CN109111389A - 一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂及其合成方法 - Google Patents

一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂及其合成方法 Download PDF

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Abstract

一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂及其合成方法,属于化学合成领域。将结构中含有氨基、苯环及羧基的对氨基苯乙酸的同系物或4‑(2‑氨基乙基)苯甲酸的同系物为原料，先将氨基二甲基化，再对产物中的羧基采用N‑羟基琥珀酰亚胺进行酯化，得到同位素衍生化试剂。同位素标记试剂的结构特点是一部分为琥珀酰亚胺酯，另一部分为二甲基取代的叔胺基，琥珀酰亚胺酯与二甲胺基之间通过碳链及与一个苯环相连，苯环和与胺基相连的碳链上碳原子个数为0‑6。本发明通过选用不同D取代或13C取代的甲醛，以及H或D取代的氰基硼氢化钠，通过调整反应路线，得到一系列可与氨基或酚羟基高效反应的具有不同同位素取代的同位素标记试剂。通过改变初始原料，通过该方法可制备得到具有类似功能的同位素标记试剂。

Description

一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂及其合成 方法
技术领域
本发明属于化学合成领域，涉及一组用于标记带有氨基或带有酚羟基的一系列化合物的 同位素标记试剂及其合成方法，借助该标记试剂对样品中的目标物进行标记，通过液相色谱- 质谱(LC-MS)联用技术可对这两类物质衍生化之后的产物实现高效准确的定量分析以及对同 分异构体的分离。而且该试剂可以引入苯环，使标记后的紫外吸收强度提高，进而有利于降 低紫外分光光度计和HPLC-UV对目标物的检测线。
背景技术
质谱法(mass spectrometry)在现代分析技术中占有举轻重的地位，基于质谱的定量方法也 在迅速发展当中，为了有效克服复杂样品中因基质效应产生的信号强度差异，同位素内标法 被广泛应用于质谱的定量分析当中。但同位素内标试剂受到价格较高，商品化程度低等限制， 通常只适合目标分析物较少的情况。当目标物增加时，这种限制由为突出。相对之下，用同 位素标记的方法则具有显著优势，特别是在生物分析中，稳定同位素标记(stable isotope labeling)技术得到了飞速发展。目前已有多种标记方法被应用于多肽及蛋白析中氨基或羧基的 标记，通过与这些目标物中的可反应基团反应将同位素结合到目标分析上物，通过对比液相 色谱-质谱中(LC-MS)的信号响应强度，对其实现相对或绝对定量分析。在该标记方法中，新 型同位素试剂的合成及标记方法的开发是该技术的关键。
本发明中的标记试剂其结构上与已申请的专利(申请号：PCT/CN2017/102659)相比， 其显著差别在于：1)本发明中的产物未经季胺化处理，得到的产物为叔胺，而已申请的专利 中为季铵；2)本发明中的产物带有苯环结构，而已申请的专利中的产物不含有苯环。
本发明通过选用不同氘或13C取代的甲醛和氰基硼氢化钠，通过对对氨基苯甲酸及其同系 物中的氨基进行甲基化反应，可得到一系列具有不同同位素的二甲氨基系列产物。将该系列 产物进一步与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，使其羧基与NHS的羟基反应形成酯，使羧基得 到活化，最终得到一组可与氨基或酚羟基高效反应的同位素标记试剂。通过采用该组试剂进 行标记，并结合LC-MS可实现对复杂样品中氨基类或酚类化合物的快速、准确、稳定的大规 模定量分析。
发明内容
本发明的目的在于合成一组新型同位素标记试剂，进而对带有氨基或酚羟基的化合物进 行标记。
本发明的技术方案为：
一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂，将结构中含有氨基、苯环及羧基的对氨 基苯乙酸的同系物(原料A’)或4-(2-氨基乙基)苯甲酸的同系物(原料B’)为原料，先将其 中的氨基二甲基化，然后再对产物中的羧基采用N-羟基琥珀酰亚胺进行酯化，得到用于标记 氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂，由原料A’得到产物A，由原料B’得到产物B，其结构式如 下表所示：
其中，R为-CH3,-CDH2，-CD2H，-CD3，-13CH3，-13CDH2，-13CD2H，-13CD3中的一种。
