CN104818025B - 克伦特罗分子印迹‑上转换发光材料荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种克伦特罗分子印迹‑上转换发光材料荧光探针制备方法，是以上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+为载体结合共价键法制备的克伦特罗分子印迹制备而成的新型荧光探针，该探针将分子印迹聚合物高特异识别性能和上转换发光材料荧光高灵敏性相结合，制备步骤如下：首先制备上转换发光材料，然后制备克伦特罗分子印迹‑上转换发光材料荧光探针，最后洗脱克伦特罗分子。制备的荧光探针是以红外光作为激发波长，发射波长为可见光，灵敏度高，特异性强，干扰小。该制备方法简单，重现性好，对实际样品中克伦特罗的选择性识别和检测具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物、材料、生物检测等交叉领域，主要涉及上转换发光材料荧光探针的制备技术，特别涉及一种克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法。
背景技术
上转换发光，即反-斯托克斯发光（Anti-Stokes），是利用长波长光转换为短波长光发射的过程，其机理包括激发态吸收、能量传递上转换和光子雪崩三种。上转换发光材料是指具有上转换发光特性的材料，该材料可在近红外光或红外光激发下发出紫外光或可见光，其特点是所吸收的光子能量低于发射的光子能量，又称为反-斯托克斯发光材料。目前，上转换发光都发生在掺杂稀土离子的化合物中，主要有氟化物、氧化物、卤化物等。与传统的有机染料和量子点荧光标记材料相比，上转换发光材料以其荧光效率高、稳定性好、分辨率高、灵敏度高、背景干扰小、机体损伤小等特点，是理想的荧光探针标记物。
分子印迹聚合物是利用分子印迹技术制备的具有对目标物有特异识别功能的高分子聚合物，该聚合物制备方法简单、理化性质稳定，是一种潜力巨大的新型分子识别受体。
克伦特罗（Clenbuterol，CLB）是一种肾上腺类神经兴奋剂，临床上曾用于防治支气管哮喘、慢性支气管炎等病症。CLB也是“瘦肉精”的一种，生物利用率高，能够改变动物体内的代谢途径，促进肌肉和骨骼中蛋白质的合成，加快生长速度，改善胴体品质，增加瘦肉率。但是，CLB易于在动物体内蓄积，在肺、肝、肾等脏器及肌肉和脂肪组织中的残留量较大，残留时间长，且可通过食物链在人体内蓄积，对机体产生毒副作用，主要表现为心律失常、肌肉震颤、头晕、乏力等，严重的可危及生命。我国和欧盟等多数国家都严禁CLB在畜禽养殖中应用。
将分子印迹聚合物与上转换发光材料联合，结合分子印迹聚合物的高特异性与上转换发光材料荧光检测技术的高灵敏性，制备克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针可应用于目标分子的选择性识别及测定。
发明内容
发明目的
本发明旨在提供一种克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针的制备方法，该荧光探针对目标物克伦特罗具有较高的选择性和灵敏度。该荧光探针制备过程简单，批次间重现性好，对实际样品中克伦特罗的选择性识别和检测具有很好的应用前景。
技术方案
本发明是通过以下技术方案来实现的：
克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法,其特征在于：是以上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+为载体，结合共价法制备克伦特罗分子印迹聚合物而形成的荧光探针，其制备步骤如下：
（1）将Y(NO3)3、Yb(NO3)3、Er(NO3)3与蒸馏水混合，搅拌至全部溶解后加入EDTA和NaF溶液，继续搅拌5~10分钟后，将上述混合物溶液转移至水热反应釜中，用NaOH或HNO3溶液将溶液pH值调至3，然后将水热反应釜拧紧后置于180℃条件下水热反应24小时，制得上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+；
（2）将克伦特罗衍生物加入致孔剂中，磁力搅拌至溶解后加入上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+、交联剂和引发剂，继续搅拌至均匀后通氮气除氧5~8分钟，然后将容器密封置于70℃条件下聚合48小时，将分子印迹聚合物与上转换发光材料联合，得到荧光探针；
（3）将氢氧化钠溶液与荧光探针混合后加热回流48小时，然后再用索氏提取装置以甲醇-冰乙酸为洗脱溶剂洗脱模板分子克伦特罗直至用紫外分光光度计检测克伦特罗分子洗脱干净为止，制得克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针。
Y(NO3)3、Yb(NO3)3、Er(NO3)3的摩尔比为0.78:0.2:0.02；Y(NO3)3与EDTA的摩尔比为1:1；Y(NO3)3与NaF的摩尔比为6.6:46。
所述致孔剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈，水热反应釜外壳为不锈钢，内胆为聚四氟乙烯。
所述的克伦特罗衍生物与交联剂的摩尔比为1:3；克伦特罗衍生物与上转换发光材料的摩尔质量比为1:0.25（mmol:g）；克伦特罗衍生物与引发剂的摩尔质量比为1:30（mmol:mg）；克伦特罗衍生物与致孔剂的摩尔体积比为1:5 （mmol:mL）。
