JPH0296567A - アクリジニウムエステルおよびリポソームを用いる分析物検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は液体試料中の分析物を検出する新規な方法に関
するものである。より詳細には、本発明はリポソーム（
ルミソーム）の壁内に封入されたアクリジニウムエステ
ルを用いて液体試料中の分析物を検出する方法に関する
ものである。本発明はまた、リポソーム小胞内に封入さ
れ、その小胞からエステルが著しくは漏れない、化学ル
ミネッセンスマーカーとして有用な新規のアクリジニウ
ムエステルにも関係する。

（従来の技術） 非同位体イムノアッセイのためのマーカー分子の担体と
してリポソームを使用することは知られている。たとえ
ば米国特許第４．７０４，３５５号、第４゜８９５．５
５４号、第４，８５６．１２９号、第４．１９３，９８
３号を参照せよ。イムノアッセイにリポソームを使用す
る重要な利点は、リポソームが、リポソーム小胞あたり
非常に多数のマーカー分子を担うことができ、それによ
って増幅したシグナルをイムノアッセイに提供すること
ができることである。たとえば酵素のような巨大分子マ
ーカー或いはたとえば蛍光または吸収色素、スピンラベ
ル、金属キレート化剤、酵素活性化剤または一阻害剤な
どの小さい有機マーカー分子を封入したリポソームを用
いるイムノアッセイが報告された。たとえばクリツカ（
Ｃｒｉｃｋａ、Ｌ、）およびカーター（Ｃａｒｔｅｒ、
Ｔ、）著“臨床および生化学的ルミネッセンス（Ｃ１１
ｎｉｃａｌａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｕｍ１
ｎｃｓｃｃｎｅｃ）″、　１５３−１７８ページ（マル
セル　デツカ−社、ニューヨークおよびバーゼル、　１
９８２）参照。

（発明が解決しようとする課′ＸＪ） 本発明以前には、化学ルミネッセンスマーカーたとえば
＾ｎｎ、ｃｌＩｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２５巻２７ペー
ジ（１９８８）。

Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ　、　３１巻、６６４ページ（１９
８５）、欧州特許出願第Ｅ　Ｐ　８２，８３６号および
米国特許第４．７４５，１８１号に記載のアクリジニウ
ムエステルは、それを抗原または抗体のような生物学的
分子に直接結合させることによってイムノアッセイの標
識として使用されたに過ぎない。先行技術のアクリジニ
ウムエステルおよびその他の化学ルミネッセンス化合物
の親油性は、それらをリポソーム内に封入することを困
難にしている。それは、それらがリポソーム壁から速か
に漏れるためである。その上、先行技術のアクリジニウ
ムエステルおよびその他の化学ルミネッセンス化合物の
水溶性は限られているため、リポソーム小胞あたりわず
かのマーカー分子しか封入できず、そのためシグナル増
幅は比較的小さい。

よって、本発明の目的は、アクリジニウムエステルを用
いる新規の分析物検出法を提供することである。リポソ
ーム内に封入して、化学ルミネッセンスマーカーとして
使用できる新規の親水性アクリジニウムエステルを提供
することも本発明の目的である。

（課題を解決するための手段および発明の詳細な説明） 明細書本文および特許請求の範囲に用いられる次の用語
は、次に述べるような意味を有する。

分析物−七ノマーまたはポリエピトープ、抗原。

またはハブテン性である配位子である、測定すべき化合
物または組成物。分析物はＤＮＡまたはＲＮＡの一片で
あってもよい。

抗原−を椎動物において、特に特異抗体の産生を伴って
、免疫反応を誘起し得る物質。

ハプテン−それ自体は免疫反応を誘起する能力をもたな
いが、その他の分子に適当に結合したときには、そのハ
ブテンを特異的に識別する抗体を産生じ得るようになる
不完全抗原。

エピトープ（抗原決定基）−成る抗体によって特異的に
識別される特異的化学的および立体的構造。

配位子−レセプターがもともと存在するか、レセプター
をそこにつぐり得る化合物。

配位子類似体−レセプターに関して類似の配位子と競合
し得る変形配位子；その変形によって、変形配位子が別
の分子と結合する手段が提供される。

レセプター−分子の特殊の立体および極性構造、すなわ
ち抗原決定基の部位を識別できる化合物。

レセプターの例は、抗体、酵素、抗体断片、たとえばＦ
ａｂ断片、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片、レクチン、補体成
分、コングルチン、リウマチ因子。

ホルモン、アビジン、ブドウ球菌蛋白質Ａなどである。

抗配位子−配位子のためのレセプター ＤＮＡブローブー一体鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリ
ダイズすることによって特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列
を識別するＤＮＡ片。

ＲＮＡブローブー一体鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリ
ダイズすることによって特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列
を識別するＲＮＡ片。

リポソーム−脂質、特に脂質混合物を水性懸濁液に分散
したときに得られる一枚膜または多重膜物体。壁または
膜は連続的脂質二重層から成る。

ルミソーム−封入アクリジニウムエステルを含んで成る
リポソーム。

本発明の方法に用いられるアクリジニウムエステルは、
リポソーム内に封入することができ、化学ルミネッセン
スシグナルを発することのできるアクリジニウムエステ
ルであればよい。好ましいアクリジニウムエステルは次
の構造式のアクリジニウムエステルである： でＲはＯないし２０のへテロ原子を含むアルキル。

アルケニル、アルキニル、アリルまたはアラルキルであ
る； Ｒ４およびＲ８は水素、アルキル、アルケニル。

アルキニル、アラルキルまたはアルコキシルである； Ｘはアニオン、好ましくはＣＨ３５ｏ、−０３０２Ｆ−
、ハライド、Ｏ８Ｏ□ＣＦ３−．０３Ｏ２ｃ、　Ｒ９−
＋　または ここでＲ１は０ないし２ｏのへテロ原子、好ましくは窒
素、酸素、燐または硫黄を含むアルキル、アルケニル、
アルキニル、アリルまたはアラルキルであり； Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は水素、アミノ、アルコキシル
、ヒドロキシル、−ＣＯ２，ハライド。

＝ｌ−ｏ、　　　ＣＮ、　　　ＳＯ３、ＮＨＣＲ，−Ｃ
Ｒ。

Ｒ６はニ ーＲ−ＩＬＩｌ、またはＱ　　ＲＩ＋−＋て、ここでＲ
は上記のように定義づけられ；Ｑは一〇−−３−、−Ｎ
Ｈ−、−Ｃ−，−５ｏ３．　　ジアゾ。

（Ｊ（Ｊ ｔｉｚ ■はイオン化可能基で；ｎは最低１である。

Ｒ，は、炭素原子１〜２４のアルキル、アルケニル、ア
ルキニル、アリルまたはアラルキルであるのが好ましい
・ ＲＺ、Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は、水素、アミノ。

−ＣＯ２，シアノ、ヒドロキシル、炭素原子１〜４のア
ルコキシル、ニトロ、ハライド、−５Ｏ３または−ＳＣ
Ｎであり； Ｒ４およびＲ８は好ましくは、水素、または炭素原子１
〜８のアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコ
キシル：Ｘはハライド；Ｒ６はＱ　　ＲＩ　（ＩＩ）　
　；　Ｑは一〇−−３−−ＮＨＮ　Ｈ−、−Ｎ　ＨＣ−
マタハ−ＣＮ　Ｈマｔニー　１．１−　Ｎ成る群から選
択されたベテロ原子０ないし２０箇を含む、炭素原子１
〜２４のアルキル　アルケニルアルキニル、アリルまた
はアラルキルである。