所述的同位素标记试剂的结构特点是一部分为琥珀酰亚胺酯，另一部分为二甲基取代的 叔氨基，琥珀酰亚胺酯与二甲氨基之间通过碳链及与一个苯环相连，与苯环和与氨基相连的 碳链上(CH2)碳原子个数为0-6。甲基的取代方式有多种，其差别为H、D及13C原子的个 数。
上述一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂的合成方法，该合成方法将含有同位 素的氰基硼氢化钠(或氰基硼氘化钠)或甲醛(或同位素取代的甲醛)通过甲基化反应后， 将原料中的氨基转化为甲氨基的同时，引入同位素；将该含有同位素的甲氨基产物与N-羟基 琥珀酰亚胺反应，将在物中的羧基进行活化，最终得到该组标记试剂。其具体步骤如下：
同位素标记试剂系列一：
第一步：从原料A’出发，以氢(H)或氘(D)取代的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)为催化剂， 使用H、2H(D)或13C取代的甲醛(CH2O)对原料中的氨基进行二甲基化反应。
将对氨基苯甲酸的同系物分散到纯水中，再加入甲醛溶液，对氨基苯乙酸的同系物与甲 醛的摩尔比为1:3-1:6，震荡，使其充分混匀。在体系中加入氰基硼氢化钠，对氨基苯乙酸与 其摩尔比为1:1.2-1:1.6，震荡，使其充分混匀。保持反应体系的体积为～1mL,同时开始计时， 反应时间为0.5-1.5h。
所述的反应原料为对氨基苯甲酸的同系物(原料A’)以氰基硼氢化钠(NaBH3CN)和甲醛 (CH2O)为例，其反应式如下：
第二步：旋转蒸发干燥后得到产物A1，产物A1溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，对产物A1中的羧基进 行活化，在40-60℃条件下，搅拌反应15-22h后得到目标最终产物。反应式如下：
所述的产物A1、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.1-2.5:2.2-4。所述的搅拌转速为800-1000 rpm。
同位素标记试剂系列二：
第一步：从原料B’出发，以氢(H)或氘(D)取代的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)为催化剂， 使用H、D或13C取代的甲醛(CH2O)对原料中的氨基进行二甲基化反应。
将原料B’分散到纯水中，再加入甲醛溶液，甲醛与4-(2-氨基乙基)苯甲酸的同系物的摩 尔比为1:3-1:6，震荡，使其充分混匀。在体系中加入氰基硼氢化钠，对氨基苯乙酸与其摩尔 比为1:1.2-1:1.8，震荡，使其充分混匀。保持反应体系的体积为～1mL，同时开始计时，反应 时间为0.5-1.5h。
以氘代氰基硼氢化钠(NaBD3CN)和甲醛(CH2O)为例，其反应式如下：
第二步：旋转蒸发干燥后得到产物B1，产物B1溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，对产物B1中的羧基进 行活化，在45-65℃条件下，搅拌反应24-36h后得到目标最终产物。反应式如下：
所述的产物B1、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.5-2.5:4-6。所述的搅拌转速为800-1000 rpm。
本发明的有益效果为，通过以价格相对较为低廉的D或13C取代的甲醛，通过其与初始 原料中的氨基反应，将伯氨基转化为叔胺并将同位素原子引入到产物中。通过选用不同的同 位素试剂及合成路线，可制备得到一系列具体分子量差异的化合物，最后用NHS与甲基化后 产物中的羧基反应，使羧基活化，得到可用于标记氨基及酚羟基的多种同位素标记试剂。同 时，在通过选用含有苯环的初始原料，使最终所得到的标记试剂在紫外光区具有吸收，使其 可被紫外检测器所探测。当用MS或LC-MS对含有氨基或酚羟基的目标物进行定量分析时， 无需借助各自的同位素内标，可将样品及已知浓度的待测目标物的标准品分别用所合成的标 记试剂进行衍生，将其转化为带有同位素的目标物，然后混合后进行LC-MS分析实现定量。 在实际分析过程中，可选用多种同位素试剂分别对样品标记，然后将多个样品混合分析，在 单次的LC-MS分析中实现对多个样品的相对定量或绝对定量。单次LC-MS分析中样品的个 数理论上可达4个及以上，仪器分析时间缩减至原来的1/4及以下。与每个样品单次进样分 析相比，利用该系列同位素试剂进行标记后可显著提高分析的效率及准确性，同时也节约了 分析的费用。此外，通过改变标记试剂中间碳链或苯环的个数，可以控制标记试剂的亲疏水 性，改善目标物分析物在LC上的保留及分离效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例一(对应试剂系列一)
