JPH0762019B2 - アミノメチルフルオレセイン誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は例えば血清、血漿、髄
液、羊水及び尿の様な生物流体中の配位子の測定のため
の方法に用いる試薬の製造に使用する中間体に関する。
本発明は螢光分極免疫評価分析で試薬として使用出来る
新規な種類のアミノメチルフルオレセイン誘導体に関す
る。

【０００２】

【従来の技術とその課題】配位子（リガンド）測定を目
的とする競争結合免疫評価分析は、配位子とトレーサー
と名付けた標識付き試薬に対して特異性を持った抗体上
の限られた数の受容体結合サイトに対する、試験試料の
配位子とトレーサーとの間の競争（配合）に基づいてい
る。試料の配位子濃度が抗体と特異的に結合するトレー
サーの量をきめている。生成したトレーサー−抗体配合
体（ｃｏｒｊｕｇａｔｅ）は定量的に測定出来、その量
は試験試料中の配位子の量に逆に関係する。螢光分極技
術は螢光標識を付された化合物が直線偏光（平面偏光）
によって励起させられた時、その回転速度に逆比例する
偏光度を持つ螢光を発するという原理に基づいている。
従って、螢光標識を有するトレーサー−抗体配合体の様
な分子が直線偏光によって励起された時は、光が吸収さ
れ放出される時間の間は螢光（原子）団が回転をさまた
げられているので放出される光は高度に偏光（分極）し
たままである。“遊離の”（即ち、抗体と結合していな
い）トレーサー化合物が直線偏光によって励起された時
は、その回転が対応するトレーサー−抗体配合体よりも
極めて早く且つ分子がより不規則に配置しているので、
従って放出された光は偏光が解消している。従って、螢
光偏光（分極）は競争結合免疫評価分析で生成したトレ
ーサー一抗体配合体の量を測定する定量的手段を提供す
る。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明は式（ＩＩ）、化
２

【０００４】

【化２】

【０００５】但し、ｎは０又は１であり、且つＲ_３は水
素、アミノ又はカルボニルである；の化合物及びその酸
塩に関する。

【０００６】本発明はまた式（Ｉ）、化３

【０００７】

【化３】

【０００８】但し、Ｒ_１、化４、は

【０００９】

【化４】

【００１０】基であり、（同式中のＲ’は水素又はＲ”
で示される基であり、Ｒ”は配位子類似体であり、その
実質的割合が配位子と同一の空間及び極性の構成を有
し、受容体の結合サイトに対して該配位子と競争し得る
一種以上の決定基又はエピトープサイトを有する一価ま
たは多価の基である；Ｒ_２は水素又はＲ_１で示される基
であり；及びＲ_３は水素、アミノ又はカルボニルであ
る；の新規な種類のフルオレセイン誘導体及び生物学上
許容し得るその塩に関する。

【００１１】本発明による化合物は螢光偏光（分極）免
疫評価分析の試薬として有用である。

【００１２】本明細書で使用する用語“配位子”（ｌｉ
ｇａｒｄ）はそれに対して結合した蛋白質−通常は抗体
−を得ること又は形成させることの出来る特に低分子量
のハプテンを指すものとする。ハプテンは動物中に注射
した時に抗体形成を誘発しないが、抗体とは反応する一
般に低分子量の蛋白質の無い化合物である。先ずハプテ
ンを蛋白質と配合させ且つ配合生成物を動物に注射する
とハプテンに対する抗体が一般に出来る。得られた抗体
は従来の抗体分離技術で分離される。

【００１３】本発明による方法で測定可能な配位子は非
常に広汎な分子量の範囲にわたっている。高分子量配位
子も測定可能であるが、最良の結果を得るには、本発明
の方法を一般に５０から４０００の範囲の低分子量の配
位子の測定に使用するのが一般に好ましい。１００乃至
２０００の範囲の分子量を持つ配位子の測定がより好ま
しい。

