CN101705084B

CN101705084B - 多色稀土纳米粒子及其制备方法

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Publication number: CN101705084B
Application number: CN2009101854200A
Authority: CN
Inventors: 陈扬; 谭宏亮; 李富森
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2009-11-09
Filing date: 2009-11-09
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2029-11-09
Also published as: CN101705084A

Abstract

多色稀土纳米粒子及其制备方法通过稀土配合物种类和数量的不同组合产生具有不同特征发射波长、发光强度的荧光组合，变化稀土配合物的种类和数量可进行荧光编码，这些不同组合的稀土混合物被包含于纳米粒子中形成多色稀土纳米粒子；多色稀土纳米粒子的制备方法是以不同组合的稀土混合物作为发光分子，通过微乳液中聚合反应形成SiO₂包裹稀土配合物的纳米粒子，纳米粒子的表面具有可连接探针分子的活性官能团，用于生物分子的荧光检测和成像，通过混合不同摩尔配比的氨羧类有机分子稀土配合物及吡啶二羧酸类稀土配合物制备的多色稀土纳米粒子发光强度高，水溶性好，可用于各种时间分辨荧光分析和成像。

Description

多色稀土纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于荧光编码的稀土发光纳米粒子及其制备方法，主要用于生物分子的荧光检测和示踪，属于生物分子纳米标记物制备的技术领域。

背景技术

荧光检测、成像技术在生命科学、医学等众多领域有着广泛的应用，传统的荧光分析使用各种有机染料分子作为标记物，然而有机染料分子易受到各种非特异性荧光的干扰(激发光、散射光及分析物背景荧光)，同时染料分子容易发生光漂白及淬灭效应导致荧光强度降低。纳米标记物是近年来发展起来的一种新型标记物，由于纳米粒子通过化学共价连接、表面吸附或包埋等方式装载了若干个荧光分子，因此使用纳米粒子标记物荧光发射强度将大大增强，常具有更好的光学稳定性，有力的提升测定的灵敏度。

随着生命科学、医学的发展，多组分、高通量的分析要求日益增长，进行多组分的同时发光检测需要发射光谱(颜色)不同的标记物，标记物的特征发射波长(颜色)差异愈大，检测分辨愈容易。目前用于高通量，多组分检测的光学编码的微、纳米粒子主要有高聚物荧光微球、量子点(M.Han，X.Gao，J.Z.Su，S.Nie，Nat.Biotechnol.，2001，19，631)、染料掺杂的SiO₂纳米粒子(L.Wang，WTan，Nano Letters，2006，6，84)、金属纳米粒子(S.I.Stoeva，J.Lee，C.S.Thaxton and C.A.Mirkin，Angew.Chem.Int.Ed.，2006，45，3303)等。荧光编码的纳米粒子的制备方法主要采用各种匹配的染料荧光分子混合装载于各种纳米粒子中，有关报道的有中国专利公开号CN1779461，2006年，王海桥，黄振立，曹元成，赵元弟，一种多色量子点微球编码方法，公开了一种在装载液中混合不同摩尔比率的量子点，利用聚苯乙烯微球物理吸附量子点制备编码微球的方法。中国专利公开号CN101321686，2006年，谭尉泓，王琳，杨朝勇，用于多路信号传递和光编码的多组分纳米颗粒，公开了一种将不同的发光分子按比例混合装载于SiO₂纳米粒子中的方法。中国专利公开号CN101333436，2008年，王柯敏，何晓晓，秦迪岚，谭蔚泓，多色光学编码硅壳纳米棒及其制备方法，公开了一种用多聚赖氨酸连接两种染料分子构成荧光能量转移对，由SiO₂包裹染料分子形成纳米棒，通过改变染料分子的配比进行荧光编码的方法。中国专利公开号CN101338189，2008年，杨清彪，宋岩，李耀先，王永强，战乃乾，多重荧光编码微球的高压电纺制备方法，公开了一种用不同数量和荧光特性的荧光材料分散于高分子溶液中通过高压电纺制备荧光编码的高分子微球方法。

