JP2822320B2 - 発光結合物およびそれを用いたアッセイ - Google Patents

発光結合物およびそれを用いたアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は液体試料中の分析物
を検出する新規な方法に関するものである。より詳細に
は、本発明はリポソーム（ルミソーム）の壁内に封入さ
れたアクリジニウムエステルを用いて液体試料中の分析
物を検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】非同位体イムノアッセイのためのマーカ
ー分子の担体としてリポソームを使用することは知られ
ている。たとえば米国特許第4,704,355 号、第4,695,55
4 号、第4,656,129 号、第4,193,983 号を参照せよ。イ
ムノアッセイにリポソームを使用する重要な利点は、リ
ポソームが、リポソーム小胞あたり非常に多数のマーカ
ー分子を担うことができ、それによって増幅したシグナ
ルをイムノアッセイに提供することができることであ
る。たとえば酵素のような巨大分子マーカー或いはたと
えば蛍光または吸収色素、スピンラベル、金属キレート
化剤、酵素活性化剤または一阻害剤などの小さい有機マ
ーカー分子を封入したリポソームを用いるイムノアッセ
イが報告された。たとえばクリッカ(Cricka,L.) および
カーター(Carter,T.) 著“臨床および生化学的ルミネッ
センス(Clinical and Biochemical Luminescence) ”，
153-178 ページ（マルセル デッカー社，ニューヨーク
およびバーゼル，1982）参照。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明以前には、化学
ルミネッセンスマーカー、たとえばAnn,Clin,Biochem．
25巻27ページ(1988)，Clin,Chem ．31巻,664ページ(198
5)，欧州特許出願第ＥＰ82,636号および米国特許第4,74
5,181 号に記載のアクリジニウムエステルは、それを抗
原または抗体のような生物学的分子に直接結合させるこ
とによってイムノアッセイの標識として使用されたに過
ぎない。先行技術のアクリジニウムエステルおよびその
他の化学ルミネッセンス化合物の親油性は、それらをリ
ポソーム内に封入することを困難にしている。それは、
それらがリポソーム壁から速かに漏れるためである。そ
の上、先行技術のアクリジニウムエステルおよびその他
の化学ルミネッセンス化合物の水溶性は限られているた
め、リポソーム小胞あたりわずかのマーカー分子しか封
入できず、そのためシグナル増幅は比較的小さい。
【０００４】よって、本発明の目的は、アクリジニウム
エステルを用いる新規の分析物検出法を提供することで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】明細書本文および特許請
求の範囲に用いられる次の用語は、次に述べるような意
味を有する。
【０００６】分析物：モノマーまたはポリエピトープ，
抗原，またはハプテン性である配位子である、測定すべ
き化合物または組成物。分析物はＤＮＡまたはＲＮＡの
一片であってもよい。
【０００７】抗原：脊椎動物において、特に特異抗体の
産生を伴って、免疫反応を誘起し得る物質。
【０００８】ハプテン：それ自体は免疫反応を誘起する
能力をもたないが、その他の分子に適当に結合したとき
には、そのハプテンを特異的に識別する抗体を産生し得
るようになる不完全抗原。
【０００９】エピトープ（抗原決定基）：或る抗体によ
って特異的に識別される特異的化学的および立体的構
造。
【００１０】配位子：レセプターがもともと存在する
か、レセプターをそこにつくり得る化合物。
【００１１】配位子類似体：レセプターに関して類似の
配位子と競合し得る変形配位子；その変形によって、変
形配位子が別の分子と結合する手段が提供される。
【００１２】レセプター：分子の特殊の立体および極性
構造、すなわち抗原決定基の部位を識別できる化合物。
レセプターの例は、抗体，酵素，抗体断片、たとえばＦ
ａｂ断片，ＤＮＡまたはＲＮＡ断片，レクチン，補体成