选用对氨基苯乙酸、NaBH3CN和CH2O为原料，具体步骤为：
a)使用1.5mL离心管直接称取10mg(0.066mmol)对氨基苯乙酸；
b)使用500μL的超纯水溶解对氨基苯乙酸，可以使用震荡或超声的方式帮助溶解；
c)加入7.4％CH2O 100μL，震荡10s时期混合充分；
d)加入0.6mol/L的催化剂NaBH3CN 150μL，震荡10s时期混合充分；
e)使用0.5％的甲酸(FA)控制溶液pH＝5，并用超纯水定容到1mL；
f)在室温，500rpm的条件下反应1h。经上述六步操作，共可得到对二甲氨基苯乙酸(反 应方程式如下)；
g)将第一步二甲基化反应产物移入洁净的25mL的圆底烧瓶中，直接使用旋转蒸发仪除 水(旋转蒸发条件为50℃，60rpm)；
h)称取12mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和30mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加 入圆底烧瓶中；
i)取用4mL干化N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(LC-MS级)加入到圆底烧瓶内；
j)利用油浴锅搅拌加热，控制温度为50℃，控制转速1000rpm(反应方程式如下)；
k)反应时长为22h；
l)冷冻离心，放置于-18℃冷藏保存用于标记反应。
实施例二(对应试剂系列一)
选用对氨基苯丁酸、NaBH3CN和CD2O为原料，其具体步骤为：
a)使用1.5mL离心管直接称取10mg对对氨基苯丁酸；
b)使用500μL的超纯水溶解对氨基苯丁酸，可以使用震荡或超声的方式帮助溶解；
c)加入20％CH2O 30μL，震荡10s时期混合充分；
d)加入0.6mol/L的催化剂NaBH3CN 150μL，震荡10s时期混合充分；
e)使用0.5％的甲酸(FA)控制溶液pH＝6，并用超纯水定容到1mL，；
f)在室温，500rpm的条件下反应1h。经上述六步操作(反应方程式如下)；
g)将第一步二甲基化反应产物移入洁净的25mL的圆底烧瓶中，直接使用旋转蒸发仪除 水(旋转蒸发条件为50℃，60rpm)；
h)称取15mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50mg(0.14mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入圆底烧瓶中；
i)取用4mL干化N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(LC-MS级)加入到圆底烧瓶内；
j)利用油浴锅搅拌加热，控制温度为50℃，控制转速800rpm(反应方程式如下)；
反应时长为25h；
k)冷冻离心，放置于-18℃冷藏保存用于标记反应。
实施例三(对应试剂系列一)
选用4-(2-氨基乙基)苯甲酸、NaBD3CN和CH2O为原料，其具体步骤为：
a)使用1.5mL离心管直接称取10mg4-(2-氨基乙基)苯甲酸；
b)使用500μL的超纯水溶解4-(2-氨基乙基)苯甲酸，可以使用震荡或超声的方式帮助溶 解；
c)加入7.4％CH2O 140μL，震荡10s时期混合充分；
d)加入0.6mol/L的催化剂NaBD3CN 160μL，震荡10s时期混合充分；
e)使用0.5％的甲酸(FA)控制溶液pH＝6，并用超纯水定容到1mL；
f)在室温，500rpm的条件下反应1h。经上述六步操作(反应方程式如下)；
g)将第一步二甲基化反应产物移入洁净的25mL的圆底烧瓶中，直接使用旋转蒸发仪除 水(旋转蒸发条件为50℃，60rpm)；
h)称取12mg(0.099mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和30mg(0.14mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入圆底烧瓶中；
i)取用4mL干化N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(LC-MS级)加入到圆底烧瓶内；
j)利用油浴锅搅拌加热，控制温度为40-60℃，控制转速800-1000rpm(反应方程式如 下)；
k)反应时长为22h；
l)冷冻离心，放置于-18℃冷藏保存用于标记反应。
实施例四(对应试剂系列一)
以4'-氨基[1,1'-联苯]-3-羧酸、NaBD3CN和13CD2O为原料，其合成具体步骤为：
