CN111205214A - 一种稳定同位素标记试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定同位素标记试剂，是含有一个伯胺基和一个羧基化合物的衍生物类稳定同位素标记试剂。该试剂的制备是首先将含有不同稳定同位素的带有一个伯氨基和一个羧基的化合物与乙醛反应，使化合物中的伯氨基变成仲胺基。将产物使用柱层析纯化后，与含有18O或者16O的水进行孵育。然后将产物与含有不同稳定同位素的甲醛，在含有硼氢化钠的缓冲液中反应，使产物中的仲胺基变成叔胺基。本发明的稳定同位素标记试剂可应用于带有氨基物质的质谱定量分析中，具有定量准确度高、操作简单、成本低、且用于定量的报告基团分子量可调的优点，适用于含有氨基物质在各种质谱仪中的标记定量。

Description

一种稳定同位素标记试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种稳定同位素标记试剂及其制备方法和应用，具体说，是涉及一种含有一个伯胺基和一个羧基化合物的衍生物类稳定同位素标记试剂及其制备方法和该稳定同位素标记试剂在带有氨基物质的质谱定量分析中的应用。
背景技术
稳定同位素标记试剂属于科研用试剂，已广泛应用于农业、食品安全、生命科学、环境、临床医学、药学等领域。近年来，随着高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术的广泛应用，基于稳定同位素标记的质谱定量技术得到了快速发展，并被广泛地应用于生物和临床研究。
对于含有氨基的化合物如蛋白质和多肽，目前最常用的基于质谱的稳定同位素标记试剂是iTraq(Richard D Unwin et al.,Simultaneous analysis of relativeprotein expression levels across multiple samples using iTRAQ isobaric tagswith 2D nano LC–MS/MS,Nature Protocols,2010,5:1574–1582)。该试剂由报告基团、平衡基团和氨基反应基团构成。itraq试剂是可与氨基连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种itraq试剂标记不同样本中的同一种含有氨基的化合物表现为相同的质荷比。因此，在一级质谱中，不同来源的相同化合物表现为一个峰；在二级质谱中，itraq试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比的峰，因此根据波峰的高度和面积，可以得到同一种含有氨基的化合物在不同样本中的含量差异。该试剂可以应用于4重到8重定量，因此有较高的定量通量。缺点是该试剂合成过程复杂，需要引入昂贵的多个15N稳定同位素，成本高，不利用于其广泛应用。LingjunLi等(N,N-Dimethyl Leucines as NovelIsobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics,Anal.Chem.,2010,82:2817-2825)发展了基于氨基酸二甲基化衍生物的稳定同位素标记试剂。该试剂具有合成步骤少、较少使用价格高昂的15N同位素、成本较低等优点。然而，该试剂在合成过程中，对氨基酸的氨基进行了二甲基化，因此会引入较多的氘原子，可能会引起标记后样品色谱保留时间的偏移进而影响定量的准确度。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处，本发明的目的之一是提供一种定量准确度高、引入稳定同位素数目少、成本低廉的稳定同位素标记试剂；本发明的目的之二是提供所述稳定同位素标记试剂的一种制备方法；本发明的目的之三是提供所述稳定同位素标记试剂在含有氨基化合物的基于质谱定量分析中的应用。
本发明提供的同位素标记试剂，是含有一个伯胺基和一个羧基化合物的衍生物类稳定同位素标记试剂R，其化学结构式是：
Figure BDA0001873819990000021
其中X1是-C#H2C#H3，C#为12C或者13C；
Y1-是一个含有若干个N、O、S原子的碳链；
X2是-C#H3 #，其中C#为12C或者13C，H#为氢或者氘；
Y2
Figure BDA0001873819990000022
是，其中C*是12C或者13C，O*是18O或者16O。
本发明所述的同位素标记试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将含有一个伯胺基和一个羧基的化合物R0(NH2-Y1-COOH)溶于弱碱性缓冲溶液(pH值在7.0-9.0之间，浓度为0.01-0.5mol/L)；
2)将乙醛溶解后，按照一定的摩尔比(1.5-20.0：1)加入到含有R0的溶液中，在15～85℃下搅拌，生成化合物R1(X1-C＝N-Y1-COOH)，然后用层析的方法除去乙醛，纯化得到R1；
3)将R1溶于弱碱性缓冲溶液中，然后加入新配置的硼氢化钠水溶液(浓度为0.01-1.0mol/L)，反应制得产物R2(X1-CH2-NH-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的R2；
4)将R2溶于弱碱性缓冲液，加入甲醛水溶液(1％-30％v/v)，然后加入硼氢化钠水溶液，在15～35℃下搅拌0.5-2小时，制得化合物R3(X1-CH2-N(CH3)-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的化合物R3；
5)将R3与含有16O或者18O的水(摩尔比1：2-20)进行孵育；用冷冻干燥或者旋转蒸发的方法除去水；将剩余的固体溶解后使用琥珀酰亚胺活化，制得稳定同位素标记试剂R；
6)在合成过程中，对生成标记试剂R的原料中的C，H，O，N元素的同位素进行组合，使
得合成的标记试剂分子质量相同或者相近
Figure BDA0001873819990000023
(<0.1Da)并且的质量存在一定的差异(>5mDa)。标记试剂中各个基团及生成标记试剂的原料中C，H，O，N元素的同位素组合如表一所示。R0代表NH2-Y1-COOH；
表一标记试剂中各个基团及生成标记试剂的原料中C，H，O，N元素的不同同位素组合
Figure BDA0001873819990000031
。
为了减少氘原子引起的保留偏移，标记试剂中不引入超过2个氘原子；如果标记试剂中不含有15N和氘，可以形成四重标记(序号1，2，3，4)；如果引入15N，可以形成七重标记(1，2，3，4，5，6，7，其中5，6，7与2，3，4分别相差6mDa)；如果引入15N+氘，组合可以形成七重标记(1，5，6(13)，7(15)，8，10(9)，12(11)，其中试剂5，6(13)，7(15)与试剂8，10(9)，12(11)分别相差9mDa)或者九重标记(1；2和5(相差6mDa)；6，3，9(分别相差6mDa)；7，4，11(分别相差6mDa))。
标记试剂与样品反应后，在质谱中进行碎裂时，由于含有不同稳定同位素的标记试剂其分子质量相同，因此来自不同样品的相同化合物分子在质谱中具有相同的质荷比而同时碎裂；在质谱中碎裂后，标记
试剂
Figure BDA0001873819990000032
的部分会断裂下来，来自不同样品的标记试剂断裂部分存在质量差异，在二级质谱图中被分辨，根据这些报告离子的强度实现对不同样品中相同分子的相对定量。
合成的标记试剂具有以下优点：在合成过程中使用价格较低的13C和18O稳定同位素，具有成本低的优势，可以进行四重标记定量；通过引入一个15N原子，可以实现七重标记定量；尽量少地引入氘原子，减少氘原子引起的被标记化合物的色谱保留迁移，有利于提高定量准确度。
与现有技术相比，本发明的同位素标记试剂在含有氨基化合物的比较分析中的应用，具有如下优点：在合成过程中尽可能使用价格较低的13C和18O稳定同位素，具有成本低的优势；尽量少地引入氘原子，减少氘原子引起的被标记化合物的色谱保留迁移，有利于提高定量准确度；可以实现四重-九重标记定量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明，但并不限制本发明的内容。
实施例1：本发明的同位素标记试剂的制备及应用1
1)将200毫克亮氨酸(NH2-CH(C4H9)-COOH)溶于10毫升50毫摩尔碳酸氢钠缓冲溶液(pH值8.0)；
2)将乙醛溶解后，按照摩尔比1.5：1加入到含有R0的溶液中，在15℃下搅拌，生成化合物R1(X1-C＝N-Y1-COOH)，然后用层析的方法除去乙醛，纯化得到R1；3)将R1溶于弱碱性缓冲溶液中，然后加入新配置的硼氢化钠水溶液(浓度为0.01mol/L)，反应制得产物R2(X1-CH2-NH-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的R2；
4)将R2溶于弱碱性缓冲液，加入甲醛水溶液(1％v/v)，然后加入硼氢化钠水溶液，在15℃下搅拌0.5小时，制得化合物R3(X1-CH2-N(CH3)-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的化合物R3；
5)将R3与含有16O或者18O的水(摩尔比1：2)进行孵育；用冷冻干燥或者旋转蒸发的方法除去水；将剩余的固体溶解后使用琥珀酰亚胺活化，制得稳定同位素标记试剂R；并通过核磁和紫外对其结构确认，为目标化合物。
6)往5-8M盐酸胍溶解的蛋白质样品(～0.1mg)中加入TEAB缓冲液(pH 8.0)至终浓度50mM，并加入10μL 50mM DTT，50℃水浴还原0.5小时。冷却至室温，加入5μL 200mM丙烯酰胺，室温烷基化0.5小时后，再次加入5μL 50mM DTT消耗残余的丙烯酰胺。将样品溶液转移至超滤膜上，12000g离心去除离心液，然后采用由50mM NH4HCO3、0.8M甘氨酸、5M盐酸胍组成的清洗液清洗三遍，40mM磷酸氢二纳缓冲液(pH 7.5)清洗一遍后，采用40mM磷酸氢二纳缓冲液溶解膜上的蛋白。以酶：蛋白质的质量比为1/40的比例加入胰蛋白酶，32℃酶解8小时后，12000g离心收集离心液，得到酶解肽段。然后加入由50mM TEAB、50mM标记试剂和40mMNaCNBH3组成的反应溶液，于32℃孵育1h。最后，加入8倍过量的甘氨酸消耗残余的标记试剂和NaCNBH3。对需要进行定量的不同蛋白质样品，分别按照上面的标记方法，使用不同的标记试剂进行标记。标记后的样品进行混合，使用液相色谱-质谱进行分析，得到的质谱数据使用蛋白质定量软件如pFind,Maxquant等进行处理，得到不同样品中蛋白质的相对含量。
实施例2：本发明的同位素标记试剂的制备及应用2
1)将200毫克亮氨酸(NH2-CH(C4H9)-COOH)溶于10毫升50毫摩尔碳酸氢钠缓冲溶液(pH值8.0)；
2)将乙醛溶解后，按照摩尔比10.0：1加入到含有R0的溶液中，在50℃下搅拌，生成化合物R1(X1-C＝N-Y1-COOH)，然后用层析的方法除去乙醛，纯化得到R1；3)将R1溶于弱碱性缓冲溶液中，然后加入新配置的硼氢化钠水溶液(浓度为0.5mol/L)，反应制得产物R2(X1-CH2-NH-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的R2；
4)将R2溶于弱碱性缓冲液，加入甲醛水溶液(15％v/v)，然后加入硼氢化钠水溶液，在25℃下搅拌1小时，制得化合物R3(X1-CH2-N(CH3)-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的化合物R3；
5)将R3与含有16O或者18O的水(摩尔比1：10)进行孵育；用冷冻干燥或者旋转蒸发的方法除去水；将剩余的固体溶解后使用琥珀酰亚胺活化，制得稳定同位素标记试剂R；
6)往6M盐酸胍溶解的蛋白质样品(～0.1mg)中加入TEAB缓冲液(pH 8.2)至终浓度100mM，并加入10μL 100mM DTT，55℃水浴还原1.0小时。冷却至室温，加入10μL 300mM丙烯酰胺，室温烷基化1.0小时后，再次加入10μL100mM DTT消耗残余的丙烯酰胺。将样品溶液转移至超滤膜上，14000g离心去除离心液，然后采用由75mM NH4HCO3、1.0M甘氨酸、6M盐酸胍组成的清洗液清洗三遍，60mM磷酸氢二纳缓冲液(pH 8.0)清洗一遍后，采用60mM磷酸氢二纳缓冲液溶解膜上的蛋白。以酶：蛋白质的质量比为1/30的比例加入胰蛋白酶，36℃酶解12小时h后，14000g离心收集离心液，得到酶解肽段。然后加入由100mM TEAB、100mM标记试剂和60mM NaCNBH3组成的反应溶液，于36℃孵育2h。最后，加入11倍过量的甘氨酸消耗残余的标记试剂和NaCNBH3。对需要进行定量的不同蛋白质样品，分别按照上面的标记方法，使用不同的标记试剂进行标记。标记后的样品进行混合，使用液相色谱-质谱进行分析，得到的质谱数据使用蛋白质定量软件如pFind,Maxquant等进行处理，得到不同样品中蛋白质的相对含量。
实施例3：本发明的同位素标记试剂的制备及应用3
1)将200毫克亮氨酸(NH2-CH(C4H9)-COOH)溶于10毫升50毫摩尔碳酸氢钠缓冲溶液(pH值8.0)；
2)将乙醛溶解后，按照摩尔比20.0：1加入到含有R0的溶液中，在85℃下搅拌，生成化合物R1(X1-C＝N-Y1-COOH)，然后用层析的方法除去乙醛，纯化得到R1；3)将R1溶于弱碱性缓冲溶液中，然后加入新配置的硼氢化钠水溶液(浓度为1.0mol/L)，反应制得产物R2(X1-CH2-NH-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的R2；
4)将R2溶于弱碱性缓冲液，加入甲醛水溶液(30％v/v)，然后加入硼氢化钠水溶液，在35℃下搅拌2小时，制得化合物R3(X1-CH2-N(CH3)-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的化合物R3；
5)将R3与含有16O或者18O的水(摩尔比1：20)进行孵育；用冷冻干燥或者旋转蒸发的方法除去水；将剩余的固体溶解后使用琥珀酰亚胺活化，制得稳定同位素标记试剂R；
6)往8M盐酸胍溶解的蛋白质样品(～0.1mg)中加入TEAB缓冲液(pH 8.4)至终浓度150mM，并加入10μL 150mM DTT，62℃水浴还原1.5小时。冷却至室温，加入15μL 400mM丙烯酰胺，室温烷基化1.5小时后，再次加入15μL 150mM DTT消耗残余的丙烯酰胺。将样品溶液转移至超滤膜上，16000g离心去除离心液，然后采用由100mM NH4HCO3、1.2M甘氨酸、8M盐酸胍组成的清洗液清洗三遍，80mM磷酸氢二纳缓冲液(pH 8.5)清洗一遍后，采用80mM磷酸氢二纳缓冲液溶解膜上的蛋白。以酶：蛋白质的质量比为1/20的比例加入胰蛋白酶，42℃酶解16小时后，16 000g离心收集离心液，得到酶解肽段。然后加入由150mM TEAB、150mM标记试剂和80mM NaCNBH3组成的反应溶液，于42℃孵育3h。最后，加入15倍过量的甘氨酸消耗残余的标记试剂和NaCNBH3。对需要进行定量的不同蛋白质样品，分别按照上面的标记方法，使用不同的标记试剂进行标记。标记后的样品进行混合，使用液相色谱-质谱进行分析，得到的质谱数据使用蛋白质定量软件如pFind,Maxquant等进行处理，得到不同样品中蛋白质的相对含量。

Claims (10)

1.一种稳定同位素标记试剂，其特征在于：为含有一个伯胺基和一个羧基化合物的衍生物类稳定同位素标记试剂R，其化学结构式是：
Figure FDA0001873819980000011
其中X1是-C#H2C#H3，C#为12C或者13C；
Y1-是一个断裂掉左端氨基和右端羧基的氨基酸基团；为其中不含有或含有1个以上的N、O、S原子中的一种或二种以上的碳链；如：C5H6N2，C5H11N3，C5H11N，C5H10，C8H8，C5H10，C10H9N，C2H4，C4H8S，C4H6，C3H4O2，C4H6O2，C3H6O，C4H8，C8H8O，C2H4O，C3H5NO，C2H4S，CH2，C4H7NO中的一种；
X2是-C#H3 #，其中C#为12C或者13C，H#为氢或者氘；
Y2
Figure FDA0001873819980000012
是，其中C*是12C或者13C，O*是18O或者16O。
2.一种权利要求1所述的稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将含有一个伯胺基和一个羧基的化合物R0(NH2-Y1-COOH)溶于弱碱性缓冲溶液；
b)将乙醛加入到含有R0的溶液中，在15～85℃下搅拌，生成化合物R1(X1-C＝N-Y1-COOH)，然后用层析的方法除去乙醛，纯化得到R1；
c)将R1溶于弱碱性缓冲溶液中，然后加入硼氢化钠水溶液，反应制得产物R2(X1-CH2-NH-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的R2；
d)将R2溶于弱碱性缓冲液，加入甲醛水溶液，然后加入硼氢化钠水溶液，在15～35℃下搅拌0.5-2小时，制得化合物R3(X1-CH2-N(CH3)-Y1-COOH)；进行柱层析，得到纯化的化合物R3；
e)将R3与含有16O或者18O的水进行孵育；用冷冻干燥或者旋转蒸发的方法除去水；将剩余的固体溶解后使用琥珀酰亚胺活化，制得稳定同位素标记试剂R。
3.根据权利要求2所述的稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：弱碱性缓冲溶液pH值在7.0-9.0之间，浓度为0.01-0.5mol/L；乙醛与化合物R0的摩尔比为(1.5-20.0)：1；硼氢化钠水溶液的浓度为0.01-1.0mol/L。
4.根据权利要求2所述的稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：甲醛水溶液的浓度为1％-30％(体积比)，甲醛与化合物R2的摩尔比为(1.5-20.0)：1，硼氢化钠与甲醛的摩尔比为(1.5-20.0)：1。
5.根据权利要求2所述的稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于：化合物R3与16O或者18O的水的摩尔比为1：(2-20)。
6.一种权利要求1所述的稳定同位素标记试剂的应用，其特征在于：对标记试剂中的C，H，O，N元素的同位素进行组合，使得合成的标记试剂分子量相近(相近是指相差<0.1Da)、并且存在一定的差异(是指相差>5mDa)。
7.根据权利要求6所述的稳定同位素标记试剂的应用，其特征在于：
标记试剂中各个基团中C，H，O，N元的同位素组合如下所示；
R0代表NH2-Y1-COOH；
1、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为12CH3，Y2基团的羰基为13C18O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为13C；
2、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为13CH3，Y2基团的羰基为12C18O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为12C；
3、X1基团为13CH3 13CH2，X2基团为12CH3，Y2基团的羰基为13C16O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为13C；
4、X1基团为13CH3 13CH2，X2基团为13CH3，Y2基团的羰基为12C16O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为12C；
5、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为12CH3，Y2基团的羰基为12C18O，R0氨基上N原子为15N，R0羧基上C原子为12C；
6、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为13CH3，Y2基团的羰基为13C16O，R0氨基上N原子为15N，R0羧基上C原子为13C；
7、X1基团为13CH3 13CH2，X2基团为12CH3，Y2基团的羰基为12C16O，R0氨基上N原子为15N，R0羧基上C原子为12C；
8、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为12CDH2，Y2基团的羰基为12C18O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为12C；
9、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为12CD2H，Y2基团的羰基为13C16O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为13C；
10、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为13CDH2，Y2基团的羰基为13C16O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为13C；
11、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为13CD2H，Y2基团的羰基为12C16O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为12C；
12、X1基团为13CH3 13CH2，X2基团为12CDH2，Y2基团的羰基为12C16O，R0氨基上N原子为14N，R0羧基上C原子为12C；
13、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为12CDH2，Y2基团的羰基为13C16O，R0氨基上N原子为15N，R0羧基上C原子为13C；
14、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为12CD2H，Y2基团的羰基为12C16O，R0氨基上N原子为15N，R0羧基上C原子为12C；
15、X1基团为12CH3 12CH2，X2基团为13CDH2，Y2基团的羰基为12C16O，R0氨基上N原子为15N，R0羧基上C原子为12C；
为了减少氘原子引起的保留偏移，标记试剂中不引入超过2个氘原子；
如果标记试剂中不含有15N和氘，可以形成二至四重标记(序号1，2，3，4)；
如果引入15N，可以形成二至七重标记(1，2，3，4，5，6，7，其中5，6，7与2，3，4分别相差6mDa)；
如果引入15N+氘，组合可以形成二至七重标记(1，5，6，7，8，10，11，其中试剂5，6，7与试剂8，10，11分别相差9mDa)或者二至九重标记(1；2和5(相差6mDa)；6，3，9(分别相差6mDa)；7，4，11(分别相差6mDa))。
8.根据权利要求6所述的稳定同位素标记试剂的应用，用于含有氨基物质的基于质谱的标记定量。
9.根据权利要求8所述的稳定同位素标记试剂的应用，其特征在于：先将目标分析物分别与轻质的和重质的标记试剂反应，再进行除杂后处理，然后用氮气吹干纯化后的标记分析物，用乙腈/水溶液溶解标记分析物，最后进行液相色谱-质谱联用分析。
10.根据权利要求9所述的稳定同位素标记试剂的应用，其特征在于：所述的目标分析物为含有自由氨基的化合物，包括N端α氨基无修饰多肽或蛋白质经过变性、酶解而得到的混合肽段或不同生理状态下的生物体蛋白质提取物中的一种或二种以上；所述的目标分析物与标记试剂的反应条件是：在pH值为7.0-9.0的缓冲溶液中，于35～85℃反应90～120分钟。
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