CN114646762A - 一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂 - Google Patents
一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114646762A CN114646762A CN202011518641.8A CN202011518641A CN114646762A CN 114646762 A CN114646762 A CN 114646762A CN 202011518641 A CN202011518641 A CN 202011518641A CN 114646762 A CN114646762 A CN 114646762A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- group
- reagents
- reporter
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,其结构包含下式:报告基团‑平衡基团‑活化基团,其中活化基因可以通过与多肽含有的不同官能团的特异性反应对多肽进行标记。本发明公布了两组不同的化学结构,每组结构可以包含多至16个化学结构完全相同的标记试剂(命名为IBT‑16PLEX标记试剂),但是在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素。本发明公开了IBT‑16PLEX标记试剂的化学结构,稳定同位素在标记试剂中的位置,标记试剂的合成路线,以及标记试剂在蛋白质组学中的具体应用。本发明中的IBT‑16PLEX采用了新颖的化学结构,降低了制备的难度,提高了产率,从而能够降低产品的成本,扩大IBT‑16PLEX标记试剂的使用范围。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子分析试剂领域,特别是用于蛋白质组学的定量分析,具体为一类可同时对16个样品的蛋白质组学进行定量的同量异位标记试剂(IBT-16PLEX)的制备和应用。
背景技术
近年来,蛋白质组学领域在不断发展,特别是在蛋白质识别和定量分析方面。这一进展将有助于深入理解细胞中特定蛋白质的存在与其生物学功能之间的相互关系。由于高通量和高特异性的特点,生物质谱技术是最为广泛使用的蛋白质组学研究工具。但是,由于质谱信号受到仪器设备,干扰物,基质效应等多个因素的影响,采用质谱技术对蛋白组学进行定量分析需要专门的样品和数据处理方法,主要包括非标法(label free methods)和稳定同位素标记法(labeled methods)。与非标法相比,稳定同位素标记法具有众多优势。由于稳定同位素试剂标记的不同样品在液相串联(LC-MS/MS)质谱分析之前被预先混合,使得全部样品在一次LC-MS/MS分析中完成,有效的降低了不同样品在不同LC-MS/MS中的系统误差,对仪器的重现性要求低,这样可以最大限度地减少不同的样本在不同此测量中产生的差异,解决在非标法中无法避免的重复性问题。同时,因为多个样品可以一次性完成定性定量分析,可以大大降低大队列体样品的分析时间。
稳定同位素标记法又分为基于一级质谱(MS1)定量和二级质谱(MS2)定量的方法。例如,SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)是一种基于 MS1的蛋白质标记方法,是在细胞培养基中加入含有稳定同位素标记的氨基酸实现的。同量异位标记法(Isobaric Labeling)是属于基于MS2的分析方法,包括iTRAQ(isobarictag for relative and absolute quantification),TMT(tandem mass tag)以及IBT(isobaric tag)。
与SILAC等基于一级质谱的定量方法相比,同量异位标记后的多个样品混合后,不同样品中所含的同一多肽被合并到一起,相当于增强了样品浓度,对应的MS/MS碎片信号变得更强,使检测的灵敏度大大提高。同时减少了质谱信号的复杂度,更加适用于多个样品的比较分析。另外,SILAC标记的定量方法依赖于细胞摄入含稳定同位素的精氨酸或赖氨素合成蛋白,进而再含有这些含有标记氨基酸的蛋白质。这种方法只在培养的细胞中可以实现,但在动物组织,人体样品的分析中难以应用。同量异位标记法则不受样本来源的限制,可以广泛应用于各种临床样品。
目前,市场上已经有多种同量异位标记试剂,包括iTRAQ-4PLEX,iTRAQ-8PLEX,TMT-10PLEX,IBT-10PLEX等。最近,Thermo公司推出了能够同时标记16个样品的 TMTpro-16PLEX试剂盒。但是,TMTpro-16PLEX不但价格昂贵,其鉴定蛋白也远少于TMT-10PLEX 和IBT-10PLEX,极大的限制了其在定量蛋白质组学上的应用。
发明内容
为解决上述问题,本发明公开了一种可以同时对16个样品进行定量分析的同量异位标记技术(IBT-16PLEX),包括了IBT-16PLEX标记试剂的化学结构,稳定同位素在标记试剂中的位置,标记试剂的合成路线,以及标记试剂在蛋白质组学中的具体应用。
本发明提供了如下技术方案:
一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,命名为IBT-16PLEX试剂。IBT-16PLEX 试剂包括了一组16个化学结构和分子量完全一致,但是在不同位置含有不同的稳定同位素的标记试剂。其结构包括了三部分:报告基团-平衡基团-活化基团。其中,活化基团通过与多肽含有的官能团的特异性反应(N-端氨基,赖氨酸的氨基,半胱氨酸的巯基等)对多肽进行标记。报告基团与平衡基团的总分子量是一致的。但是,报告基团和平衡基团通过一个MS/MS 可剪切键连接,这样,在二级质谱中,IBT-16PLEX标记的样品会产生一组特征性报告离子,其相对峰高用于测定原样品中的相对含量。
本发明公开了两组不同的IBT-16PLEX试剂的化学结构(结构A和结构B)。每组结构有细微差别,在具体应用中可以互换。
IBT-16PLEX试剂(结构A)标记多肽的反应以及标记后的多肽在串联质谱中裂解形成的报告基团的结构如下。
一组IBT-16PLEX试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂。在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,因此报告基团的质量是不同的,但是报告基团的不同质量被平衡基团所补偿。这样,每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的。报告基团和平衡基团通过可剪切键连接,剪切键在MS/MS中优先断裂,产生一系列报告基团离子,分别具有不同的分子式和质量,其报告基团和平衡基团离子的具体分子式和精确质量如下:
标记代码 | 报告基团分子式 | 报告基团分子量 | 平衡基团分子式 | 平衡基团分子量 | 总分子量 |
T114 | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 114.1277 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 149.0989 | 263.2266 |
T115N | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 115.1248 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 148.1019 | 263.2267 |
T115C | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 115.1311 | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 148.0956 | 263.2267 |
T116N | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 116.1281 | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 147.0986 | 263.2267 |