上述这些方法有各自的特点，也存在诸多不足。量子点本身有许多优点，但其水溶性差，表面修饰化学较困难，对细胞的毒性及发光“闪烁”(blinking)问题仍处于研究之中(K.Cottingham，Anal.Chem.，2005，77，354A；C.M.Niemeyer，Angew.Chem.Int.Ed.，2001，40，4128)；高聚物微球存在过大的尺寸(常μm量级)，疏水的表面在水溶液中易聚集、非特异吸附强，有机溶剂中膨胀产生染料泄漏的问题(M.Seydack，Biosens.Bioelectron.，2005，20，2454)；SiO₂荧光纳米粒子虽有可控的尺寸(5-200nm)，表面易于修饰，良好的生物相容性等优点，但染料荧光的Stokes位移很小，荧光发射易受到激发光的干扰，各种荧光谱容易重叠。

发光纳米粒子标记物的关键是合成制备具有高发光强度、良好稳定性的发光分子/内核，发光分子/内核的光学特性和化学性质决定了纳米粒子标记物的主要品质。

稀土化合物作为荧光标记物具有一些独特的优点，如发射波长与激发波长相距远，Stokes位移可达150nm以上；荧光发射峰窄，常小于10nm；荧光寿命长，可达毫秒级，比一般本底物质的荧光寿命高5～6个数量级，因此可通过荧光延迟测量技术进行时间分辨荧光分析，有效地消除各种非特异性荧光的干扰获得高的灵敏度和更清晰的荧光图像。一些稀土螯合物标记的生物分析，灵敏度达到放射性同位素标记的水平(E.Soini，T.Lovgren，CRC Crit.Rev.Anal.Chem.，1987，18，105；E.Solni，H.Kojola，Clin.Chem.，1983，29，65)；细胞的时间分辨荧光成像对比度(信噪比)比普通荧光成像提高了约400倍(L.Seveus，M.Vaisala，S.Syrjanen，M.Sandberg，A.Kuusisto，R.Harju，J.Salo，I.Hemmila，H.Kojola，E.Soini，Cyrometry，1992，13，329；G.Marriott，R.M.Clegg，D.J.Arndt-Jovin，T.M.Jovin，Biophys.J.，1991，60，1374)。用稀土化合物制备的纳米粒子则集合了稀土化合物和纳米粒子两者的优点，既具有稀土化合物的荧光特性又包含了许多发光分子具有更高的荧光强度，包裹层避免了环境因素(溶剂分子、氧气)对荧光的淬灭作用且更加容易修饰探针分子。

可进行荧光编码的稀土纳米粒子及其制备国内外尚未见报道。本发明的目的是提供一种荧光编码的稀土纳米粒子及其制备方法。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种可荧光编码的稀土纳米粒子及其制备方法，通过该方法制备的多色稀土纳米粒子发光强度高、水溶性好，可用于各种时间分辨荧光分析和成像，应用于多组分的分析。

技术方案：本发明是通过以下技术方案实现的：以稀土配合物作为发光分子，不同的稀土配合物以各种比例混合通过微乳液中聚合反应形成SiO₂包裹的稀土配合物的纳米粒子，纳米粒子的表面具有可连接探针分子的活性官能团，用于生物分子的荧光检测和成像。

所述的稀土离子是铽离子(Tb³⁺)、铕离子(Eu³⁺)、钐离子(Sm³⁺)中的一种。

所述的稀土配合物为氨羧类有机分子-敏化分子与稀土离子生成的配合物，氨羧类有机分子是二乙基三胺五乙酸“DTPA”，三乙基四胺六乙酸“TTHA”，1，4，8，11-四氮杂十四环-1，4，8，11-四乙酸“TETA”，乙二胺四乙酸“EDTA”，1，4，7，10-四氮杂十二环-N，N’，N”，N”’四乙酸“DOTA”中的一种；敏化分子是7-氨基-4-甲基-2-羟基喹啉酮，7-氨基-4-甲基香豆素，氨基荧光素，氨基罗丹明B中的一种。