本発明の目的のためのイオン化可能基は、特異的ｐＨ範
囲内で正味の正−または負電荷を保有する官能基である
。好ましくは官能基はｐＨ２−１０の範囲内で、より一
層好ましくはＰＨ５−９の範囲内で正味の正−または負
電荷を保有する。■は、本発明のアクリジニウムエステ
ルのリポソーム内への封入に有害でないいかなるイオン
化可能基でもよい。■は好ましくは−ｓｏ３．−ｏｓｏ
３．−ｐ○３．−０ＰＯ３または−ＣＯ２で、ｎは好ま
しくは約１ないし約２０、より一層好ましくは約１０以
下である。

より好ましくは、Ｒ１が炭素原子１〜１０のアルキルで
、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ３，Ｒ７が水素、ニトロ。

−ＣＮ、ハライド、炭素原子１〜４のアルコキシル、ア
ミノまたは−Ｓ０３で；Ｒ４およびＲ８が炭素原子１〜
４のアルキルである。

最も好ましくは、Ｒ１，Ｒ，、Ｒ８がメチルで；Ｒ２，
Ｒ３，Ｒ，、Ｒ，が水素で；Ｘはプロミド；Ｒ６は−Ｑ
−Ｒ−１（。２．Ｑは−Ｃ−で、−ＲＩ　ｌ）はアミノ
メタンスルフォン酸、７−アミノ−１，３−ナツタレン
ジスルフォン酸、５−（３−スルフォブロピル）システ
ィン、２−アミノエチル酸性硫酸エステル、２−アミノ
エチルホスフォン酸、および２−アミノエチルジヒドロ
ゲンホスフェードから成る群から選択される。

本発明のアクリジニウムエステルにおいてＲ・５とＲ６
の位置は交換可能である。よって、本発明の好ましくは
アクリジニウムエステルは、次の構造式のアクリジニウ
ムエステルを含む：Ｒ。

ここで、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ１，Ｒ５，Ｒ６゜Ｒ，、
Ｒ８およびＸは上で定められたものである。

本発明の新規のアクリジニウムエステルは水によく溶け
、リポソームに高い濃度で封入される。

ひとたびリポソーム内に入ると、新規のアクリジニウム
エステルは長時間封入されたままで、目立つほどは漏れ
ない。

本発明の新規のアクリジニウムエステルは、リポソーム
と共に使用することに関して説明してきたが、本発明の
新規のアクリジニウムエステルはその他の用途、たとえ
ば配位子または分析物（例：抗原）を標識化する、配位
子または分析物の特異的結合パートナ−（例：対応する
抗体）を標識化する；または核酸および核酸を含む分子
を標識化するなどのためにアクリジニウムエステルを利
用する場合にも有用であることは当然である。

本発明に有用なルミソームは、単層リポソーム小胞か多
重層リポソーム小胞のいずれかを生産する種々の公知の
方法のいずれかによってつくられる。ルミソームは、本
発明に有用なアクリジニウムエステルを含む水性懸濁液
に脂質または脂質混合物を分散したときに得られる一枚
膜または多重膜体である。

ルミソームを生産する方法の例として、脂質を適当な有
機溶媒、たとえばクロロホルムに溶解し、適当な容器に
入れる。有機溶媒の蒸発によって、乾燥した脂質膜が容
器の内面に形成される。それから、ルミソーム内に捕捉
する予定のアクリジニウムエステルを含む水溶液をその
容器に入れて脂質膜と接触させる。その後烈しく撹拌す
るか超音波処理により脂質膜を水溶液中に分散させる。

本発明において有用なルミソームの生産に役立つ多数の
その他のリポソーム生成法があり、所望の用途のために
最も適した方法の選択は熟練者に任される。リポソーム
の好ましい製法は、ここに引例によって挿入される、１
９８６年１２月１０日提出の係属米国出願第９４０　、
５１９号に開示されている。

ルミソームは、当業者に公知の方法を用いて、配位子、
配位子類似体または抗配位子と共に誘導される。目的と
するルミソームの用途によって、配位子、配位子類似体
または抗配位子は、抗原。

ハブテン、抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アビジンまた
はその他のレセプターである。このように形成されたル
ミソームを、試料液中の分析物を検出するアッセイに、
イレーサーとして用いることができる。たとえば、競合
的アッセイを用いて抗原またはハブテンを′／Ｉ１１定
する場合、用いられる配位子または配位子類似体は分析
物かその類似体のいずれかである。

サンドイッチアッセイが用いられる場合は使用される配
位子、配位子類似体または抗配位子は、７＋１１１定（
Ｈｓｓａｙ）すべき分析物に特異的であるだろう。

たとえば、測定すべき分析物に反応してあらゆる抗体、
たとえばモノクローナル抗体を利用してルミソームを誘
導（ｄｅｒｉｖａｔｌｚｅ）することができる。

本発明のルミソームを用いてＤＮＡまたはＲＮＡプロー
ブを検出するアッセイの例は次のようである：　ＤＮＡ
またはＲＮＡプローブに、ハブテンまたはビオチニル化
変形ヌクレオチットのような配位子で標詭をつける。Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡプローブを一体鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ
とハイブリダイズさせ、固体支持体上に固定する。固定
されたプローブをそれから配位子のためのレセプターを
含むルミソームと反応させる。この場合の配位子はたと
えば抗体、或いは、プローブがビオチニル化されている
場合はアビジンである。ルミソームを破壊し、封入アク
リジニウムエステルによって発生するシグナルの量を測
定する。

別法として、標識のない場合の抗ノ＼イブリッド抗体の
ようなプローブ／一体鎖ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリッ
ドを識別し、それと結合するレセプターを用いることが
できる。

（実　施　例） 次に実施例を示して本発明を説明する。

実施例１ ２′　　６′−ジメチル−４′−ベンジルオキシカルボ
ニルフェニル　１０−メチル−アクリジニウム−９−カ
ルボキシレート　メトスルフェート（７，９，１３，４
ｍ　ｍｏｌｅ）　　（米国特許節４，７４５，１８１号
に記載されているように製造）と、１５０　ｍの氷酢酸
と、４８ｄの４８％臭化水素とを１００℃−１０５℃で
３時間加熱し、その後−晩室温に放置した。

