CN105928912A - 一种肝素的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝素的检测方法，通过将3，4，9，10‑苝四甲酸二酐与氢氧化钠在一定条件下合成3，4，9，10‑苝四酸，通过3，4，9，10‑苝四酸(PTCA)与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)结合，形成PTCA/CTAB复合物，随着CTAB浓度的增大，体系荧光强度逐渐升高，当往上述体系中加入肝素后，肝素能夺取PTCA/CTAB复合物中的CTAB形成较稳定的肝素/CTAB复合物，从而使PTCA的荧光恢复。以肝素浓度为X轴，对应的荧光淬灭比率为Y轴作图，得到肝素浓度与荧光猝灭比率之间的线性方程为F＝‑26.0C+551.58且线性相关系数R2为0.9895，根据线性方程通过检测溶液中加入肝素后的荧光强度猝灭比率进而判断溶液中肝素的浓度。

Description

一种肝素的检测方法
技术领域
本发明设计一种肝素的检测方法，具体涉及一种以3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵复合溶液作为荧光探针检测肝素的方法。
背景技术
肝素(heparin)是目前已知的负电性最强的生物分子，存在于动物组织的肥大细胞中。众所周知，肝素具有很多医学方面的应用。比如，它被广泛的用于抗血栓，抑制人体免疫缺陷病毒的增长和复制，抑制血管生长从而抑制肿瘤生长。在心血管手术和处理紧急情况下静脉血栓形成中肝素的剂量为2-8U mL-1，在术后和长期治疗中肝素的剂量为0.2-1.2U mL-1。肝素过量会导致许多副作用，最常见的有导致大量出血，肝素诱导血小板减少症和骨质疏松症。因此，在治疗学药物和血液中检测肝素是非常有必要的。
目前，对肝素最常用的检测方法有比色法，吸收法和电化学免疫分析法。尽管有些方法具有很好的敏感性和特异性，但是仍具有检测不精确，操作复杂，耗时且重现性差等不足。
发明内容
针对以上不足，本发明提供了一种肝素的检测方法，通过合成3，4，9，10-苝四酸，并以3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵复合溶液作为荧光探针，定量检测肝素浓度。
本发明采取的技术方案为：
一种3，4，9，10-苝四酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将3，4，9，10-苝四甲酸二酐与氢氧化钠在水溶液中95℃-100℃下回流反应5h-6h，再将反应液进行酸化，即可制得3，4，9，10-苝四酸。
所述3，4，9，10-苝四甲酸二酐与氢氧化钠的物质的量之比为1：3～5；3，4，9，10-苝四甲酸二酐在水溶液中的浓度为0.04～0.06mol/L。
所述酸化所用溶液为盐酸溶液，其与3，4，9，10-苝四甲酸二酐的物质的量之比为1：25～30。
本发明还提供了上述3，4，9，10-苝四酸在检测肝素中的应用。
本发明还提供了一种肝素的检测方法，通过向3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合体系中加入不同浓度的肝素，通过肝素浓度与荧光淬灭比率(F0-F)/F0之间的线型关系定量检测出肝素的浓度；
F0、F分别为3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合体系加入肝素前后在488nm处的荧光强度值。
所述检测方法具体包括以下步骤：
A.配置多组3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合溶液：分别将3，4，9，10-苝四酸水溶液与十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，反应2～5分钟；
B.向上述复合溶液中依次加入浓度范围在0～60U mL-1的肝素水溶液与pH值为9.0～10.6的Na2HPO4-Na3PO4缓冲溶液，并用去离子水稀释至10mL，继续搅拌反应20～30分钟，测量体系的荧光强度；
C.以肝素浓度为X轴，对应的荧光淬灭比率(F0-F)/F0为Y轴作图，得到肝素浓度与荧光猝灭比率(F0-F)/F0之间的线性方程，根据线性方程可计算出任意荧光强度F所对应的肝素浓度；
所述3，4，9，10-苝四酸与十六烷基三甲基溴化铵的终浓度分别为2.75×10-7mol L-1和2.5×10-6molL-1；
所述肝素的终浓度分别为0、1.0U mL-1、2.0U mL-1、2.75U mL-1、3.5U mL-1、4.7U mL-1、5.5U mL-1和6.0U mL-1。
所述肝素浓度与荧光猝灭比率之间的线性方程为F＝-26.0C+551.58，C为肝素浓度。
所述Na2HPO4-Na3PO4缓冲溶液的pH优选为9.5。
所述检测方法具体包括以下步骤：
A.配置多组3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合溶液：分别将1mL浓度为2.75×10-6mol L-1的3，4，9，10-苝四酸水溶液与1mL浓度为2.5×10-5mol L-1的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，反应2分钟；