所述的稀土配合物为吡啶二羧酸与稀土离子生成的配合物，吡啶二羧酸是两个羧基取代基分别连在吡啶环2位和6位的吡啶-2，6-二羧酸。

吡啶-2，6-二羧酸

吡啶-2，6-二羧酸(DPA)与稀土离子(Ln³⁺)生成的配合物是Ln(DPA)₃或Ln(DPA)₂或Ln(DPA)类型配合物中的一种。

具体的步骤为：

第一步，将稀土离子硝酸盐或盐酸盐的水溶液与氨羧类有机分子-敏化分子构成的配体按1∶1摩尔比混合反应形成稀土配合物或将稀土离子硝酸盐或盐酸盐的水溶液与吡啶二羧酸溶液按1∶3摩尔比混合反应形成稀土配合物。

根据各种配合物荧光发射强度的差异，将不同的氨羧类有机分子-敏化分子-稀土离子配合物的溶液按一定摩尔比列混合；或将不同的吡啶二羧酸-稀土离子配合物的溶液按一定摩尔比列混合生成混合液。

第二步，稀土纳米粒子的制备：油包水反相微乳液体系中，将油相试剂、表面活性剂及助表面活性剂混合搅拌均匀后，加入第一步生成的稀土配合物的混合水溶液，充分搅拌形成油包水的微乳液后，加入正硅酸乙酯和氨水进行水解反应；在水解反应过程中或反应后，加入硅烷化试剂继续反应，反应完成后在乳白色悬浮液中加入丙酮离心沉降，经乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO₂包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用。

油包水反相微乳液体系中油相为环己烷，表面活性剂为Triton X-100或壬基酚聚氧乙烯醚(OP-10)，助表面活性剂为正己醇或正辛醇，水相为含有特定摩尔配比的稀土配合物的混合水溶液。

所制备的稀土纳米粒子由油包水反相微乳液体系中氨水催化正硅酸乙酯水解形成的SiO₂构成。

所制备的稀土纳米粒子表面的活性官能团通过在微乳液中加入带有不同活性官能团的硅烷化试剂生成，硅烷化试剂是氨基硅烷化试剂，或巯基硅烷化试剂，或3-缩水甘油醚氧丙基硅烷化试剂，这些活性官能团可进一步共价连接各种探针分子如DNA、抗体、生物素、酶等以识别和检测或示踪对应的生物分子。

有益效果：目前报道的光学编码的微球以荧光染料分子或量子点为发光内核，但荧光分子固有的Stokes位移小，荧光峰容易重叠干扰，易受各种非特异性荧光的干扰。本发明以稀土配合物为发光分子，Stokes位移可达150nm以上；荧光发射峰窄，常小于10nm；荧光寿命长，可达毫秒级，比一般本底物质的荧光寿命高5～6个数量级，因此可通过荧光延迟测量技术进行各种时间分辨荧光分析和成像，有效地消除各种非特异性荧光的干扰获得高的灵敏度和更清晰的荧光图像。由于采用相同的配体，各种配合物的激发波长相同可用单波长激发。所制备的粒子具有良好的水溶性、稳定性、高的发光强度，可应用于多组分同时分析。

所使用的稀土离子配体可以从商业上直接获得，避免了合成配体的复杂有机合成，制备方法简单，有助于稀土纳米标记物在广泛的领域被应用。

附图说明

图1.一种多色稀土纳米粒子的透射电镜图。

图2.7-氨基-4-甲基-2-喹啉酮-DTPA类多色稀土纳米粒子的荧光光谱图。

图3.吡啶二羧酸类多色稀土纳米粒子的荧光光谱图。

图4.几种多色稀土纳米粒子的荧光颜色。

具体实施方式

稀土纳米粒子由SiO₂包裹发光稀土配合物构成；稀土配合物由配体氨羧类有机分子-敏化分子或吡啶二羧酸结合稀土离子生成；SiO₂包裹稀土配合物通过油包水反相微乳液中氨水催化正硅酸乙酯的水解形成SiO₂生成。稀土纳米粒子的直径大小可通过控制水相与表面活性剂的摩尔比及正硅酸乙酯和氨水的摩尔用量来控制。生成的纳米粒子大小通常在10-150nm。在水解聚合过程中使用带有不同活性官能团的硅烷化试剂，可在SiO₂表面分别生成不同的活性官能团，如硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三甲氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷可在SiO₂表面分别生成-NH₂、-SH、3-缩水甘油醚氧丙基官能团，这些官能团可进一步共价连接各种探针分子如DNA、抗体、生物素、酶等以识别和检测或示踪对应的生物分子。

