，1×10-5mol/L的Ru-PTZ、1×10-4mol/L的次氯酸钠体系，和硫化氢在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随硫化氢浓度的变化情况。
其中横坐标为波长，纵坐标为加入硫化氢后，探针对其响应的发光强度值。
图12是实施例6，1×10-5mol/L的Ru-PTZ、1×10-4mol/L的次氯酸钠体系，和硫化氢在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随硫化氢浓度的增加而降低，并逐渐达到平衡的情况。
其中横坐标为所加入的硫化氢样品浓度，纵坐标为加入硫化氢后，探针对其响应的发光强度值。
图13是实施例6，1×10-5mol/L的Ru-PTZ、1×10-4mol/L的次氯酸钠体系，和硫化氢在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，利用荧光检测器测得的探针的发光强度随硫化氢浓度的增加而降低的线性关系情况。
其中横坐标为所加入硫化氢浓度的对数，纵坐标为加入硫化氢后，探针对硫化氢响应后的发光强度值。
图14是实施例7，验证1×10-5mol/L的Ru-PTZ、1×10-4mol/L的次氯酸钠体系在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，对硫化氢高选择性图示。
其中横坐标为向检测体系中所加入的被检测组份，纵坐标为加入被检测组份后探针的发光强度值。
图15是实施例8，考察1×10-5mol/L的Ru-PTZ在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，对次氯酸钠和硫化氢的可逆循环响应图示。
其中横坐标为循环次数，纵坐标为加入次氯酸钠或硫化氢后，探针对其发光强度响应值。
图16是实施例11，利用1×10-5mol/L的Ru-PTZ（pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液），监控细胞内探针对次氯酸钠响应的发光成像情况。
其中(a)是细胞在1×10-5mol/L的Ru-PTZ探针中孵育150min后，用450nm波长激发，在470nm-700nm发射范围接收的发光成像情况；(b)是细胞在1×10-5mol/L的Ru-PTZ探针中孵育150min后的明场成像；(c)是图(a)与(b)相互叠加的结果。(d)是细胞在1×10-5mol/L的Ru-PTZ探针中孵育120min后，再加入少量佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸醋（PMA），继续培育30min后，用450nm波长激发，在470nm-700nm发射范围接收的发光成像情况；(e)是与(d)对应的明场成像；(f)是图(d)与(e)相互叠加的结果。
图17是实施例12，利用1×10-5mol/L的Ru-PTZ在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，监控次氯酸钠和硫化氢在小白鼠活体内氧化还原循环时的发光成像情况。
其中（a）是向小白鼠腿部皮层注射1×10-5mol/L的Ru-PTZ后的发光成像情况；（b）是向上述小白鼠腿部皮层注射过1×10-5mol/L的Ru-PTZ的位置，再注入1×10-4mol/L的ClO-后的发光成像情况；（c）是向上述小白鼠腿部皮层注射过1×10-5mol/L的Ru-PTZ和1×10-4mol/L的ClO-的位置，再次注入1×10-4mol/L H2S后的发光成像情况；(d)是向上述小白鼠腿部皮层注射过H2S的位置，再次注入1×10-4mol/L ClO-后的发光成像情况。
表1是实施例9，利用1×10-5mol/L的Ru-PTZ在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，对不同浓度次氯酸钠回收率的测定结果。
表2是实施例10，利用1×10-5mol/L的Ru-PTZ、1×10-4mol/L次氯酸钠体系在pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中，对不同浓度硫化氢回收率的测定结果。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所用Ru-PTZ按下述方法制备：
孙世国，孙立成，杨洋，彭孝军，樊江莉，刘凤玉。分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇ECL标记物，中国发明专利（公开号101531683A）实施例1所记载方法制备。
实施例1
