CN116283787A - 一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法及应用 - Google Patents

一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂合成方法及应用，属于有机小分子胺类化合物荧光标记技术领域。以菲并咪唑为母体环，氯甲酸酯为反应活性基团，化学名称为：4‑(N‑苯基菲并咪唑基)‑苯甲基氯甲酸酯，具体制备方法为：(1)将菲醌、苯胺、对羟基甲基苯甲醛、醋酸铵进行反应，得到中间体；(2)将中间体与氢氧化钾水溶液进行水解反应，得到中间产物4‑(N‑苯基菲并咪唑基)‑苯甲醇；(3)中间产物与固体光气反应，得到目标产物。本发明可以快速、准确、灵敏地标记10种脂肪胺，从而实现复杂体系中痕量脂肪胺的分离与检测，可用于生命、食品等研究领域中多种脂肪胺的荧光标记与分析，具有广阔的应用前景。

Description

一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法及 应用
技术领域
本发明涉及有机小分子胺类化合物荧光标记技术领域，具体提供一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法及应用。
背景技术
大多数胺类化合物具有刺激性气味，可危害人体健康。许多胺类不仅有毒，还极易与空气中氮的氧化物及羟基自由基反应产生强致癌性物质—N-亚硝胺类化合物。因此建立一种高灵敏和高选择性的检测方法对保护环境和人类健康具有重要的意义。理想的衍生化试剂必须具备以下条件：试剂本身必须稳定，且在较大温度范围内能够迅速的衍生化；过量试剂或副产物不影响分离；试剂具有强的紫外吸收或在紫外下发射强的荧光；试剂易合成，衍生物在流动相体系下具有较好的溶解度。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所提供一种标记反应速率快、标记产物信号高、荧光检测胺类化合物准确性和灵敏度高的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，本发明提供一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂，以菲并咪唑为荧光母体环，氯甲酸酯为反应活性基团，其化学名称为：4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯，其化学结构式为：
Figure BDA0004142211440000011
本发明还包括一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，包括：
步骤1：将菲醌、苯胺、对羟基甲基苯甲醛与醋酸铵进行反应并水解，得到中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇；
步骤2：将中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇与固体光气反应，得到目标产物4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯。
进一步的，所述合成方法具体包括以下步骤：
步骤1：取代反应：将菲醌、苯胺、对羟基甲基苯甲醛、醋酸铵溶解到醋酸中，电磁搅拌下油浴105℃反应4h，反应结束，待反应液冷却后，倒入400mL水中，并不断搅拌，析出淡绿色固体，抽滤，并水洗两次，粗产物晾干。取上述产物溶于乙醇中，加入氢氧化钾水溶液，电磁搅拌下油浴80℃反应1h，反应结束后，旋转蒸发仪旋干，取乙醇重结晶两遍出淡绿色晶体。
步骤2：氯甲酰化反应：将固体光气溶解于二氯甲烷中，冰浴冷却搅拌条件下，滴加少量三乙胺，逐滴滴加溶有中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇的二氯甲烷溶液，冰浴下反应3小时，缓慢升到室温反应24小时，反应结束后，抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压蒸干，并用二氯甲烷重结晶，得到目标产物4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯。
进一步的，所述步骤1中，菲醌、苯胺、对羟基甲基苯甲醛、醋酸铵摩尔比优选为1:1.2:1:10，反应温度优选为105℃，反应时间优选为4h；中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇用乙醇重结晶2次，得到浅绿色结晶产物。
进一步的，所述步骤2中，目标产物4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯用二氯甲烷重结晶2次，得到白色针状结晶产物；
4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯与固体光气的摩尔比优选为1:3，三乙胺的加入量为固体光气质量的3％。
本发明还包括一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的应用，标记试剂具有上述的结构，或通过上述的合成方法合成，应用于检测样品中脂肪胺含量。
进一步的，检测样品中脂肪胺含量的具体步骤如下：
(1)溶液配制：配制pH＝9.0的硼酸-硼砂缓冲溶液；配制5份混合脂肪胺混合标准品溶液，浓度分别为10nM、100nM、1μM、10μM和100μM；配制浓度为10mM的4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液；
(2)工作曲线绘制：依次将400μL硼酸-硼砂缓冲溶液、20μL脂肪胺混合标准溶液和100μL4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，室温下反应4min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL进行高效液相色谱-荧光分析，得到脂肪胺混合标准品色谱分离图，将五份脂肪胺混合标准品依次衍生、高效液相色谱-荧光分析后，以脂肪胺浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制脂肪胺浓度工作曲线；
(3)脂肪胺浓度检测：将样品用4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯衍生标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入脂肪胺浓度工作曲线中，即可得到样品中脂肪胺的浓度。
进一步的，所述步骤(1)中，脂肪胺为甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺、壬胺和癸胺的混合物。
进一步的，检测生鲜鱼肉中脂肪胺含量的步骤如下：
取生鲜鱼肉1g剪碎并研磨置于10mL离心管中，加入2mL水、2mL乙腈充分振荡并超声15min。食物上清液中加入50mg Na2SO4，进一步除去食物中残留水分，按所述步骤(2)方法标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得生鲜鱼肉中各脂肪胺的浓度，进而得出各脂肪胺的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明试剂荧光最大激发波长与发射波长分别在297nm与418nm，可以实现对脂肪胺的荧光标记与检测。该试剂以菲并咪唑为荧光母体环，氯甲酸酯为反应活性基团，其合成步骤简单方便，易于实现，三步反应即可完成：(1)将菲醌、苯胺、对羟基甲基苯甲醛、醋酸铵进行反应，(2)经碱性溶液水解得到中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇，经乙醇重结晶2次得浅绿色晶体；(3)将中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇与固体光气反应，得到目标产物4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯，经二氯甲烷重结晶2次，得到白色针状结晶产品。
本发明荧光标记试剂化学性质稳定，化学纯度达99.6％。本发明菲并咪唑类荧光标记试剂是以菲并咪唑为母体环，以氯甲酸酯为活性基团。氯甲酸酯基团在标记胺类化合物(如氨基酸，脂肪胺)时，对胺类化合物选择性专一，而且标记时间短、标记产率高。在衍生条件上，菲醌荧光标记试剂只需在室温条件下反应2-5分钟即可衍生完全，且不需要复杂的萃取条件，在检测方法上，采用高效液相色谱即可进行荧光检测。因此，本发明所述的氯甲酸酯标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记检测胺类化合物，尤其适用于复杂体系中微量、痕量小分子胺类化合物的分离检测，可用于生命分析、食品分析等研究领域中多种脂肪胺的荧光标记与分析，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1制备4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯合成路线图；
图2是本发明实施例1 4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的核磁1H NMR图；
图3是本发明实施例1 4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的紫外可见吸收光谱图；
图4是本发明实施例1 4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的荧光发射光谱图；
图5是本发明实施例2标记试剂与脂肪胺的反应路线图；
图6是本发明实施例2标记试剂衍生10种脂肪胺混合标准品的色谱分离图；
图7是本发明实施例3标记试剂检测实际样品生鲜鱼肉中的脂肪胺色谱图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例及对比例中所用试剂及材料，如无特殊说明，均可经过商业途径得到。
本发明提供一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用，具体实施例如下。
实施例1
一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂，以菲并咪唑为荧光母体环，氯甲酸酯为反应活性基团，其化学名称为：4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯，其化学结构式为：
Figure BDA0004142211440000051
具体的合成路线见图1，包括：
步骤1：取代反应：在500mL三口圆底烧瓶中加入菲醌(5.0g)与200mL冰醋酸，迅速加热至105℃使之互溶，依次加入对羟基甲基苯甲醛(3.25g)的醋酸溶液和苯胺(2.62mL)以及醋酸铵(18.0g)，加热回流4h后冷却至室温，将反应溶液缓慢倒入500mL水中，剧烈搅拌。过滤收集沉淀的固体，然后用去离子水洗涤2次，自然晾干；将固体溶于乙醇溶液中并倒入20mL 10M的KOH水溶液，80℃加热回流1h。后旋蒸浓缩乙醇重结晶两遍，得浅绿色晶体。
步骤2：氯甲酰化反应：向500mL三口圆底烧瓶中倒入200mL二氯甲烷冰浴下冷却至0℃，称取固体光气11.8g倒入烧瓶中电磁搅拌下反应30min，然后加入0.5mL三乙胺迅速盖好瓶塞反应10min。向烧瓶中缓慢加入溶有4.0g 4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇的二氯甲烷混合液约1h。滴加完成后冰浴下反应3h，后室温反应24h，过滤滤去不溶物，滤液经旋转蒸发仪减压蒸干，并用二氯甲烷重结晶两遍得白色针状结晶产物。
图2是4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的核磁1H NMR图，其表征数据如下：1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.03(s,2H),8.97(s,1H),7.90(s,1H),7.85(s,2H),7.75(s,2H),7.72(s,1H),7.69(s,1H),7.66(s,1H),7.64(s,1H),7.44(s,1H),7.41(s,2H),7.05(s,1H),5.76(s,1H),4.54(s,2H)。
为提高荧光标记脂肪胺的检测灵敏度，准确的获得荧光标记试剂的最大激发波长与最大发射波长是提高检测灵敏度的关键。本发明的标记试剂的最大激发波长与最大发射波长见图3-4，其中，图3是标记试剂的紫外可见吸收光谱图；图4是标记试剂的荧光发射光谱图。由图3-4可知，获得标记产物的最大激发波长与最大发射波长分别为297nm与418nm。
实施例2
本发明还提供一种检测样品中脂肪胺含量的方法，具体的：
(1)配制pH＝9.0的硼酸-硼砂缓冲溶液；配制5份混合脂肪胺混合标准品溶液，其中每种脂肪胺(甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺、壬胺、癸胺)的浓度均分别为10nM配制10nM混合脂肪胺标准品溶液，依次配制100nM、1μM、10μM和100μM；配制浓度为10mM的4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液；
(2)依次将400μL硼酸-硼砂缓冲溶液、20μL脂肪胺混合标准溶液和100μL4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，室温下反应4min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL进行高效液相色谱-荧光分析，得到脂肪胺混合标准品色谱分离图，将五份脂肪胺混合标准品依次衍生、高效液相色谱-荧光分析后，以脂肪胺浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制脂肪胺浓度工作曲线，见表1；
(3)将样品用4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯衍生标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入脂肪胺浓度工作曲线中，即可得到样品中脂肪胺的浓度。
表1
Figure BDA0004142211440000071
注：Y为峰面积，X为浓度。
由表1可知，各脂肪胺的标准曲线相关系数R2>0.9992,表明该分析物具有良好的线性关系。LODs和LOQs分别在1.59-4.29μg/Kg和4.27-14.63μg/Kg范围内。分析物的日内日间精密度分别在0.63-2.14％和2.89-6.94％范围内。即该分析方法具有良好的线性关系、较高精密度、较低的检测线和定量限。
本发明标记试剂与脂肪胺的反应路线图见图5；经过标记衍生10种脂肪胺混合标准品的色谱分离图见图6。由图6可知，本发明的标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记脂肪胺，尤其适用于复杂体系中微量、痕量小分子胺类化合物的分离检测。
实施例3
一种检测生鲜鱼肉中脂肪胺含量的方法，步骤如下：
取鲜鱼肉1g剪碎并研磨置于10mL离心管中，加入2mL水、2mL乙腈充分振荡并超声15min。离心分离得到食物上清液，向上清液中加入50mg Na2SO4，除去食物中残留水分得到待测样品，将400μL硼酸-硼砂缓冲溶液、20μL上述待测样品和100μL 4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，室温下反应4min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL进行高效液相色谱-荧光分析，得到样品生鲜鱼肉中的脂肪胺色谱图，见图7，将所得到的各脂肪胺的峰面积代入相对应工作曲线中，即可求得生鲜鱼肉中各脂肪胺的浓度，进而得出各脂肪胺的含量，具体的见表2。
表2
Figure BDA0004142211440000081
由表2可知，本实施例选取的生鲜鱼肉中仅含有甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺八种脂肪胺，并精确测量出其浓度。
实施例4
通过对三个水平(5mg/L、10mg/L、15mg/L)的脂肪胺标准溶液添加到海鲜产品提取液中评估回收率，回收率公式为：(测定脂肪胺浓度/理论脂肪胺浓度)×100％。具体的：
(1)依据实施例3得到生鲜鱼肉待测样品，并检测生鲜鱼肉中各脂肪胺浓度c1；
(2)依次将400μL硼酸-硼砂缓冲溶液、20μL上述待测样品、100μL4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，再分别加入浓度为5mg/L(C1-C10各脂肪胺的浓度均为5mg/L)、10mg/L(C1-C10各脂肪胺的浓度均为10mg/L)、15mg/L(C1-C10各脂肪胺的浓度均为15mg/L)的混合脂肪胺标准样品，室温下下反应4min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL进行高效液相色谱-荧光分析，得到新的脂肪胺色谱图，将所得到的各脂肪胺的峰面积代入相对应工作曲线中，即可求得各脂肪胺的浓度c2，依据下述公式计算回收率，结果见表3。
回收率＝(c2-c1)×100％/混合脂肪胺标准样品浓度。
表3
Figure BDA0004142211440000091
由表2可知，通过对三个水平(5mg/L、10mg/L、15mg/L)的脂肪胺标准溶液添加到海鲜产品提取液中评估回收率，回收率在88.5-100.8％范围内，本发明脂肪胺的回收率良好，说明本方法的准确度较好。
综上可知，本发明制备的标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记脂肪胺，同时，本发明提供的分析方法具有良好的线性关系、较高的准确度和精密度、较低的检测线和定量限，具有广阔的应用前景。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂，其特征在于，具有如下所示的化学结构式：
Figure FDA0004142211430000011
2.权利要求1所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，其特征在于，包括：
步骤1：将菲并咪唑与对羟基甲基苯甲醛进行取代反应并水解，得到中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇；
步骤2：将中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇与固体光气反应，得到目标产物4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯。
3.根据权利要求2所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
将菲醌、苯胺、对羟基甲基苯甲醛、醋酸铵溶解到醋酸中，电磁搅拌下油浴105℃反应4h，反应结束，待反应液冷却后，倒入500mL水中，并不断搅拌，析出淡绿色固体，抽滤，并水洗两次，粗产物晾干；取上述产物溶于300mL 95％乙醇中，加入氢氧化钾水溶液，电磁搅拌下油浴80℃反应1h，反应结束后，旋转蒸发仪旋干，取乙醇重结晶两遍得到淡绿色晶体。
4.根据权利要求2所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
将固体光气溶解于二氯甲烷中，冰浴冷却搅拌条件下，滴加三乙胺，逐滴滴加溶有中间体4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇的二氯甲烷溶液，冰浴下反应3小时，缓慢升到室温反应24小时，反应结束后，抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压蒸干，并用二氯甲烷重结晶，得到目标产物4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯。
5.根据权利要求3所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，其特征在于，所述步骤1中，菲醌、苯胺、对羟基甲基苯甲醛、醋酸铵摩尔比为1:1.2:1:10，反应温度为105℃，反应时间为4h。
6.根据权利要求4所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，其特征在于，所述步骤2中，4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯重结晶2次，得到白色针状结晶产物；4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲醇与固体光气的摩尔比为1:3，三乙胺的加入量为固体光气质量的3％。
7.权利要求1所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的应用，其特征在于，用于检测样品中脂肪胺含量。
8.根据权利要求7所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的应用，其特征在于，具体步骤如下：
(1)溶液配制：配制pH为9.0的硼酸-硼砂缓冲溶液；配制5份混合脂肪胺混合标准品溶液，浓度分别为10nM、100nM、1μM、10μM和100μM；配制浓度为10mM的4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液；
(2)工作曲线绘制：依次将400μL硼酸-硼砂缓冲溶液、20μL脂肪胺混合标准溶液和100μL 4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，室温下反应4min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL反应液进行高效液相色谱-荧光分析，得到脂肪胺混合标准品色谱分离图，将五份脂肪胺混合标准品依次衍生、高效液相色谱-荧光分析后，以脂肪胺浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制脂肪胺浓度工作曲线；
(3)脂肪胺浓度检测：将待测样品用4-(N-苯基菲并咪唑基)-苯甲基氯甲酸酯按照所述步骤(2)衍生标记处理后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入脂肪胺浓度工作曲线中，即可得到样品中脂肪胺的浓度。
9.根据权利要求8所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，脂肪胺为甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺、壬胺和癸胺的混合物。
10.根据权利要求9所述的菲并咪唑类荧光胺类化合物标记试剂的应用，其特征在于，用于检测生鲜鱼肉中脂肪胺含量的步骤如下：
取生鲜鱼肉1g剪碎并研磨置于10mL EP管中，加入2mL水、2mL乙腈充分振荡并超声15min，食物上清液中加入50mg Na2SO4，进一步除去食物中残留水分，按权利要求8中步骤(2)方法标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得生鲜鱼肉中各脂肪胺的浓度，进而得出各脂肪胺的含量。
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