４００威無水エチルエーテルをその混合物に加え、第二
の混合物を形成し、それをその後３日間冷蔵した。それ
から第二の混合物を濾過し、黄色結晶性残留物を得た。

その残留物を無水エチルエーテルで洗い、空気乾燥した
。

実施例２ ２’、６’　−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル
　１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレー
トプロミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ）２０１ｎｇ、　０．
０４３１１１ａｂａｔｅ）をジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）／ＣＨＣｌ３　（１：　１）２ｍＲに溶かした溶
液を氷水浴中で冷やし、トリエチルアミン（３１μｆｌ
　、　０．２１５ｍ　ｍｏｌｅ＞およびクロル蟻酸エチ
ル（６，１ｔｔｃ　Ｏ，Ｏｆ３５ｍ　ｌ！１ｏｌｅ）で
処理して反応混合物を形成する。３０分後、反応混合物
を蒸発させた。蒸発残渣に２　ｍ　Ｄ　Ｍ　Ｆを加えて
再刊酸化し、トリエチルアミン（３１μｊ！、　０．２
１５ｍ　ｍｏｌｅ）およびアミノメタンスルフォン酸（
９，５ｍ９．０．０８６ｍ　ｍｏｌｅ）で処理して第二
の反応混り物を形成する。第二の反応混合物を室温で一
晩撹拌し、蒸発させた。こうして形成された粗生成物を
分析用ＴＬＣプレート（シリカゲル８０．Ｆ２５４．　
　メルク社、ラスウェイ、Ｎ。

Ｊ、）上で精製し、クロロホルム／メタノール／水（［
ｉ５：２５：４）で展開した。プレート上に発現した黄
色バンド（Ｒｒ−０，３８）　　（これは長および短Ｕ
Ｖ光下でも検出できた）をプレートから剥がし、同じ溶
媒系で溶出した。生成した溶出液を蒸発し、蒸発残渣を
メタノールと共に摩砕して混合物を形成する。この混合
物を、シリンジ＜５ｙｒｊ　ｎｇｃ）フィルターホルダ
ー上にとりつけたポリカルボネート膜（直径１３ｍｍ、
孔の大きさ０．２　μＴｒＬ）　　（ヌクレオポア社、
プレザントン、ＣＡ）を通して一過した。

得られたＰ液を蒸発するとＤＭＡＥ−ＡＭＳが得られる
（１５ｍｇ、　　［ｉ２％）。

実施例３ 製法 ２′　　６′　−ジメチル−４′　−カルボキシルフェ
ニル１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレ
ートプロミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，１８７７１９゜０
．０３８ａ＋　ｍｏｌｅ　）を３．８　ｄジオキサン／
水（１：　１）混液に溶かした溶液を室温で１−（３−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
塩酸［３７４１ｇ、　０．１９３ｍ　ｒａｏｌｅ　、ア
ルドリッヒケミカル社（＾！ｄｒｌｃｈ　Ｃｈｅｍｙｃ
ａｌ　Ｃｏ、、ｌｎｃ、　）　、　　ミルウオーキー、
Ｗ！］で５分間処理し、反応混合物を形成する。７−ア
ミノ−１，３−ナツタレンジスルフォン酸（ＡＮＤ　Ｓ
、　２８ｍｇ、　０．０７［ｉｍ　ｍｏｌｅ　、アルド
リッヒケミカル社）を０．９戒水に溶かした溶液を反応
混合物に加え、それをその後−晩室温で撹拌し、蒸発さ
せた。

蒸発残渣を最小量のＯ，１Ｍ炭酸ナトリウムに溶解し、
中性ｐＨの溶液を得る。この溶液を等量のメタノールと
混合し、２０Ｘ２０ｃｍの分取ＴＬＣプレート（シリカ
ゲル６０．　　Ｆ２５４　、　　メルク社）上で精製し
、クロロホルム／メタノール／水（５５：４０：５）で
展開した。発現した黄色バンド（Ｒｆ　−０，４）を実
施例１に記載の黄色バンドと同様な方法で処理し、ＤＭ
ＡＥ−ＡＮＤＳが得られる（１５＃ｌＬ　　５０％）。

速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析［オネイダリサーチ　サ
ービス（Ｏｎｅｉｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｃｒｖｉ
ｃｅｓ）　、　ホワイツボロ、　　Ｎ、　　Ｙ、　］は
、陽イオンモードで、Ｍ＋ピーク６７１　、　Ｍ＋Ｎａ
ピーク６９３゜Ｍ＋２Ｎａピーク７１５を与えた。プロ
ミドのピーク８０は、陰イオンモードで検出された。

実施例４ ２′　　６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル
ｌローメチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート
プロミド（ＤＭＡ　Ｅ　−ＣＯＯＨ，５０ｍｇ。

Ｑ、１０７ｍ　ａｌｏｌｅ　）をｌＯｒｎｌＤＭＦ／Ｃ
ＨＣＪ３　（１：１）に溶かした溶液を水浴中で冷やし
、トリエチルアミンＣ７１ｔｔ　ｆ！　、　０．５３５
ｍ　ｌｌ１ｏｌｅ　）と、クロル蟻酸エチル（２０μｆ
ｌ　、　０．２１４１１ＩＩｌｏｌｅ　）とて処理し、
反応混合物を形成した。３０分後、反応混合物を蒸発し
た。蒸発残渣をｌＯ１０１Ｄ／ＣＨＣｊ！３　（１：１
）と混合し、トリエチルアミン（７７μｍ、　０．５３
！ｏｎ　ｎ＋ｏｌｅ　）と、５−３−スルフォブロピル
ーしシスティン（５Ｕｇ、　０．２１４ｍ　ｍｏｌｅ　
）　　［ルエグ（Ｕ。

Ｔ、Ｒｕｅｇｇ　）およびルジンガ−（Ｊ、Ｒｕｄｉｎ
ｇｅｒ）の方法によって調製、Ｊ、ＰｅｐＬｌｄｅ　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、６，４４７゜１９７４］とで処
理して第二の反応混合物を形成した。

第二の反応混合物を一晩６０℃〜７０℃に加熱し、蒸発
した。

蒸発残渣を２０Ｘ２０ｃｍの分取ＴＬＣプレート（シリ
カゲル６０．　　Ｆ２５４　、メルク社）上で精製し、
クロロホルム／メタノール／水（５５：４０：５）で展
開した。発現した黄色バンド（これは長および類ＵＶ光
の下でも検出される）を、実施例１に記載された黄色バ
ンドと同様に処理しＤＭＡＥ−３Ｃｙｓを得るＣ３７ｍ
ｇ、　３６％）。

陽イオンモードにおけるＦＡＢ質量分析の結果、Ｍ＋ビ
ーク６１１　、　　Ｍ＋Ｎ１ビーク６３３　、　　Ｍ十
Ｎａ。

Ｋピーク６７３が得られた。

実施例５ ２’　、６’　−ジメチル−４′−カルボキシルフェニ
ル１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレー
トプロミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，３５ｍｇ。

０．０７５ａ＋　ｍｏｌｅ　）を５ｄＤＭＦに溶かした
溶液を水浴中で冷やし、トリエチルアミン（４４μＪ、
　０．３１ｍ　ｌｌ１ｏｌｅ）と、クロル蟻酸エチル（
８，５ｕｆｌ、　０．０９０ｆｆｉｍｏｌｅ　）とで処
理した。２０分後、アミノエチル酸性硫酸エステル（ア
ルドリッヒ、　３０ｍｇ、　０．２１ｍＩＩｏ　Ｉ　ｃ
）を加えて反応混合物を形成し、水浴をとり除いた。反
応混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発した。蒸発残渣をク
ロロホルム／メタノール／水（７３二２４：　３）混合
物５ｄと共にすりつぶし濾過して不溶性物質を除去する
。こうして生成したＰ液を濃縮し、２０Ｘ２０ｃｍの分
取ＴＬＣプレート（シリカゲルＧｏ、　　Ｆ２５４　、
メルク社）上で精製し、クロロホルム／メタノール／水
（８５：２５：４）で展開した。発現した黄色バンド（
Ｒｆ　−０，４８）　　（長および短ＵＶ光下でも検出
される）を実施例１に記載した黄色バンドと同じ方法で
処理し、ＤＭＡＥ−ＡＥＯ５を得る（１４／ｉＬ　３２
％）。