B.向上述复合溶液中依次加入1mL浓度分别0、10U mL-1、20U mL-1、27.5U mL-1、35U mL-1、47U mL-1、55U mL-1、60U mL-1的肝素水溶液与1mLpH值为9.5的Na2HPO4-Na3PO4缓冲溶液，并用去离子水稀释至10mL，此时肝素的终浓度分别为0、1.0U mL-1、2.0U mL-1、2.75U mL-1、3.5U mL-1、4,7U mL-1、5.5U mL-1、6.0U mL-1；继续搅拌反应20分钟，测量各体系的荧光强度；
C.以肝素浓度为X轴，对应的荧光淬灭比率(F0-F)/F0为Y轴作图，得到肝素浓度与荧光猝灭比率之间的线性方程为F＝-26.0C+551.58且线性相关系数R2为0.9895，根据线性方程可计算出任意荧光强度F所对应的肝素浓度。
所述的检测方法能够排除其它生物分子的干扰，对肝素的检测限可以达到0.00032U mL-1。
本发明将3，4，9，10-苝四甲酸二酐与氢氧化钠在一定条件下合成3，4，9，10-苝四酸(PTCA)，通过3，4，9，10-苝四酸(PTCA)与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)结合，形成PTCA/CTAB复合物，随着CTAB浓度的增大，体系荧光强度逐渐升高，当往上述体系中加入肝素后，肝素能夺取PTCA/CTAB复合物中的CTAB形成较稳定的肝素/CTAB复合物，从而使PTCA的荧光恢复。
此检测方法操作简单，分析速度快且具有高的敏感性，并且可以排除其它生物分子的干扰，因而是一种方便快捷的检测肝素的方法。
附图说明
图1为3，4，9，10-苝四酸合成的化学方程式；
图2为3，4，9，10-苝四酸溶液中加入不同浓度的十六烷基三甲基溴化铵溶液后的荧光光谱图，图中曲线由下至上所对应的十六烷基三甲基溴化铵的浓度依次为0、0.25×10-6mol L-1、0.5×10-6mol L-1、0.75×10-6mol L-1、1.25×10-6mol L-1、1.75×10-6mol L-1、2×10-6mol L-1、2.75×10-6mol L-1、3.5×10-6molL-1；
图3为3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵体系中加入不同浓度的肝素溶液后的荧光光谱图，图中曲线由上至下所对应的肝素浓度依次为0，1.0U mL-1、2.0U mL-1、2.75U mL-1、3.5U mL-1、4.7UmL-1、5.5U mL-1和6.0U mL-1、；
图4为不同PH与荧光淬灭比率之间的关系图；
图5为肝素浓度与荧光淬灭比率之间的线性关系图；
图6为3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵体系中加入肝素和其它生物分子的荧光猝灭强度图；
图7为CTAB浓度对体系荧光猝灭效率的影响图。
具体实施方式
肝素钠，又称肝素，购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为H104201-1.0g,规格为185USPunits/mg。
其它化合物及原料均可从市场上的厂家直接购买得到。
实施例1
一种3，4，9，10-苝四酸(PTCA)的制备方法，包括以下步骤：
将3，4，9，10-苝四甲酸二酐(0.013mol，5g)和氢氧化钠(0.05mol，2.0g)溶解在250mL水中，混合液在95℃下回流反应6h，冷却，过滤，再向滤液中加入5mL浓度为0.1mol L-1的盐酸进行酸化，过滤，得到3，4，9，10-苝四酸(PTCA)固体，4℃冷藏备用。
实施例2
一种3，4，9，10-苝四酸(PTCA)的制备方法，包括以下步骤：
将3，4，9，10-苝四甲酸二酐(0.013mol，5g)和氢氧化钠(0.065mol，2.6g)溶解在220mL水中，混合液在100℃下回流反应5h，冷却，过滤，再向滤液中加入4mL浓度为0.15mol L-1的盐酸进行酸化，过滤，得到3，4，9，10-苝四酸(PTCA)固体，4℃冷藏备用。
实施例3
一种3，4，9，10-苝四酸(PTCA)的制备方法，包括以下步骤：
将3，4，9，10-苝四甲酸二酐(0.013mol，5g)和氢氧化钠(0.055mol，2.2g)溶解在260mL水中，混合液在95℃下回流反应5.5h，冷却，过滤，再向滤液中加入6mL浓度为0.08mol L-1的盐酸进行酸化，过滤，得到3，4，9，10-苝四酸(PTCA)固体，4℃冷藏备用。
实施例4
3，4，9，10-苝四酸(PTCA)与不同浓度的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)混合体系的荧光测试实验
在终浓度为2.75×10-7mol L-1的PTCA溶液中分别加入终浓度为0、0.25×10-6mol L-1、0.5×10-6molL-1、0.75×10-6mol L-1、1.25×10-6mol L-1、1.75×10-6mol L-1、2×10-6mol L-1、2.75×10-6mol L-1、3.5×10-6mol L-1CTAB溶液，分别测量各体系的荧光强度，其荧光光谱图如图2所示。
3，4，9，10-苝四酸(PTCA)溶液具有很弱的荧光强度，当加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)后，1，8-萘二胺的荧光强度随着十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)浓度的增加而逐渐增强，当加入的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)浓度为5×10-6mol L-1时，3，4，9，10-苝四酸(PTCA)的荧光强度几乎不再增强。说明十六烷基三甲基溴化铵CTAB对3，4，9，10-苝四酸(PTCA)的荧光有增强作用。