T116C | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 116.1344 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 147.0922 | 263.2266 |
T117N | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 117.1315 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 146.0952 | 263.2267 |
T117C | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 117.1378 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 146.0889 | 263.2267 |
T118N | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 118.1348 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 145.0918 | 263.2266 |
T118C | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 118.1411 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 145.0855 | 263.2266 |
T119N | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 119.1382 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 144.0885 | 263.2267 |
T119C | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 119.1445 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 144.0822 | 263.2267 |
T120N | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 120.1415 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 143.0851 | 263.2267 |
T120C | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 120.1479 | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 143.0788 | 263.2266 |
T121N | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 121.1449 | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 142.0818 | 263.2267 |
T121C | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 121.1512 | C<sub>7</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 142.0755 | 263.2267 |
T122 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 122.1482 | C<sub>7</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 141.0784 | 263.2266 |
其对应的化学结构如下,其中星号标记代表一组IBT-16PLEX(结构A)试剂中稳定同位素15N和13C的位置。
选择不同的起始原料,在不改变报告基团和平衡基团分子量的情况下,15N和13C的位置可以变动到报告基团内部和平衡基团内部的任意不同位置,而不是仅限于上述所示的同位素位置。因此,报告基团的质量在114至122Da的范围内,在保持报告基团和平衡基团分子式不变的情况下,稳定同位素包括任何可行位置的组合。
IBT-16PLEX试剂在对最多16个蛋白质组多肽样品标记后,可以通过质谱进行鉴定分析。鉴定分析步骤如下:
1)采用纳米反相色谱柱进行液相色谱分离;在需要的时候,可以采用不同的二维色谱组合进行高精度分离(例如:碱性反相柱+酸性反相柱;阳离子交换柱+酸性反相柱等)
2)采用Orbitrap高分辨质谱仪对标记的多肽进行鉴定分析;设定分辨率至少在30000以上用以区分在一对报告基团离子中的0.063Da的差别。
3)采用量化分析的报告基团离子的信号强度至少为最大峰值的5%。
其中,结构A的合成路线如下:
具体的合成方法如下:
1)化合物1(β-Ala-OBzl.HCl)和丙酮在还原剂NaCNBH3作用得到化合物2;
2)化合物2与化合物3(Boc-Gly-OH)偶合成化合物4;
3)化合物4在酸性条件下脱去Boc基团,形成化合物5;
4)化合物5依次与丙酮、丙醛在还原剂NaCNBH3作用下形成化合物6;
5)化合物6与氢气在钯碳的催化作用下脱去Bzl保护基团形成化合物7;
6)化合物7与TSTU反应,形成活化的化合物8(IBT-NHS);
IBT-16PLEX试剂(结构B)标记多肽的反应以及标记后的多肽在串联质谱中裂解形成的报告基团的结构如下。
一组IBT-16PLEX试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂。在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,因此报告基团的质量是不同的,但是报告基团的不同质量被平衡基团所补偿。这样,每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的。报告基团和平衡基团通过可剪切键连接,剪切键在MS/MS中优先断裂,产生一系列报告基团离子,分别具有不同的分子式和质量,其报告基团和平衡基团离子的具体分子式和精确质量如下:
标记代码 | 报告基团分子式 | 报告基团分子量 | 平衡基团分子式 | 平衡基团分子量 | 总分子量 |
T114 | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 114.1277 | <sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 164.0671 | 278.1948 |
T115N | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 115.1248 | <sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 163.0701 | 278.1949 |
T115C | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 115.1311 | C<sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 163.0638 | 278.1949 |
T116N | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 116.1281 | C<sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 162.0668 | 278.1949 |
T116C | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 116.1344 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 162.0604 | 278.1948 |