所述致孔剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液，乙酸乙酯与甲醇的体积比为2:3。
所述与荧光探针加热回流的氢氧化钠溶液的浓度为3mol/L；氢氧化钠溶液与荧光探针的体积质量比为200:3~5（mL:g），索氏提取装置中甲醇与冰乙酸的体积比为9:1。
所述克伦特罗衍生物是克伦特罗与甲基丙烯酰氯反应的二取代产物。
克伦特罗衍生物的制备方法如下：
取克伦特罗溶于二氯甲烷中，向溶液中加入三乙胺后，滴加甲基丙烯酰氯，室温反应过夜；反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V）为淋洗液用硅胶柱提纯克伦特罗与甲基丙烯酰氯反应的二取代产物，即克伦特罗衍生物。
硅胶柱中所用硅胶直径为200~300目。
克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10 mmol:50~55 mL；克伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3.5~4；克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2~2.5。
优点及效果
本发明具有如下优点及有益效果：
以上转换发光材料为载体，在其表面修饰克伦特罗分子印迹聚合物，结合了分子印迹聚合物的高选择性和上转换发光材料荧光信号的高灵敏性和低干扰性；该分子印迹-上转换发光材料荧光探针不但可以用于目标物克伦特罗的特异性识别和富集，还可以用于实际样品中克伦特罗的测定。
附图说明
图1为该克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针的扫描电镜图。图中显示：克伦特罗分子印迹与上转换发光材料紧密结合在一起，荧光探针制备成功。
图2为该克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针对克伦特罗识别性能的荧光表征。通过不同浓度的克伦特罗溶液对荧光探针的荧光猝灭强度，可说明克伦特罗仿生抗体-上转换发光材料荧光探针对目标物克伦特罗具有较好的识别行为。
图3为非印迹聚合物探针（参照）对克伦特罗识别性能的荧光表征。通过比较克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针和参照探针对目标物克伦特罗的荧光变化，可以看出，相同浓度的目标物对荧光探针的荧光猝灭强度明显大于参照探针，这说明制备的上转换荧光探针具有良好的识别行为。
图4为克伦特罗对克伦特罗-上转换发光材料荧光探针荧光猝灭的Stern-Volmer图。由图4可以看到，目标物克伦特罗的浓度与荧光猝灭程度F 0/F在一定范围内呈线性关系，线性方程为F 0/F =0.0043C q+1.0251，相关系数为0.9940。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行详细的说明：
本发明涉及一种克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法,其特征在于：是以上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+为载体，结合共价法制备克伦特罗分子印迹聚合物而形成的荧光探针，该荧光探针集分子印迹聚合物的高选择性与上转换发光材料的特殊荧光发射特性于一体，其制备步骤如下：
（1）将Y(NO3)3、Yb(NO3)3、Er(NO3)3与蒸馏水混合，搅拌至全部溶解后加入EDTA和NaF溶液，继续搅拌5~10分钟后，将上述混合物溶液转移至水热反应釜中，用NaOH或HNO3溶液将溶液pH值调至3，然后将水热反应釜拧紧后置于180℃条件下水热反应24小时，即制得上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+；
（2）将克伦特罗衍生物加入致孔剂中，磁力搅拌至溶解后加入步骤（1）得到的上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+、交联剂和引发剂，继续搅拌至均匀后通氮气除氧5~8分钟，然后将容器密封置于70℃条件下聚合48小时，即可将分子印迹聚合物与上转换发光材料联合，得到荧光探针；
（3）将氢氧化钠溶液与荧光探针混合后加热回流48小时，然后再用索氏提取装置以甲醇-冰乙酸为洗脱溶剂洗脱模板分子克伦特罗直至用紫外分光光度计检测模板分子洗脱干净为止，制得克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针。
步骤（1）中所述Y(NO3)3、Yb(NO3)3、Er(NO3)3的摩尔比为0.78:0.2:0.02；Y(NO3)3与EDTA的摩尔比为1:1；Y(NO3)3与NaF的摩尔比为6.6:46，水热反应釜中溶液的最终体积为反应釜总体积的80%~90%。
所述致孔剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈，水热反应釜外壳为不锈钢，内胆为聚四氟乙烯。
所述的克伦特罗衍生物与交联剂（乙二醇二甲基丙烯酸酯）的摩尔比为1:3；克伦特罗衍生物与上转换发光材料的摩尔质量比为1:0.25（mmol:g）；克伦特罗衍生物与引发剂的摩尔质量比为1:30（mmol:mg）；克伦特罗衍生物与致孔剂的摩尔体积比为1:5（mmol:mL）。
所述致孔剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液，乙酸乙酯与甲醇的体积比为2:3。
