CN107556268A - 一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂及其合成方法。合成过程中以同时带有氨基和羧基的试剂(如6‐氨基己酸的同系物)作为原料，经与含同位素D或¹³C取代的碘甲烷或甲醛反应，将氨基转化成季铵，并实现将碘甲烷或甲醛上的同位素引入到季铵的甲基上。通过选用不同D取代或¹³C取代的碘甲烷和甲醛，通过调整反应路线，可得到一系列具有不同同位素取代的产物。将该系列产物进一步与N‐羟基琥珀酰亚胺反应，使其羧基与N‐羟基琥珀酰亚胺的羟基反应形成酯，即得到一组可与氨基或酚羟基高效反应的同位素标记试剂。

Description

一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂及其合成方法

技术领域

本发明属于化学合成领域，涉及一组用于标记氨基或酚羟基的同位素标记试剂及其合成方法，借助该标记试剂对样品进行标记，在液相色谱-质谱联用技术中可对这两类物质实现高效准确的定量分析。

背景技术

质谱法(mass spectrometry)在现代分析技术中占有举轻重的地位，基于质谱的定量方法也在迅速发展当中，为了有效克服复杂样品中因基质效应产生的信号强度差异，同位素内标法被广泛应用于质谱的定量分析当中。但同位素内标试剂受到价格较高，商品化程度低等限制，通常只适合目标分析物较少的情况。当目标物增加时，这种限制由为突出。相对之下，用同位素标记的方法则具有显著优势，特别是在生物分析中，稳定同位素标记(stable isotope labeling)技术得到了飞速发展。目前已有多种标记方法被应用于多肽及蛋白析中氨基或羧基的标记，通过与这些目标物中的可反应基团反应将同位素结合到目标分析上物，通过对比液相色谱-质谱中(LC-MS)的信号响应强度，对其实现相对或绝对定量分析。在该标记方法中，新型同位素试剂的合成及标记方法的开发是该技术的关键。

本发明通过选用不同氘代或¹³C取代的碘甲烷和甲醛，通过对6-氨基己酸同系物中的氨基进行甲基化反应，可得到一系列具有不同同位素的季铵盐产物。将该系列产物进一步与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，使其羧基与NHS的羟基反应形成酯，使羧基得到活化，最终得到一组可与氨基或酚羟基高效反应的同位素标记试剂。通过采用该组试剂进行标记，并结合LC-MS可实现对复杂样品中氨基类或酚类化合物的快速、准确、稳定的大规模定量分析。

发明内容

本发明的目的在于合成一组新型同位素标记试剂，进而对带有氨基或酚羟基的化合物进行标记。

本发明的技术方案为：

一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂，以6-氨基己酸或其同系物为原料，将原料中的氨基甲基化后，对甲基化后的产物中的羧基用N-羟基琥珀酰亚胺进行酯化，得到该同位素标记试剂，同位素标记试剂化的结构式如下：

其中，R₁，R₂和R₃为-CH₃,-CDH₂，-CD₂H，-CD₃，-¹³CH₃,-¹³CDH₂，-¹³CD₂H，或-¹³CD₃中的一种，三个取代基可相同也可不同。

所述的同位素标记试剂的结构特点是一端为琥珀酰亚胺酯，另一端为三甲基取代的铵盐，琥珀酰亚胺酯与三甲基铵盐之间通过碳链相连，中部碳链上(CH₂)碳原子个数为1-11。季铵上甲基的取代方式有多种，其差别为H、D及¹³C原子的个数。

上述一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，该合成方法将含有同位素的碘甲烷或甲醛通过多步的甲基化反应后，原料中的氨基转化为季铵的同时，引入同位素；将该含有同位素的季铵产物与N-羟基琥珀酰亚胺反应，将季铵产物中的羧基进行活化，最终得到该组标记试剂。在合成过程中采用两种路线，其具体步骤如下：

路线一：仅适用于R₁、R₂和R₃三个取代基全部相同时

第一步：以6-氨基己酸的同系物为反应原料，采用碘甲烷或同位素取代的碘甲烷对伯胺进行季铵化

将水和有机溶剂按1:1-1:4的体积比混合后，依次加入反应原料和碱性溶液，室温搅拌均匀得到混合溶液A，其中，反应原料在水中的浓度为0.035-1mmol/mL，碱在水中的浓度为0.5-7mmol/mL。室温下，将碘甲烷或同位素取代的碘甲烷加入混合溶液A中，60-80℃条件下，搅拌回流反应8-10h后，得到产物溶液B。所述的反应原料为6-氨基己酸的同系物，结构式为：