T117N | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 117.1315 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 161.0634 | 278.1949 |
T117C | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 117.1378 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 161.0571 | 278.1949 |
T118N | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 118.1348 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 160.0600 | 278.1948 |
T118C | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 118.1411 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 160.0537 | 278.1948 |
T119N | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 119.1382 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 159.0567 | 278.1949 |
T119C | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 119.1445 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 159.0567 | 278.2012 |
T120N | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 120.1415 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 158.0597 | 278.2012 |
T120C | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 120.1479 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>CH<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 158.0533 | 278.2012 |
T121N | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 121.1449 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>CH<sub>8</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 157.0563 | 278.2012 |
T121C | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 121.1512 | C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 157.0500 | 278.2012 |
T122 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 122.1482 | C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 156.0529 | 278.2011 |
其对应的化学结构如下,其中星号标记代表一组IBT-16PLEX(结构B)试剂中稳定同位素15N和13C的位置。
选择不同的起始原料,在不改变报告基团和平衡基团分子量的情况下,15N和13C的位置可以变动到报告基团内部和平衡基团内部的任意不同位置,而不是仅限于上述所示的同位素位置。因此,报告基团的质量在114至122Da的范围内,在保持报告基团和平衡基团分子式不变的情况下,稳定同位素包括任何可行位置的组合。
IBT-16PLEX试剂在对最多16个蛋白质组多肽样品标记后,可以通过质谱进行鉴定分析。鉴定分析步骤如下:
1)采用纳米反相色谱柱进行液相色谱分离;在需要的时候,可以采用不同的二维色谱组合进行高精度分离(例如:碱性反相柱+酸性反相柱;阳离子交换柱+酸性反相柱等)
2)采用Orbitrap高分辨质谱仪对标记的多肽进行鉴定分析;设定分辨率至少在30000以上用以区分在一对报告基团离子中的0.063Da的差别。
3)采用量化分析的报告基团离子的信号强度至少为最大峰值的5%。
其中结构B的合成路径如下:
具体的合成方法如下:
1)化合物1(β-Ala-OBzl.HCl)和化合物2(Boc-Gly-OH)偶合成化合物3;
2)化合物3在酸性条件下脱去Boc基团,形成化合物4;
3)化合物4和化合物5(Boc-Gly-OH)偶合成化合物6;
4)化合物6在酸性条件下脱去Boc基团,形成化合物7;
5)化合物7依次与丙酮、丙醛在还原剂NaCNBH3作用下形成化合物8;
6)化合物8与氢气在钯碳的催化作用下脱去Bzl保护基团形成化合物9;
7)化合物9与TSTU反应,形成活化的化合物10(IBT-NHS)。
IBT-16PLEX试剂可以直接对16种多肽样品进行标记。标记完成后混合用于LC-MS/MS分析。由于报告基团和平衡基团通过质谱MS/MS可剪切键连接,在串联质谱分析中被切断所形成的报告离子的不同质量可以用高分辨质谱进行分析后用于定量。此外,由于IBT-16PLEX只含有13C和15N同位素,而不含有另一种常用同位素氘,避免了氘引起的相关的色谱位移,确保了定量准确性。
本发明还公开了上述标记试剂的应用,所述的标记试剂用于多肽定量分析方法,具体为一类可应用于16个样品的高通量蛋白质组学定量的同量异位标记试剂(IBT-16PLEX)在多肽定量分析中的应用。
IBT-16PLEX试剂用于多肽定量分析时,主要步骤包括标记,分子碎片化、定量三步。最多16个多肽样品可以被IBT-16PLEX试剂(结构A或者结构B)分别标记后,混合在一起,然后在液相色谱LC上被分离,进而在MS/MS中产生特征碎片峰和试剂报告基团,根据特征峰和报告基团的强度对多肽进行定性,定量分析。
其中,多肽通过以下方法获得:
(1)从细胞提取的蛋白
(2)经过胰蛋白酶消化
(3)除盐获得多肽混合物
其中多肽获自细胞培养或者其他样品。样品的制备可以来自于培养的细胞或其他生物样品中提取的蛋白成分。
本发明具有如下有益效果:
本发明中的IBT-16PLEX采用了新颖的化学结构,降低了制备的难度,提高了产率,从而能够降低产品的成本,扩大同量异位标记法的使用范围。
本发明具备所有同量异位试剂固有的高效,高通量,高灵敏的特点,同时改善了其他同类试剂的缺陷,具有低成本性。
本发明的试剂含有16种标记标记,可以同时标记16种不同样品,可以应用于多种蛋白质组学的多肽定量分析,特别适用于药物分析中的热转变蛋白质谱分析技术(ThermalProteome Profiling)。
附图说明
图1、本发明的实施例1的合成路线图。
图2、本发明的实施例2的合成路线图。
图3、本发明的实施例3的合成路线图。
图4、IBT-16PLEX试剂定量的准确性分析图。