这主要是由于溶液中3，4，9，10-苝四酸(PTCA)与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)之间存在静电作用和π-π作用，使3，4，9，10-苝四酸(PTCA)的荧光强度迅速增强。
PTCA与CTAB的浓度既能影响体系的荧光强度，又能影响实验的灵敏度，因此，实验中选择PTCA的终浓度为2.75×10-7mol L-1。CTAB浓度对体系荧光猝灭效率的影响如图7所示。从图7中可以看出，当CTAB的浓度为2.5×10-6mol L-1时，体系的荧光猝灭效率最大。因此，实验中选取终浓度为2×10-6molL-1的CTAB溶液进行肝素的检测实验。
实施例5
一种肝素的检测方法，包括以下步骤：
A.配置多组3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合溶液：分别将1mL浓度为2.75×10-6mol L-1的3，4，9，10-苝四酸水溶液与1mL浓度为2.5×10-5mol L-1的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，反应2分钟；
B.向上述复合溶液中依次向上述复合溶液中依次加入1mL浓度分别为0、10U mL-1、20U mL-1、27.5U mL-1、35U mL-1、47U mL-1、55U mL-1、60U mL-1的肝素水溶液与1mLpH值为9.5的Na2HPO4-Na3PO4缓冲溶液，并用去离子水稀释至10mL，此时肝素的终浓度分别0、1.0U mL-1、2.0U mL-1、2.75UmL-1、3.5U mL-1、4.7U mL-1、5.5U mL-1、6.0U mL-1；继续搅拌反应20分钟，测量各体系的荧光强度。
各体系的荧光光谱图如图3所示，当加入肝素时，肝素与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的结合能力大于3，4，9，10-苝四酸(PTCA)与CTAB的结合能力，从而将3，4，9，10-苝四酸(PTCA)释放出来，随着肝素浓度的增加，体系的荧光强度逐渐降低；
C.以肝素浓度为X轴，对应的荧光淬灭比率(F0-F)/F0为Y轴，F0、F分别为3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合体系加入肝素前后在488nm处的荧光强度值，在直角坐标系中作图，如图5所示，得到肝素浓度与荧光强度F之间的线性方程为F＝-26.0C+551.58，且线性相关系数(R2)为0.9895，根据线性方程通过检测溶液中加入肝素后的荧光强度进而判断溶液中肝素的浓度。
实施例6
3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵对肝素检测方法的优化
3，4，9，10-苝四酸(PTCA)检测的灵敏度和稳定性等都与溶液的pH值有关，因此，为了提高肝素检测的速度和灵敏度，必须要找到最适宜的pH值。实验中选取磷酸氢二钠缓冲溶液作为缓冲溶液，肝素溶液为样品，对3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵检测肝素的适宜pH值进行测定，体系中，PTCA浓度为2.75×10-7mol L-1；CTAB浓度为2.5×10-6mol L-1；肝素浓度为5.0U mL-1。
从图4中可以看出pH值在2.5-9.5范围时，肝素的检测效果随pH值的增加而增加；出现这种现象的原因可能是随着pH的增加，溶液中的H+随着减少，3，4，9，10-苝四酸(PTCA)中的H+易被解离，PTCA易于和CTAB形成复合物，导致荧光强度增强，灵敏度增大。当pH值大于9.5时，检测效果随pH值的增加而下降，主要是因为在pH值大的溶液中含有大量的OH－易与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)反应不利于肝素的检测。因此，在实验中选取在pH值为9.5的条件下进行肝素检测的实验。
实施例7
3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵对肝素检测的选择性实验
选择常见的生物分子(如透明质酸(HA)，L-半胱氨酸(L-Cysteine)，甘氨酸(Glycine)，酪氨酸(Tyrosline)，酪蛋白塑料(CS)，降钙素(HCT)和肝素(heparin))用于选择性试验。体系中，PTCA浓度为2.75×10-7mol L-1；CTAB浓度为2.5×10-6mol L-1；肝素浓度为5.0U mL-1；其它生物分子的浓度为3×10-5mol L-1。
如图6所示，当往3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵体系中加入3×10-5mol L-1的各种生物分子时，加入肝素使3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵体系的荧光猝灭最大，除肝素外，其他生物分子对3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵体系荧光强度的猝灭几乎可以忽略。这主要是由于在这些生物分子中，肝素拥有最多的负电荷，它与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)之间的静电作用力远远大于其他生物分子与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)之间的静电作用力，因此荧光猝灭最大。
