CN116794198A - 一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双稀土金属标记肽段合成及定量新方法，应用于定量蛋白质组学的研究。该方法通过在一定条件下，将DOTA精确合成到肽段特殊位点的方式，实现肽段的双重稀土金属标记。肽段可以通过标记的稀土金属实现精准的相对定量。本发明突破了现有几类常用定量标记的技术瓶颈，在扩大标记选材库的同时保证了标记效率，降低了标记成本与时间成本，为定量蛋白质组学提供了大规模高通量鉴定的新方法，对生物医学及药物化学领域中的差异蛋白质组或比较蛋白质组分析起到了极大的支撑作用。
Description
技术领域
本发明属于定量蛋白质组学技术领域，具体涉及一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法。
背景技术
随着基因组学和蛋白质组学的发展，基于液质联用的目标蛋白质组定量技术已经成为常用的蛋白质定量手段。在定量蛋白质组学中，稳定同位素标记技术将轻、重同位素差异纳入两个或多个样品中，被广泛应用于蛋白质组差异的全面分析。其中，SILAC、TMT、iTRAQ等标记方式受到了大规模的应用。然而，该类标记方式受到了同位素试剂合成困难、价格高昂、定量动态范围有限以及存在“压缩效应”等因素的制约。
相较于稳定同位素标记技术，金属标记技术是使用金属元素代替同位素试剂，通过相似的反应路线为样品添加化学标签，实现目标蛋白质组定量的目的。金属标记技术具有原材料易制得、价格低廉、金属选择供体种类繁多等诸多优点。使用化学性质相近的金属元素进行标记，可使不同金属标记的同一肽段在色谱中的保留时间及在质谱中的碎裂行为、信号响应都非常接近，有利于蛋白质组学定量的研究。因此，稀土金属由于其外源性、稳定性以及相互间相似的化学性质成为理想的标记物。然而，使用单稀土金属标记肽段，无法提高混合样品的上样规模，实现高通量定量蛋白质组。
综上所述，目前金属标记肽段的方法还不能满足高通量定量蛋白质组的要求，有必要开发更好的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法。
本发明所提供的一种双稀土金属标记肽段合成的新方法，通过更改标记金属的种类，实现混合样品的高通量定量鉴定。
本发明的方法是使用两种相同或不同的稀土金属对C端带有赖氨酸的肽段进行标记。
具体方法包括下述步骤：
1)使用DOTA-NHS-ester试剂对目的肽段的N端氨基通过脱水缩合反应进行修饰，所述DOTA-NHS-ester的结构式如下式1所示：
2)将稀土元素氯化物加入到步骤1)DOTA-NHS-ester修饰后的肽段溶液中，得到单稀土金属标记肽段；
3)使用DOTA-NHS-ester试剂对步骤2)得到的单稀土金属标记肽段的C端赖氨酸通过脱水缩合反应进行修饰；
4)将稀土元素氯化物加入到步骤3)制备的肽段溶液中，得到双稀土金属标记肽段。
上述方法步骤1)中，所述反应的条件如下：肽段与DOTA-NHS-ester物质的量比为1:10-1:1000(优选1:100)，pH为9.0-9.4，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
上述方法步骤1)中，所述DOTA-NHS-ester溶于无水乙腈，配置成10mM-50mM溶液，优选25mM；所述肽段溶于三乙胺-碳酸缓冲溶液(TEAB缓冲液)，配置成10mM-50mM溶液，优选25mM(pH 9.2)。
上述方法步骤1)中，所述反应的反应体系中水与乙腈的体积比为1:1-1:10，优选的，使用1:3作为反应条件。
上述方法步骤2)中，所述DOTA-NHS-ester修饰后的肽段溶液是将DOTA-NHS-ester修饰后的肽段溶于0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)中得到的。
上述方法步骤2)中，所述反应的条件如下：DOTA-NHS-ester与稀土元素氯化物的物质的量比为1:1-1:10(优选1:5)，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
上述方法步骤3)中，所述反应的条件如下：肽段与DOTA-NHS-ester物质的量比为1:10-1:1000(优选1:100)，pH为8.3-8.7，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
上述方法步骤3)中，所述DOTA-NHS-ester溶于无水乙腈，配置成10mM-50mM溶液，优选25mM；所述肽段溶于三乙胺-碳酸缓冲溶液(TEAB缓冲液)，配置成100mM溶液(pH 8.8)。
上述方法步骤3)中，所述反应的反应体系中水与乙腈的体积比为1:1-1:10，优选的，使用1:3作为反应条件。
上述方法步骤4)中，所述步骤3)制备的肽段溶液是将步骤3)制备的肽段溶于0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)中得到的。
上述方法步骤4)中，所述反应的条件如下：DOTA-NHS-ester与稀土元素氯化物的物质的量比为1:1-1:10，优选1:5，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