图5、IBT-16PLEX试剂定量的动态范围图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式,进一步阐明本发明,应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明公开了一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,包括两组同量异位标记试剂IBT-16PLEX试剂(结构A和结构B)。每组IBT-16PLEX试剂包含16个化学结构完全相同的标记试剂,在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,同位素标记试剂包括: T-114、T-115N、T-115C、T-116N、T-116C、T-117N、T-118N、T-117C、T-118C、T-119N、T-119C、 T-120N、T-120C、T-121N、T-121C、T-122。同位素标记试剂包含MS/MS可剪切键和含有同位素标记的能够与多肽反应的基团,对多肽进行标记并定量;所述同位素标记试剂的结构包括下式:报告基团-平衡基团–活化基团,其中报告基团和平衡基团通过MS/MS可剪切键连接,活化基团与多肽的氨基反应形成稳定的酰胺键;每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的。在保持报告基团和平衡基团分子式不变的情况下,稳定同位素可以包括任何位置的组合。在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,保持报告基团和平衡基团的总分子量一致;标记试剂在二级质谱中通过剪切键的位置产生报告基团;一组试剂的报告基团的质量在114至122Da的范围内,可以独立地选自13C和/或15N的不同数目和位置的同位素原子组合
与现有技术相比,IBT-16PLEX具有三大创新:1)通过改变平衡基团的化学结构,扩大了平衡基团补偿报告基团质量的范围,将IBT-16PLEX的报告基团的质量从IBT-10PLEX的114-119Da扩大为114-122Da;2)在IBT-16PLEX试剂制备过程中需要13C3-丙醛,本发明开发了从商业化产品13C3-丙酸(Sigma-Aldrich公司)开始,仅需二步的13C3-丙醛的新型高效合成方法;3)在合成IBT-16PLEX活化基团的过程中,开发了采用试剂TSTU (2-Succinimido-1,1,3,3-tetra-methyluronium tetrafluor,2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3- 四甲基脲四氟硼酸酯)的新型合成方法,提高了IBT-16PLEX试剂的产率和纯度,大大延长了试剂的稳定保存时间,同时降低了多肽标记的试剂使用量。
实例1:IBT-16PLEX(结构A)的合成路线
如图1所示:IBT-16PLEX试剂(结构A)的合成路线。采用本路线,从含有不同同位素的原料(化合物1,丙酮,化合物3,丙醛),可以合成全套16个IBT-16PLEX试剂。
化合物1(β-Ala-OBzl.HCl,215mg,1mmol)溶解在20mL甲醇中,加入丙酮(225μL,180 mg),然后加入95mg氰基硼氢化钠(1.5mmol)反应2个小时。用旋转蒸发仪除去甲醇,加入20mL饱和碳酸氢钠溶液,20mL二氯甲烷萃取三次,合并有机溶液后用旋转蒸发仪除去有机相,加入5mL HCl的二氧六环溶液(4M),然后加入乙醚25mL,过滤获得195mg白色固体化合物2(0.88mmol,88%产率)。化合物2(195mg)和化合物3(Boc-Gly-OH,155mg, 0.88mmol),溶解在20mL二氯甲烷中,加入EDC.HCl(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,200mg,1.05mmol),反应在氩气保护下进行20小时,反应液用25mM稀盐酸30mL洗三遍,有机相干燥后用旋转蒸发仪除去,获得240mg油状化合物4(0.63mmol,72%产率)。化合物4(240mg)溶解在20mL甲醇中,加入丙酮(145μL,115mg),然后加入 60mg氰基硼氢化钠反应2个小时。用旋转蒸发仪除去甲醇,继续加入丙醛(145μL,115mg),补充30mg氰基硼氢化钠反应2个小时。用旋转蒸发仪除去甲醇。粗品用二氯甲烷:乙酸乙酯(9:1)在硅胶柱上提纯得到174mg油状化合物6(0.50mmol,80%产率)。化合物6溶解在20mL甲醇中,加入20mg Pd/C后,在氢气球作用下反应一个小时。除去溶剂得到125 mg白色固体化合物7(0.46mmol,92%产率)。化合物7(125mg)溶解在20mL二氯甲烷中,加入TSTU(166mg,0.55mmol),DIPEA(diisopropylethylamine,1.38mmol,178mg, 227μL)在氩气保护下反应10小时。反应液用20mM碳酸氢钠溶液30mL洗3遍,用饱和盐水30mL洗一遍,有机相干燥后旋干得到白色油状物化合物8,继续溶解于乙腈中冷冻干燥后的到白色固体127mg(0.36mmol,78%产率)。分析数据:NMR(400MHz,CDCl3):8.05(s,1H), 6.54(s,1H),3.80(t,1H),3.58(t,2H),3.08(s,2H),2.95(m,1H),2.74(s,4H),2.60(t,2H), 2.45(t,2H),1.47(m,2H),1.26(d,6H),1.04(d,6H),0.94(t,3H)。ESI-MS(M+H)+(计算)369.22,(实测)369.03。
IBT-16PLEX试剂(结构A)标记多肽的反应以及标记后的多肽在串联质谱中裂解形成的报告基团的结构如下。
一组IBT-16PLEX试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂(命名为:T114,T115N, T115C,T116N,T116C,T117N,T117C,T118N,T118C,T119N,T119C,T120N,T120C,T121N, T121C,T122)。在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,因此报告基团的质量是不同的,但是报告基团的不同质量被平衡基团所补偿。这样,每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的。报告基团和平衡基团通过可剪切键连接,剪切键在MS/MS中优先断裂,产生一系列报告基团离子,分别具有不同的分子式和质量,其报告基团和平衡基团离子的具体分子式和精确质量如下:
标记代码 | 报告基团分子式 | 报告基团分子量 | 平衡基团分子式 | 平衡基团分子量 | 总分子量 |
T114 | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 114.1277 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 149.0989 | 263.2266 |
T115N | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 115.1248 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 148.1019 | 263.2267 |
T115C | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 115.1311 | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 148.0956 | 263.2267 |
T116N | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 116.1281 | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 147.0986 | 263.2267 |
T116C | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 116.1344 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 147.0922 | 263.2266 |
T117N | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 117.1315 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 146.0952 | 263.2267 |
T117C | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 117.1378 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 146.0889 | 263.2267 |