【００１４】本発明による方法に依って測定出来る配位
子の代表例には、例えばエストリオール、エストロン、
エストラジオール、コルチゾール、テストステロン、プ
ロゲステロン、ケノデオキシコール酸、ジゴキシン、コ
ール酸、ジキトキシン、デオキシコール酸、リトコール
酸及びそれらのエステル及びアミド誘導体の様なステロ
イド；例えばＢ−１２、葉酸、チロキシン、トリヨード
チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、ＰＧＥ、ＰＧ
Ｆ、ＰＧＡの様なプロスタグランジンの様なビタミン；
テオフイリンの様な抗喘息薬；ドキソルビシン及びメト
トレキセートの様な抗新生物薬；デイソピラミド、リド
カイン、プロカインアミド、プロプラノロール、キニジ
ン、Ｎ−アセチルプロカインアミドの様な抗不整脈薬；
フエノバビタール、フエニトン、プリミドン、バルプロ
酸、カルバマゼピン及びエトサクシミドの様な抗ケイレ
ン薬；ペニシリン、セフアロスポリン、エリスロマイシ
ン、バンコマイシン、ゲンタミシン、アミカシン、クロ
ラムフエニコール、ストレプトマイシン、及びトブラマ
イシンの様な抗生物質；サルチル酸塩（サリチラート）
の様な抗関節炎症薬；ノルトリプチリン、アミトリプチ
リン、イミプラミン及びデシプラミンを含む三環式化合
物の様な抗制うつ薬；及びそれらの代謝産物と共に類似
物がある。更に、モルフイン、ヘロイン、ヒドロモルホ
ン、オキシモルホン、メタポン（ｍｅｔａｐｏｎ）コデ
イン、ヒドロユドン、ジヒドロコデイン、ジヒドロヒド
ロキシコデイノン、ホロコジン（Ｐｈｏｌｏｃｏｄｉｎ
ｅ）、デキストロメトルフアン、フエナゾシン及びデオ
ニン及びそれらの代謝産物の様な悪用された薬も本発明
の方法によって測定出来る。

【００１５】本明細書中で使用する用語「配位子類似体
（ｌｉｇａｎｄ−ａｎａｌｏｇ）」は、その実質的割合
が配位子（リガンド）と同一の空間及び極性の構成を有
し、受容体の結合サイトに対して該配位子と競争し得る
一種以上の決定基（デターミナント）又はエピトープサ
イトを有する一価または多価の基である。そのような配
位子類似体の特徴は、この類似体が抗体によって配位子
として認識されるように、対象の配位子と構造上十分な
類似性を持つことにある。多くは、この配位子類似体
は、その分子表面の主要部分について対象の配位子と同
一かまたは実質的に同一の構造及び荷電分布（空間及び
極性の構成）を有すであろう。しばしばハプテンについ
ての結合サイトが配位子との結合に使用されるものと抗
体の生産のために抗原を準備するのと同一なので、抗体
に対して鋳型（テンプレート）の役割を果す配位子類似
体の同一の部分がトレーサー中の配位子類似体にさらさ
れるであろう。

【００１６】配位子類似体は式（ＩＩ）、化５

【００１７】

【化５】

【００１８】（但しｎは０又は１である）のアミノメチ
ルフルオレセイン誘導体との配合に適した官能性又は官
能性にした配位子として記述されるであろう。

【００１９】好ましい官能基の代表としては、例えば、
活性化された酸、即ち活性エステル、酸クロライド、及
びアミド；イソシアネート、イソチオシアネート、及び
置換ハロアルキル誘導体が包含される。

【００２０】本発明によるトレーサーは一般にそのプロ
トン化された状態とイオン化された状態の間の平衡（状
態）で存在しており、本発明の方法で有効なのはイオン
化された状態である。従って本発明はプロトン化された
状態か又はイオン化された状態のトレーサーより成り、
且つ便宜上、本発明のトレーサーを構造的に本明細書中
ではプロトン化された状態で代表させておく。本発明の
トレーサーがイオン化された状態で存在する時は、トレ
ーサーが生物学上許容し得る塩の形態で存在する。本明
細書中で使用されている如く、“生物学上許容し得る
塩”とは、本発明の方法で使用された時にトレーサーが
イオン化された状態で存在する、例えばナトリウム、カ
リウム、アンモニウム及び類似物の様な塩を指す。一般
に本発明のトレーサーが溶液中で塩として存在する時
は、緩衝液を用いた時、即ち燐酸ナトリウム緩衝液の共
存下で得られる特定の塩として存在する時は、本発明の
トレーサーは一般にそのナトリウム塩としてイオン化さ
れた状態で存在するであろう。