实施例1：7-氨基-4-甲基-2-喹啉酮-DTPA类多色稀土纳米粒子的制备：

稀土配合物的配体制备：将等摩尔量的7-氨基-4-甲基-2-喹啉酮和二乙基三胺五乙酸二酐分别溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，在二乙基三胺五乙酸二酐DMF溶液中加入适量无水三乙胺并逐滴搅拌加入7-氨基-4-甲基-2-喹啉酮的DMF溶液，在避光搅拌条件下反应2小时。

稀土配合物的制备：将等摩尔量的Tb³⁺离子水溶液(硝酸盐或盐酸盐)与上述制备的配体溶液混合10分钟，得到Tb³⁺的配合物。同法可制备Eu³⁺的配合物。

多色稀土纳米粒子的稀土配合物溶液制备：将Tb³⁺配合物和Eu³⁺配合物溶液分别按30∶5，30∶1和10∶5的摩尔比混合生成混合液。

多色稀土纳米粒子的制备：将环己酮、正己醇、Triton X-100(v/v，4∶1∶1)混合并搅拌均匀，加入适量上述稀土配合物的混合液(水相)，充分搅拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和浓氨水，搅拌2小时后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(硅烷化试剂)，反应混合物在搅拌下反应20小时，反应完成后在乳白色悬浮液中加入适量丙酮离心沉降，分别用乙醇、水洗涤以除去反应溶液，分离得到SiO₂包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用。图1是制得的7-氨基-4-甲基-2-喹啉酮-DTPA类多色稀土纳米粒子的透射电镜图，显示具有良好的均一性和单一性。图2是其铽配合物与铕配合物分别按上述摩尔比率混合制备的纳米粒子的荧光光谱图，图中Tb与Eu的特征峰强度比(Tb 545nm/Eu 616nm)分别为2∶2(图2A)和2∶1(图2B)和1∶4(图2C)。图3是铽和铕配合物按0∶20，10∶5，30∶5，30∶1和20∶0摩尔比混合制备的多色稀土纳米粒子的荧光颜色。

稀土纳米粒子标记的寡核苷酸探针的制备：称取一定量干燥的表面NH₂修饰的稀土纳米粒子重新分散于1×PBS溶液中，加入25％的戊二醛(最终浓度约1％)溶液，室温下反应2小时，反应完成后经0.5％Tween-20水洗后，离心移走上清液，加入含适量链亲和素的1×PBS溶液，室温搅拌下反应16小时，反应完成后，0.5％Tween-20 1×PBS溶液洗涤，离心分离后加入足量Biotin-oligo的1×PBS溶液，室温下反应3小时，反应完成后，3次1×PBS溶液洗涤后悬浮于1×PBS溶液备用。

实施例2：吡啶二羧酸类多色稀土纳米粒子的制备

稀土配合物的制备：将稀土Tb³⁺、Eu³⁺、Sm³⁺的硝酸盐或盐酸盐水溶液分别与吡啶二羧酸溶液按1∶3摩尔比混合，反应10分钟，分别得到吡啶二羧酸-铽、吡啶二羧酸-铕、吡啶二羧酸-钐。

多色稀土纳米粒子的稀土配合物溶液制备：将吡啶二羧酸-钐与吡啶二羧酸-铕按80∶3摩尔比混合，吡啶二羧酸-铽与吡啶二羧酸-铕分别按30∶5和15∶5摩尔比混合生成混合液。