所述的同位素取代的碘甲烷包括CH₃I、¹³CH₃I、CH₂DI、CHD₂I、CD₃I、¹³CD₃I。所述的碱性溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠溶液等。所述的搅拌的转速为200-400rpm。所述反应原料与碘甲烷摩尔比为1:3.3-1:4.8。

以碘甲烷为例，其反应式如下：

第二步：将产物溶液B用盐酸将其pH调到酸性，pH＝2-5，旋转蒸发干燥后得到产物C，产物C溶解于乙腈溶剂中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，对产物C中的羧基进行活化，在40-60℃条件下，搅拌反应15-20h后得到目标最终产物。反应式如下：

所述的产物C、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.1-2.5:2.2-4。所述的搅拌转速为200-400rpm。

路线二：适用于R₁、R₂和R₃三个取代基不完全相同时

第一步：以6-氨基己酸的同系物为反应原料，采用甲醛或同位素取代的甲醛，结合使用氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)或氰基硼氘化钠(NaBD₃CN)溶液对伯胺进行二甲基化。

将反应原料和甲醛或同位素取代的甲醛溶于缓冲液中，再加入NaBH₃CN或NaBD₃CN，得到反应溶液，室温下反应1-2h后加入氨水溶液终止反应，最后加入甲酸酸化样品，得到产物D。所述的反应原料为6-氨基己酸的同系物(同路线一)。该步的反应式为：

或为：

所述的反应溶液的pH为6-8。所述的反应原料、甲醛或同位素取代的甲醛、NaBH₃CN或NaBD₃CN三者的摩尔比为1:2-3:2-3；所述的同位素取代的甲醛包括CH₂O、CD₂O、¹³CH₂O、¹³CD₂O。所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液等。

第二步：以产物D为原料，将其溶解于乙腈中，再加入碘甲烷或同位素取代的碘甲烷及一定量的碱，在60-80℃条件下，搅拌回流反应4-6h，完成季铵化反应，得到产物E，其反应式如下：

所述的产物D，碘甲烷或同位素取代的碘甲烷，碱的三者的摩尔比为1:1.1-1.6:5-15。所述的搅拌转速为200-400rpm。所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾。

第三步：以产物E为原料，将产物E溶于乙腈溶剂中，在反应体系中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，对产物E的羧基进行活化并形成酯，在40-60℃条件下，搅拌反应15-20h后得到目标最终产物。

该步的反应式如下：

所述的产物E、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.1-2.5:2.2-4。所述的搅拌转速为200-400rpm。

本发明通过6-氨基己酸的同系物与碘甲烷的季铵化反应及与甲醛的二甲基化反应结合，再与N-羟基琥珀酰亚胺脱水缩合，可合成34种同位素标记试剂。在质谱分析中，该组试剂可显著提高对氨基化合物分析过程中的定量能力，且可将多份样品在一次质谱分析中完成，提高分析效率。此外，该试剂可使目标物季铵化，可提高分析物的在电喷雾电离中的离子化效率，提高分析的灵敏度，实现了对环境介质中痕量氨基化合物的快速、准确定量分析。

本发明的有益效果为，通过以价格相对较为低廉的D或¹³C取代的碘甲烷或甲醛，通过其与初始原料中的氨基反应，将氨基转化为季铵并将同位素原子引入到产物中。通过选用不同的同位素试剂及合成路线，可制备得到一系列具体分子量差异的化合物。最后用NHS与季铵化产物中的羧基反应，使羧基活化，得到可用于标记氨基及酚羟基的30余种同位素标记试剂。当用MS或LC-MS对含有氨基或酚羟基的目标物进行定量分析时，无需借助各自的同位素内标，可将样品及已知浓度的待测目标物的标准品分别用所合成的标记试剂进行衍生，将其转化为带有同位素的目标物，然后混合后进行LC-MS分析实现定量。在实际分析过程中，可选用多种同位素试剂分别对样品标记，然后将多个样品混合分析，在单次的LC-MS分析中实现对多个样品的相对定量或绝对定量。单次LC-MS分析中样品的个数理论上可达12个及以上，仪器分析时间缩减至原来的1/12及以下。与每个样品单次进样分析相比，利用该系列同位素试剂进行标记后可显著提高分析的效率及准确性，同时也节约了分析的费用。此外，通过改变标记试剂中间碳链的个数，可以控制标记试剂的亲疏水性，改善目标物分析物在LC上的保留及分离效果。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1(路线1)：