分，コングルチン，リウマチ因子，ホルモン，アビジ
ン，ブドウ球菌蛋白質Ａなどである。
【００１３】抗配位子：配位子のためのレセプター。
【００１４】ＤＮＡプローブ：一体鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａにハイブリダイズすることによって特異的ＤＮＡまた
はＲＮＡ配列を識別するＤＮＡ片。
【００１５】ＲＮＡプローブ：一体鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａにハイブリダイズすることによって特異的ＤＮＡまた
はＲＮＡ配列を識別するＲＮＡ片。
【００１６】リポソーム：脂質、特に脂質混合物を水性
懸濁液に分散したときに得られる一枚膜または多重膜物
体。壁または膜は連続的脂質二重層から成る。
【００１７】ルミソーム：封入アクリジニウムエステル
を含んで成るリポソーム。
【００１８】本発明の方法に用いられるアクリジニウム
エステルは、リポソーム内に封入することができ、化学
ルミネッセンスシグナルを発することのできるアクリジ
ニウムエステルであればよい。好ましいアクリジニウム
エステルは次の構造式のアクリジニウムエステルであ
る：
【００１９】
【化４】
【００２０】ここでＲ1 は０ないし20のヘテロ原子、好
ましくは窒素，酸素，燐または硫黄を含むアルキル，ア
ルケニル，アルキニル，アリールまたはアラルキルであ
り；Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ5 ，Ｒ7 は水素，アミノ，アルコキ
シル，ヒドロキシル，−Ｃ アルキル，アルケニル，アルキニル，アリールまたはア
ラルキルである；Ｒ4 およびＲ8 は水素，アルキル，ア
ルケニル，アルキニル，アラルキルまたはアルコキシル
である；Ｘはアニオン、好ましくはＣＨ3 ＳＯ4 - ＯＳ
Ｏ2 Ｆ- ，ハライド，ＯＳＯ2 ＣＦ3 - ，ＯＳＯ2 Ｃ4
Ｆ9 - ，または
【００２１】
【化５】
【００２２】であり、Ｒ6 は： −Ｒ−Ｉ(n) またはＱ
−Ｒ−Ｉ(n) で、ここでＲは上記のように定 Ｉはイオン化可能基で；ｎは最低１である。
【００２３】Ｒ1 は、炭素原子１〜24のアルキル，アル
ケニル，アルキニル，アリールまたはアラルキルである
のが好ましい；Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ5 ，Ｒ7 は、水素，アミ
ノ， −ＣＯ2 ，シアノ，ヒドロキシル，炭素原子１〜
４のアルコキシル，ニトロ，ハライド，−ＳＯ3 または
−ＳＣＮであり；Ｒ4 およびＲ8 は好ましくは、水素，
または炭素原子１〜８のアルキル，アルケニル，アルキ
ニルまたはアルコキシル；Ｘはハライド； そしてＲは、窒素，酸素，燐，硫黄から成る群から選択
されたヘテロ原子０ないし20箇を含む、炭素原子１〜24
のアルキル，アルケニル，アルキニル，アリールまたは
アラルキルである。
【００２４】本発明の目的のためのイオン化可能基は、
特異的範囲内で正味の正一または負電荷を保有する官能
基である。好ましくは官能基は２−10の範囲内で、より
一層好ましくは５−９の範囲内で正味の正一または負電
荷を保有する。Ｉは、本発明のアクリジニウムエステル
のリポソーム内への封入に有害でないいかなるイオン化
可能基でもよい。Ｉは好ましくは−ＳＯ3 ，−ＯＳ
Ｏ3 ，−ＰＯ3 ，−ＯＰＯ3 または−ＣＯ2 で、ｎは好
ましくは約１ないし約20、より一層好ましくは約10以下
である。
【００２５】より好ましくは、Ｒが炭素原子１〜10のア
ルキルで、Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ5 ，Ｒ7が水素，ニトロ，−
ＣＮ，ハライド，炭素原子１〜４のアルコキシル，アミ
ノまたは−ＳＯ3 で；Ｒ4 およびＲ8 が炭素原子１〜４
のアルキルである。
【００２６】最も好ましくは、Ｒ1 ，Ｒ4 ，Ｒ8 がメチ
ルで；Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ5 ，Ｒ7 が水 −Ｒ−Ｉ(n) はアミノメタンスルフォン酸，７−アミノ
−１，３−ナフタレンジスルフォン酸，Ｓ−（３−スル
フォプロピル）システィン，２−アミノエチルヒドロゲ