多色稀土纳米粒子的制备：将环己酮、正己醇、Triton X-100(v/v，4∶1∶1)混合并搅拌均匀，加入适量上述稀土配合物的混合液(水相)，充分搅拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和浓氨水，搅拌2小时后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(硅烷化试剂)，反应混合物在搅拌下反应20小时，反应完成后在乳白色悬浮液中加入适量丙酮离心沉降，分别用乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO₂包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用。图4是按上述摩尔比率混合制备的纳米粒子的荧光光谱图，图中有三种不同特征发射波长和发光强度的荧光组合，Dy与Eu的特征峰强度比(Dy 481nm/Eu 616nm)为1∶1(图4A)，Tb与Eu的特征峰强度比(Tb 545nm/Eu 616nm)分别约为1∶1(图4B)和1∶2(图4C)。

Claims

1.一种多色稀土纳米粒子的制备方法，其特征是通过稀土配合物的种类和数量的不同组合产生具有不同特征发射波长、发光强度的荧光组合，变化稀土配合物的种类和数量可进行荧光编码，这些不同组合的稀土混合物被包含于纳米粒子中形成多色稀土纳米粒子；多色稀土纳米粒子的制备方法是以不同组合的稀土混合物作为发光分子,通过微乳液中聚合反应形成SiO₂包裹稀土配合物的纳米粒子,纳米粒子的表面具有可连接探针分子的活性官能团，用于生物分子的荧光检测和成像，制备方法的具体步骤为：

第一步，将稀土离子硝酸盐或盐酸盐的水溶液与配体溶液反应形成稀土配合物；

第二步，根据稀土配合物荧光发射强度的差异，将各种稀土配合物按不同摩尔比列混合生成混合水溶液，产生多种特征峰波长和荧光强度不同的组合；

第三步，稀土纳米粒子的制备：油包水反相微乳液体系中，将油相试剂、表面活性剂及助表面活性剂混合搅拌均匀后，加入第二步生成的稀土配合物的混合水溶液，充分搅拌形成油包水的微乳液后，加入正硅酸乙酯和氨水进行水解反应；在水解反应过程中或反应后，加入硅烷化试剂继续反应，反应完成后在乳白色悬浮液中加入丙酮离心沉降，经乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO₂包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用；

其中，所述的稀土离子是铽离子Tb³⁺、铕离子Eu³⁺、钐离子Sm³⁺、镝离子Dy³⁺中的一种；

与稀土离子生成配合物的配体是氨羧类有机分子-敏化分子或吡啶-2，6-二羧酸，即两个羧基取代基是分别连在吡啶环的2位和6位。

2.根据权利要求1所述的一种多色稀土纳米粒子的制备方法，其特征是所述的氨羧类有机分子-敏化分子配体中的氨羧类有机分子是二乙基三胺五乙酸“DTPA”，三乙基四胺六乙酸“TTHA”，1,4,8,11-四氮杂十四环-1,4,8,11-四乙酸“TETA”，乙二胺四乙酸“EDTA”，1,4,7,10-四氮杂十二环-N,N’,N’’,N’’’四乙酸“DOTA”中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种多色稀土纳米粒子的制备方法，其特征是所述的氨羧类有机分子-敏化分子配体中的敏化分子为7-氨基-4-甲基-2-羟基喹啉酮，7-氨基-4-甲基香豆素，氨基荧光素，氨基罗丹明B中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种多色稀土纳米粒子的制备方法，其特征是油包水反相微乳液体系中油相为环己烷，表面活性剂为TritonX-100或壬基酚聚氧乙烯醚OP-10，助表面活性剂为正己醇或正辛醇，水相为含有发光稀土配合物的水溶液。

5.根据权利要求1所述的一种多色稀土纳米粒子的制备方法，其特征是所制备的多色稀土纳米粒子表面的活性官能团通过在微乳液中加入带有不同活性官能团的硅烷化试剂生成，硅烷化试剂是氨基硅烷化试剂，或巯基硅烷化试剂，或3-缩水甘油醚氧丙基硅烷化试剂，这些活性官能团可进一步共价连接DNA、抗体、生物素、酶探针分子以识别和检测或示踪对应的生物分子。