T118N | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 118.1348 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 145.0918 | 263.2266 |
T118C | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 118.1411 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 145.0855 | 263.2266 |
T119N | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 119.1382 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 144.0885 | 263.2267 |
T119C | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 119.1445 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 144.0822 | 263.2267 |
T120N | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 120.1415 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 143.0851 | 263.2267 |
T120C | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 120.1479 | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 143.0788 | 263.2266 |
T121N | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 121.1449 | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 142.0818 | 263.2267 |
T121C | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 121.1512 | C<sub>7</sub>H<sub>11</sub><sup>15</sup>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 142.0755 | 263.2267 |
T122 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 122.1482 | C<sub>7</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub><sup>+</sup> | 141.0784 | 263.2266 |
其对应的化学结构如下,其中星号标记代表一组IBT-16PLEX(结构A)试剂中稳定同位素15N和13C的位置。
选择不同的起始原料,在不改变报告基团和平衡基团分子量的情况下,15N和13C的位置可以变动到报告基团内部和平衡基团内部的任意不同位置,而不是仅限于上述所示的同位素位置。因此,报告基团的质量在114至122Da的范围内,可以独立地选自13C和/或15N 的不同数目和位置的同位素原子组合。IBT-16PLEX试剂在对最多16个蛋白质组多肽样品标记后,可以通过质谱进行鉴定分析。
鉴定分析步骤如下:
1)采用纳米反相色谱柱进行液相色谱分离;在需要的时候,可以采用不同的二维色谱组合进行高精度分离(例如:碱性反相柱+酸性反相柱;阳离子交换柱+酸性反相柱等)
2)采用Orbitrap高分辨质谱仪对标记的多肽进行鉴定分析;设定分辨率至少在30000以上用以区分在一对报告基团离子中的0.063Da的差别。
3)采用量化分析的报告基团离子的信号强度至少为最大峰值的5%。
实例2:IBT-16PLEX(结构B)的合成路线
如图2所示:IBT-16PLEX试剂(结构B)的合成路线。采用本路线,从含有不同同位素的原料(化合物1,化合物2,化合物5,丙酮,丙醛),可以合成全套16个IBT-16PLEX试剂。
化合物1(β-Ala-OBzl.HCl,215mg,1mmol)和化合物2(Boc-Gly-OH,175mg,1mmol)溶解在20mL二氯甲烷中,加入EDC.HCl(229mg,1.2mmol),反应在氩气保护下进行20小时,反应液用25mM稀盐酸30mL洗三遍,有机相干燥后用旋转蒸发仪除去,获得260mg油状化合物3(0.77mmol,77%产率)。化合物3(260mg)加入50mL HCl的二氧六环溶液(4 M)搅拌1小时,出现的白色沉淀过滤收集得到194mg白色固体化合物4(0.71mmol,92%产率)。化合物4(194mg,0.71mmol)和化合物5(Boc-Gly-OH,125mg,0.71mmol)溶解在 20mL二氯甲烷中,加入EDC.HCl(165mg,0.85mmol),反应在氩气保护下进行20小时,反应液用25mM稀盐酸30mL洗三遍,有机相干燥后用旋转蒸发仪除去得210mg油状化合物 6(0.53mmol,75%产率)。化合物6(210mg)加入50mL HCl的二氧六环溶液(4M)搅拌1小时,出现的白色沉淀过滤收集得到158mg白色固体化合物7(0.48mmol,90%产率)。化合物7溶解在20mL甲醇中,加入丙酮(110μL,90mg),然后加入45mg氰基硼氢化钠反应2个小时,(162μL,130mg)。用旋转蒸发仪除去甲醇,继续加入丙醛(110μL,90mg),补充30mg氰基硼氢化钠反应2个小时。用旋转蒸发仪除去甲醇。粗品用二氯甲烷:乙酸乙酯(9:1)在硅胶柱上提纯得到136mg油状化合物8(0.36mmol,75%产率)。化合物8溶解在20mL甲醇中,加入20mg Pd/C后,在氢气球作用下反应一个小时。除去溶剂得到98mg 白色固体化合物9(0.34mmol,95%产率)。化合物9(98mg)溶解在20mL二氯甲烷中,加入TSTU(120mg,0.4mmol),DIPEA(diisopropylethylamine,0.85mmol,110mg,140μL) 在氩气保护下反应10小时。反应液用20mM碳酸氢钠溶液30mL洗3遍,用饱和盐水30mL 洗一遍,有机相干燥后旋干,得到白色固体化合物10(不含稳定同位素的IBT-16PLEX,结构B,99mg,76%产率)。分析数据:NMR(400MHz,CDCl3):8.05(s,1H),6.54(s,1H),4.00(s,2H), 3.58(t,2H),3.08(s,2H),2.95(m,1H),2.78(s,4H),2.60(t,2H),2.45(t,2H),1.47(m,2H), 1.04(d,6H),0.94(t,3H)。ESI-MS(M+H)+(计算)384.20,(实测)384.53。
IBT-16PLEX试剂(结构B)标记多肽的反应以及标记后的多肽在串联质谱中裂解形成的报告基团的结构如下。
一组IBT-16PLEX试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂。在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,因此报告基团的质量是不同的,但是报告基团的不同质量被平衡基团所补偿。这样,每个试剂中的报告基团+平衡基团的总分子量是相同的。报告基团和平衡基团通过可剪切键连接,剪切键在MS/MS中优先断裂,产生一系列报告基团离子,分别具有不同的分子式和质量,其报告基团和平衡基团离子的具体分子式和精确质量如下:
标记代码 | 报告基团分子式 | 报告基团分子量 | 平衡基团分子式 | 平衡基团分子量 | 总分子量 |
T114 | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 114.1277 | <sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 164.0671 | 278.1948 |