ンスルフェート，２−アミノエチルホスフォン酸，およ
び２−アミノエチルジヒドロゲンホスフェードから成る
群から選択される。
【００２７】本発明のアクリジニウムエステルにおいて
Ｒ5 とＲ6 の位置は交換可能である。よって、本発明の
好ましくはアクリジニウムエステルは、次の構造式のア
クリジニウムエステルを含む：
【００２８】
【化６】
【００２９】ここで、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 ，Ｒ5 ，
Ｒ6 ，Ｒ7 ，Ｒ8 およびＸは上で定められたものであ
る。
【００３０】本発明の新規のアクリジニウムエステルは
水によく溶け、リポソームに高い濃度で封入される。ひ
とたびリポソーム内に入ると、新規のアクリジニウムエ
ステルは長時間封入されたままで、目立つほどは漏れな
い。
【００３１】本発明の新規のアクリジニウムエステル
は、リポソームと共に使用することに関して説明してき
たが、本発明の新規のアクリジニウムエステルはその他
の用途、たとえば配位子または分析物（例：抗原）を標
識化する、配位子または分析物の特異的結合パートナー
（例：対応する抗体）を標識化する；または核酸および
核酸を含む分子を標識化するなどのためにアクリジニウ
ムエステルを利用する場合にも有用であることは当然で
ある。
【００３２】
【発明の実施の形態】本発明に有用なルミソームは、単
層リポソーム小胞か多重層リポソーム小胞のいずれかを
生産する種々の公知の方法のいずれかによってつくられ
る。ルミソームは、本発明に有用なアクリジニウムエス
テルを含む水性懸濁液に脂質または脂質混合物を分散し
たときに得られる一枚膜または多重膜体である。
【００３３】ルミソームを生産する方法の例として、脂
質を適当な有機溶媒、たとえばクロロホルムに溶解し、
適当な容器に入れる。有機溶媒の蒸発によって、乾燥し
た脂質膜が容器の内面に形成される。それから、ルミソ
ーム内に捕捉する予定のアクリジニウムエステルを含む
水溶液をその容器に入れて脂質膜と接触させる。その後
烈しく攪拌するか超音波処理により脂質膜を水溶液中に
分散させる。本発明において有用なルミソームの生産に
役立つ多数のその他のリポソーム生成法があり、所望の
用途のために最も適した方法の選択は熟練者に任され
る。リポソームの好ましい製法は、ここに引例によって
挿入される、1986年12月10日提出の係属米国出願第940,
519 号に開示されている。
【００３４】ルミソームは、当業者に公知の方法を用い
て、配位子，配位子類似体または抗配位子と共に誘導さ
れる。目的とするルミソームの用途によって、配位子，
配位子類似体または抗配位子は、抗原，ハプテン，抗
体，核酸，ＤＮＡ，ＲＮＡ，アビジンまたはその他のレ
セプターである。
【００３５】このように形成されたルミソームを、試料
液中の分析物を検出するアッセイに、トレーサーとして
用いることができる。たとえば、競合的アッセイを用い
て抗原またはハプテンを測定する場合、用いられる配位
子または配位子類似体は分析物かその類似体のいずれか
である。
【００３６】サンドイッチアッセイが用いられる場合は
使用される配位子，配位子類似体または抗配位子は、測
定(assay) すべき分析物に特異的であるだろう。たとえ
ば、測定すべき分析物に反応してあらゆる抗体、たとえ
ばモノクローナル抗体を利用してルミソームを誘導(der
ivatize)することができる。
【００３７】本発明のルミソームを用いてＤＮＡまたは
ＲＮＡプローブを検出するアッセイの例は次のようであ
る：ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに、ハプテンまたはビ
オチニル化変形ヌクレオチッドのような配位子で標識を
つける。ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを一体鎖ＤＮＡま
たはＲＮＡとハイブリダイズさせ、固体支持体上に固定
する。固定されたプローブをそれから配位子のためのレ
セプターを含むルミソームと反応させる。この場合の配
位子はたとえば抗体、或いは、プローブがビオチニル化
されている場合はアビジンである。ルミソームを破壊