本发明中所述C端带有赖氨酸的肽段的样本来源可以是组织、细胞、蛋白以及标准合成肽段。
来源于组织、细胞、蛋白样品的肽段的制备方法如下：通过常规方法对组织或细胞进行裂解获得产物，并使用蛋白内切酶Lys-C对产物进行酶切，得到C端带有赖氨酸的肽段混合物。
所述标准合成肽段，如标准合成肽段DVDPGEHYIIK，其结构如下所示：
上述方法中，所述稀土金属可为铽、钬、镱、镝、铒、铥。
上述方法步骤2)和步骤3)中，所述稀土金属氯化物中的稀土金属可以相同或不同。
上述方法还包括下述步骤：
4)合成肽段的鉴定及标记效率的计算
用MALDI-TOF MS对标记结果进行鉴定验证，并计算稀土金属双标记的标记效率；
5)双标记样本的质谱定量
使用LC-MS/MS对双标记样本进行质谱检测，对肽段进行鉴定与定量，并进行质谱数据解析及蛋白质鉴定。
上述方法制备得到的双稀土金属标记肽段也属于本发明的保护方法。
本发明合成的双稀土金属标记肽段可应用于高通量大规模的定量蛋白质组学研究中。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明使用可选种类繁多的稀土金属标记代替同位素标记，在扩大标记选材库的同时保证了标记效率；使用双标记代替单标记，在维持定量稳定性的同时大幅度提高了鉴定通量，显著的提高了蛋白质组学样本的多样性。
2、本发明的新方法是蛋白质差异表达相对定量分析工具，大大的降低了蛋白质组学中相对定量的成本。此外，标记反应过程的条件温和、操作简便、时间成本低且容易实现。
3、本发明的新方法适用于对两种或多种组织或细胞样品的蛋白质差异表达进行相对定量。该方法简便快速、普适性强，可成为疾病诊断及药物筛选的快检工具，对生物医学及药物化学领域中的差异蛋白质组或比较蛋白质组分析起到了极大的支撑作用。
4、本发明的方法具有广泛的实用性，用途包括但不限于：生物化学、医学、药物化学、农业科学等领域，对动物、植物以及微生物的定量蛋白质组学研究。
附图说明
图1为双稀土金属标记肽段合成及定量方法的流程图。
图2为本发明方法对a标准合成肽段DVDPGEHYIIK，b标准合成肽段的铽稀土金属标记，c标准合成肽段的铽、钬双稀土金属标记的MALDI-TOF MS图谱。
图3为本发明方法对HeLa细胞中蛋白质三次标记定量鉴定的韦恩图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例中DOTA-NHS-ester试剂，其结构式如下式1所示：
实施例1、标准合成肽段的铽、钬双稀土金属标记效果评价
选用标准合成肽段DVDPGEHYIIK，对其进行铽、钬双金属标记，并对标记结果进行评价。
标准合成肽段DVDPGEHYIIK结构如下式2所示：
将DOTA-NHS-ester溶于无水乙腈，配置成25mM溶液，标准合成肽段DVDPGEHYIIK溶于三乙胺-碳酸缓冲溶液(TEAB缓冲液，pH 8.8)，配置成25mM溶液(pH 9.2)。按肽段与DOTA-NHS-ester物质的量比1:100，向肽段溶液中加入DOTA-NHS-ester乙腈溶液，逐渐滴加乙腈，使体系终体积比VH2O:VACN为1：3。然后于室温下反应1h。热干至完全干燥后，加入到0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)中。
TbCl3溶于0.1M的醋酸铵缓冲体系(pH＝5.6)，配置成100mM溶液(pH＝5.6)，并将该溶液逐滴加入上述体系中，使DOTA-NHS-ester与铽离子物质的量之比为1：5，并于37℃水浴中孵育1h。反应结束后，对该反应体系进行脱盐、热干，得到铽金属标记肽段。
将肽段重溶于10μL 50mM TEAB缓存液(pH 8.5)中，取1μL备用，剩余肽段溶液按肽段与DOTA-NHS-ester物质的量之比1:100，向其中加入DOTA-NHS-ester的乙腈溶液，逐渐滴加乙腈，使体系终体积比VH2O:VACN为1：3。然后于室温下反应1h。热干至完全干燥后，加入到0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)中。
HoCl3溶于0.1M的醋酸铵缓冲体系(pH＝5.6)，配置成100mM溶液(pH＝5.6)，并将该溶液逐滴加入上述体系中，使DOTA-NHS-ester与钬离子物质的量比为1：5，37℃水浴孵育1h。反应结束后，对该反应体系进行脱盐、热干，得到铽、钬双稀土金属标记肽段。
将热干后的样品溶解于10μL 50％乙腈中，取1μL，以CHCA作为基质，进行MALDI-TOF MS分析。
将铽金属标记肽段的1μL备用液，以CHCA作为基质，进行MALDI-TOF MS分析。
将标准合成肽段稀释到一定浓度，取1μL，以CHCA作为基质，进行MALDI-TOF MS分析。
如图2所示，铽金属标记、铽钬双稀土金属标记肽段均取的良好的标记效果，标记效率分别为99.3％和98.9％，标记效率均>98％。
实施例2、Hela细胞的双稀土金属标记效果评价