実施例６ ２′ ６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル１０−メ
チル−アクリジニウム−９−カルボキシレートプロミド
（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，１００ｍｇ、　０．２１．５ｍ
　ｍｏｌｅ　）を２５％ＤＭＦ−りｏｏホルム溶液２０
ｍ１に溶かした溶液を水浴中で冷やし、トリエチルアミ
ン（１８０μ！、　１．３０ｍ　ｍｏｌｅ）と、クロル
蟻酸エチルＣＧ２ｕ　１　、０．６！ｏｎ　ｍｏｌｅ）
で処理し、反応混合物を形成する。３０分後、反応混合
物を蒸発させた。蒸発残渣を１２ｙｆＤＭＦと混合し、
再組成化した。こうして生成した溶液にトリエチルアミ
ン（３００ｕ　ｆ！　、　２．１５＋ｎ　ｍｏｌｅ）お
よび２−アミノエチルホスフォン酸（８０〃１９．０．
６４＋ｕ　ｍｏｌｅ、アルドリッヒケミカル社）を水５
゜０に溶かした溶液を加えて第二の反応混合物を形成し
た。第二の反応混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発した。

蒸発残渣を２〜３ｄのクロロホルム／メタノール／水（
７３：２４：３）にとり、２０Ｘ２０ｃｍの分取ＴＬＣ
プレート（シリカゲルＧｏ、　　Ｆ２５４　、　メルク
社）上で精製し、クロロホルム／メタノール／水（０５
：２５：４）で展開した。プレート上に発現した黄色バ
ンド（Ｒｆ−０，４５）　　（これは長および短ＵＶ光
下でも検出される）を実施例１に記載の黄色バンドと同
じ方法で処理し、ＤＭＡＥ−ＡＥＰが得られた（７２ｍ
ｇ。

５８％）。

陽イオンモードにおけるＦＡＢ質二分析はＭ＋ビーク４
９３　、　Ｍ十Ｎａビーク５１５を与えた。

実施例７ ２’、６’　−ジメチル−４′−カルポキンルフェニル
１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート
プロミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，１００Ｉｎｋ、　０．
２１５ｍ　ｍｏｌｅ　）を２５％ＤＭＦ−りｏｏホルム
溶液２０戒に溶かした溶液を水浴中で冷やし、トリエチ
ルアミン（１８０ｔｔｌ！、　１．３０ＩＩｌ１１ｏｌ
ｅ）および、クロル蟻酸エチル（６２，ｃｚ　、ｆ）　
、　Ｏ，Ｇ５＋ｎ　ｍｏｌｅ）で処理し、反応混合物を
形成した。３０分後、反応混合物を蒸発した。蒸発残渣
を１．２Ｉｄ！ＤＭＦに溶かした。

こうして生成した溶液にトリエチルアミン（３００ｕ　
Ｊ！　、　２．１５ｍ　ｒａｏｌｅ）および２−アミノ
エチルジヒドロゲンホスフエ−ト（９１ｍｇ、　Ｏ，６
４ｍ　ｍｏｌｅ、アルドリッヒケミカル社）を水５ｍｌ
に溶かした溶液を加えて第二の反応混合物を形成する。

第二の反応混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発した。蒸発
残渣を２〜３ｄのクロロホルム／メタノール／水（７３
：２４：３）にとり、１枚の２０Ｘ２０ｃｍの分取ＴＬ
Ｃプレート（シリカゲル［ｉｏ、　　Ｆ２５４　、　メ
ルク社）上で精製し、クロロホルム／メタノール／水（
６５：　２５　：４）で展開した。発現した黄色バンド
（Ｒｆ　−０゜４５）（これは長および類ＵＶ光の下で
も検出される）を実施例１に記載の黄色バンドと同様な
方法で処ｆ’ｌｕＬ、ＤＭＡＥ−ＡＥＯＰを得た（１０
０〃＋９゜７９％）。

陽イオンモードにおけるＦＡＢ質量分析はＭ＋ピーク５
０９を与えた。

実施例８ ルミソームからのアクリジニウムエステルの漏れ率 ルミソームは次のようにしてっ（った・２５ｍ’Ｊジパ
ルミトイルホスファチジルコリン。

１３．５７１１１ｇコレステロール、２．２ｍｇジパル
ミトイルホスファチジルグリセロールを含むクロロホル
ム溶液を７ｃｍ直径の円形偏平ガラス皿上で空気乾燥し
、１６時間真空中に置いて乾燥脂質膜を生成する。アク
リジニウムエステルＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，ＤＭＡＥ−Ａ
ＭＳ、ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ（７）各々を０．２１５Ｍス
クロース、０．２５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７に溶がしり（
０，１−０，２６ｍｇ／ｄ）　、アクリジニウムエステ
ルＤＭＡＥ−３ＣＹＳ、ＤＭＡＥ−ＡＥＯ３゜ＤＭＡＥ
−ＡＥＰ、ＤＭＡＥ−ＡＥＯＰの各々を５ＨＬＭ燐酸ナ
トリウム溶液、ＰＨ７，４に溶がした（０．１−０．２
８ｍｇ／ｌｄ＞　、こうして得られた各アクリジニウム
エステル溶液３Ｉｎｆ！部分を個々の乾燥脂質膜に加え
、４５℃で１０分間しずかに混合し、ルミソーム懸濁液
を形成した。こうして得られたＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，Ｄ
ＭＡＥ−ＡＭＳ、　そしテＤＭＡＥ−ＡＮＤＳを含有す
る各懸濁液を、孔の大きさ０．４および０．２　ミクロ
ンのポリカルボネート膜を通して押し出し、トリス緩衝
液（０，１Ｐｔｌリス。

０．０３ＭＮａ　Ｃ１，０，０１９６Ｎａ　Ｎ３　、０
．５　ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　ＰＨ７，８）中テ４５．Ｏ
ＯＯｒｐｍ、３０分間超遠心分離することにより４回洗
浄し、ルミソームペレットを形成した。こうして得られ
たルミソームベレットを各々、１ＯＩｎｌトリス緩衝液
に再懸濁させた。

ＤＭＡＥ−３ＣＹＳ、ＤＭＡＥ−ＡＥＯ３，ＤＭＡＥ−
ＡＥＰおよびＤＭＡＥ−ＡＥＯＰを含む各懸濁液を、孔
の大きさ０．４および０．２ミクロンのポリカルボネー
ト膜を通して押し出し、その後、５０１７１Ｍ燐酸ナト
リウム溶液、ｐＨ７，４中で４５．０００ｒｐｌで３０
分間超遠心分離することによって４回洗浄し、ルミソー
ムペレットを形成する。こうして得られたルミソームペ
レットを各々、５０ＴｒＬＭ燐酸ナトリウム、　ｐＨ７
，４、ｌＯｄに再懸濁させた。各々の再懸濁させたルミ
ソームペレットの試料を０．１％トライトンＸ−１００
デタージエント（重量／容量）と混合し、封入されたア
クリジニウムエステルの総量を測定した。各々の再懸濁
ルミソームベレットの一部をとり、４℃および３７℃で
７日間インキュベートした。その部分をその後４５，０
００ｒｐｉで２時間遠心分離した。遠心分離後、各上澄
液から試料をとり、０．１％トライトンＸ　−１００と
混合した。