1)称量0.76mmol的6-氨基己酸于10mL离心管中，加1mL超纯水溶解，再加入7mmol的氢氧化钠，振荡搅拌均匀。

2)将上述溶液转移至25mL的烧瓶，再加4mL的乙腈，混合均匀。

3)再向烧瓶加2.75mmol的碘甲烷，反应体系加热控温70℃，搅拌回流，转速控制在200rpm，反应8小时即得到季铵产物的混合溶液。反应式如下：

4)取0.12mmol上述获得的季铵盐产物于25mL的烧瓶中，加100μL浓盐酸(37％)调酸性，再用旋转蒸发仪旋蒸干，再加4mL干化的乙腈作为溶剂。加入0.14mmol NHS，再加入0.36mmol DCC，开始搅拌，转速300rpm加热控温40℃回流。反应15小时即得目标产物0D-0¹³C(不含D和¹³C的同位素)。反应式如下：

实施例2(路线2)：

1)取0.076mmol 8-氨基辛酸于10mL离心管中，再加1mL pH＝7的磷酸盐缓冲溶液(由0.2M)使其溶解。

2)再加0.228mmol的氘代甲醛(37％)溶液以及250μL NaBH₃CN(0.6mol/L)于上述1)所得的溶液中，于试管混合器上反应2小时。最后加入16μL 1％氨水溶液终止反应，然后再加入8μL甲酸酸化样品。

3)将2)中溶液转移至25mL的烧瓶，再向瓶中加入0.3mmol氢氧化钠调碱性，再加入0.0836mmol碘甲烷再向瓶中加入2mL乙腈，在70℃下回流，转速控制在200rpm，反应时间5h。反应式如下：

4)将3)中0.025mmol季铵盐产物溶液转移于烧瓶中，加20μL浓盐酸(36％)，用旋转蒸发仪旋蒸干后再加4mL乙腈溶解。加入0.03mmol NHS及0.055mmol DCC，转速400rpm下搅拌，50℃下回流，反应17小时即得目标产物4D-0¹³C(含有4个D原子，0个¹³C原子)。反应式如下：

实施例3(路线1)：

1)称量0.076mmol的4-氨基丁酸于10mL离心管中，加1mL超纯水溶解，再加入0.7mmol的氢氧化钠固体，搅拌溶解。

2)将上述溶液转移至25mL的烧瓶，再加2mL的乙腈。

3)再向烧瓶加0.30mmol的氘代碘甲烷(CD₃I)，搅拌转速300rpm，在60℃下回流反应8小时即得季铵产物的溶液。反应式如下：

4)取0.025mmol上述获得的季铵盐产物于25mL的烧瓶中，加30μL浓盐酸(37％)，再用旋转蒸发仪旋蒸干，再加4mL乙腈作为溶剂溶解。加入0.0325mmol N-羟基琥珀酰亚胺，再加入0.0575mmol DCC，开始搅拌，转速300rpm下加热至60℃回流。反应20h后得目标产物9D-0C(含有9个D原子，0个¹³C原子)。反应式如下：

实施例4(路线2)：

1)取0.15mmol 10-氨基癸酸于10mL离心管中，再加1mL pH＝7的磷酸盐缓冲溶液(0.2M)使其溶解；

2)再加0.3mmol D₂-甲醛以及750μL NaBH₃CN(0.6mol/L)溶液，于试管混合器上反应1h。反应完成后加入32μL 1％氨水溶液终止反应，然后再加入16μL甲酸酸化样品，得到二甲基化的产物。反应式如下：

3)将2)中溶液转移至25mL的烧瓶，加入3mmol氢氧化钠，搅拌均匀后再加入0.21mmol氘代碘甲烷(ID₃)及2mL乙腈，温度控制在60℃，转速控制在300rpm，回流反应时间8h，得到季铵盐产物。反应式如下：

4)将3)中溶液转移于烧瓶中，加40μL浓盐酸调酸性，再用旋转蒸发仪旋蒸干，再加4mL干化的乙腈作为溶剂。加入0.18mmol NHS和0.45mmol DCC，开始搅拌，加热并保持在50℃，转速400rpm，回流反应20小时即得目标产物7D-0¹³C(含有7个D原子，0个¹³C原子)。反应式如下：