所述与荧光探针加热回流的氢氧化钠溶液的浓度为3mol/L；氢氧化钠溶液与荧光探针的体积质量比为200:3~5（mL:g）；索氏提取装置中甲醇与冰乙酸的体积比为9:1。
所述克伦特罗衍生物是克伦特罗与甲基丙烯酰氯反应的二取代产物。
克伦特罗衍生物的制备方法如下：
取克伦特罗溶于二氯甲烷中，向溶液中加入三乙胺后，滴加甲基丙烯酰氯，室温反应过夜；反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V）为淋洗液用硅胶柱（硅胶直径为200~300目）提纯克伦特罗与甲基丙烯酰氯反应的二取代产物，即克伦特罗衍生物。
克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10 mmol:50~55 mL；克伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3.5~4；克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2~2.5。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
一种克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针制备方法，是以上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+为载体，结合共价键法制备的克伦特罗分子印迹而形成的荧光探针，步骤如下：
（1）上转换发光材料的制备：
将6.6 mmol Y(NO3)3（纯度99.99%）、1.69 mmol Yb(NO3)3（纯度99.99%）、0.169mmol Er(NO3)3（纯度99.99%）与13.0~18.0 mL蒸馏水混合，搅拌至全部溶解后加入33.0 mLEDTA （6.6 mmol）溶液和33.0 mL NaF（46 mmol）溶液，继续搅拌5~10分钟后，将上述混合物溶液转移至水热反应釜中，用NaOH或HNO3溶液将溶液pH值调至3，然后将水热反应釜拧紧后置于180℃条件下水热反应24小时，即制得上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+，水热反应釜中溶液的最终体积为反应釜总体积的80%~90%。
（2）克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针的制备：
将1 mmol克伦特罗衍生物加入2 mL乙酸乙酯和3 mL甲醇混合的致孔剂中，磁力搅拌至溶解后加入0.25 g上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+、3 mmol 交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和30 mg引发剂偶氮二异丁腈，继续搅拌至均匀后通氮气除氧5~8分钟，然后将容器密封置于70℃条件下聚合48小时，即可将分子印迹聚合物与上转换发光材料联合，即为荧光探针。
（3）克伦特罗分子的洗脱：
将3mol/L氢氧化钠溶液200 mL与3g荧光探针混合后加热回流48小时，然后再用索氏提取装置以甲醇-冰乙酸（9:1；v:v）为洗脱溶剂洗脱模板分子克伦特罗直至用紫外分光光度计检测模板分子洗脱干净为止，即制得克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针。
上述克伦特罗衍生物的制备方法如下：
取10 mmol 克伦特罗溶于50mL二氯甲烷中，向溶液中加入40 mmol三乙胺后，滴加22 mmol甲基丙烯酰氯，室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V）为淋洗液用硅胶柱（硅胶直径为200~300目）提纯克伦特罗与甲基丙烯酰氯反应的的二取代产物，即克伦特罗衍生物。
实施例2
一种克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针制备方法，步骤（2）中，将3mol/L氢氧化钠溶液200 mL与5g荧光探针混合后加热回流48小时；制备克伦特罗衍生物时，取10mmol 克伦特罗溶于55mL二氯甲烷中，向溶液中加入35 mmol三乙胺后，滴加25 mmol甲基丙烯酰氯，室温反应过夜；其他条件同实施例1。
实施例3
一种克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针制备方法，步骤（1）中，水热反应釜中溶液的最终体积为反应釜总体积的85%；步骤（2）中，将3mol/L氢氧化钠溶液200 mL与4g荧光探针混合后加热回流48小时；制备克伦特罗衍生物时，取10 mmol 克伦特罗溶于52mL二氯甲烷中，向溶液中加入38 mmol三乙胺后，滴加20 mmol甲基丙烯酰氯，室温反应过夜；其他条件同实施例1。
克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针对目标物克伦特罗的识别性能：
分别称取克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针和参照探针各15 mg，分别置于2个石英比色皿中，然后加入4mL含有不同浓度的克伦特罗甲醇溶液，孵育5分钟后用荧光分光光度计测定荧光探针及参照探针与目标物克伦特罗的响应（日立F7000型荧光分光光度计（日本）；激发波长890nm，在575 nm-610 nm范围内记录实验数据）。