各上澄液中のアクリジニウムエステルの濃度をチバコー
ニングマジック８ライト分析器［チバコーニングディア
グノスティック社（Ｃｉｂａ　ｅｏｒｎｉｎｇ　ＤＩａ
ｇｎＯ５ＬＩＣ３ｃｏｒｐ、）　、　　メトフィールド
、ＭＡ］　を用いて測定した。それからアクリジニウム
漏れ百分率を、最初にルミソーム内に封入されたアクリ
ジニウムエステルの総量に対して上澄液中のアクリジニ
ウムエステル量を比較することによって計算した。

１表 ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ ＤＭＡＥ−ＡＭＳ ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ ＤＭＡＥ−３ＣＹＳ ＤＭＡＥ−ＡＥＯ３ ＤＭＡＥ−ＡＥＰ ＤＭＡＥ−ＡＥＯＰ ３６．０ ２Ｇ、０ １．９ ４．９ ５２．８ １．０ １．７ 実施例９ つ 表 ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ封入ルミソームを実施例８に記載の
方法によってつくった、但しＤＭＡ　ＥＡＮＤＳを乾燥
脂質膜に加える前に、ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳを２表に列挙
させる４緩衝液に溶かした。

その後その緩衝液を用いて、２表に挙げた４ルミソ一ム
標本をそれぞれ洗い、再懸濁し、貯蔵した。

こうしてつくられたルミソームは４℃か３７℃で３５日
間、それぞれの緩衝液中に保存され、それから４５、Ｏ
ＯＯｒｐｍで２時間遠心分離された。それから各上澄液
中のＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ濃度をチバコーニングマジック
３ライト分析器を用いて測定した。

それからＤＭＡＥ−ＡＮＤＳの漏れ百分率を、上澄液中
のＤ　Ｍ　Ａ　Ｅ　−Ａ　Ｎ　Ｄ　Ｓ　量を最初にルミ
ソーム内に封入されたＤ　Ｍ　Ａ　Ｅ　−Ａ　Ｎ　Ｄ　
Ｓ　Ｒに比較することによって計算した。

の影響 燐酸ナトリウム、　ｐＨ７，４０，３５０，８５酢酸ナ
トリウム、　ｐＨ７，４０，３３１，３９酒石酸ナトリ
ウム、ｐＨ７，４０，１３２１，３０１１１ＥＰＥＳナ
トリウム、　ｐＨ７，４０，７９１，７１実施例１０ 総Ｔ４アッセイ Ａ６　試薬の調製 ＤＭＡＥ−ＡＭＳを封入したチロキシン（Ｔ４）ルミソ
ームを実施例８に記載のように調製した、但し０．１Ｇ
／１１９のジパルミトイル−ホスファチジルエタノール
アミン−スクシニル−チロキシン（引例によってここに
挿入される１９８７年９月９日提出の米国特許出願節０
９４，６６７号に記載の方法でつくられた）を脂質混合
物に加えた。脂質膜の水和のために、燐酸緩衝液中０．
２ｎ１ｇ／ｄのＤＭＡＥ−ＡＭＳを用いた。最終的ルミ
ソーム標本を緩衝液Ａ（０，０２Ｍ　トリス０．Ｉ　Ｍ
Ｎａ　Ｃ１，０，００１ＭＥＤＴＡ、Ｏ，１％ウシ血’
（ＩＩｊアルブミン（ＢＳＡ）、０．１％アジドナトリ
ウム、　ｐＨ７，８）に溶かした。

モノクローナル抗−Ｔ４抗体をつくるためには、コーラ
−（Ｋｏｈｌｃｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｃ
Ｉｎ）の方法（“自然“（ロンドン）　、　２５Ｇ巻２
４９５−４９７ページ）により、マウス（Ａ／Ｊ）にお
いてＢＳＡ−Ｔ４結合物で免疫し、その後牌細胞をＳ　
Ｐ　２１０−Ａｇ　＋４骨髄腫細胞と融合させた。抗−
Ｔ、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は次の操作法を
用いるラジオイムノアッセイによって検出された。細胞
からの上澄液を、０．１％（重量／容工）ウシガンマ−
グロブリンを含む燐酸緩衝食塩水で１＝５に稀釈した。

各稀釈上澄液１００μ（および＋２５１−標識化Ｔ４１
００μｍを試験管に加え、室温で１時間インキュベート
した。常磁性粒子に結合させたヤギ抗マウスＩｇＧを室
温で１０分間各６に加えた。粒子を磁気的に分離し、計
数した。試験の結果陽性であった（すなわちバックグラ
ウンドに対してカウントを発生した）細胞を０．１細胞
／凹みの割で培養し、増殖後再試験した。

試験の結果陽性であったこの１【ｆ増殖細胞からとった
細胞を、ブリスタンを食べさせた（ｐｒ！ｓｔａｎｃ−
ｐｒｌｍｅｄ　）　マウス（ＣＡＦ）に腹腔内注射した
。

３−５週後にこれらのマウスから腹水を集めた。

抗Ｔ４抗体は、アフィーゲル（Ａｒｆ’１−Ｇｅ１）蛋
白質ＡＭＡ　Ｐ　Ｓ　ＩＩキット　［ビオ−ラッドラボ
ラトリーズ（Ｂｊｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）リッチモンド、ＣＡ］を用いて、このキットに備え
られているプロトコールに従って蛋白質Ａカラムクロマ
トグラフィーによって腹水から分離精製された。抗Ｔ４
抗体は、グロマン（Ｇｒｏｍａｎ）らの方法［）＜イオ
テクニ・ンク（Ｂｌｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　３巻
、　１５Ｇ−ＩＧＯ（１９８５）コによって常磁性粒子
上に固定された。抗体誘導粒子（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄ
ｃｒｌｖａｔｌｚｃｄ　　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）　　は
、ｔ　Ｍｊ　ｉ夜Ｂ　（（１，０３Ｍ燐酸塩、　Ｏ，Ｌ
　ＭＮａ　Ｃｊ２　、２．９　ｍ’ｉｌ／ｍｌメルチオ
レート、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジドナトリウム、
　ｐＨ７，４）　０．１　ｎｒＲあたり粒子５０μ’ｊ
の、・濃度にまて［１貸釈された。