T115N | C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 115.1248 | <sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 163.0701 | 278.1949 |
T115C | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 115.1311 | C<sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 163.0638 | 278.1949 |
T116N | C<sub>6</sub><sup>13</sup>CH<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 116.1281 | C<sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 162.0668 | 278.1949 |
T116C | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 116.1344 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 162.0604 | 278.1948 |
T117N | C<sub>5</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 117.1315 | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 161.0634 | 278.1949 |
T117C | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 117.1378 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 161.0571 | 278.1949 |
T118N | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 118.1348 | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>3</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 160.0600 | 278.1948 |
T118C | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 118.1411 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub><sup>15</sup>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 160.0537 | 278.1948 |
T119N | C<sub>3</sub><sup>13</sup>C<sub>4</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 119.1382 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 159.0567 | 278.1949 |
T119C | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 119.1445 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 159.0567 | 278.2012 |
T120N | C<sub>2</sub><sup>13</sup>C<sub>5</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 120.1415 | C<sub>4</sub><sup>13</sup>C<sub>2</sub>H<sub>8</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 158.0597 | 278.2012 |
T120C | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 120.1479 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>CH<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 158.0533 | 278.2012 |
T121N | C<sup>13</sup>C<sub>6</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 121.1449 | C<sub>5</sub><sup>13</sup>CH<sub>8</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 157.0563 | 278.2012 |
T121C | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub>N<sup>+</sup> | 121.1512 | C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sup>15</sup>NO<sub>3</sub><sup>+</sup> | 157.0500 | 278.2012 |
T122 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>H<sub>16</sub><sup>15</sup>N<sup>+</sup> | 122.1482 | C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sup>+</sup> | 156.0529 | 278.2011 |
其对应的化学结构如下,其中星号标记代表一组IBT-16PLEX(结构B)试剂中稳定同位素15N和13C的位置。
选择不同的起始原料,在不改变报告基团和平衡基团分子量的情况下,15N和13C的位置可以变动到报告基团内部和平衡基团内部的任意不同位置,而不是仅限于上述所示的同位素位置。因此,报告基团的质量在114至122Da的范围内,可以独立地选自13C和/或15N 的不同数目和位置的同位素原子组合。IBT-16PLEX试剂在对最多16个蛋白质组多肽样品标记后,可以通过质谱进行鉴定分析。
鉴定分析步骤如下:
1)采用纳米反相色谱柱进行液相色谱分离;在需要的时候,可以采用不同的二维色谱组合进行高精度分离(例如:碱性反相柱+酸性反相柱;阳离子交换柱+酸性反相柱等)
2)采用Orbitrap高分辨质谱仪对标记的多肽进行鉴定分析;设定分辨率至少在30000以上用以区分在一对报告基团离子中的0.063Da的差别。
3)采用量化分析的报告基团离子的信号强度至少为最大峰值的5%。
实例3:13C3-丙醛的合成
如图3:13C3-丙醛的2步合成路线:实施例1和实施例2中所需要的13C3-丙醛均采用本实施例的方法制备。
13C3-丙酸(4g,54mmol)加入200mL二氯甲烷,加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐(59.4mmol,5.76 g)和EDC.HCl(59.4mmol,11.4g)。在氮气保护下反应20小时。分别用水(50mL)和饱和食盐水(50mL)洗3遍后,有机相干燥后旋干,得到白色固体5.4g(46mmol,85%产率)。溶于50mL无水甲醇后,慢慢加入0.875g四氢锂铝粉末(23mmol)。在黑暗中反应1小时后,用旋转蒸发仪除去甲醇。在残余固体中慢慢加入25mL稀盐酸萃灭过量的四氢锂铝以及水解 Weinerb反应的中间体。产生的丙醛用100mL乙醚进行液液连续萃取(liquid-liquidcontinuous extraction),然后常压蒸馏获得13C3-丙醛(1.35g,22.5mmol,49%产率)NMR(400MHz,CD3Cl)9.96(m,0.5H),9.62(m,0.5H),2.63(m,1H),2.29(m,1H),1.28(m,1.5H),0.94(m,1.5H)。
