CN106084114A - 一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法 - Google Patents

一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，以Y2O3、Yb2O3和Tm2O3为原料，制备上转换发光材料，进行硅烷化修饰后，用亲和素进一步修饰，制备亲和素修饰的上转换发光材料，将生物素修饰的恩诺沙星适配体连接于亲和素修饰的上转换发光材料表面，制备恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料；最后均匀分散于致孔剂中，加入功能单体，加入交联剂和引发剂，制得恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。优点是：该探针具有分子印迹聚合物和适配体协同增效的双重识别保障，识别能力更加高效、精准；不但可以用于目标物恩诺沙星的特异性识别和富集，还可以用于定量测定。

Description

一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制 备方法
技术领域
本发明涉及高分子材料技术领域，尤其涉及一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法。
背景技术
恩诺沙星，是氟喹诺酮类抑菌剂中应用最为广泛的品种之一，常被用于兽医临床和水产养殖业中。但因其耐药性和潜在的致癌性引起了广泛的关注。目前恩诺沙星的检测方法主要是仪器法和酶联免疫法，然而仪器法所需仪器昂贵，操作复杂，酶联免疫法需要抗体，抗体稳定性差，制备周期长。这两种方法都存在一定的问题。
适配体(Aptamer)是通过SELEX技术筛选得到的一段可以特异性识别并结合靶分子的寡聚核苷酸片段(DNA或RNA)。适配体能够与靶标分子发生特异性结合，且亲和力高、特异性强。与抗体相比，适配体筛选无需动物实验，可根据需要进行全化学合成；筛选周期短，有效避免抗体存在批次差异大的问题，可实现批量生产；适配体末端易于修饰上各种活性基团，可根据不同分析目的对其进行固定修饰。这些优点使其在分析检测和传感领域中显示出良好的应用前景。
分子印迹技术是模拟天然分子识别现象，人工合成对特定印迹分子具有高度选择性固态高分子聚合物的新技术。因其具有选择性高、稳定性好、制备过程简单、可重复使用等优点，常常被誉为“仿生抗体”，表现出巨大应用潜力。
荧光检测是一种常用的快速检测方法。作为新型发光材料的上转换纳米粒子(UCNPs)发展迅速。UCNPs具有独特的发光性质，以近红外光作为激发光源，可有效避免样品基质自发荧光的干扰，荧光背景信号干扰小。该材料还具有化学稳定性好、荧光寿命长、吸收和发射带窄、量子产率高以及毒性低等诸多优点，是理想的荧光探针标记物。
本发明以上转换荧光纳米粒子标记，将分子印迹聚合物与适配体的高特异性结合，制备一种可应用于恩诺沙星识别与测定的适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。
发明内容
本发明要解决的问题是提出一种对恩诺沙星同时具有富集和上转换光信号传感复合材料的适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法。
本发明的技术解决方案：
一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，采用上转换荧光纳米材料作为载体偶联恩诺沙星适配体，以甲基丙烯酸为功能单体，利用分子印迹技术中的包埋法制备，其制备步骤如下：
一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，制备步骤如下：
(1)将Y2O3、Yb2O3和Tm2O3硝酸化后，加入EDTA、CTAB的乙二醇溶液、HF和浓硝酸，进行水热反应，制得上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm；
(2)将步骤(1)制备的上转换发光材料0.05g-0.2g分散于60mL-100mL异丙醇中；依次加入20mL-40mL的蒸馏水和2.5mL-5mL质量浓度为25％的氨水，室温下搅拌15min-30min；滴加40μL-80μL的正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌3h后；滴加200μL-400μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下反应1h-2h后停止搅拌，室温下陈化2h-6h；离心分离，得到的固体物质经蒸馏水洗涤三次，60℃-90℃烘干，得到硅烷化上转换发光材料；
(3)将步骤(2)制得的硅烷化上转换发光材料10mg-50mg，分散于5mL-8mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1.25mL质量浓度为25％戊二醛溶液，在室温下振荡1h-2h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，重新分散于5mL-8mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1mL浓度为0.1mg/mL-0.2mg/mL的亲和素溶液中，在37℃振荡17h-30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，得到亲和素修饰的上转换发光材料；
(4)将步骤(3)制备的亲和素修饰的上转换发光材料10mg-50mg均匀分散于10mmol/L的PBS中，加入200μL-300μL浓度为1μmol/L的恩诺沙星适配体溶液，在37℃振荡17h-30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，得到恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料；