【００２１】本発明によるトレーサーは以下の方法に従
って調製出来る。

【００２２】フルオレセインを硫酸の存在下でクロロア
セトアミドメタノールで処理すると式（ＩＩＩ）、化６
のクロロアセトアミド誘導体が得られる。

【００２３】

【化６】

【００２４】このクロロアセトアミド誘導体を酸及びエ
タノールの共存下で加水分解して式（ＩＶ）、化７；

【００２５】

【化７】

【００２６】（但しＡは、例えば、一例として、塩化水
素、トリフルオロアセテート、アセテート、トリクロロ
アセテート及び類似物の様な３より小なｐＨを持つ酸塩
である）のアミノメチルフルオレセイン誘導体の酸塩が
得られる。

【００２７】式（ＩＶ）のアミノメチルフルオレセイン
誘導体を式（Ｖ）； Ｒ”−Ｙ （Ｖ） （但しＹは活性化されたエステル基である）の配位子類
似体の活性化されたエステルで適当な溶媒中で処理する
と式（ＶＩ）、化８；

【００２８】

【化８】

【００２９】の化合物が得られる。

【００３０】本発明のトレーサーの調製反応を進行させ
る反応温度は臨界的ではない。温度は反応を開始させ且
つ維持するのに充分なものであるべきである。通常は便
宜上及び経済性から、室温で充分である。本発明のトレ
ーサーの調製では反応物の比率は狭い範囲に限定される
ものではない。

【００３１】取扱い及び生成物回収の容易さのために、
本発明のトレーサーの調製プロセスは不活性溶媒の存在
で実施する。好適な不活性溶媒には、実質上出発物質と
反応せず且つ充分に出発物質を溶解する溶媒であって、
例えばクロロホルム、ピリジン及び類似物が包含され
る。最高の生成物収率を得るために、反応を好ましくは
中性又は塩基性条件で進める。好適な塩基には、例えば
トリエチルアミン、ピリジン、及び類似物が包含され
る。反応生成物は、本発明の方法に利用する前に、一般
に薄層又はカラム・クロマトグラフィーを用いて精製す
る。

【００３２】本発明の方法によれば、測定すべき配位子
を含んだ試料を式（ＶＩ）のトレーサーの生物学上許容
し得る塩及び配位子及びトレーサーに対して特異性のあ
る抗体と混合する。試料中の配位子とトレーサーが限ら
れた抗体のサイトに向って競争し、その結果、配位子−
抗体複合体及びトレーサー−抗体複合体が形成される。
トレーサー及び抗体の濃度を一定にしておけば、生成し
た配位子−抗体複合体のトレーサー−抗体複合体に対す
る比は試料中に存在する配位子の量に直接比例する。従
って、螢光灯によって混合物を励起させ且つトレーサー
及びトレーサー−抗体複合体から放出される螢光の偏光
（分極）を測定すれば、試料中の配位子の量を定量的に
定めることが出来る。

【００３３】理論上は、抗体と複合体形成していないト
レーサーの螢光分極は低く、ゼロに近い。特定の抗体と
の複合体形成に依り、かくして形成されたトレーサー−
抗体複合体では、比較的小さなトレーサー分子よりも抗
体分子の回転がゆっくりしていると考えられ、測定され
る偏光（分極）が増える。従って、抗体のサイトをトレ
ーサーと配位子とを競争させた時は、トレーサー抗体複
合体の実測される螢光偏光分極はトレーサーとトレーサ
ー−抗体のものの間の値となる。試料が高濃度の配位子
を含有している時は、実測した（偏光）分極値は遊離の
配位子のそれ、即ち低い値に近くなっている。試験試料
が低濃度の配位子を含む時は、分極値は結合した配位子
のそれ、即ち高い値に近くなる。免疫評価分析の反応混
合物を垂直及び水平偏光した光で逐次的に励起し且つ放
出される光の垂直成分だけを分析すれば、反応混合物の
螢光の（偏光）分極を正確に求めることが出来る。測定
すべき配位子の（偏光）分極と濃度との厳密な関係は既
知濃度のキャリビレーターを測定して定める。配位子の
濃度はこの方法で作成した標準カーブから外挿出来る。