实例4:IBT-16PLEX(结构B)和TMTpro-16PLEX的比较
牛血清白蛋白(10μg)溶解在1mL变性溶液中(8M尿素,50mM四硼酸钠,pH=8.3),5mM TCEP,tris(2-carboxyethyl)phosphine),在37℃保持30分钟。然后,加入溴乙酰胺(20mm)用来烷基化蛋白中的游离半胱氨酸。蛋白质用甲醇/氯仿法沉淀提纯后,溶解在100μL缓冲液(200mM四硼酸钠,pH=8.3,0.8M尿素),加入胰蛋白酶消化(10μg)在37℃保持8个小时。将1mg IBT-16PLEX(或者1mg TMTpro)溶解在200μL乙腈中,在室温下反应2小时。旋干溶液后,用C18固相柱除盐。重新溶解在20μL 0.1%甲酸,10%乙腈溶液中,用QE-HF Orbitrap质谱仪分析。质谱分析条件:一级MS1扫描范围为350到2000m/z,扫描分辨率70000,最低信号强度为20000。二级MS/MS扫描分辨率为35000.最低信噪比设为1.5。数据库搜索:蛋白质鉴定和定量使用iQuant软件利用iPeak搜索。蛋白鉴定利用SwissProt 数据库(物种Bovine)和decoy序列。具体参数设定为:蛋白和肽的鉴定错误率(FDR)设定为小于1%;选择胰蛋白酶作为特异性酶,每个肽最多含一个错误切割;固定修饰包括 IBT-16PLEX(N-term),IBT-16PLEX(K),氨基甲酰基甲基化(C)和可变修饰包括氧化(M),脱氨基(N,Q)MS1质量误差值20ppm,MS2片段质量误差0.1Da。
HeLa蛋白质组也用IBT-16PLEX和TMTpro-16PLEX进行了分析。HeLa细胞加入1mL细胞裂解液(20mM Tris,pH=7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1%Triton,1mM Na3VO4),高速离心,收集上层清液,加入2mL丙酮,高速离心,收集沉淀的蛋白质后溶解在1mL变性溶液中(8M尿素,50mM四硼酸钠,pH=8.3),5mM TCEP,tris(2-carboxyethyl) phosphine),在37℃保持30分钟。然后,加入溴乙酰胺(20mm)用来烷基化蛋白中的游离半胱氨酸。蛋白质用甲醇/氯仿法沉淀提纯后,溶解在100μL缓冲液(200mM四硼酸钠,pH=8.3, 0.8M尿素),加入胰蛋白酶消化(100μg)在37℃保持8个小时。将1mg IBT-16PLEX(或者 1mg TMTpro)溶解在200μL乙腈中,在室温下反应2小时。旋干溶液后,用C18固相柱除盐。重新溶解在20μL 0.1%甲酸,10%乙腈溶液中,用QE-HF Orbitrap质谱仪分析。质谱分析条件:一级MS1扫描范围为350到2000m/z,扫描分辨率70000,最低信号强度为20000。二级MS/MS扫描分辨率为35000.最低信噪比设为1.5。数据库搜索:蛋白质鉴定和定量使用iQuant软件利用iPeak搜索。蛋白鉴定利用SwissProt数据库(物种Human)和decoy序列。具体参数设定为:蛋白和肽的鉴定错误率(FDR)设定为小于1%;选择胰蛋白酶作为特异性酶,每个肽最多含一个错误切割;固定修饰包括IBT-16PLEX(N-term),IBT-16PLEX(K),氨基甲酰基甲基化(C)和可变修饰包括氧化(M),脱氨基(N,Q)MS1质量误差值20ppm, MS2片段质量误差0.1Da。
数据表明,采用IBT-16PLEX对HeLa蛋白质组进行标记,可以比TMTpro多鉴定约30%的多肽(19141/14350~133%)和13%的蛋白(3372/2992~113%),体现了巨大的优势。
表1:IBT-16PLEX和TMTpro标记后鉴定的多肽和蛋白数比较
实例5:IBT-16PLEX用于HeLa细胞蛋白质组学定量分析
在实例4中所制备的HeLa蛋白质组多肽分成16等份(1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1: 1:1:1),用IBT-16PLEX试剂标记后混合。然后按照实例4中的步骤进行质谱分析。重复独立实验3次后,对数据进行统计分析。结果表明,以质量为114的分子标记标记的样品为对照,另外15种分子标记标记的样品量比值均接近1.0。
如图4所示:IBT-16PLEX试剂定量的准确性。Y轴是IBT-16PLEX的不同标记对114标记的实测比例,实测均值和误差范围是从3组独立的实验获得。
为了确定IBT-16PLEX的定量动态范围,将实例4中制备的HeLa蛋白质组多肽按照下列比例(1:10:10:10:5:5:5:1:1:1:0.2:0.2:0.2:0.1:0.1:0.1)与IBT-16PLEX的16个试剂反应后混合,然后按照实例4中的步骤进行质谱分析。重复独立实验3次后,对数据进行统计分析。结果表明,以质量为114的分子标记标记的样品为对照,另外15种分子标记标记的样品量比值均接近理论值。
如图5所示:IBT-16PLEX试剂定量的动态范围。Y轴是IBT-16PLEX的不同标记对114标记的实测比例的对数值(LogR),实测均值和误差范围是从3组独立的实验获得。
实施例6
本发明还公开了一种上述实施例1或2的IBT-16PLEX试剂用于多肽定量分析,主要步骤包括标记,分子碎片化、定量三步。最多16个多肽样品可以被IBT-16PLEX试剂(结构A或者结构B)分别标记后,混合在一起,然后在液相色谱LC上被分离,进而在MS/MS中产生特征碎片峰和试剂报告基团,根据特征峰和报告基团的强度对多肽进行定性,定量分析。
其中,多肽通过以下方法获得:
(1)从细胞提取的蛋白
(2)经过胰蛋白酶消化
(3)除盐获得多肽混合物
其中多肽获自细胞培养或者其他样品。样品的制备可以来自于培养的细胞或其他生物样品中提取的蛋白成分。
具体的定量分析方法如上述实施例4和实施例5。
实施例7
本发明还公开了上述实施例1和实施例2的标记试剂的应用,所述的标记试剂用于多肽定量分析方法,具体为一类可应用于16个样品的高通量蛋白质组学定量的同量异位标记试剂 (IBT-16PLEX)在多肽定量分析中的应用。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段,还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,其特征在于:所述试剂包括了一组16个化学结构和分子量完全一致,在不同位置含有不同的稳定同位素的标记试剂,其结构包括了三部分:报告基团-平衡基团-活化基团;其中,活化基团通过与多肽含有的不同官能团的特异性反应对多肽进行标记;报告基团与平衡基团的总质量是一致的,报告基团和平衡基团通过一个MS/MS可剪切键连接。
2.如权利要求1所述的一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,其特征在于:所述试剂的结构具体为:一组试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂;命名为:T114,T115N,T115C,T116N,T116C,T117N,T117C,T118N,T118C,T119N,T119C,T120N,T120C,T121N,T121C,T122;在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,保持报告基团和平衡基团的总分子量一致;标记试剂在二级质谱中通过剪切键的位置产生报告基团;一组试剂的报告基团的质量在114至122Da的范围内,可以独立地选自13C和/或15N的不同数目和位置的同位素原子组合;具体结构式如下:
4.如权利要求1所述的一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,其特征在于:所述试剂的结构具体为:一组试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂;命名为:T114,T115N,T115C,T116N,T116C,T117N,T117C,T118N,T118C,T119N,T119C,T120N,T120C,T121N,T121C,T122;在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素,保持报告基团和平衡基团的总分子量一致;标记试剂在二级质谱中通过剪切键的位置产生报告基团;一组试剂的报告基团的质量在114至122Da的范围内,可以独立地选自13C和/或15N的不同数目和位置的同位素原子组合;具体结构式如下:
。
6.如权利要求2或4所述的一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,其特征在于:所述试剂的结构具体为:在保持报告基团和平衡基团分子式不变的情况下,稳定同位素可以包括任何位置的组合。
7.如权利要求2或4所述的一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂,其特征在于:所述试剂在对最多16个蛋白质组多肽样品标记后,通过质谱进行鉴定分析;鉴定分析步骤如下:
1)采用一维纳米反相色谱柱进行液相色谱分离;
2)采用不同二维色谱组合进行高精度分离:碱性反相柱+酸性反相柱;阳离子交换柱+酸性反相柱;
3)采用Orbitrap高分辨质谱仪对标记的多肽进行鉴定分析;设定分辨率至少在30000以上用以区分在一对报告基团离子中的0.063Da的差别;
4)采用量化分析的报告基团离子的信号强度至少为最大峰值的5%。
10.如权利要求1-9所述的任意一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂的应用,其特征在于:所述的标记试剂用于多肽定量分析方法,具体为一类可应用于16个样品的高通量蛋白质组学定量的同量异位标记试剂在多肽定量分析中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011518641.8A CN114646762A (zh) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | 一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011518641.8A CN114646762A (zh) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | 一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114646762A true CN114646762A (zh) | 2022-06-21 |
Family
ID=81989968
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011518641.8A Pending CN114646762A (zh) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | 一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114646762A (zh) |
-
2020
- 2020-12-21 CN CN202011518641.8A patent/CN114646762A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1588145B1 (en) | Methods, mixtures, kits and compositions pertaining to analyte determination | |
JP4188701B2 (ja) | タンパク質サンプルを分析するためのプロセス | |
US8071392B2 (en) | Mass spectrometric analysis of proteins using stable isotopes of pyrylium derivates as labels | |
US20080242838A1 (en) | Labeling reagent and methods of use | |
US20020164649A1 (en) | Mass tags for quantitative analysis | |
US8486712B2 (en) | Deuterium isobaric tag reagents for quantitative analysis | |
US20060275842A1 (en) | Methods and kits useful for the simplification of complex peptide mixtures | |
US20100167262A1 (en) | Method and reagent for the specific identification and quantification of one or more proteins in a sample using in particular inductively coupled plasma-mass spectrometry | |
US20050221413A1 (en) | Sulfenyl compound, labeling reagent, and method of analyzing peptide | |
Stefanowicz et al. | Derivatization of peptides for improved detection by mass spectrometry | |
CN114646762A (zh) | 一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂 | |
US20070015233A1 (en) | Analysis of molecules | |
EP2710380B1 (en) | Method of detection of amino acid sequence and/or identification of peptides and proteins, by use of a new derivatization reagent and synthesis of 5-formyl-benzene-1,3-disulphonic acid as derivatization reagent | |
CN111205214B (zh) | 一种稳定同位素标记试剂及其制备方法和应用 | |
CN111024867A (zh) | 一类基于稳定同位素的高通量蛋白质组学定量试剂 | |
CN113620847A (zh) | 萘磺酰类化合物、其制备方法和应用 | |
Niwayama et al. | Synthesis of D-labeled naphthyliodoacetamide and application to quantitative peptide analysis by isotope differential mass spectrometry | |
US20060234314A1 (en) | Selective binding and analysis of macromolecules | |
CN116794198A (zh) | 一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法 | |
CN116337567A (zh) | 一种快速高效的化学蛋白质组学样品制备方法 | |
CN115536566A (zh) | 化学交联剂、其制备方法及其应用 | |
JP2005232132A (ja) | ダンシル基を有するチオール基特異的標識用試薬、その製法、および該標識試薬を用いた標識法 | |
JP2010071986A (ja) | 蛍光試薬 | |
Ross et al. | Multiplexed quantitative proteomics using mass spectrometry |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |