CN115784910B - 一种用于检测甲醛的比率型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于检测甲醛的比率型荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测甲醛的比率型荧光探针及其制备方法和在食品检测中的应用,该探针分子的分子式为C20H17NO,其结构式如下所示。该探针在乙腈/HEPE(10mM,pH=7.4)溶剂中能与甲醛发生氮杂‑cope重排反应,脱掉烯丙基氨基,生成相应的醛,从而使荧光发生比率型变化,从蓝色荧光变成紫色荧光。探针PN能通过自体校正消除背景干扰,并且响应速度较快,与甲醛结合后不到100秒即可发生荧光颜色的变化。同时该探针还能在较为复杂的基质中稳定检测甲醛,因此在食品检测领域具有重要的应用价值,能用于甲醛的定性定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针领域,具体涉及一种用于检测甲醛的比率型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
甲醛(HCHO,简称FA)是一种无色、有刺激性气味的气体。作为一种细胞原生质毒物,甲醛可直接作用于氨基、巯基、羟基和羧基,生成次甲基衍生物,破坏机体蛋白质和酶,使组织细胞发生不可逆的凝固和坏死,从而对神经系统、肺和肝脏产生损害;摄取少量甲醛即能阻止胃酶和胰酶的消化作用,影响代谢机能,世界卫生组织已将其确定为致癌和致畸物质,且在我国有毒化学品控制名单上高居第二。我国目前规定在食品加工中禁止使用甲醛作为添加剂,但食品中甲醛检出的新闻仍然屡见不鲜。食品中的甲醛来源有三种主要途径,分别为人为添加、加工过程中引入或污染,以及动植物“内源性”产生。因此,食品中甲醛的残留已成为人们关注的问题。在这样的背景下,建立一种能够快速、灵敏、便携式检测甲醛的方法显得尤为重要。
目前已有许多成熟的方法检测甲醛,包括电化学法、比色法以及色谱法等,但都存在一定的不足,如限制条件多、抗干扰性差,操作过程繁琐等缺点,且这些技术的前处理过程复杂,不利于现场的快速检测。而荧光探针具有实时性、较高的灵敏度和选择性,具有单一选择性及强抗干扰性等优点,使得其在甲醛的检测上有着无可比拟的优势。因此,越来越多的反应型荧光探针被设计、报道并应用于检测甲醛。已经报道的方法主要基于三种机理,分别是烯丙基氨基与甲醛的氮杂-cope重排反应、氨基与甲醛的缩合反应以及肼基与甲醛的缩合反应。已报道的荧光探针虽然都成功地对甲醛进行了定性定量分析,都存在一些不足,比如发射波长单一,无法消除背景干扰,反应时间过长,无法达到快速检测的目的,没有便携性装置等。最重要的是,目前应用于检测食品中甲醛含量的探针鲜少报道。因此,非常需要开发一种快速、灵敏、实时检测食品中的甲醛含量。
发明内容
本发明的目的之一是提供克服现有技术的缺点与不足,提供一种用于检测甲醛的荧光探针;目的之二是提供所用于检测甲醛的荧光探针的制备方法;目的之三是提供所用于检测甲醛的荧光探针在食品检测中的应用。该探针的分子式为C20H17NO,外观呈现为淡黄色粉末,结构如下:
用于检测甲醛的比率型荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
在0℃,氮气氛围下,将烯丙基三氟硼酸钾加入到氨甲醇溶液中,搅拌后,将1-羟基-2芘甲醛加入反应瓶中,进行反应,反应结束后,用碳酸氢钠淬灭反应,粗产物用二氯甲烷萃取,收集有机层,用无水硫酸镁干燥后,旋干,经柱层析法得到荧光探针PN。
所述的1-羟基-2芘甲醛与烯丙基三氟硼酸钾的摩尔比为1:4~6。
柱层析法采用的硅胶为200-300目,淋洗剂为V正己烷:V乙酸乙酯=6:1。
所述的氨甲醇溶液中氨的浓度为5~9mol/L,氨甲醇溶液是通过氨溶解在甲醇溶剂里获得。
烯丙基三氟硼酸钾在氨甲醇溶液中搅拌时间为10~30min,进一步优选为20min。
加入1-羟基-2芘甲醛后的反应时间为8~12h(进一步优选为10h),反应温度为15~35℃。
具体地,其合成路线是:
具体制备方法:在0℃,氮气氛围中,将烯丙基三氟硼酸钾(1.480g,10mmol)加入到氨甲醇溶液(16mL,112mmol)中,搅拌20min,然后1-羟基-2芘甲醛(0.574mg,2mmol)通过注射的方式加入到反应瓶中,将反应温度恢复至室温,反应10h。用碳酸氢钠淬灭反应后。粗产物用二氯甲烷萃取后后,有机层用无水硫酸钠干燥,反应液减压旋蒸除去溶剂。以正己烷/乙酸乙酯(v/v,6:1)为洗脱剂,经过柱层析纯化,得到淡黄色探针PN固体。
本发明的探针的机理如下:
本发明的荧光探针作用机制如下,在探针分子中,烯丙基氨基与甲醛反应后,先生成亚胺,再通过氮杂-cope重排以及不饱和碳基β消除,快速释放出荧光团,生成1-羟基-2-芘甲醛,通过这个过程,富电子的烯丙基氨基变为具有强吸电子能力的醛集,强大的分子内电荷转移过程(ICT)导致探针的发射波长红移,荧光强度发生比率型变化,390nm处的发射峰强度显著增强,446nm处的发射峰强度显著减弱,荧光颜色从蓝色变为紫色。
用于检测甲醛的比率型荧光探针在检测甲醛中的应用。
一种应用的具体方式包括:
将荧光探针PN溶解于溶剂中,配置成(0.5~2)×10-3mol/L(进一步优选为1×10- 3mol/L)的探针溶液,然后加入待测物质,得到待测样品溶液,选择激发波长为340~350nm(进一步优选为345nm),在390nm处与446nm处,观察荧光强度变化。
另一种应用的具体方式包括:
将荧光探针PN溶于乙腈/HEPES溶剂(10mM,pH=7.4)中,配制成荧光探针PN的浓度为(0.5~2)×10-5mol/L(进一步优选为1.0×10-5mol/L)的溶液,然后加入甲醛样品溶液,配制成不同浓度梯度的甲醛样品溶液,用荧光仪观察荧光光谱变化,并计算390nm和446nm处的荧光强度比值I390/I446,根据荧光强度比值变化与加入甲醛样品浓度,绘制标准曲线,得到线性方程;
将待测样品加入到探针溶液中,得到待测样品溶液,然后用荧光光谱仪观察荧光光谱的变化,并计算I390/I446,再根据线性方程获得待测样品的含量。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
本发明探针分子的分子式为C20H17NO,在乙腈/HEPE(10mM,pH=7.4)溶剂中能与甲醛发生氮杂-cope重排反应,脱掉烯丙基氨基,生成相应的醛,从而使荧光发生比率型变化,从蓝色荧光变成紫色荧光。探针PN能通过自体校正消除背景干扰,并且响应速度较快,与甲醛结合后不到100秒即可发生荧光颜色的变化。同时该探针还能在较为复杂的基质中稳定检测甲醛,因此在食品检测领域具有重要的应用价值,能用于甲醛的定性定量检测。
本发明的荧光探针具有响应快速快,可以通过自体校正消除背景干扰,能在复杂基质中稳定检测甲醛的特点。
附图说明
图1为本发明中探针PN在氘代DMSO中氢谱,横坐标为化学位移(ppm),纵坐标为强度。
图2为本发明中探针PN在氘代DMSO中碳谱,横坐标为化学位移(ppm),纵坐标为强度。
图3为本发明中探针PN的质谱,电离源为:ESI-。
图4为本发明中探针PN在乙腈/HEPES(10mM,pH=7.4)溶剂中的紫外吸收光谱。
图5为本发明探针PN(1×10-5mol/L),在乙腈/HEPES(10mM,pH=7.4)溶剂中,室温分别与对照,Ca2+,NO3 -,Mg2+,Cl-,L-谷氨酸,L-精氨酸,L-亮氨酸,L-甘氨酸,L-半胱氨酸,N-乙酰-L-半胱氨酸,丙酮酸钠,丙酮酸,苯甲醛,乙醛反应后记录的荧光光谱。激发波长为:345nm。
图6为本发明探针PN与不同浓度甲醛反应后的荧光强度比值与线性关系。
图7为本发明探针PN与甲醛反应后390nm处与446nm处的荧光强度随时间变化。
图8为本发明探针PN-FA(1×10-5mol/L),在乙腈/HEPES(10mM,pH=7.4)溶剂中,室温分别与对照,Ca2+,NO3 -,Mg2+,Cl-,L-赖氨酸,L-精氨酸,L-亮氨酸,L-甘氨酸,L-半胱氨酸,N-乙酰-L-半胱氨酸,丙酮酸钠,丙酮酸,苯甲醛,乙醛反应记录的荧光光谱。激发波长为:345nm。
图9为本发明中PN-FA的质谱图,电离源为:ESI+。
图10为PN探针制成的纸基与不同浓度甲醛反应后的荧光颜色变化。
图11为B1探针的结构及发射光谱。
图12为B1探针的各项性能总结。
表1为实际水样中甲醛回收率数据。
表2为食品样品中甲醛检测数据。
具体实施方式
下面结合实例和附图对本发明作进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法,通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明,本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。
实施例1PN荧光探针的合成
0℃下,氮气氛围中,向50mL圆底烧瓶中,加入烯丙基三氟硼酸钾(1.480g,10mmol)以及氨甲醇溶液(16mL,112mmol),搅拌20min,然后将1-羟基-2芘甲醛(0.574g,2mmol)加入到反应瓶中,恢复至室温,室温25℃下反应10小时,用碳酸氢钠溶液淬灭反应,粗产物用二氯甲烷萃取,收集上层有机层,用无水Na2SO4干燥。减压除溶剂后,以乙酸乙酯/正己烷(v/v,1:6)为洗脱剂,柱层析纯化,得到淡黄色探针PN固体(335mg,产率62%)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ8.30(d,J=9.1Hz,1H),δ8.08(dd,J=2.3Hz,2H),δ8.01–7.89(m,4H),δ7.84(d,J=8.9Hz,1H),δ5.86(td,J=7.0Hz,1H),δ5.11–5.03(m,2H),δ4.56(t,J=6.8Hz,1H),δ3.63(s,6H),δ2.64(t,J=7.0Hz,2H).13C NMR(DMSO-d6,500MHz):δ154.92,135.43,131.81,127.85,126.37,125.44,123.94,123.69,122.07,119.23,118.49,55.97,41.69.[M-1]-:286.1229.
实施例2PN荧光探针对不同干扰离子的选择性
将实施例1中PN荧光探针配置成1×10-3mol/L的母液。
将下列物质甲醛,CaCl2,四甲基硝酸铵,MgSO4,NaCl,L-赖氨酸,L-精氨酸,L-亮氨酸,L-甘氨酸,L-半胱氨酸,N-乙酰-L-半胱氨酸,丙酮酸钠,丙酮酸,苯甲醛,乙醛配置成1×10-1mol/L的母液。
取15支试管,分别依次加入30μL上述不同的干扰离子母液与甲醛母液,然后加入2700μL的HEPES缓冲液(10mM,pH=7.4)与240μL乙腈溶液,最后分别加入30μL的探针母液。各溶液摇匀后进行荧光检测(Ex=345nm)。以荧光强度为纵坐标,波长为横坐标作图5;由图5可以发现只有甲醛能够使PN探针发生显著的比率型荧光变化,而其它干扰离子对其荧光强度几乎没有干扰。
实施例3PN荧光探针对不同浓度甲醛的荧光滴定
配置浓度为1×10-2mol/L的甲醛母液,通过改变加入试管中体积的不同来控制最后甲醛的浓度,形成不同当量甲醛的含量。反应后进行荧光检测(Ex=345nm),记录各体系中的荧光强度。以390nm处荧光强度与446nm处荧光强度的比值I390/I446为纵坐标,甲醛的浓度为横坐标作曲线,并绘制线性关系。由图6可知,随着甲醛的浓度增加,I390/I446比值逐渐增加,当甲醛的含量达到400当量时,探针的荧光强度比值不再增加。
实施例4PN荧光探针对甲醛的响应时间关系
配制浓度为1×10-1mol/L的甲醛母液,将2700μL HEPES缓冲液(10mM,pH=7.4)、240μL乙腈溶液与1×10-3mol/L PN探针母液30μL依次加入到石英比色皿中,混合均匀,迅速加入1×10-1mol/L甲醛母液30μL,观察390nm与446nm处荧光强度随时间变化情况,结果如图7所示,可以看出,不到100s时甲醛与探针已经反应完成,荧光强度稳定不变。
实施例5PN荧光探针对不同水样中甲醛含量检测
选取4种水样进行加标回收率实验(包括食品厂废水、化工厂废水、污水处理厂废水及雨水)。
在4支试管中各加入1×10-3mol/L PN母液30μL,再加入4种水样各2700μL,与不同体积的甲醛样品溶液,最后补加入不同体积的乙腈溶液,在Ex=345nm下进行荧光检测。计算回收率以及RSD。以水样为纵坐标,甲醛浓度、回收率、RSD为横坐标绘制表1。回收率均在95%-105%之间,RSD均小于1。
表1实际水样中FA回收率数据
实施例6PN探针对不同食品样品中的甲醛含量检测