a)使用1.5mL离心管直接称取10mg4'-氨基[1,1'-联苯]-3-羧酸；
b)使用500μL的超纯水溶解4'-氨基[1,1'-联苯]-3-羧酸，可以使用震荡或超声的方式帮 助溶解；
c)加入20％13CD2O 30μL，震荡10s时期混合充分；
d)加入0.6mol/L的催化剂NaBD3CN 140μL，震荡10s时期混合充分；
e)使用0.5％的甲酸(FA)控制溶液pH＝5，并用超纯水定容到1mL；
f)在室温，500rpm的条件下反应1h。经上述六步操作(反应方程式如下)；
g)将第一步二甲基化反应产物移入洁净的25mL的圆底烧瓶中，直接使用旋转蒸发仪除 水(旋转蒸发条件为50℃，60rpm)；
h)称取20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和60mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加 入圆底烧瓶中；
i)取用4mL干化N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(LC-MS级)加入到圆底烧瓶内；
j)利用油浴锅搅拌加热，控制温度为40-60℃，控制转速800-1000rpm(反应方程式如 下)；
k)反应时长为30h；
l)冷冻离心，放置于-18℃冷藏保存用于标记反应。
实施例五(对应试剂系列一)
以4'-氨基[1,1'-联苯]-2-羧酸及NaBD3CN和13CD2O为原料，其合成具体步骤为：
a)使用1.5mL离心管直接称取10mg4'-氨基[1,1'-联苯]-2-羧酸；
b)使用500μL的超纯水溶解4'-氨基[1,1'-联苯]-2-羧酸，可以使用震荡或超声的方式帮 助溶解；
c)加入20％13CD2O 31μL，震荡10s时期混合充分；
d)加入0.6mol/L的催化剂NaBD3CN 150μL，震荡10s时期混合充分；
e)使用0.5％的甲酸(FA)控制溶液pH＝5，并用超纯水定容到1mL；
f)在室温，500rpm的条件下反应1h。经上述六步操作(反应方程式如下)；
g)将第一步二甲基化反应产物移入洁净的25mL的圆底烧瓶中，直接使用旋转蒸发仪除 水(旋转蒸发条件为50℃，60rpm)；
h)称取20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和60mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加 入圆底烧瓶中；
i)取用4mL干化N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(LC-MS级)加入到圆底烧瓶内；
j)利用油浴锅搅拌加热，控制温度为40-60℃，控制转速800-1000rpm(反应方程式如 下)；
k)反应时长为29h；
l)冷冻离心，放置于-18℃冷藏保存用于标记反应。
实施例六(对应试剂系列二)
以3-苯基-L-丙氨酸、NaBH3CN和13CH2O为原料，其具体步骤为：
a)使用1.5mL离心管直接称取10mg 3-苯基-L-丙氨酸；
b)使用500μL的超纯水溶解3-苯基-L-丙氨酸，可以使用震荡或超声的方式帮助溶解；
c)加入5％13CH2O 110μL，震荡10s时期混合充分；
d)加入0.6mol/L的催化剂NaBH3CN 140μL，震荡10s时期混合充分；
e)使用0.5％的甲酸(FA)控制溶液pH＝6，并用超纯水定容到1mL，；
f)在室温，500rpm的条件下反应1h。经上述六步操作(反应方程式如下)；
g)将第一步二甲基化反应产物移入洁净的25mL的圆底烧瓶中，直接使用旋转蒸发仪除 水(旋转蒸发条件为50℃，60rpm)；
h)称取15mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和60mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加 入圆底烧瓶中；
i)取用4mL干化N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(LC-MS级)加入到圆底烧瓶内；
j)利用油浴锅搅拌加热，控制温度为60℃，控制转速1000rpm(反应方程式如下)；
k)反应时长为26h；
l)冷冻离心，放置于-18℃冷藏保存用于标记反应。

Claims (8)

1.一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂，其特征在于，所述的同位素衍生化试剂以含有氨基、苯环及羧基的对氨基苯乙酸的同系物为原料A’，将其中的氨基二甲基化，然后再对产物中的羧基采用N-羟基琥珀酰亚胺进行酯化，得到产物A，其结构式如下表所示：