因此，在3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵对肝素的检测实验中，可以排除其它生物分子的干扰。
上述参照实施例对肝素的检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种3，4，9，10-苝四酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将3，4，9，10-苝四甲酸二酐与氢氧化钠在水溶液中95℃～100℃下回流反应5h-6h，再将反应液进行酸化，即可制得3，4，9，10-苝四酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述3，4，9，10-苝四甲酸二酐与氢氧化钠的物质的量之比为1：3～5；3，4，9，10-苝四甲酸二酐在水溶液中的浓度为0.04～0.06mol/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酸化所用溶液为盐酸溶液，其与3，4，9，10-苝四甲酸二酐的物质的量之比为1：20～30。
4.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的3，4，9，10-苝四酸在检测肝素中的应用。
5.一种肝素的检测方法，其特征在于：通过向3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合体系中加入不同浓度的肝素，通过肝素浓度与荧光淬灭比率(F0-F)/F0之间的线型关系定量检测出肝素的浓度；
F0、F分别为3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合体系加入肝素前后在488nm处的荧光强度值。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
A.配置多组3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合溶液：分别将3，4，9，10-苝四酸水溶液与十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，反应2～5分钟；
B.向上述复合溶液中依次加入浓度范围在0～60U mL-1的肝素水溶液与pH值为9.0～10.6的Na2HPO4-Na3PO4缓冲溶液，并用去离子水稀释至10mL，继续搅拌反应20～30分钟，测量体系的荧光强度；
C.以肝素浓度为X轴，对应的荧光淬灭比率(F0-F)/F0为Y轴作图，得到肝素浓度与荧光猝灭比率(F0-F)/F0之间的线性方程，根据线性方程可计算出任意荧光强度F所对应的肝素浓度；
所述3，4，9，10-苝四酸与十六烷基三甲基溴化铵的终浓度分别为2.75×10-7mol L-1和2.5×10-6molL-1；
所述肝素的终浓度分别为0、1.0U mL-1、2.0U mL-1、2.75U mL-1、3.5U mL-1、4.7U mL-1、5.5U mL-1和6.0U mL-1。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述肝素浓度与荧光猝灭比率之间的线性方程为F＝-26.0C+551.58，C为肝素浓度。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述Na2HPO4-Na3PO4缓冲溶液的pH为9.5。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
A.配置多组3，4，9，10-苝四酸/十六烷基三甲基溴化铵的复合溶液：分别将1mL浓度为2.75×10-6mol L-1的3，4，9，10-苝四酸水溶液与1mL浓度为2.5×10-5mol L-1的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，反应2分钟；
B.向上述复合溶液中依次加入1mL浓度分别为0、10U mL-1、20U mL-1、27.5U mL-1、35U mL-1、47U mL-1、55U mL-1、60U mL-1的肝素水溶液与1mL pH值为9.2的Na2HPO4-Na3PO4缓冲溶液，并用去离子水稀释至10mL，此时肝素的终浓度分别为1.0U mL-1、2.0U mL-1、2.75U mL-1、3.5U mL-1、4,7U mL-1、5.5U mL-1,6.0U mL-1；继续搅拌反应20分钟，测量各体系的荧光强度；
C.以肝素浓度为X轴，对应的荧光淬灭比率(F0-F)/F0为Y轴作图，得到肝素浓度与荧光猝灭比率(F0-F)/F0之间的线性方程为F＝-26.0C+551.58且线性相关系数R2为0.9895，根据线性方程可计算出任意荧光强度F所对应的肝素浓度。
10.根据权利要求6-9任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法能够排除其它生物分子的干扰，对肝素的检测限可以达到0.00032U mL-1。
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