【００３４】本発明の方法を実施するｐＨは、式（Ｖ
Ｉ）のトレーサーがそのイオン化された状態で存在する
のに充分なものでなければならぬ。ｐＨは約３乃至１
２、より通常は５乃至１０の範囲、最も好ましくは約６
乃至８の範囲とすることが出来る。評価分析実施の間、
所定のｐＨにして維持するために様々の緩衝液が使用可
能である。代表的な緩衝液には硼酸塩、燐酸塩、炭酸
塩、トリス、バルビタール及び類似物がある。使用され
る特定の緩衝液が本発明にとって決定的なのではなく、
それぞれの評価分析に於いて使用される抗体及び測定す
べき配位子についてみると特定の緩衝液が好ましいこと
となろう。緩衝液のカチオン部分は溶液中のトレーサー
塩のカチオン部分によって一般にはきまるであろう。

【００３５】本発明の方法は温和な温度で且つ好ましく
は恒温で実施される。温度は通常は約０°乃至５０℃、
より普通には約１５°乃至４０℃の範囲であろう。

【００３６】評価分析可能な配位子濃度は一般に約１０
^−２乃至１０^−１３Ｍ、より普通は約１０^−４乃至１０
^−１０Ｍの範囲であろう。これより高い濃度の配位子は
原試料を稀釈して評価分析出来よう。対象とする配位子
の濃度範囲以外に、評価分析が定性的か、半定量的か、
定量的かのいずれであるかという様な判断、使用する装
置、及びトレーサー及び抗体の特徴が通常は使用するト
レーサー及び抗体の濃度をきめる因子となる。他の試
薬、即ちトレーサー及び抗体の濃度は評価分析の感度を
最適化するように通常はなっているので、個々の試薬の
濃度は実験的に定められるであろう。トレーサー及び抗
体の濃度は当業界の通常の技術を有する人によって容易
に定められる。

【００３７】

【実施例】以下の例示的な、非限定的な実施例は当業者
に本発明の範囲の特定のトレーサーが調製可能の方法を
更に詳しく示すためのものである。実施例１及び２はフ
ルオレセインアミノメチル誘導体の合成法を示し、そし
て実施例３〜７はさらなる合成による該誘導体からのト
レーサーの製法を示す。実施例８〜１０は螢光偏光免疫
分析法における該トレーサーの作用効果を立証するため
のデータを示す。

【００３８】実施例１ ２５ｍｌの濃硫酸中の５ｇ（１５．１ｍＭｏｌ）のフル
オレセインに、定常攪拌しつつ、１．８８ｇ（１４．６
ｍＭｏｌ）のクロロアセテイミドメタノールを加えた。
１６時間後に得られた混合物を５００ｍｌの水に注い
だ。生成した沈澱を濾過により捕集した。沈澱をメタノ
ール：塩化メチレンの１：１混合物に溶解させた。得ら
れた混合物に無水の硫酸マグネシウムを加え且つ粗生成
物を、１０％メタノール／１０％ベンゼン／８０％塩化
メチレンの混合物を溶離剤として用いたクロマトグラフ
ィーで更に精製し４．２ｇ（６４％収率）の次式のフル
オレセインのクロロアセトアミド誘導体化合物１、化
９、を得た。

【００３９】

【化９】

【００４０】実施例２ 実施例１で調製したクロロアセテイミイドフルオレセイ
ン誘導体に９５％エタノール２０ｍｌ及び３ｍ１の濃塩
酸を加えた。得られた混合物を一晩環流し、反応完了
後、得られた混合物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成
物を溶離剤に塩化メチレン：メタノール（７：３）の７
対３混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーを用
いて精製し、次式の４−アミノメチルフルオレセイン誘
導体化合物２、化１０、の２ｇ（７３％収率）を得た。