图1为该克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针的扫描电镜图。图中显示：克伦特罗分子印迹与上转换发光材料紧密结合在一起，荧光探针制备成功。
图2为该克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针对克伦特罗识别性能的荧光表征。通过不同浓度的克伦特罗溶液对荧光探针的荧光猝灭强度，可说明克伦特罗仿生抗体-上转换发光材料荧光探针对目标物克伦特罗具有较好的识别行为。
图3为非印迹聚合物探针（参照）对克伦特罗识别性能的荧光表征。通过比较克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针和参照探针对目标物克伦特罗的荧光变化，可以看出，相同浓度的目标物对荧光探针的荧光猝灭强度明显大于参照探针，这说明制备的上转换荧光探针具有良好的识别行为。
图4为克伦特罗对克伦特罗-上转换发光材料荧光探针荧光猝灭的Stern-Volmer图。由图4可以看到，目标物克伦特罗的浓度与荧光猝灭程度F 0/F在一定范围内呈线性关系，线性方程为F 0/F =0.0043C q+1.0251，相关系数为0.9940。
Claims (7)
1.克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法,其特征在于：是以上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+为载体，结合共价法制备克伦特罗分子印迹聚合物而形成的荧光探针，其制备步骤如下：
（1）将Y(NO3)3、Yb(NO3)3、Er(NO3)3与蒸馏水混合，搅拌至全部溶解后加入EDTA和NaF溶液，继续搅拌5~10分钟后，将上述混合物溶液转移至水热反应釜中，用NaOH或HNO3溶液将溶液pH值调至3，然后将水热反应釜拧紧后置于180℃条件下水热反应24小时，制得上转换发光材料YF3:Yb3+,Er3+；
（2）将克伦特罗衍生物加入致孔剂中，磁力搅拌至溶解后加入上转换发光材料YF3:Yb3 +,Er3+、交联剂和引发剂，继续搅拌至均匀后通氮气除氧5~8分钟，然后将容器密封置于70℃条件下聚合48小时，将分子印迹聚合物与上转换发光材料联合，得到荧光探针；
（3）将氢氧化钠溶液与荧光探针混合后加热回流48小时，然后再用索氏提取装置以甲醇-冰乙酸为洗脱溶剂洗脱模板分子克伦特罗直至用紫外分光光度计检测克伦特罗分子洗脱干净为止，制得克伦特罗分子印迹-上转换发光材料荧光探针；
Y(NO3)3、Yb(NO3)3、Er(NO3)3的摩尔比为0.78:0.2:0.02；Y(NO3)3与EDTA的摩尔比为1:1；Y(NO3)3与NaF的摩尔比为6.6:46；
所述致孔剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈，水热反应釜外壳为不锈钢，内胆为聚四氟乙烯；
所述的克伦特罗衍生物与交联剂的摩尔比为1:3；克伦特罗衍生物与上转换发光材料的摩尔质量比为1 mmol:0.25 g；克伦特罗衍生物与引发剂的摩尔质量比为1 mmol:30 mg；克伦特罗衍生物与致孔剂的摩尔体积比为1 mmol:5 mL。
2.根据权利要求1所述的克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法，其特征在于：所述致孔剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液，乙酸乙酯与甲醇的体积比为2:3。
3. 根据权利要求1所述的克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法，其特征在于：所述与荧光探针加热回流的氢氧化钠溶液的浓度为3mol/L；氢氧化钠溶液与荧光探针的体积质量比为200 mL:3 ~5 g，索氏提取装置中甲醇与冰乙酸的体积比为9:1。
4.根据权利要求1所述的克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法，其特征在于：所述克伦特罗衍生物是克伦特罗与甲基丙烯酰氯反应的二取代产物。
5.根据权利要求1或4所述的克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法，其特征在于：克伦特罗衍生物的制备方法如下：取克伦特罗溶于二氯甲烷中，向溶液中加入三乙胺后，滴加甲基丙烯酰氯，室温反应过夜；反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯为淋洗液用硅胶柱提纯克伦特罗与甲基丙烯酰氯反应的二取代产物，即克伦特罗衍生物。
6.根据权利要求5所述的克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法，其特征在于：硅胶柱中所用硅胶直径为200~300目。
7. 根据权利要求5所述的克伦特罗分子印迹-上转换发光材料标记荧光探针的制备方法，其特征在于：克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10 mmol:50~55 mL；克伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3.5~4；克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2~2.5。
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