(5)将步骤(4)制备的恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料10mg-50mg分散于10mmol/L的PBS中，加入1mL浓度为10μg/mL-30μg/mL恩诺沙星溶液，在37℃振荡1h-2h，离心分离，收集固体物质；
(6)将步骤(5)得到的固体物质均匀分散于致孔剂中，加入功能单体，振荡15min-30min，加入交联剂和引发剂，所述固体物质的质量与致孔剂的体积之比为10mg:5mL-10mL，固体物质的质量与功能单体的摩尔比10mg:0.2mmol-0.6mmol，固体物质质量与交联剂的摩尔比10mg:10mmol-20mmol，固体物质与引发剂的质量比为10mg:0.01g-0.08g；在60℃-80℃水浴振荡器反应12h-24h，水浴振荡器的振荡速度为150转/分-300转/分，将产物置于甲醇中反复洗脱5次-10次，再用解离缓冲液反复洗脱5次-10次，制得恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。
进一步的，所述致孔剂为乙腈，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。
进一步的，所述适配体核酸序列为5’-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGTTCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3’。
进一步的，步骤(1)制备上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm时，将Y2O3、Yb2O3、Tm2O3按照摩尔比0.78:0.2:0.02加入浓硝酸中，所述Y2O3与浓硝酸的摩尔体积比为0.78mol：0.5mL-2mL，60℃-90℃溶解后，挥发掉多余硝酸，加入蒸馏水，所述Y2O3与蒸馏水的摩尔体积比为0.78mol：0.5mL-2mL，搅拌至全部溶解后按照EDTA与Y2O3氧化钇的摩尔比1:1加入EDTA，用浓度为1mol/L-6mol/L的NaOH调节pH至7-8；加入浓度为0.016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，Y2O3与CTAB的摩尔体积比为0.78mol：25mL，100r/min-300r/min转速下按照Y2O3氧化钇与HF的摩尔体积比0.78mol：1.5mL边搅拌边加入HF，得到白色乳状液体；最后再按照Y2O3与浓硝酸的摩尔体积比0.78mol：3.5mL加入浓硝酸，搅拌均匀后，将混合物溶液转移至水热反应釜中，然后将水热反应釜拧紧后置于170℃-200℃条件下水热反应18h-24h。
进一步的，所述解离缓冲液是由10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2组成。
本发明的有益效果：
以上转换发光材料为载体，在其表面构建对恩诺沙星具有高度选择性的分子印迹聚合物/适配体杂化表层，构建荧光探针。其中适配体的固定是杂化探针成功制备的关键，首先对上转换发光材料进行硅烷化修饰，以提高其生物亲和性；然后用亲和素对硅烷化的上转换发光材料进一步修饰；最后利用亲和素与生物素之间的特异性反应，将生物素修饰的恩诺沙星适配体连接于亲和素修饰的上转换发光材料表面，实现适配体的固定。该探针除了具有上转换发光材料荧光信号的高灵敏性和低干扰性外，更重要的是，与传统探针仅靠分子印迹聚合物或者适配体的单重识别效能相比，该探针具有分子印迹聚合物和适配体协同增效的双重识别保障，识别能力更加高效、精准。该探针不但可以用于目标物恩诺沙星的特异性识别和富集，还可以用于实际样品中恩诺沙星的定量测定。
附图说明
图1是不同浓度恩诺沙星对本发明的恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针强度的影响图；
图2不同浓度恩诺沙星与本发明的恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针强度变化的标准曲线；
图3是本发明的上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm的透射电镜图；
图4是本发明的恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的透射电镜图；
图5是本发明的上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm、硅烷化上转换发光材料和恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的红外光谱图。
具体实施方式
实施例1
(1)将0.78mol Y2O3(氧化钇)、0.2mol Yb2O3(氧化镱)、0.02mol Tm2O3(氧化铥)加入0.5mL浓硝酸中，60℃-70℃溶解后，挥发掉多余硝酸后，加入0.5mL蒸馏水搅拌至全部溶解后加入0.78mol EDTA(EDTA与Y2O3氧化钇的摩尔比为1:1)，用1mol/L的NaOH调节pH至7；加入25mL浓度为0.016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，100r/min转速下边搅拌边加入1.5mL HF，得到白色乳状液体；最后再加入3.5mL浓硝酸，搅拌均匀后，转移至水热反应釜中，然后将水热反应釜拧紧后置于200℃条件下水热反应18h，制得上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm；
(2)将步骤(1)制备的上转换发光材料0.05g分散于60mL异丙醇中；依次加入20mL的蒸馏水和2.5mL质量浓度为25％的氨水，室温下磁力搅拌15min；滴加40μL TEOS，磁力搅拌3h后；滴加200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下反应1h后停止搅拌，室温下陈化2h；离心分离，得到的固体物质经蒸馏水洗涤三次，60℃烘干得到硅烷化上转换发光材料；(3)将步骤(2)制得的硅烷化上转换发光材料10mg，分散于5mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1.25mL质量浓度为25％戊二醛溶液，在室温下振荡1h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，重新分散于5mL浓度为10mmol/L PBS中，加入1mL浓度为0.1mg/mL的亲和素溶液中，在37℃振荡17h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，得到亲和素修饰的上转换发光材料；