【００４１】

【化１０】

【００４２】実施例３ テトラヒドロフランに溶解した１００ｍｇ（０．４ｍＭ
ｏｌ）の８−カルボキシメチルテオフイリンに、８５ｍ
ｇ（０．５２ｍＭｏｌ）のカルボニルジイミジゾールを
加えた。反応を１５分間進行させた時、１５１ｍｇ
（０．３８ｍＭｏｌ）の実施例２で調製した４−アミノ
メチルフルオレセイン誘導体を２ｍｌのジメチルホルム
アミドに溶かして反応混合物に加えた。反応を完結させ
た後、真空下で溶媒を除去し粗生成物を得て、これを塩
化メチレン中の１５％のメタノール混合物を用いる予備
薄層クロマトグラフィーを用いて精製し、次式のテオフ
イリンアミノメチルフルオレセイン誘導体化合物３、化
１１、１２０ｍｇ（５４％収率）を得た。

【００４３】

【化１１】

【００４４】実施例４ ２ｍｌのテトラヒドロフラン中の６１ｍｇ（０．１４ｍ
Ｍｏｌ）のコルチゾール−３−カルボキシメチルオキシ
ムに１６ｍｇ（０．１４ｍＭｏｌ）のＮ−ヒドロキシス
クシンイミド及び３６ｍｇ（０．１７ｍＭｏｌ）のジシ
クロヘキシルカルボジイミドを加えた。反応を３時間進
行させて後、反応混合物を濾過し、濾液をテトラヒドロ
フラン：メタノールの８：２混合物５ｍｌ中の実施例２
で調製した５０ｍｇ（０．１２ｍＭｏｌ）の４−アミノ
メチルフルオレセイン誘導体に加えた。得られた混合物
を一晩攪拌し、ついで濃縮して粗生成物を得た。これを
塩化メチレン：メタノールの９：１混合物を用いる予備
薄層クロマトグラフィーによって精製し、次式のコルチ
ゾール−アミノメチルフルオレセイン誘導体化合物４、
化１２、２５ｍｇ（２５％収率）を得た。

【００４５】

【化１２】

【００４６】実施例５ ２ｍｌのジメチルホルムアミド及び１０ｍｇ（０．９９
ｍＭｏｌ）のトリエチルアミン中に実施例２と同様に調
製した３９．４ｍｇ（０．９９ｍＭｏｌ）の４−アミノ
メチルフルオレセイン誘導体を含む溶液に、１００ｍｇ
（０．１１ｍＭｏｌ）のＮ−アセチルチロキシンのＮ−
ヒドロキシスクシイミド活性エステルを加えた。反応完
了後、エーテル：へキサンの２：１混合物２５ｍｌを反
応混合物に加え、粗生成物を沈澱させた。粗生成物を塩
化メチレン：メタノール：ベンゼンの８：１：１混合物
を使用する予備薄層クロマトグラフィーを用いて精製
し、次式のチロキシン−アミノメチルフルオレセイン誘
導体化合物５、化１３、５０ｍｇ（４３％収率）を得
た。

【００４７】

【化１３】

【００４８】実施例６ テトラヒドロフラン：ジメチルホルムアミドの９：１混
合物の５０ｍｌ中に、実施例２と同様に調製した５０ｍ
ｇ（０．１２ｍＭｏｌ）の４−アミノメチルフルオレセ
イン誘導体を含む混合物に、４１．４ｍｇ（０．１３ｍ
Ｍｏｌ）の５−（２−クロロホルミルエチル）−５−フ
ェニルバルヒツル酸を加えた。反応混合物を一晩攪拌
し、次に真空下で濃縮し生成物を得た。この生成物をメ
タノールの塩化メチレン中の５％混合物中で予備薄層ク
ロマトグラフィーによって精製し、次式のフェニルバル
ビタールアミノメチルフルオレセイン誘導体化合物６、
化１４、１０ｍｇ（１２％収率）を得た。

【００４９】

【化１４】

【００５０】実施例７ １ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した４０ｍｇ（０．
１１ｍＭｏｌ）のエストリオールー６−カルボキシメチ
ルオキシムに１６ｍｇ（０．１４ｍＭｏｌ）のＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド及び２９ｍｇ（０．１４ｍＭｏ
ｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。反応
混合物を室温で５時間攪拌し、エストリオールの活性エ
ステルを生成させ且つジシクロヘキシル尿素を濾過に依
り除去した。かく生成したエストリオールの活性エステ
ルをテトラヒドロフラン：メタノールの９：１混合物５
ｍｌ中に実施例２で調製した４２ｍｇ（０．１１ｍＭｏ
ｌ）の４−アミノメチルフルオレセイン誘導体を含む混
合物に加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、真空下
で溶媒を除去して粗生成物を得た。この粗生成物を溶媒
として塩化メチレン：メタノールの９：１混合物を用い
て予備薄層クロマトグラフィーを用いて精製し、次式の
エストリオールーアミノメチルフルオレセイン誘導体化
合物７、化１５、３１ｍｇ（４１％収率）を得た。

【００５１】

【化１５】

【００５２】先述の如く、本発明のトレーサーは螢光偏
光（分極）免疫評価分析で使用する有効な試薬である。
以下の実施例は螢光偏光（分極）技術を利用した免疫評
価分析での本発明のトレーサーの適合性を例示するもの
である。かかる評価分析は次の一般的方法に従って実施
される。 １）標準又は試験血清の計量した容積を試験管に入れ、
緩衝液で稀釈する； ２）任意的に界面活性剤をも含む本発明の既知濃度のト
レーサーを次に各試験管に加える； ３）既知濃度の抗血清を試験管に加える； ４）反応混合物を室温で恒温放置し；且つ ５）抗体に結合したトレーサーの量を試料中の配位子の
尺度として、螢光偏光（分極）法によって測定する。

【００５３】実施例８エストリオール評価分析 Ａ．必要な用器等； １．牛のガンマーグロプリン０．０１％及びナトリウム
アジド０．０１％を含む０．１Ｍ燐酸ナトリウムより成
り、ｐＨ７．３５のＢＧＧ緩衝液。 ２．実施例７で調製したエストリオールカルボキシメチ
ルオキシムアミノメチルフルオレセインより成る、ＢＧ
Ｇ緩衝液中大約６０ｎＭの濃度のトレーサー。 ３．エストリオールに対して高められ、ＢＧＧ緩衝液で
適切に稀釈されている抗血清。 ４．９Ｍのカリウムチオシアネートより成る前処理溶
液。 ５．人の血清又はエストリオールを含んだその他の生物
流体試料。 ６．キュベット（分光セル）として使用される１０×７
５ｍｍのガラス培養管のキュベット。 ７．±０．００１単位の精度で螢光偏光（分極）を測定
可能な螢光計。

【００５４】Ｂ．評価分析方法 １．小容積の試料（２１．６μｌ）を、２５μｌの抗体
溶液及び２５μｌの前処理溶液と共に予備稀釈容器中に
ピュペットで計量して入れた。最終容積が大約５００μ
ｌとなる様にＢＧＧ緩衝液で調節した。 ２．予備稀釈容器中の上記の混合物１７５μｌをキュベ
ットに加え、ＢＧＧ緩衝液を用いて最終容積を０．９９
ｍｌとした。 ３．内容物を良く混合した。３分後、バックグランド測
定を実施した。 ４．２５μｌのトレーサーと共に、追加の予備稀釈混合
物１７５μｌを評価分析キュベットに加え、ＢＧＧ緩衝
液でその容積を０．９９ｍｌとした。（キュベット中の
全容積は大約２．０ｍｌであった。） ５．容積増加と共に内容物を良く混合し、且つ７分間定
温放置した。 ６．適切な装置（螢光計）を用いて螢光偏光（分極）値
を測った。 ７．すべての定温放置は３５℃で実施した。 Ｃ．０から５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でエストリオール
を含んでいる一連の血清標準品の結果は次のとおりであ
る。

【００５５】 エストリオール濃度（ｎｇ／ｍｌ） 分 極 ０ ．３１０ ２ ．３０４ ５ ．２９９ １５ ．２８１ ３０ ．２５０ ５０ ．２１８

【００５６】螢光の分極はエストリオール濃度が増加す
るにつれて、規則的に減少してゆき、標準カープを描く
ことが出来るように見える。同一の方法で処理を行った
未知試料は標準カープを参照して定量測定出来る。

【００５７】上記の方法を用いて、５５の未知試料を評
価分析し、その結果をアマーシャム・アマレックス（登
録商標）−エストリオール（未配合）エストロール Ｒ
ｌＡ−キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｍｅｒｌｅｘ
^▲Ｒ▼−Ｅｓｔｒｉｏｌ（ｕｎｃｏｎｊｕａｔｅｄ）Ｅ
ｓｔｒｏｌ ＲｌＡ−ｋｉｔ）を用いる放射化免疫評価
分析法と相関させた。相関係数は０．８５７であった。

【００５８】ある種の試料ではバックグランド値を減少
させるために、有機溶剤抽出を用いることが出来る。試
料及び２倍容積の適当な有機溶剤を激しく攪拌する。有
機溶剤の一部を除去し、蒸発乾固して再懸濁させる。適
当な有機溶剤は酢酸エチルである。ＢＧＧ緩衝液を抽出
したエストリオールの再懸濁に用いる。抽出後、再懸濁
させた物質を上述の如く評価分析する。

【００５９】実施例９コルチゾール評価分析 Ａ．必要な用器等； １．牛のガンマーグロプリン０．０１％及びナトリウム
アジド０．０１％を含む０．１Ｍ燐酸ナトリウムより成
り、ｐＨ７．５のＢＧＧ緩衝液。 ２．実施例４で調製したコルチゾールー３−カルボキシ
メチルオキシム−アミノメチルフルオレセインより成
る、ＢＧＧ緩衝液中大約８０ｎＭの濃度のトレーサー。 ３．エストリオールに対して高められ、ＢＧＧ緩衝液で
適切に稀釈されている抗血清。 ４．水に０．５％のリチウムドデシルサルフェートを含
む試料前処理溶液。 ５．人の血清又はコルチゾールを含んだその他の生物流
体試料。 ６．キュベット（分光セル）として使用される１０×７
５ｍｍのガラス培養管のキュベット。 ７．±０．００１単位の精度で螢光偏光（分極）を測定
可能な螢光計。

【００６０】Ｂ．評価分析方法 １．２５μｌの試料及び１００μｌのＢＧＧ緩衝液を稀
釈容器中にピュペットで計量することに依ってキュベッ
ト中に小容積の試料を分散させた。次に２５μｌの稀釈
した上記試料をキュベットに、次に２５μｌの試料前処
理溶液及び９５０μｌのＢＧＧ緩衝液をキュベットにピ
ペットで秤量して入れ、バックグランド螢光強度を次に
螢光計で読み取った。 ２．それぞれ２５μｌのトレーサー及び抗体、及び９７
５μｌのＢＧＧ緩衝液と共に更に２５μｌの稀釈試料を
キュベットに加えた。内容物を完全に混合し室温で１５
分間定温放置した。キュベット中の試料は原試料の１０
μｌに相当するものであった。 ３．（バックグランドを適切に差引いた）螢光偏光（分
極）を螢光計で読み取り、未知試料の濃度決定のための
標準カーブを作成した。

【００６１】Ｃ．０から６０μｇ／ｄｌの間のコルチゾ
ール濃度の一連の標準試料の結果を次に示す。それぞれ
の濃度では２回評価分析して平約してある。

【００６２】 コルチゾール濃度（μｇ／ｄｌ） 分 極 ０ ．１７９ ２．０ ．１７０ ５．０ ．１５４ １０．０ ．１３５ ２５．０ ．１０５ ６０・０ ．０７０

【００６３】螢光の分極はコルチゾール濃度が増加する
につれて、規則的に減少してゆき、標準カーブを描くこ
とが出来るように見える。同一の方法で処理した未知試
料は標準カーブを参照して定量測定出来る。１１人の患
者の血清を上記の方法を用いて分析し、得られた結果を
カルダレラ等（Ｃａｌｄａｒｅｌｌａ，ｅｔ．ａｌ．）
のＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２８巻第３号５３８頁（１９８
２年）のＨＰＬＰ参照法と相関させた。相関係数は０．
９９５であった。

【００６４】上述の結果から明らかな如く、本発明のト
レーサーは螢光分極免疫評価分析に於ける有効な試薬で
ある。上述の方法の特徴の外に、本発明のトレーサーは
高度の熱安定性、高度の結合分極、高い量子収率を有
し、且つ比較的に容易に調製、精製出来る。

【００６５】螢光分極免疫評価分析に於ける試料として
有用である外に、本発明のチロキシンアミノメチルフル
オレセイン誘導体は、次の実施例の方法によって、不飽
和チロキシンと結合する蛋白質サイト（“Ｔ摂取”）を
測定する螢光分極評価分析に於けるトレーサーとして利
用出来る。

【００６６】実施例１０ Ａ．試 薬 １．前処理溶液−０．１Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．２５）に０．１５％のナトリウムドデシルサルフ
ェート、０．５６４Ｍのトリエチレンジアミン（ＤＡＢ
ＣＯ）、及び０．１％のナトリウムアジドを含む溶液。 ２．Ｔ_４−フルオレセイン・トレーサー−実施例５で調
製した化合物５より成り、０．１Ｍの燐酸ナトリウム緩
衝液中に０．００５％のナトリウムドデシルサルフェー
ト、０．１％の牛のガンマーグロブリン、及び０．１％
のナトリウムアジドを含む緩衝媒体中で２．４×１０
^−７Ｍの濃度で使用する。 ３．Ｔ摂取キャリヒレーター−０、０．５、１．０、
１．５、２．０、及び２．５の摂取値を有する（４％の
人の血清マトリックス中の）羊のアンチ−Ｔ抗血清。
１．０の摂取値は通常の血清のＴ摂取に相当する。 ４．稀釈緩衝液：０．１％の牛のガンマーグロブリン及
び０．１％のナトリウムアジドを含む０．１Ｍの燐酸ナ
トリウム。 分極した螢光の測定はすべて分極分光螢光計〔｛アボッ
ト（Ａｂｂｏｔｔ）の登録商標｝フルオレセンス・ポー
ラリゼーション・アナライザー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅ
ｒ）。

【００６７】Ｂ．評価分析プロトコール １．未知試料の１μｌを２５μｌの前処理溶液に加え、
得られた混合物を稀釈緩衝液で１ｍｌに稀釈した。得ら
れた評価分析溶液を混合し、分極螢光バックグランドを
測定する。 ２．工程１の評価分析溶液に、未知試料の次の１μｌ、
２５μｌの前処理溶液、２５μｌのＴ_４フルオレセイン
・トレーサー、及び緩衝液を加え２ｍｌの容積にする。
得られた溶液を混合し、分極螢光を測定する。 ３．トレーサーの結合に依る螢光分極は、混合物の最終
分極螢光強度からバックグランドの分極螢光強度を差引
いて求める。 ４．得られた分極値は各試料のＴ摂取に比例している。 ５．公知のＴ摂取値のキャリビレーターを用いて作成し
た標準カーブと比較して、試料の螢光分析からＴ摂取値
を求める。

【００６８】この発明は特定の改良に関して記述して来
てあるが、その詳細は限定的なものとして解釈すべきで
はない。何故ならば、様々の等価物、変更、改良が本発
明の精神及び範囲から外れることなく存在することは明
白であり、かかる等価の態様は本発明の中に含まれるも
のと理解されたい。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（ＩＩ）、化１ 【化１】 但し、ｎは０又は１であり、且つＲ_３は水素、アミノ又
   はカルボニルである；の化合物及びその酸塩。
2. 【請求項２】 ｎが０である請求項１記載の化合物。