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入相同浓度（1×10-4mol/L）不同种类的活性氧物种（所加入的活性氧物种为：次氯酸钠、钼酸钠、H2O2、·OH），考察探针对不同活性氧物种的响应情况。从图1可以看出，相比其他的活性氧物种，探针对次氯酸钠具有专一、高灵敏响应，并且响应非常迅速。
实施例2
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入不同浓度的次氯酸钠，观察其对探针发光强度的影响。通过图2可以观察到，向检测体系中加入次氯酸钠后，探针的发光强度随次氯酸钠浓度均匀增加，同时结合图3可知，当次氯酸钠的浓度达到1×10-4mol/L时，探针的发光强度增加达到饱和，此后探针的发光强度不再随次氯酸钠浓度的增加而变化。根据图4可知，探针的发光强度值（LMax）与次氯酸钠浓度的对数（log[ClO-]）在1×10-9mol/L～1×10-4mol/L次氯酸钠浓度范围内呈现良好的线性关系，线性方程为：LMax=546.28+54.38log[ClO-]，线性相关系数为0.9961。根据公式计算(LOD=3σ/k，式中：σ代表次氯酸钠加入之前探针发光强度的标准偏差，k代表探针发光强度与次氯酸钠浓度对数之间线性关系的斜率)可知，次氯酸钠的检测限为1.8×10-11mol/L。
实施例3
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入不同种类，1×10-4mol/L的干扰离子或物质，然后再加入1×10-4mol/L的次氯酸钠，考察所加入的干扰离子或物质，是否会对检测产生影响，从而考察探针对次氯酸钠的选择性。根据图5可知，探针对所加入的几种干扰离子或物质的响应较弱，而对次氯酸钠具有很强的响应。所以即使在上述干扰组份或物质存在的情况下，探针仍然会对次氯酸钠产生专一性、高灵敏的响应。
实施例4
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入不同浓度的次氯酸钠，观察其对探针发光强度的影响。通过图6可以看到，当向检测体系中加入次氯酸钠后，探针的发光强度随次氯酸钠浓度均匀增加，同时结合图7可知，当次氯酸钠的浓度达到1×10-4mol/L时，探针的发光强度增加达到饱和，此后探针的发光强度不再随次氯酸钠浓度的增加而变化。
实施例5
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-A-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。向检测体系中加入不同浓度的次氯酸钠，观察其对探针发光强度的影响。通过图8可以观察到，当向检测体系中加入次氯酸钠后，探针的发光强度随次氯酸钠浓度均匀增加，同时结合图9可知，当次氯酸钠浓度达到1×10-4mol/L时，探针的发光强度增加达到饱和，此后探针的发光强度不再随次氯酸钠浓度的增加而变化。根据图10可知，加入次氯酸钠后探针发光强度与加入次氯酸钠前探针发光强度的差值(ΔLMax)与次氯酸钠浓度的对数（log[ClO-]）在1×10-9mol/L～1×10-6mol/L次氯酸钠浓度范围内呈现良好的线性关系，线性方程为：ΔLMax=54.3315+3.15321log[ClO-]，线性相关系数为0.99298。根据公式计算(LOD=3σ/k，式中：σ代表次氯酸钠加入之前探针发光强度的标准偏差，k代表探针发光强度与次氯酸钠浓度对数之间线性关系的斜率)可知，次氯酸钠的检测限为1.01×10-9mol/L。
实施例6
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。根据实施例2的实验数据，先向体系中加入1×10-4mol/L的次氯酸钠，使探针的发光强度达到最大值，然后向体系中再加入不同浓度的硫化氢，观察加入硫化氢后，探针发光强度变化情况。通过图11可以看到，当向检测体系中加入硫化氢后，探针的发光强度随硫化氢浓度的增加而均匀降低。同时结合图12可知，当硫化氢样品的浓度达到1×10-4mol/L时，探针的发光强度降到最低，此后探针的发光强度不再随硫化氢样品浓度的增加而变化。同时结合图13可知，探针的发光强度值（LMax）与硫化氢样品浓度的对数值（log[H2S]）在1×10-9mol/L～1×10-4mol/L硫化氢浓度范围内呈现良好的线性关系，线性方程为：LMax=231.9194-62.6113log[H2S]，线性相关系数为0.99308。根据公式计算(LOD=3σ/k，式中：σ代表硫化氢加入之前探针发光强度的标准偏差，k代表探针发光强度与硫化氢浓度对数之间线性关系的斜率)可知，硫化氢的检测限为1.2×10-11mol/L。
实施例7
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。为了考察Ru-PTZ、次氯酸钠体系对硫化氢样品的选择性，向检测体系中加入不同种类的还原性物质，观察Ru-PTZ、次氯酸钠体系对硫化氢和其它还原性物质的响应情况。根据图14可以看到，当向体系中加入不同种类的还原性物质时，Ru-PTZ、次氯酸钠体系对硫化氢具有高度的选择性，同时响应时间较短，能够迅速实现对硫化氢样品的检测。