其中，R为-CH3,-CDH2，-CD2H，-CD3，-13CH3，-13CDH2，-13CD2H，-13CD3中的一种；
所述的同位素标记试剂的结构特点是一部分为琥珀酰亚胺酯，另一部分为二甲基取代的叔氨基，琥珀酰亚胺酯与二甲氨基之间通过碳链及与一个苯环相连，与苯环和与氨基相连的碳链上CH2碳原子个数为0-6；甲基的取代方式有多种，其差别为H、D及13C原子的个数。
2.一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂，其特征在于，所述的同位素衍生化试剂以4-(2-氨基乙基)苯甲酸的同系物为原料B’，将其中的氨基二甲基化，然后再对产物中的羧基采用N-羟基琥珀酰亚胺进行酯化，得到产物B，其结构式如下表所示：
其中，R为-CH3,-CDH2，-CD2H，-CD3，-13CH3，-13CDH2，-13CD2H，-13CD3中的一种；
所述的同位素标记试剂的结构特点是一部分为琥珀酰亚胺酯，另一部分为二甲基取代的叔氨基，琥珀酰亚胺酯与二甲氨基之间通过碳链及与一个苯环相连，与苯环和与氨基相连的碳链上CH2碳原子个数为0-6；甲基的取代方式有多种，其差别为H、D及13C原子的个数。
3.权利要求1所述的一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：以含有氨基、苯环及羧基的对氨基苯乙酸的同系物为原料A’，从原料A’出发，以H或D取代的氰基硼氢化钠NaBH3CN为催化剂，使用H、D或13C取代的甲醛CH2O对原料中的氨基进行二甲基化反应；
将对氨基苯甲酸的同系物分散到纯水中，再加入甲醛溶液，对氨基苯乙酸的同系物与甲醛的摩尔比为1:3-1:6，震荡，使其充分混匀；在体系中加入氰基硼氢化钠，对氨基苯乙酸与其摩尔比为1:1.2-1:1.6，震荡，使其充分混匀，反应0.5-1.5h；
第二步：旋转蒸发干燥后得到产物A1，产物A1溶解于溶剂中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N,N-二环己基碳二亚胺DCC，对产物A1中的羧基进行活化，在40-60℃条件下，搅拌反应15-22h后得到目标最终产物；所述的产物A1、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.1-2.5:2.2-4。
4.根据权利要求3所述的一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂的合成方法，其特征在于，所述的第二步中的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求3或4所述的一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂的合成方法，其特征在于，所述的第二步中搅拌转速为800-1000rpm。
6.权利要求2所述的一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：以4-(2-氨基乙基)苯甲酸的同系物为原料B’，从原料B’出发，以H或D取代的氰基硼氢化钠NaBH3CN为催化剂，使用H、D或13C取代的甲醛CH2O对原料中的氨基进行二甲基化反应；
将原料B’分散到纯水中，再加入甲醛溶液，甲醛与4-(2-氨基乙基)苯甲酸的同系物的摩尔比为1:3-1:6，震荡，使其充分混匀；在体系中加入氰基硼氢化钠，对氨基苯乙酸与其摩尔比为1:1.2-1:1.8，震荡，使其充分混匀，反应时间为0.5-1.5h；
第二步：旋转蒸发干燥后得到产物B1，产物B1溶解于溶剂中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N,N-二环己基碳二亚胺DCC，对产物B1中的羧基进行活化，在45-65℃条件下，搅拌反应24-36h后得到目标最终产物；所述的产物B1、NHS、DCC三者的摩尔比为1:1.5-2.5:4-6。
7.根据权利要求6所述的一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂的合成方法，其特征在于，所述的第二步中的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
8.根据权利要求6或7所述的一组用于标记氨基/酚羟基的同位素衍生化试剂的合成方法，其特征在于，所述的第二步中搅拌转速为800-1000rpm。
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