实施例5(路线2)：

1)取0.076mmol 7-氨基庚酸于10mL离心管中，再加1mL pH＝7的磷酸盐缓冲溶液(0.2M)使其溶解。

2)再加0.19mmol氘代甲醛以及316μL NaBH₃CN(0.6mol/L)溶液，开始于试管混合器上反应1.5h。最后加入32μL 1％氨水溶液终止反应，然后再加入16μL甲酸酸化样品，得到二甲基化产物。反应式如下：

3)将2)中溶液转移至250mL的烧瓶，再向瓶中加入5mmol氢氧化钠调碱性，再加入0.12mmol碳13取代的碘甲烷(¹³CH₃I)再向瓶中加入2mL乙腈，温度控制在80℃，转速控制在300rpm，回流反应时间8h。反应式如下：

4)将3)中溶液转移于烧瓶中，加40μL浓盐酸调酸性，再用旋转蒸发仪旋蒸干，再加4mL乙腈溶解。加入0.114mmol NHS和0.19mmol DCC，搅拌转速300rpm加热控温50℃，回流反应17h即得目标产物4D-1¹³C(含有4个D原子，1个¹³C原子)。反应式如下：

实施例6(路线1)：

1)称量0.76mmol的2-氨基乙酸(甘氨酸)于离心管中，加1mL超纯水溶解，再加入3mmol的氢氧化钠，振荡溶解。

2)将上述溶液转移至250mL的烧瓶，再加3mL的乙腈，混合均匀。

3)再向烧瓶加2.5mmol的碘甲烷，反应体系加热控温70℃，回流，搅拌转速控制在300rpm，开始反应，反应10小时得季铵盐产物的溶液。反应式如下：

4)取0.12mmol上述获得的季铵盐产物于250mL的烧瓶中，加80μL浓盐酸(37％)调酸性，再用旋转蒸发仪旋蒸干，再加4mL乙腈溶解。加入0.13mmol NHS和0.48mmol DCC，开始搅拌，转速300rpm，控温40℃下回流，反应15小时即得标记试剂0D-3¹³C(含有0个D原子，3个¹³C原子)。反应式如下：

实施例7(路线1)：

1)称量0.76mmol的12-氨基十二酸于离心管中，加1mL超纯水溶解，再加入3mmol的氢氧化钠固体，振荡溶解。

2)将上述溶液转移至25mL的烧瓶，再加6mL的乙腈，振荡混合均匀。

3)再向烧瓶加3.6mmol的¹³C取代的碘甲烷(I¹³CHD₂)，反应体系加热控温70℃，回流，搅拌转速控制在400rpm，开始反应，反应9h得季铵产物。反应式如下：

4)取0.12mmol上述获得的季铵盐产物于25mL的烧瓶中，加80μL浓盐酸(37％)调酸性，再用旋转蒸发仪旋蒸干，再加5mL乙腈溶解。加入0.3mmol NHS和0.26mmol DCC，搅拌转速400rpm，在温度为50℃下回流，反应19h得目标产物9D-3¹³C(含有9个D原子，3个¹³C原子)。反应式如下：

实施例8(路线2)：

1)取0.076mmol 6-氨基庚酸于10mL离心管中，再加1mL pH＝7的磷酸盐缓冲溶液(0.2M)使其溶解。

2)再加0.19mmol甲醛以及316μL NaBD₃CN(0.6mol/L)溶液，开始于试管混合器上反应1.5h。最后加入32μL 1％氨水溶液终止反应，然后再加入16μL甲酸酸化样品，得到二甲基化产物。反应式如下：

3)将2)中溶液转移至250mL的烧瓶，再向瓶中加入5mmol氢氧化钾调碱性，再加入0.12mmol碳13取代的碘甲烷(¹³CH₃I)再向瓶中加入2mL乙腈，温度控制在80℃，转速控制在400rpm，回流反应时间8h。反应式如下：

4)将3)中溶液转移于烧瓶中，加40μL浓盐酸调酸性，再用旋转蒸发仪旋蒸干，再加4mL乙腈溶解。加入0.114mmol NHS和0.19mmol DCC，搅拌转速300rpm加热控温50℃，回流反应15h即得目标产物2D-1¹³C(含有2个D原子，1个¹³C原子)。反应式如下：

Claims (10)

1.一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂，其特征在于，所述的同位素标记试剂以6-氨基己酸或其同系物为原料，原料中的氨基甲基化后，对产物中的羧基采用N-羟基琥珀酰亚胺进行酯化，得到该同位素标记试剂；同位素标记试剂的结构特点是一端为琥珀酰亚胺酯，另一端为三甲基取代的铵盐，琥珀酰亚胺酯与三甲基铵盐之间通过中部碳链相连，中部碳链上碳原子个数为1-11；

同位素标记试剂化的结构式如下：

其中，R₁，R₂和R₃为-CH₃,-CDH₂，-CD₂H，-CD₃，-¹³CH₃,-¹³CDH₂，-¹³CD₂H，或-¹³CD₃中的一种，三个取代基相同或不同。

2.权利要求1所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，合成方法中包括两种路线，步骤如下：

路线一：适用于R₁、R₂和R₃三个取代基全部相同时

第一步：以6-氨基己酸的同系物为反应原料，采用碘甲烷或同位素取代的碘甲烷对伯胺进行季铵化

将水和有机溶剂混合后，依次加入反应原料和碱性溶液，室温搅拌均匀得到混合溶液A，其中，反应原料在水中的浓度为0.035-1mmol/mL，碱在水中的浓度为0.5-7mmol/mL；室温下，将碘甲烷或同位素取代的碘甲烷加入混合溶液A中，60-80℃条件下，搅拌回流反应8-10h后，得到产物溶液B；所述反应原料与碘甲烷摩尔比为1:3.3-1:4.8；所述的反应原料的结构式为：

第二步：将产物溶液B用盐酸将其pH调到酸性，旋转蒸发干燥后得到产物C，产物C溶解于乙腈溶剂中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N,N-二环己基碳二亚胺DCC，对产物C中的羧基进行活化，在40-60℃条件下，搅拌反应15-20h后得到目标最终产物；所述的产物C、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.1-2.5:2.2-4；

路线二：适用于R₁、R₂和R₃三个取代基不完全相同时

第一步：以6-氨基己酸的同系物为反应原料，采用甲醛或同位素取代的甲醛，结合使用氰基硼氢化钠NaBH₃CN或氰基硼氘化钠NaBD₃CN溶液对伯胺进行二甲基化

将反应原料、甲醛或同位素取代的甲醛溶于缓冲液中，再加入NaBH₃CN或NaBD₃CN，得到反应溶液，反应溶液的pH为6-8，室温下反应1-2h后加入氨水溶液终止反应，最后加入甲酸酸化样品，得到产物D；所述的反应原料、甲醛或同位素取代的甲醛、NaBH₃CN或NaBD₃CN三者的摩尔比为1:2-3:2-3；

第二步：以产物D为原料，将其溶解于乙腈中，再加入碘甲烷或同位素取代的碘甲烷及一定量的碱，在60-80℃条件下，搅拌回流反应4-6h，完成季铵化反应，得到产物E；所述的产物D，碘甲烷或同位素取代的碘甲烷，碱三者的摩尔比为1:1.1-1.6:5-15；

第三步：以产物E为原料，将产物E溶于乙腈溶剂中，在反应体系中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS和N,N-二环己基碳二亚胺DCC，对产物E的羧基进行活化并形成酯，在40-60℃条件下，搅拌反应15-20h后得到目标最终产物；所述的产物E、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.1-2.5:2.2-4。

3.根据权利要求2所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，所述的同位素取代的碘甲烷包括CH₃I、¹³CH₃I、CH₂DI、CHD₂I、CD₃I、¹³CD₃I；所述的同位素取代的甲醛包括CH₂O、CD₂O、¹³CH₂O、¹³CD₂O。

4.根据权利要求2或3所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，路线1第二步中所述的盐酸调后的产物溶液B的pH＝2-5。

5.根据权利要求2或3所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，路线1第一步所述的碱性溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠溶液。

6.根据权利要求4所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，路线1第一步所述的碱性溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠溶液；路线2第一步中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求2或3或6所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，路线1第一步、路线1第二步，路线2第二步、路线2第三步中所述的搅拌的转速为200-400rpm。

8.根据权利要求5所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，路线1第一步、路线1第二步，路线2第二步、路线2第三步中所述的搅拌的转速为200-400rpm。

9.根据权利要求2或3或6或8所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，路线1第一步中所述的水和有机溶剂的体积比为1:1-1:4。

10.根据权利要求7所述的一组用于氨基/酚羟基标记的同位素标记试剂的合成方法，其特征在于，路线1第一步中所述的水和有机溶剂的体积比为1:1-1:4。