Ｂ、アッセイ法 増加する既知量のＴ！を含む一連のスタンダード（０，
０５ｄ）を１２ｘ７５ｍｍプラスチック管に加えた。

それから、緩衝’ｔ（Ｊｔ、　Ａ中に１Ｏｘｌｏ６ＲＬ
Ｕ　（相対的光１１１位ｒｅｌａｔｉｖｃ　ｌｌｇｈｓ
　ｕｎｉｔｓ　）を含むようにＡで調製された′ｒ、−
ルミソーム０．１　ｍｆ！を加え、次いでＡで作成され
たモノクローナル抗Ｔ４抗体と共に固定された常磁性粒
子０．５　ｍｆ！を加えた。それらの管を室温で１時間
インキュベートし、試験管中の常磁性粒子を磁気的に分
離するために有用な、特別に設計した台（ｒａｃｈ）　
　（チバコーニング・ディアグノスチックス社、メトフ
ィールド、ＭＡ）の磁場に置いた。磁場は粒子を上澄液
から分離した。その後上澄液を傾１９した。粒子を１ｍ
ｆ！の燐酸緩衝食塩水中で１回洗い、うす巻き状に撹拌
し、磁気的に分離した。粒子を脱イオン水中０．１％（
Ｗ／Ｖ）　　トライトンＸ−１０００，Ｉ　Ｉｎｆ！に
再懸濁させた。

それから管をルミノメータ−（マジック８ライト分析器
、チバコーニングディアグノスティック社、メドゥフィ
ールド、ＭＡ）中に置いた。０．ｌＮＨＮＯ３中０．１
９６過酸化水素溶液０３ｍ１をルミノメータ−を経て６
管に加えた。その後、ＡＲＱＵＡＤ界面活性剤［アルマ
ークケミカルス（Ａｒｍａｒｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
　、　　シカゴ、イリノイ］含有１）、２５ＮＮａ　Ｏ
Ｈ０，３ａｔ！の添加によって光の放出か誘発された。

６管でａｌｌｌ定されたＲＬＵを第１図に示すようにそ
れぞれ対応するＴム濃度に対してプロットした。

実施例１１ 遊離Ｔ４アッセイ 増加する既知濃度の遊離Ｔ４を含む一連の血清基礎−ス
タンダートを１２Ｘ７５ｍｍプラスチック管に加えた。

１０ｘ　１０６ＲＬ　Ｕを含む、実施例１０Ａで調製し
たＴ、−ルミソーム０，１ｍｌを加え、次いて緩衝液Ｂ
からメチルオレートを除いた液で実施例１０Ａにおいて
作成したような常磁性粒子上・抗Ｔ４抗体０，５戒を添
加した。反応は室温で１時間行われ、その後、実施例Ｉ
Ｏと同様に、管を処理して、読み取った。第２図は台管
で測定されたＲＬＵをその対応する遊離Ｔ、ａ度に対し
てプロットすることにより得られた。

実施例１２ クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）アッセイ Ａ、試薬の調製 クレアチニンキナーゼＭＢ　（ＣＫＭＢ）およびクレア
チニンキナーゼＢＢ　（ＣＫＢＢ）に対するモノクロー
ナル抗体を、ピラン（Ｐｉｒａｎｅ）らの方法［臨床化
学（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、　３
３巻、　＋５１７−１５２０ページ（１９８７）　］に
よってつくった。

ルミソームの作成は、バーベット（＋３ａｒｂｃｔ）ら
（Ｊ、Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｔｒｕｃｔｕ
ｒｅｔｅａ、　２４３−２５８ページ、　１９８１）の
方法によって合成されたジチオピリジルジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）
ｌ１ｇを脂質混合物に加えたことを除けば、実施例８に
記載のように行った。乾燥脂質膜をＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ
、２ｍｇ／ｒｎｌｌで水和し、最終的ルミソーム標本を
０．１Ｍ−燐酸ナトリウム、　０．ｌ５ＭＮａ　Ｃｆ！
、０．００５ＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５で稀釈した。

抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体を、バーベットらの方
法（Ｊ、Ｓｕｐｒａｍｏｌｃｃｕｌａｒ　５ｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ　　１Ｇ巻。

２４３−２５８ページ、　１９８１）によって、ＤＴＰ
−ＤＰＰＥ含有ルミソームに結合させた。抗ＣＫＭＢ抗
体を１■うルミソームを緩衝液Ｃ（０，１Ｍｌ、　４−
ビベラジンジエタンズルフオン酸、　０．１５ＭＮａＣ
Ｊ！、０．００１　ＭＥＤＴＡ、０．１％Ｎａ　Ｎ３　
、０．１％Ｂ　Ｓ　Ａ、　ｐＨ６，５）で稀釈した。

抗−ＣＫＢＢモノクローナル抗体を、抗−Ｔ４抗体に関
して実施例１０に述べたように、常磁性粒子上に固定し
、緩衝液Ｃ１ｄあたり粒子１００μ９の最終濃度になる
ように緩衝液Ｃで稀釈した。

Ｂ、アッセイ法 増加する既知濃度のヒト心臓ＣＫＭＢを含む一連の血清
−基礎スタンダート（０，１ｄ）を１２Ｘ７５ｍｍプラ
スチック管に加えた。Ａでつくられた、１０ＸＩＱ６Ｒ
ＬＵを含む、抗−ＣＫＭＢ抗体を担うルミソーム０．１
　ｄを台管に加え、その後それらの管を室温で３０分間
インキュベートした。それから台管にＡでつくった抗−
ＣＫＢＢ抗体を担う常磁性粒子５０μりを加え、これら
の管を室温でさらに３０分間インキュベートした。その
後管を実施例１０に記したように処理し、読みとった。

但し洗浄段階には燐酸緩衝食塩水の代りに緩衝液Ｃから
ＢＳＡを除いた液を用いた。第３図に示すように、台管
でΔＩ１１定したＲＬＵを、その対応するＣ　Ｋ　Ｍ　
Ｂ　濃度に対してプロットした。

Ｃ，４つのヒト血清試料をＢに記載の方法を用いて試験
し、＜　１．２１．２４．６８μ９／ｎｆｃＫＭＢの濃
度をそれぞれ測定した。これら４試料を、ＣＫＭＢマジ
ック３ライトアッセイ（チバコーニングディアグノステ
ィック社、メドゥフィールド１ＭＡ、　０２０５２　）
を用いて測定したとき、＜１．１８゜２４、７２μｇ／
ｄのＣＫＭＢ値がそれぞれ確認され、二つのアッセイ間
で良く一致することが示された。

実施例１３ Ａ、試薬の調製 抗ＴＳＨモノクローナル抗体は、抗−Ｔ４抗体の製法に
関して実施例１０に記載した方法でＴＳＨ免疫マウスか
らつくられた。ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳを担ったＤＴＰ−Ｄ
ＰＰＥ含有ルミソームおよび常磁性粒子上に固定された
抗ＴＳＨの製法は実施例１２に記載の通りである。これ
らの試薬は緩衝液Ｃて稀釈された。

Ｂ、アッセイ法 増加する既知濃度のＴＳＨを含む一連の血清基礎スタン
ダード（０，１ｒｎｆりを１２ｘ７５ｍｍプラスチック
管に加えた。Ａでつくられた、８Ｘ１０６ＲＬＵを含む
、抗−ＴＳＨ抗体を担うルミソーム０．■ｄを加え、そ
れから管を室温で２時間インキュベートシた。Ａでつく
られた常磁性粒子固定−抗ＴＳＨ抗体をそれから加え（
０，５ｍ）　、管をさらに３０分間室温でインキュベー
トした。その後実施例１１に記載したように管を処理し
、読みを取った。

Ｃ，ＴＳＨアッセイをＢに記載したのと同じ方法で行っ
た。但し抗−ＴＳＨ抗体を担うルミソームの代りに、２
′、６′−ジメチル−４’　−（Ｎスクシンイミジルオ
キシカルボニル）フェニル１０−メチル−アクリジニウ
ム−９−カルボキシレートメトサルフェート（ＤＭＡＥ
−ＮＨ５）て直接標識化した、Ａでつくった抗ＴＳＨ抗
体を用いた。

Ｄ、２種類の標識を用いてＢおよびＣに記載した方法に
よって作成した標準曲線を第４図に示す。

その結果は、標識として親水性アクリジニウムエステル
類似体を封入したルミソームを用いることによって、ア
ッセイの低末端におけるシグナル対ノイズ比が著しく増
加することを示している。このシグナル対ノイズ比の増
加は、アッセイの感度、精度、速度を改吾するから好都
合である。

Ｅ、Ｂｉこｔ己載のアッセイを、より１豆いインキュベ
ション時間を用いて行った（第５図り照）。第一のイン
キュベーション時間が２．５分で、第二のインキュベー
ション時間も２．５分であったときでさえ、このアッセ
イの感度は十分であることがわかった。ＤＭＡＥ−ＮＨ
３で直接標識化した抗−ＴＳＨ抗体を用い、短いインキ
ュベーション時間を用いたとき、十分感度の良い標準曲
線を得ることはできなかった。驚くべきことに、短時間
のルミソームアッセイにおけるシグナル対ノイズ比は、
従来の２．０時間１０．５時間アッセイのそれより高か
った（第５図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のルミソームを用いる総Ｔ４アッセイの
だめの標準曲線である。 第２図は本発明のルミソームを用いる遊Ｍ　Ｔ　ｔアッ
セイのための標準曲線である。 第３図は本発明のルミソームを用いるＣ　Ｋ　Ｍ　Ｂア
ッセイのための標準曲線である。 第４図はＴＳＨアッセイのための２本の標べ！’、　ｔ
ｉｌｊ線の比較である。上の曲線は本発明のルミソーム
を用いるＴＳＨアッセイをあられし、下の曲線はアクリ
ジニウムエステルで直接標識化した抗体を用いるＴＳＨ
アッセイをあられす。 第５図はＴＳＨアッセイのための２本の標僧曲線の比較
である。上の曲線は、本発明のルミソームと短いインキ
ュベーション時間を用いるＴＳＨアッセイをあられし、
下の曲線はアクリジニウムエステルで直接１票識化した
抗体と通常のインキュベーション時間を用いるＴＳＨア
ッセイをあられす。 図面の７χｇ（内’ｆ＋−に変更なし）關匪？？？？？
６８？井８２８賛８８９ＤＫ ８件の表示 平成０１ 発明の名称 年 第１９９．１７８ アクリジニウムエステルＪ３よびリポソームを用いる分
析物検出法補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 補正の対象 ７、補正の内容 添付書類 優先権証明書および図面 １）優先権証明書を補充する。 ２）手書き図面を墨入れ図面に補正する。 （内容に変更なし） １１ｆｆ先権証明書および同訳文　　　各１通２）図　
面　　　　　　　　　　　１通名　称　チバ　コーニン
グ　ダイアグノスティクス　コーポレーション代 理 人 ５、　？４正命令の日付 自発補正