(4)将步骤(3)制备的10mg均匀分散于10mmol/L PBS中，加入200μL浓度为1μmol/L的恩诺沙星适配体溶液，适配体核酸序列为5’-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGTTCGGCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA -biotin-3’)，在37℃振荡17h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，得到恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料；
(5)将步骤(4)制备的恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料10mg分散于10mmol/LPBS中，加入1mL浓度为10μg/mL恩诺沙星溶液，在37℃振荡1h，离心分离，将得到的固体物质；
(6)将步骤(5)的固体物质10mg均匀分散于10mL致孔剂乙腈中，加入0.6mmol功能单体甲基丙烯酸，振荡30min，加入20mmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和0.08g引发剂偶氮二异丁腈，80℃水浴振荡器反应24h，水浴振荡器的振荡速度为300转/分，将产物置于甲醇中反复洗脱10次，再用解离缓冲液(10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)反复洗脱10次，制得恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。
实施例2
(1)将0.78mol Y2O3(氧化钇)、0.2mol Yb2O3(氧化镱)、0.02mol Tm2O3(氧化铥)加入2mL浓硝酸中，70℃-80℃溶解后，挥发掉多余硝酸后，加入2mL蒸馏水，搅拌至全部溶解后加入0.78mol EDTA，用6mol/L的NaOH调节pH至8；加入25mL浓度为0.016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，300r/min转速下边搅拌边加入1.5mL HF，得到白色乳状液体；最后再加入3.5mL浓硝酸，搅拌均匀后，转移至水热反应釜中，然后将水热反应釜拧紧后置于170℃条件下水热反应24h，制得上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm；
(2)将步骤(1)制备的上转换发光材料0.2g分散于100mL异丙醇中；依次加入40mL的蒸馏水和5mL质量浓度为25％的氨水，室温下磁力搅拌30min；滴加80μL TEOS，磁力搅拌3h后；滴加400μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下反应2h后停止搅拌，室温下陈化6h；离心分离，得到的固体物质经蒸馏水洗涤三次，90℃烘干得到硅烷化上转换发光材料；
(3)将步骤(2)制得的硅烷化上转换发光材料50mg，分散于8mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1.25mL质量浓度为25％戊二醛溶液，在室温下振荡2h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，重新分散于8mL 10mmol/L PBS中，加入1mL浓度为0.2mg/mL的亲和素溶液中，在37℃振荡30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，得到亲和素修饰的上转换发光材料；
(4)将步骤(3)制备的50mg均匀分散于10mmol/L PBS中，加入300μL浓度为1μmol/L的恩诺沙星适配体溶液，适配体核酸序列为5’-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCGGCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3’)，在37℃振荡30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，得到恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料；
(5)将步骤(4)制备的恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料50mg分散于10mmol/LPBS中，加入1mL浓度为30μg/mL恩诺沙星溶液，在37℃振荡2h，离心分离，收集固体物质；(6)将步骤(5)的固体物质10mg均匀分散于8mL致孔剂乙腈中，加入0.4mmol功能单体甲基丙烯酸，振荡20min，加入15mmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和0.05g引发剂偶氮二异丁腈，70℃水浴振荡器反应18h，水浴振荡器的振荡速度为200转/分，将产物置于甲醇中反复洗脱8次，再用解离缓冲液(10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)反复洗脱8次，制得恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。
实施例3
(1)将0.78mol Y2O3(氧化钇)、0.2mol Yb2O3(氧化镱)、0.02mol Tm2O3(氧化铥)加入1mL浓硝酸中，80℃-90℃溶解后，挥发掉多余硝酸后，加入1mL蒸馏水，搅拌至全部溶解后加入0.78mol EDTA，用3mol/L的NaOH调节pH至7.3；加入25mL浓度为0.016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，200r/min转速下边搅拌边加入1.5mL HF，得到白色乳状液体；最后再加入3.5mL浓硝酸，搅拌均匀后，转移至水热反应釜中，然后将水热反应釜拧紧后置于180℃条件下水热反应20h，制得上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm；
(2)将步骤(1)制备的上转换发光材料0.1g分散于80mL异丙醇中；依次加入30mL的蒸馏水和3mL质量浓度为25％的氨水，室温下磁力搅拌20min；滴加60μL TEOS，磁力搅拌3h后；滴加300μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下反应1.5h后停止搅拌，室温下陈化4h；离心分离，得到的固体物质经蒸馏水洗涤三次，80℃烘干得到硅烷化上转换发光材料；
(3)将步骤(2)制得的硅烷化上转换发光材料30mg，分散于6mL 10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1.25mL质量浓度为25％戊二醛溶液，在室温下振荡1.5h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，重新分散于6mL 10mmol/L PBS中，加入1mL浓度为0.15mg/mL的亲和素溶液中，在37℃振荡25h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，得到亲和素修饰的上转换发光材料；
(4)将步骤(3)制备的30mg均匀分散于10mmol/L PBS中，加入240μL浓度为1μmol/L的恩诺沙星适配体溶液，适配体核酸序列为5’-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCGGCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3’)，在37℃振荡22h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L PBS洗三次，得到恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料；
(5)将步骤(4)制备的恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料30mg分散于10mmol/LPBS中，加入1mL浓度为20μg/mL恩诺沙星溶液，在37℃振荡1.5h，离心分离，收集固体物质；(6)将步骤(5)的固体物质10mg均匀分散于5mL致孔剂乙腈中，加入0.2mmol功能单体甲基丙烯酸，振荡15min，加入10mmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和0.01g引发剂偶氮二异丁腈，60℃水浴振荡器反应12h，水浴振荡器的振荡速度为150转/分，将得到的产物置于甲醇中反复洗脱5次，再用解离缓冲液(10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)反复洗脱5次，制得恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。
恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针(以下简称探针)对恩诺沙星的检测数据：
图1是在0.01g探针中分别加入5mL浓度为0、0.5、1、3、5、7、10ng/mL的恩诺沙星标准溶液。由图1可知，随着探针溶液中恩诺沙星浓度的不断增大，探针的荧光强度不断下降。
图2是在0.01g探针中分别加入5mL浓度为0、0.5、1、3、5、7、10ng/mL的恩诺沙星标准溶液。以恩诺沙星的浓度为横坐标，以探针在不同浓度恩诺沙星中荧光强度的变化为纵坐标，拟合标准曲线，如图2所示，标准曲线的线性范围为0.5ng/mL-10ng/mL，方程为y＝46.016x+145.38，相关系数R2为0.9901。
图3为上转换发光材料的透射电镜，由图可知粒径约为50nm。图4为恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的透射电镜图，由图可知适配体/分子印迹杂化聚合物被成功的包被于上转换发光材料表面，包被厚度约为20nm。
分别对上转换发光材料、硅烷化上转换发光材料和恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针三种材料进行红外光谱扫描，如图5所示，上转换发光材料的图谱中可以看出，1654cm-1and 3421cm-1分别为氨基的弯曲和伸缩振动峰。从硅烷化上转换发光材料图谱看出，在798cm-1和1095cm-1处出现了新的伸缩振动峰，分别为Si–O和Si–O–Si，证明上转换发光材料表面被成功的进行了硅烷化修饰，增加了上转换发光材料的生物亲和性，为下一步荧光探针的合成奠定了基础。从恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针图谱看出，在1172cm-1,1263cm-1和1716cm-1处，出现了新吸收峰，主要是由于C–O和C＝O导致的，在2993cm-1也出现了C–H振动峰，这些结果证明功能单体甲基丙烯酸和交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯被成功的聚合在了修饰后的上转换发光材料表面，形成了恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。
实际样品测定：选取鲈鱼、鲶鱼、鲅鱼三种市场上常见鱼类作为样品，参考国家标准方法农业部783号公告-2-2006进行样品前处理，得到待测样品溶液5mL，在待测溶液中加入本发明实施例3的探针0.01g，进行实际样品检测。测定结果如表1所示，三个加标水平下的回收率范围为87.05％-96.24％，RSD值为1.19％-4.68％，均低于5％，说明该探针可用于实际水产样品中恩诺沙星的检测分析。
表1实际样品分析(n＝3)
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，其特征是：制备步骤如下：
(1)将Y2O3、Yb2O3和Tm2O3硝酸化后，加入EDTA、CTAB的乙二醇溶液、HF和浓硝酸，进行水热反应，制得上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm；
(2)将步骤(1)制备的上转换发光材料0.05g-0.2g分散于60mL-100mL异丙醇中；依次加入20mL-40mL的蒸馏水和2.5mL-5mL质量浓度为25％的氨水，室温下搅拌15min-30min；滴加40μL-80μL的正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌3h后；滴加200μL-400μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下反应1h-2h后停止搅拌，室温下陈化2h-6h；离心分离，得到的固体物质经蒸馏水洗涤三次，60℃-90℃烘干，得到硅烷化上转换发光材料；
(3)将步骤(2)制得的硅烷化上转换发光材料10mg-50mg，分散于5mL-8mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1.25mL质量浓度为25％戊二醛溶液，在室温下振荡1h-2h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，重新分散于5mL-8mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1mL浓度为0.1mg/mL-0.2mg/mL的亲和素溶液中，在37℃振荡17h-30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，得到亲和素修饰的上转换发光材料；
(4)将步骤(3)制备的亲和素修饰的上转换发光材料10mg-50mg均匀分散于10mmol/L的PBS中，加入200μL-300μL浓度为1μmol/L的恩诺沙星适配体溶液，在37℃振荡17h-30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，得到恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料；
(5)将步骤(4)制备的恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料10mg-50mg分散于10mmol/L的PBS中，加入1mL浓度为10μg/mL-30μg/mL恩诺沙星溶液，在37℃振荡1h-2h，离心分离，收集固体物质；
(6)将步骤(5)得到的固体物质均匀分散于致孔剂中，加入功能单体，振荡15min-30min，加入交联剂和引发剂，所述固体物质的质量与致孔剂的体积之比为10mg:5mL-10mL，固体物质的质量与功能单体的摩尔比10mg:0.2mmol-0.6mmol，固体物质质量与交联剂的摩尔比10mg:10mmol-20mmol，固体物质与引发剂的质量比为10mg:0.01g-0.08g；在60℃-80℃水浴中振荡反应12h-24h，振荡速度为150转/分-300转/分，将产物置于甲醇中反复洗脱5次-10次，再用解离缓冲液反复洗脱5次-10次，制得恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。
2.根据权利要求1所述的恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，其特征是：所述致孔剂为乙腈，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。
3.根据权利要求1所述的恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，其特征是：所述适配体核酸序列为5’-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCGGCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3’。
4.根据权利要求1所述的恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，其特征是：步骤(1)制备上转换发光材料NaYF4:Yb,Tm时，将Y2O3、Yb2O3、Tm2O3按照摩尔比0.78:0.2:0.02加入浓硝酸中，所述Y2O3与浓硝酸的摩尔体积比为0.78mol：0.5mL-2mL，60℃-90℃溶解后，挥发掉多余硝酸，加入蒸馏水，所述Y2O3与蒸馏水的摩尔体积比为0.78mol：0.5mL-2mL，搅拌至全部溶解后按照EDTA与Y2O3氧化钇的摩尔比1:1加入EDTA，用浓度为1mol/L-6mol/L的NaOH调节pH至7-8；加入浓度为0.016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，Y2O3与CTAB的摩尔体积比为0.78mol：25mL，100r/min-300r/min转速下按照Y2O3氧化钇与HF的摩尔体积比0.78mol：1.5mL边搅拌边加入HF，得到白色乳状液体；最后再按照Y2O3与浓硝酸的摩尔体积比0.78mol：3.5mL加入浓硝酸，搅拌均匀后，得到混合物溶液；将混合物溶液转移至水热反应釜中，然后将水热反应釜拧紧后置于170℃-200℃条件下水热反应18h-24h。
5.根据权利要求1所述的恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，其特征是：所述解离缓冲液是由10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2组成。
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