三盘HeLa细胞在100mm培养皿中覆板率达到约80％时，除去培养皿中的培养基，使用PBS溶液润洗细胞3次(每次10mL)。向培养皿中加入2mL 0.05％(w/v)Trypsin-EDTA在37℃孵育箱中消化2min后，加入新鲜培养基中止消化，并收集细胞于15mL离心管中，1000g离心3min，弃上清液。得到的Hela细胞溶于含8M尿素的100mM碳酸氢铵缓冲溶液中并进行裂解。在细胞裂解后，加入10mM TCEP和50mM CAA于室温下孵育40min进行还原烷基化处理，取变性后的蛋白以1:100的物质的量之比加入赖氨酸蛋白酶Lys-C，放置于37℃恒温箱孵育16小时即可得到酶解产物肽段。酶解产物肽段经过C18Zip-Tips脱盐柱脱盐、洗脱后冷冻干燥备用。
干燥的肽段后的标记步骤与实施例1中标准合成肽段的标记步骤完全相同，双标记金属分别为铽、钬，镱、钬，和镱、铽。
使用纳升液相色谱(EASY-nLC 1000)与生物质谱(Orbitrap Fusion Tribrid)联用对酶解产物肽段进行质谱分析。其中，液相色谱使用C18反向色谱填料装填的柱(填料直径1.9μm，色谱柱内径75μm，柱长30cm)，并以300nL/min的流速来实现样品的分离。一级质谱分析的扫描范围设置为300-1400m/z，分辨率为120K。二级质谱分析选择数据依赖性扫描模式，高能碰撞解离(HCD)碎裂模式的能量设置为30％。
质谱原始数据raw文件使用Proteome Discoverer V2.2软件进行搜库解析。蛋白酶切模式设置为Lys-C，并允许每个肽段中最多含有2个漏切位点，最少含有6个氨基酸残基。脲甲基修饰半胱氨酸、金属标签修饰N端以及金属标签修饰赖氨酸被设为固定修饰，氧化甲硫氨酸和N端乙酰修饰被设为可变修饰。对于蛋白质鉴定，FDR上限设为0.01，并且每个蛋白质需要鉴定到至少两条独有的肽段才认为是可靠的鉴定结果。如图3所示，本发明提供的方法在三次平行标记的样本中，分别鉴定到4341、4124、4271个蛋白质，共计鉴定到4572个蛋白质，三次共鉴定标记重叠率为80.2％(3667个蛋白质)。
Claims (10)
1.一种双稀土金属标记肽段的合成方法，是使用两种相同或不同的稀土金属对C端带有赖氨酸的肽段进行标记；
包括下述步骤：
1)使用DOTA-NHS-ester试剂对目的肽段的N端氨基通过脱水缩合反应进行修饰，所述DOTA-NHS-ester的结构式如下式1所示：
2)将稀土元素氯化物加入到步骤1)DOTA-NHS-ester修饰后的肽段溶液中，得到单稀土金属标记肽段；
3)使用DOTA-NHS-ester试剂对步骤2)得到的单稀土金属标记肽段的C端赖氨酸通过脱水缩合反应进行修饰；
4)将稀土元素氯化物加入到步骤3)制备的肽段溶液中，得到双稀土金属标记肽段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述反应的条件如下：肽段与DOTA-NHS-ester物质的量比为1:10-1:1000，pH为9.0-9.4，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述DOTA-NHS-ester溶于无水乙腈，配置成10mM-50mM溶液；所述肽段溶于三乙胺-碳酸缓冲溶液，配置成10mM-50mM溶液；
所述反应的反应体系中水与乙腈的体积比为1:1-1:10。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：
所述步骤2)中，所述反应的条件如下：DOTA-NHS-ester与稀土元素氯化物的物质的量比为1:1-1:10，温度为4～37℃，时间为0.5～6h；
或，所述步骤2)中，所述反应的反应溶剂为0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述反应的条件如下：肽段与DOTA-NHS-ester物质的量比为1:10-1:1000，pH为8.3-8.7，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述DOTA-NHS-ester溶于无水乙腈，配置成10mM-50mM溶液；所述肽段溶于三乙胺-碳酸缓冲溶液，配置成100mM溶液(pH 8.8)；
所述步骤3)中，所述反应的反应体系中水与乙腈的体积比为1:1-1:10。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述反应的条件如下：DOTA-NHS-ester与稀土元素氯化物的物质的量比为1:1-1:10，温度为4～37℃，时间为0.5～6h；
或，所述步骤2)中，所述反应的反应溶剂为0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的的方法，其特征在于：所述C端带有赖氨酸的肽段的样本来源可以是组织、细胞、蛋白以及标准合成肽段；
来源于组织、细胞、蛋白样品的肽段的制备方法如下：通过常规方法对组织或细胞进行裂解获得产物，并使用蛋白内切酶Lys-C对产物进行酶切，得到C端带有赖氨酸的肽段混合物；
所述稀土金属为铽、钬、镱、镝、铒、铥。
9.权利要求1-8中任一项所述方法得到的双稀土金属标记肽段。
10.权利要求9所述双稀土金属标记肽段在高通量大规模的定量蛋白质组学研究中的应用。
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