实际样品选取了市场上具有代表性的4种食品(包括冻虾仁,冻鱿鱼,腐竹,香菇)。称取10.0g不同的食品样品溶于20mL HEPES缓冲液(10.0mM,pH=7.4)中,加入5mL Zn(AcO)2(0.1M)与5mL K4Fe(CN)6(0.1M),超声20min后在10000rpm/min转速下离心20min,过滤,取上清液。
实际样品检测时,取2700μL食品上清液,加入1×10-3mol/L PN母液30μL,再分别加入不同体积的甲醛溶液与不同体积的乙腈溶液。各溶液摇匀后进行荧光检测(Ex=345nm),计算回收率以及RSD。以实际样品为纵坐标,甲醛浓度浓度、回收率、RSD为横坐标绘制表2。
表2PN探针检测不同食品中的甲醛含量结果
实施例7PN探针检测甲醛在纸基上的应用
将实验室用的滤纸剪成大小一致的9张条状滤纸条,将所有滤纸条浸泡在探针母液(c=1×10-4mol/L)中,干燥后,在每张滤纸条上滴加等量的甲醛溶液,对照滴加等量的水。反应后在手持紫外灯下观察荧光变化。从图10中可以看出,探针本身呈现蓝色荧光,而随着甲醛浓度的增加,荧光颜色从蓝色逐渐变为紫色。
实施例8PN探针与相似结构母体探针的性能对比
与已报道的B1探针相比,PN探针具有其无可比拟的优点。首先,B1探针为荧光开启型探针,而PN探针则为比率型探针,比起单开启探针,比率型探针可消除背景干扰,达到自体校正的目的,更适合用于复杂基质中甲醛的检测。其次,PN探针具有检测时间快(100秒)的特点,仅为B1探针响应时间(120分钟)的1/72,因此,PN探针更能达到快速检测的目的。综上所示,PN探针比B1探针具有更优越的性能。
Claims (10)
1.一种用于检测甲醛的比率型荧光探针,其特征在于:荧光探针的分子式为C20H17NO,其结构式如下所示:
2.根据权利要求1所述的用于检测甲醛的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
在0℃,氮气氛围下,将烯丙基三氟硼酸钾加入到氨甲醇溶液中,搅拌后,将1-羟基-2芘甲醛加入反应瓶中,进行反应,反应结束后,用碳酸氢钠淬灭反应,粗产物用二氯甲烷萃取,收集有机层,用无水硫酸镁干燥后,旋干,经柱层析法得到荧光探针PN。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述的1-羟基-2芘甲醛与烯丙基三氟硼酸钾的摩尔比为1:4~6。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,柱层析法采用的硅胶为200-300目,淋洗剂为V正己烷:V乙酸乙酯=6:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的氨甲醇溶液中氨的浓度为5~9mol/L。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,烯丙基三氟硼酸钾在氨甲醇溶液中搅拌时间为10~30min。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,加入1-羟基-2芘甲醛后的反应时间为8~12h,反应温度为15~35℃。
8.根据权利要求1所述的用于检测甲醛的比率型荧光探针在食品中检测甲醛的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,具体包括:
将荧光探针PN溶解于溶剂中,配置成(0.5~2)×10-3mol/L的探针溶液,然后加入待测物质,得到待测样品溶液,选择激发波长为340~350nm,在390nm处与446nm处,观察荧光强度变化。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,具体包括:
将荧光探针PN溶于乙腈/HEPES溶剂中,配制成荧光探针PN的浓度为(0.5~2)×10- 5mol/L的溶液,然后加入甲醛样品溶液,配制成不同浓度梯度的甲醛样品溶液,用荧光仪观察荧光光谱变化,并计算390nm和446nm处的荧光强度比值I390/I446,根据荧光强度比值变化与加入甲醛样品浓度,绘制标准曲线,得到线性方程;
将待测样品加入到探针溶液中,得到待测样品溶液,然后用荧光光谱仪观察荧光光谱的变化,并计算I390/I446,再根据线性方程获得待测样品的含量。
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