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、ここでＲ＿１は０〜２０箇のヘテロ原子を含む
   アルキル，アルケニル，アルキニル，アリルまたはアラ
   ルキルであり、 Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，Ｒ＿７は水素．アミノ，アル
   コキシル，ヒドロキシル，−ＣＯ＿２，ハライド，ニト
   ロ，−ＣＮ，−ＳＯ＿３▲数式、化学式、表等がありま
   す▼ ▲数式、化学式、表等があります▼または−ＳＣＮで、
   ここ でＲは０〜２０箇のヘテロ原子を含むアルキル，アルケ
   ニル，アルキニル，アリルまたはアラルキルであり； 　Ｒ＿４およびＲ＿６は水素，アルキル，アルケニル，
   アルキニル，アラルキルまたはアルコキシルであり； 　Ｘはアニオン； 　Ｒ６は−Ｒ−Ｉ＿（ｎ）またはＱ−Ｒ−Ｉ（ｎ）で、
   ここでＲは上と同様に定められ；Ｑは−Ｏ−，▲数式、
   化学式、表等があります▼ 　 I はイオン化可能基で：ｎは最低１であるアクリジ
   ニウムエステル。 ２）Ｒ＿１が、窒素，酸素，燐，硫黄から成る群から選
   択されるヘテロ原子Ｏ〜２０箇を含む、炭素原子１〜２
   ４のアルキル，アルケニル，アルキニル，アリルまたは
   アラルキルである請求項１記載のアクリジニウムエステ
   ル。 ３）　Ｒ＿１が炭素原子１〜１０のアルキルである請求
   項２記載のアクリジニウムエステル。 ４）　Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，Ｒ＿７が水素，アミノ
   ，−ＣＯ＿２，−ＣＮ，ヒドロキシル，Ｃ＿１−Ｃ＿４
   アルコキシル，ニトロ，ハライド，−ＳＯ＿３，または
   −ＳＣＮである請求項１記載のアクリジニウムエステル
   。 ５）　Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，Ｒ＿７，が水素，Ｃ＿
   １〜Ｃ＿４−アルコキシル，ニトロ，アミノ，または−
   ＳＯ＿３である請求項４記載のアクリジニウムエステル
   。 ６）　ＸがＣＨ＿３ＳＯ＿４＾−，ＯＳＯ＿２Ｆ＾−，
   ハライド，ＯＳＯ＿２ＣＦ＿３＾−，ＯＳＯ＿２Ｃ＿４
   Ｆ＿３＾−または▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項１記載のアクリジニウムエステル。 ７）　Ｘがハライドである請求項６記載のアクリジニウ
   ムエステル。 ８）　Ｒが窒素，酸素，燐，硫黄から成る群から選択さ
   れるヘテロ原子０〜２０箇を含む、炭素原子１〜２４の
   アルキル，アルケニル，アルキニルまたはアラルキルで
   ある請求項１記載のアクリジニウムエステル。 ９） ▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項１記載のアクリジニウムエステル。 １０）　Ｒ＿４およびＲ＿８が、水素，または炭素原子
   １〜８のアルキル，アルケニル，アルキニルまたはアル
   コキシルである請求項１記載のアクリジニウムエステル
   。 １１）　Ｒ＿４びＲ＿８が、炭素原子１〜４のアルキル
   である請求項１０記載のアクリジニウムエステル。 １２）　Ｒ＿６が−Ｑ−Ｒ−Ｉ＿（＿ａ＿）である請求
   項１記載のアクリジニウムエステル。 １３）　Ｉが−ＳＯ＿３，−ＯＳＯ＿３，−ＰＯ＿３，
   −ＯＰＯ＿３または−ＣＯ＿２である請求項１記載のア
   クリジニウムエステル。 １４）　ｎが約１ないし約２０である請求項１記載のア
   クリジニウムエステル。 １５）　ｎが約１ないし約１０である請求項１４記載の
   アクリジニウムエステル。 １６）　Ｒ＿１が、窒素，酸素，燐，硫黄から成る群か
   ら選択されるヘテロ原子０〜２０箇を含む、炭素原子１
   〜２４のアルキル，アルケニル，アルキニルまたはアリ
   ルであり； Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，Ｒ＿７は水素，アミノ，　−
   ＣＯ＿２，シアノ，ヒドロキシル，Ｃ＿１〜Ｃ＿４−ア
   ルコキシル，ニトロ，ハライド，−ＳＯ＿３または−Ｓ
   ＣＮであり； Ｒ＿４およびＲ＿８は水素，または炭素原子１〜８のア
   ルキル，アルケニル，アルキニルまたはアルコキシルで
   あり； ＸはＣＨ＿３ＳＯ＿４＾−，ＯＳＯ＿２Ｆ＾−，ハライ
   ド，ＯＳＯ＿２ＣＦ＿３＾−，ＯＳＯ＿２Ｃ＿４Ｆ＿３
   ＾−，または▲数式、化学式、表等があります▼ Ｒは、窒素，酸素，燐，硫黄から成る群から選択された
   ヘテロ原子０〜２０箇を含む、炭素原子１〜２４のアル
   キル，アルケニル，アルキニル，アリルまたはアラルキ
   ルであり； ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｉが−ＳＯ＿３，−ＯＳＯ＿３，−ＰＯ＿３または−Ｃ
   Ｏ＿２である請求項１記載のアクリジニウムエステル。 １７）　Ｒ＿６が−Ｑ−Ｒ−Ｉ＿（＿ａ＿）で、Ｘがハ
   ライドである請求項１６記載のアクリジニウムエステル
   。 １８）　Ｒ＿１が炭素原子１〜１０のアルキルであり；
   Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，Ｒ＿７，が水素、Ｃ＿１−Ｃ
   ＿４アルコキシル，ニトロ，アミノまたは−ＳＯ＿３で
   あり； Ｒ＿４およびＲ＿８が炭素原子１〜４のアルキルである
   請求項１７記載のアクリジニウムエステル。 １９）Ｒ＿１，Ｒ＿４，Ｒ＿８がメチルで；Ｒ＿２，Ｒ
   ＿３，Ｒ５＿，Ｒ＿７が水素であり；Ｘがプロミドであ
   り；Ｑが　▲数式、化学式、表等があります▼　であり
   ；Ｒ−Ｉ＿（＿ｎ＿）がアミノメタンスルフォン酸、７
   −アミノ−１，３−ナフタレンジスルフォン酸、Ｓ−（
   ３−スルフォプロピル）システイン、２−アミノエチル
   酸性硫酸エステル、２−アミノエチルホスフォン酸、２
   −アミノエチルジヒドロゲンホスフェートから成る群か
   ら選択される請求項１８記載のアクリジニウムエステル
   。 ２０）　構造式　 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、ここでＲ＿１，Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿４，Ｒ＿
   ５，Ｒ＿６，Ｒ＿７，Ｒ＿８およびＸが請求項１に記載
   されたものであるアクリジニウムエステル。 ２１）　構造式　 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、ここでＲ＿１，Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿４，Ｒ＿
   ５，Ｒ＿６，Ｒ＿７，Ｒ＿８およびＸが請求項１６に記
   載されたものであるアクリジニウムエステル。 ２２）ルミソーム。 ２３）請求項１記載のアクリジニウムエステルを含んで
   成るルミソーム。 ２４）請求項１６記載のアクリジニウムエステルを含ん
   で成るルミソーム。 ２５）請求項１７記載のアクリジニウムエステルを含ん
   で成るルミソーム。 ２６）請求項１８記載のアクリジニウムエステルを含ん
   で成るルミソーム。 ２７）請求項１９記載のアクリジニウムエステルを含ん
   で成るルミソーム。 ２８）生物学的活性を有する最低一つの分子と結合した
   請求項２３記載のルミソームから成る発光（ｌｕｍｉｎ
   ｅｓｃｅｎｔ）アッセイに使用される発光結合物。 ２９）生物学的活性を有する分子が抗体である請求項２
   ８記載の発光結合物。 ３０）生物学的活性を有する分子が抗原またはハプテン
   である請求項２８記載の発光結合物。 ３１）生物学的活性を有する分子が核酸である請求項２
   ８記載の発光結合物。 ３２）生物学的活性を有する分子が核酸を含んで成る請
   求項２８記載の発光結合物。 ３３）分析物を含む疑いのある試料液を標識と分析物の
   ための第一のレセプターとを含むリボソームと結合させ
   、その後分析物と結合した標識の量を測定することから
   成る分析物測定アッセイにおいて、ルミソームをリボソ
   ームとして使用することから成る改良。 ３４）ルミソームが請求項２３記載のルミソームである
   請求項３３記載のアッセイ。 ３５）ルミソームが請求項２４記載のルミソームである
   請求項３３記載のアッセイ。 ３６）ルミソームが請求項２５記載のルミソームである
   請求項３３記載のアッセイ。 ３７）ルミソームが請求項２６記載のルミソームである
   請求項３３記載のアッセイ。 ３８）ルミソームが請求項２７記載のルミソームである
   請求項３３記載のアッセイ。 ３９）分析物が抗原またはハプテンである請求項３３記
   載のアツセイ。 ４０）分析物がＤＮＡプローブ或いはＲＮＡプローブで
   ある請求項３３記載のアッセイ。 ４１）レセプターが抗体である請求項３３記載のアッセ
   イ。 ４２）試料液をリボソームと結合させる前に、試料液を
   、分析物のための第二のレセプターを含んで成る固体支
   持体と結合させる段階をさらに含む請求項３３記載のア
   ッセイ。 ４３）試料液とリボソームとの結合と同時に、試料液を
   、分析物のための第二のレセプターを含んで成る固体支
   持体と結合させる段階をさらに含む請求項３３記載のア
   ッセイ。 ４４）試料液とリボソームとの結合の後に、試料液を、
   分析物のための第二のレセプターを含んで成る固体支持
   体と結合させる段階をさらに含む請求項３３記載のアッ
   セイ。 ４５）分析物が配位子と抗配位子とから成る特異的結合
   対のメンバーであり、検出可能標識値を、既知量の分析
   物を含む試料の検出可能標識の測定値と比較して決定す
   る分析物測定アッセイにおいて、ルミソームをリボソー
   ムとして使用することから成る改良。 ４６）ルミソームが請求項７記載のルミソームである請
   求項４５記載のアッセイ。 ４７）　構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、ここでＲ＿１，Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿４，Ｒ＿
   ５，Ｒ＿７，Ｒ＿８およびＸが請求項１記載のものであ
   るアクリジニウムエステル。 ４８）　構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、ここでＲ＿１，Ｒ２，Ｒ＿３，Ｒ＿４，Ｒ＿５
   ，Ｒ＿７，Ｒ＿８およびＸが請求項１６記載のものであ
   るアクリジニウムエステル。 ４９）Ｒ＿１が炭素原子１〜１０のアルキルであり、Ｒ
   ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５，Ｒ＿７が水素、Ｃ＿１−Ｃ＿４
   アルコキシル，ニトロ，アミノまたは−ＳＯ＿３であり
   、Ｒ＿４およびＲ＿８が炭素原子１〜４のアルキルであ
   るアクリジニウムエステル。