实施例8
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。为了考察Ru-PTZ发光探针对次氯酸钠和硫化氢的循环响应性能，分别向体系中加入次氯酸钠和硫化氢样品，加入次氯酸钠后，使探针的发光强度值达到最大，然后再向体系中加入足以使发光强度回到原始值的硫化氢样品，如此反复。结果如图15所示，根据图15得出，该探针可以对次氯酸钠和硫化氢样品进行循环检测，循环次数在10次以上。
实施例9
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。为了考察利用Ru-PTZ作为发光探针检测次氯酸钠的准确性，分别配制4种不同浓度的次氯酸钠溶液：5.0×10-9mol/L；1.0×10-7mol/L；5.0×10-6mol/L；1.0×10-4mol/L，并利用1×10-5mol/L的Ru-PTZ对上述4种不同浓度的次氯酸钠溶液分别进行发光检测，每一种浓度分别检测三次。将每一次探针对次氯酸钠的响应发光强度值代入实施例2所得的线性方程中，得到待测次氯酸钠溶液的相应浓度。将三次检测所得响应浓度的平均值作为检测浓度，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。结果如表1所示。由表1中数据分析可知，利用该探针检测次氯酸钠时，回收率在98.7%-111%范围内波动。相对标准偏差不超过1.54%。这些结果都表明利用Ru-PTZ作为发光探针对次氯酸钠进行检测是非常可靠的。
表1发光探针Ru-PTZ（10μM，pH=7.4，0.1M PBS）检测次氯酸钠回收率结果
实施例10
使用LS55型荧光检测器，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，设定激发光波长为450nm，扫描波长范围为470nm-700nm，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。为了考察利用Ru-PTZ、次氯酸钠体系检测硫化氢的准确性，分别配制4个不同浓度的硫化氢溶液：1.0×10-8mol/L；1.0×10-7mol/L；1.0×10-6mol/L；1.0×10-4mol/L，并利用1×10-5mol/L的Ru-PTZ、1.0×10-4mol/L的次氯酸钠体系对上述4种不同浓度的硫化氢溶液分别进行发光检测，每一种浓度分别检测三次。将每一次探针对硫化氢的响应发光强度值代入实施例6所得的线性方程中，得到响应的检测浓度。将三次检测所得响应浓度的平均值作为检测浓度，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。结果如表2所示。利用该体系检测硫化氢时，回收率在102%-105%范围内波动。相对标准偏差不超过5.8%。这些结果都表明利用Ru-PTZ、次氯酸钠体系对硫化氢进行发光检测是非常可靠的。
表2发光探针Ru-PTZ的氧化态（10μM Ru-PTZ+1.0×10-4mol/L次氯酸钠，pH=7.4，0.1M PBS）检测硫化氢回收率结果
实施例11
利用pH=7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，配制1×10-5mol/L Ru-PTZ发光探针溶液。量取40μL探针溶液加入到带有2mL培养基的MCF-7（人乳癌细胞）细胞培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育150min。然后在激光共聚焦扫描显微镜上(TCS-SP2,Germany)观察细胞形态。相同条件下，取40μL的探针溶液加到另外一个细胞培养皿中，培养120min后加少量佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸醋（PMA），再培育30min后在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞形态。选取代表性区域，用450nm波长激发，选用470nm-700nm接收通道接收发射光。如图16(a)，(b)，(c)所示，当只向细胞中注入Ru-PTZ时，由于没有次氯酸，探针在细胞中呈现出较弱的发光强度。如图16(d)，(e)，(f)所示，在PMA的刺激下，细胞内产生次氯酸，产生的次氯酸使探针的发光明显增强。
实施例12
使用NightOWL II LB983活体荧光成像系统，选择Ru-PTZ发光探针分子的浓度为1×10-5mol/L，所使用的缓冲溶液为pH=7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。激发光波长为450nm，使用600-620nm的滤光片接收发射光。为了考察探针对于活体内部的次氯酸钠和硫化氢的氧化还原响应情况，选择小白鼠活体进行发光成像实验。首先，向小白鼠腿部皮层注射1mL1×10-5mol/L Ru-PTZ，其发光成像如图17（a）所示，从图17(a)可以看出，单独的1×10-5mol/L Ru-PTZ显现出比较弱的发光强度。然后，再向小白鼠腿部皮层相同的位置注射1.0×10-4mol/L的次氯酸钠，发光成像如图17（b）所示。从图17(b)可以看出，当向注射过1×10-5mol/L Ru-PTZ的位置，再次注射次氯酸钠后，发光强度明显增强。其次，再向上述小白鼠腿部皮层相同的位置注射1.0×10-4mol/L的硫化氢，发光成像如图17（c）所示。从图17（c）可以看出，当向注射过1×10-5mol/L Ru-PTZ和1.0×10-4mol/L次氯酸钠的位置，再次注射硫化氢后，探针的发光强度恢复到了原始水平。最后，再次向上述小白鼠腿部皮层相同位置注射1.0×10-4mol/L的次氯酸钠，其发光成像如图17（d）所示。从图17（d）可以看到，虽然注射过硫化氢后，探针的发光强度恢复到了原始水平，但当探针再次遇到次氯酸钠后，其发光强度再次显著增强。上述实验结果表明，该探针能够应用于监控小白鼠活体内部次氯酸钠和硫化氢的氧化还原循环过程。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。本发明的实施例中采用磷酸盐缓冲体系，其他缓冲体系在适当的pH值下，利用上述发光探针分子也能达到相似的检测效果，也应当属于本发明的保护范围。本发明的实施例中只列举了几种利用分子内带有吩噻嗪供电基团的发光探针分子，通过发光分析法检测次氯酸根和硫化氢的方法，其他种类的分子内带有吩噻嗪供电基团的发光探针分子也可以在适当的条件下应用到次氯酸根和硫化氢的检测中，都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种可逆检测次氯酸根和硫化氢的方法，包括下述步骤：
①将已知次氯酸根浓度标准样品和发光探针分子溶于缓冲溶液中，测定体系发光强度，建立次氯酸根浓度与发光探针分子发光强度关系，其中，所述缓冲溶液为磷酸、硼酸或Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液的pH＝7.4；
②将已知硫化氢浓度标准样品加入步骤①所得被氧化的发光探针分子缓冲溶液中，测定体系发光强度，建立硫化氢浓度与发光探针分子发光强度关系；
③将待测次氯酸根样品和发光探针分子溶于缓冲溶液中，测定体系发光强度，根据步骤①所得次氯酸根浓度与体系发光强度关系，确定待测次氯酸根样品中次氯酸根的浓度；
④将待测硫化氢样品加入步骤③所得溶液中，测定体系发光强度，根据步骤②所得硫化氢浓度与体系发光强度关系，确定待测硫化氢样品中硫化氢的浓度，
其中，所述发光探针分子为具有通式I结构的金属配合物：
(L1L2)M-L3Y3
I
式I中，M为Ru或Os；
Y为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -或OTs-；
L1和L2各自独立地选自如下配体：
其中，R1和R2各自独立地选自H、C1-18烷基、CHO、COOH、NH2、C1-6烷基氨基、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6酰胺基、C1-6烷基取代或未取代的苄基、卤素或C1-6卤代烷基，
L3选自如下配体：
其中，R3为H、CH3或R4；
R4选自具有通式PTZ1、PTZ2或PTZ3的基团，
式中：n＝1～18，m＝0～18
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述L1和L2各自独立地选自如下配体：
其中，R1和R2各自独立地选自H和C1-6烷基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述L3选自如下配体：
其中，R3为H或CH3；R4选自具有通式PTZ2或PTZ3的基团，式中，m＝0，n＝2～6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发光探针分子选自下述金属配合物中的一种：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发光探针分子发光强度按下述方法确定：对溶液进行发光光谱扫描，激发光波长为450nm，发射波长扫描范围为470nm～700nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发光探针分子在缓冲溶液中的浓度为1×10-5mol/L。
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