し、封入アクリジニウムエステルによって発生するシグ
ナルの量を測定する。
【００３８】別法として、標識のない場合の抗ハイブリ
ッド抗体のようなプローブ／一体鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ
ハイブリッドを識別し、それと結合するレセプターを用
いることができる。
【００３９】
【実施例】次に実施例を示して本発明を説明する。
【００４０】実施例１ ２′，６′−ジメチル−４′−カルボキシフェニル 10
メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートブロミ
ド（ＤＮＡＥ−ＣＯＯＨ）の製法 ２′，６′−ジメチ
ル−４′−ベンジルオキシカルボニルフェニル 10−メ
チル−アクリジニウム−９−カルボキシレート メトス
ルフェート（7.9 ，13.4m mole) （米国特許第4,745,18
1 号に記載されているように製造）と、150 mlの氷酢酸
と、46mlの48％臭化水素とを100 ℃−105 ℃で３時間加
熱し、その後一晩室温に放置した。400 ml無水エチルエ
ーテルをその混合物に加え、第二の混合物を形成し、そ
れをその後３日間冷蔵した。それから第二の混合物を濾
過し、黄色結晶性残留物を得た。その残留物を無水エチ
ルエーテルで洗い、空気乾燥した。
【００４１】実施例２ ２′，６′−ジメチル−４′−（スルフォメチルカルバ
モイル）フェニル 10−メチル−アクリジニウム−９−
カルボキシレートブロミド（ＤＭＡＥーＡＭＳ）の製法 ２′，６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル
10−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートブ
ロミド（ＤＭＡＥーＣＯＯＨ），20mg，0.043mmole)を
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／ＣＨＣｌ3 （１：
１）２mlに溶かした溶液を氷水浴中で冷やし、トリエチ
ルアミン（31μｌ，0.215m mole)およびクロル蟻酸エチ
ル（6.1 μｌ，0.065m mole)で処理して反応混合物を形
成する。30分後、反応混合物を蒸発させた。蒸発残渣に
２mlＤＭＦを加えて再組成化し、トリエチルアミン（31
μｌ，0.215m mole)およびアミノメタンスルフォン酸
（9.5mg，0.086m mole)で処理して第二の反応混合物を
形成する。第二の反応混合物を室温で一晩攪拌し、蒸発
させた。こうして形成された粗生成物を分析用ＴＬＣプ
レート（シリカゲル60，Ｆ254 ，メルク社，ラスウェ
イ，Ｎ．Ｊ．）上で精製し、クロロホルム／メタノール
／水（65：25：４）で展開した。プレート上に発現した
黄色バンド（Rf＝0.38) （これは長および短ＵＶ光下で
も検出できた）をプレートから剥がし、同じ溶媒系で溶
出した。生成した溶出液を蒸発し、蒸発残渣をメタノー
ルと共に摩砕して混合物を形成する。この混合物を、シ
リンジ(syringe) フィルターホルダー上にとりつけたポ
リカルボネート膜（直径13mm，孔の大きさ0.2 μｍ）
（ヌクレオポア社，プレザントン，ＣＡ）を通して濾過
した。得られた濾液を蒸発するとＤＭＡＥーＡＭＳが得
られる（15mg，62％）。
【００４２】実施例３ ２′，６′−ジメチル−４′−［Ｎ−７−（１，３−ジ
スルフォナフタレニル）−カルバモイル］フェニル10−
メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート ブロミ
ド（ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ）の製法 ２′，６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル10
−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートブロ
ミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，18mg，0.038m mole ）を3.
6 mlジオキサン／水（１：１）混液に溶かした溶液を室
温で１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル
カルボジイミド塩酸［37mg，0.193m mole ，アルドリッ
ヒケミカル社（Aldrich Chemycal Co.,Inc. ），ミルウ
ォーキー，ＷＩ］で５分間処理し、反応混合物を形成す
る。７−アミノ−１，３−ナフタレンジスルフォン酸
（ＡＮＤＳ，26mg，0.076m mole ，アルドリッヒケミカ
ル社）を0.9 ml水に溶かした溶液を反応混合物に加え、
それをその後一晩室温で攪拌し、蒸発させた。
【００４３】蒸発残渣を最小量の0.1M炭酸ナトリウムに
溶解し、中性pHの溶液を得る。この溶液を等量のメタノ
ールと混合し、20×20cmの分取ＴＬＣプレート（シリカ
ゲル60，Ｆ254 ，メルク社）上で精製し、クロロホルム
／メタノール／水（55：40：５）で展開した。発現した
黄色バンド（Ｒｆ＝0.4 ）を実施例１に記載の黄色バン
ドと同様な方法で処理し、ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳが得られ
る（15mg, 50％）。速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析［オ
ネイダ リサーチ サービス（Oneida Research Servic
es），ホワイツボロ，Ｎ．Ｙ．］は、陽イオンモード
で、Ｍ+ ピーク671 ，Ｍ＋Ｎa ピーク693 ，Ｍ＋２Ｎa
ピーク715 を与えた。ブロミドのピーク80は、陰イオン
モードで検出された。
【００４４】実施例４ ２′，６′−ジメチル−４′−｛Ｎ−［１−カルボキシ
ル−２−（３−スルフォプロピル−チオ）エチル］カル
バモイル｝フェニル10−メチル−アクリジニウム−９−
カルボキシレートブロミド（ＤＭＡＥ−ＳＣＹＳ） ２′，６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル10
−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートブロ
ミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，50mg，0.107m mole ）を10
mlＤＭＦ／ＣＨＣｌ3 （１：１）に溶かした溶液を氷浴
中で冷やし、トリエチルアミン（77μｌ，0.535m mole
）と、クロル蟻酸エチル（20μｌ，0.214m mole ）と
で処理し、反応混合物を形成した。30分後、反応混合物
を蒸発した。蒸発残渣を10mlＤＭＦ／ＣＨＣｌ3 （１：
１）と混合し、トリエチルアミン（77μｌ，0.535m mol
e ）と、Ｓ−３−スルフォプロピル−Ｌ−システイン
（51mg，0.214m mole ）［ルエグ（U.T.Ruegg ）および
ルジンガー（J.Rudinger）の方法によって調製、J.Pept
ide Protein Res.6,447,1974］とで処理して第二の反応
混合物を形成した。第二の反応混合物を一晩60℃〜70℃
に加熱し、蒸発した。
【００４５】蒸発残渣を20×20cmの分取ＴＬＣプレート
（シリカゲル60，Ｆ254 ，メルク社）上で精製し、クロ
ロホルム／メタノール／水（55：40：５）で展開した。
発現した黄色バンド（これは長および短ＵＶ光の下でも
検出される）を、実施例１に記載された黄色バンドと同
様に処理しＤＭＡＥ−ＳＣＹＳを得る（37mg，36％）。
【００４６】陽イオンモードにおけるＦＡＢ質量分析の
結果、Ｍ+ ピーク611 ，Ｍ＋Ｎa ピーク633 ，Ｍ＋Ｎa,
Ｋピーク673 が得られた。
【００４７】実施例５ ２′，６′−ジメチル−４′−［Ｎ−（２−スルフォニ
ルオキシエチル）−カルバモイル］フェニル10−メチル
−アクリジニウム−９−カルボキシレートブロミド（Ｄ
ＭＡＥ−ＡＥＯＳ）の製法 ２′，６′−ジメチル−
４′−カルボキシルフェニル10−メチル−アクリジニウ
ム−９−カルボキシレートブロミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯ
Ｈ，35mg，0.075m mole ）を５mlＤＭＦに溶かした溶液
を氷浴中で冷やし、トリエチルアミン（44μｌ，0.31m
mole）と、クロル蟻酸エチル（8.5μｌ，0.090m mole
）とで処理した。20分後、アミノエチル酸性硫酸エス
テル（アルドリッヒ，30mg，0.21m mole）を加えて反応
混合物を形成し、氷浴をとり除いた。反応混合物を室温
で一晩攪拌し、蒸発した。蒸発残渣をクロロホルム／メ
タノール／水（73：24：３）混合物５mlと共にすりつぶ
し濾過して不溶性物質を除去する。こうして生成した濾
液を濃縮し、20×20cmの分取ＴＬＣプレート（シリカゲ
ル60，Ｆ254 ，メルク社）上で精製し、クロロホルム／
メタノール／水（65：25：４）で展開した。発現した黄
色バンド（Ｒｆ＝0.48）（長および短ＵＶ光下でも検出
される）を実施例１に記載した黄色バンドと同じ方法で
処理し、ＤＭＡＥ−ＡＥＯＳを得る（14mg，32％）。
【００４８】実施例６ ２′，６′−ジメチル−４′−［Ｎ−（２−ホスフォノ
エチル）−カルバモイル］フェニル10−メチル−アクリ
ジニウム−９−カルボキシレートブロミド（Ｄ ＭＡＥ−
ＡＥＰ）の製法 ２′，６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル10
−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートブロ
ミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，100 mg，0.215m mole ）を
25％ＤＭＦ・クロロホルム溶液20mlに溶かした溶液を氷
浴中で冷やし、トリエチルアミン（180 μｌ，1.30m mo
le）と、クロル蟻酸エチル（62μｌ，0.65m mole）で処
理し、反応混合物を形成する。30分後、反応混合物を蒸
発させた。蒸発残渣を12mlＤＭＦと混合し、再組成化し
た。こうして生成した溶液にトリエチルアミン（300 μ
ｌ，2.15m mole）および２−アミノエチルホスフォン酸
（80ml，0.64m mole，アルドリッヒケミカル社）を水５
mlに溶かした溶液を加えて第二の反応混合物を形成し
た。第二の反応混合物を室温で一晩攪拌し、蒸発した。
蒸発残渣を２〜３mlのクロロホルム／メタノール／水
（73：24：３）にとり、20×20cmの分取ＴＬＣプレート
（シリカゲル60，Ｆ254 ，メルク社）上で精製し、クロ
ロホルム／メタノール／水（65：25：４）で展開した。
プレート上に発現した黄色バンド（Ｒｆ＝0.45）（これ
は長および短ＵＶ光下でも検出される）を実施例１に記
載の黄色バンドと同じ方法で処理し、ＤＭＡＥ−ＡＥＰ
が得られた（72mg，58％）。
【００４９】陽イオンモードにおけるＦＡＢ質量分析は
Ｍ+ ピーク493 ，Ｍ＋Ｎa ピーク515 を与えた。
【００５０】実施例７ ２′，６′−ジメチル−４′−［Ｎ−（２−ホスフォノ
オキシエチル）−カルバモイル］フェニル10−メチル−
アクリジニウム−９−カルボキシレートブロミド（ＤＭ
ＡＥ−ＡＥＯＰ）の製法 ２′，６′−ジメチル−４′−カルボキシルフェニル10
−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートブロ
ミド（ＤＭＡＥ−ＣＯＯＨ，100 mg，0.215m mole ）を
25％ＤＭＦ・クロロホルム溶液20mlに溶かした溶液を氷
浴中で冷やし、トリエチルアミン（180 μｌ，1.30m mo
le）および、クロル蟻酸エチル（62μｌ，0.65m mole）
で処理し、反応混合物を形成した。30分後、反応混合物
を蒸発した。蒸発残渣を12mlＤＭＦに溶かした。こうし
て生成した溶液にトリエチルアミン（300 μｌ，2.15m
mole）および２−アミノエチルジヒドロゲンホスフェー
ト（91mg，0.64m mole，アルドリッヒケミカル社）を水
５mlに溶かした溶液を加えて第二の反応混合物を形成す
る。第二の反応混合物を室温で一晩攪拌し、蒸発した。
蒸発残渣を２〜３mlのクロロホルム／メタノール／水
（73：24：３）にとり、１枚の20×20cmの分取ＴＬＣプ
レート（シリカゲル60，Ｆ254 ，メルク社）上で精製
し、クロロホルム／メタノール／水（65：25：４）で展
開した。発現した黄色バンド（Ｒｆ＝0.45）（これは長
および短ＵＶ光の下でも検出される）を実施例１に記載
の黄色バンドと同様な方法で処理し、ＤＭＡＥ−ＡＥＯ
Ｐを得た（100 mg，79％）。
【００５１】陽イオンモードにおけるＦＡＢ質量分析は
Ｍ+ ピーク509 を与えた。
【００５２】実施例８ ルミソームからのアクリジニウムエステルの漏れ率 25mgジパルミトレイルホスファチジルコリン、13.5mgコ
レステロール、2.2 mgジパルミトイルホスファチジルグ
リセロールを含むクロロホルム溶液を７cm直径の円形偏
平ガラス皿上で空気乾燥し、16時間真空中に置いて乾燥
脂質膜を生成する。アクリジニウムエステルＤＭＡＥ−
ＣＯＯＨ，ＤＭＡＥ−ＡＭＳ，ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳの各
々を0.215 Ｍスクロース，0.25ｍＭＥＤＴＡ，pH７に溶
かした（0.1 −0.26mg／ml）。アクリジニウムエステル
ＤＭＡＥ−ＳＣＹＳ，ＤＭＡＥ−ＡＥＯＳ，ＤＭＡＥ−
ＡＥＰ，ＤＭＡＥ−ＡＥＯＰの各々を50ｍＭ燐酸ナトリ
ウム溶液、pH7.4 に溶かした（0.1 −0.26mg／ml）。こ
うして得られた各アクリジニウムエステル溶液３ml部分
を個々の乾燥脂質膜に加え、45℃で10分間しずかに混合
し、ルミソーム懸濁液を形成した。こうして得られたＤ
ＭＡＥ−ＣＯＯＨ，ＤＭＡＥ−ＡＭＳ，そしてＤＭＡＥ
−ＡＮＤＳを含有する各懸濁液を、孔の大きさ0.4 およ
び0.2 ミクロンのポリカルボネート膜を通して押し出
し、トリス緩衝液（0.1 Ｍトリス，0.03ＭＮa Ｃｌ，0.
01％Ｎa Ｎ3 ，0.5 ｍＭ ＥＤＴＡ，pH7.8 ）中で45,0
00rpm,30分間超遠心分離することにより４回洗浄し、ル
ミソームペレットを形成した。こうして得られたルミソ
ームペレットを各々、10mlトリス緩衝液に再懸濁させ
た。ＤＭＡＥ−ＳＣＹＳ，ＤＭＡＥ−ＡＥＯＳ，ＤＭＡ
Ｅ−ＡＥＰおよびＤＭＡＥ−ＡＥＯＰを含む各懸濁液
を、孔の大きさ0.4 および0.2ミクロンのポリカルボネ
ート膜を通して押し出し、その後、50ｍＭ燐酸ナトリウ
ム溶液、pH7.4 中で45,000rpm で30分間超遠心分離する
ことによって４回洗浄し、ルミソームペレットを形成す
る。こうして得られたルミソームペレットを各々、50ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム，pH7.4 ，10mlに再懸濁させた。各々
の再懸濁させたルミソームペレットの試料を0.1 ％トラ
イトンＸ−100 デタージェント（重量／容量）と混合
し、封入されたアクリジニウムエステルの総量を測定し
た。各々の再懸濁ルミソームペレットの一部をとり、４
℃および37℃で７日間インキュベートした。その部分を
その後45,000rpm で２時間遠心分離した。遠心分離後、
各上澄液から試料をとり、0.1 ％トライトンＸ−100 と
混合した。各上澄液中のアクリジニウムエステルの濃度
をチバコーニングマジックR ライト分析器［チバコーニ
ングディアグノスティック社（Ciba corning Diagnosti
cs corp.），メドフィールド，ＭＡ］を用いて測定し
た。それからアクリジニウム漏れ百分率を、最初にルミ
ソーム内に封入されたアクリジニウムエステルの総量に
対して上澄液中のアクリジニウムエステル量を比較する
ことによって計算した。
【００５３】
【表１】
【００５４】実施例９ ルミソームからのアクリジニウムエステルの漏れに与え
る異なる緩衝液の影響 ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ封入ルミソームを実施例８に記載の
方法によってつくった、但しＤＭＡＥ−ＡＮＤＳを乾燥
脂質膜に加える前に、ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳを２表に列挙
させる４緩衝液に溶かした。その後その緩衝液を用い
て、２表に挙げた４ルミソーム標本をそれぞれ洗い、再
懸濁し、貯蔵した。こうしてつくられたルミソームは４
℃か37℃で35日間、それぞれの緩衝液中に保存され、そ
れから45,000rpm で２時間遠心分離された。それから各
上澄液中のＤＭＡＥ−ＡＮＤＳ濃度をチバコーニングマ
ジックR ライト分析器を用いて測定した。それからＤＭ
ＡＥ−ＡＮＤＳの漏れ百分率を、上澄液中のＤＭＡＥ−
ＡＮＤＳ量を最初にルミソーム内に封入されたＤＭＡＥ
−ＡＮＤＳ量に比較することによって計算した。
【００５５】
【表２】
【００５６】実施例10 総Ｔ 4 アッセイ Ａ．試薬の調製 ＤＭＡＥ−ＡＭＳを封入したチロキシン（Ｔ4 ）ルミソ
ームを実施例８に記載のように調製した、但し0.16mgの
ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン−ス
クシニル−チロキシン（引例によってここに挿入される
1987年９月９日提出の米国特許出願第094,667 号に記載
の方法でつくられた）を脂質混合物に加えた。脂質膜の
水和のために、燐酸緩衝液中0.2 mg／mlのＤＭＡＥ−Ａ
ＭＳを用いた。最終的ルミソーム標本を緩衝液Ａ（0.02
Ｍトリス0.1 ＭＮa Ｃｌ，0.001ＭＥＤＴＡ，0.1 ％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ），0.1 ％アジドナトリウ
ム，pH7.8 ）に溶かした。
【００５７】モノクローナル抗−Ｔ4 抗体をつくるため
には、コーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milste
in）の方法（“自然”（ロンドン），256 巻，495-497
ページ）により、マウス（Ａ／Ｊ）においてＢＳＡ−Ｔ
4 結合物で免疫し、その後脾細胞をＳＰ２／０−Ａg 14
骨髄腫細胞と融合させた。抗−Ｔ4 抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞は次の操作法を用いるラジオイムノアッ
セイによって検出された：細胞からの上澄液を、0.1 ％
（重量／容量）ウシガンマ−グロブリンを含む燐酸緩衝
食塩水で１：５に稀釈した。各稀釈上澄液100 μｌおよ
び125 Ｉ−標識化Ｔ4 100 μｌを試験管に加え、室温で
１時間インキュベートした。常磁性粒子に結合させたヤ
ギ抗マウスＩg Ｇを室温で10分間各管に加えた。粒子を
磁気的に分離し、計数した。試験の結果陽性であった
（すなわちバックグラウンドに対してカウントを発生し
た）細胞を0.1 細胞／凹みの割で培養し、増殖後再試験
した。
【００５８】試験の結果陽性であったこの再増殖細胞か
らとった細胞を、プリスタンを食べさせた（pristane-p
rimed ）マウス（ＣＡＦ）に腹腔内注射した。３−５週
後にこれらのマウスから腹水を集めた。抗Ｔ4 抗体は、
アフィ−ゲル（Affi-Gel）蛋白質ＡＭＡＰＳIIキット
［ビオ−ラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratorie
s）リッチモンド，ＣＡ］を用いて、このキットに備え
られているプロトコールに従って蛋白質Ａカラムクロマ
トグラフィーによって腹水から分離精製された。抗Ｔ4
抗体は、グロマン（Groman）らの方法［バイオテクニッ
ク（Bio Techniques）３巻，156-160 （1985）］によっ
て常磁性粒子上に固定された。抗体誘導粒子（antibody
-derivatized particles）は、緩衝液Ｂ（0.03Ｍ燐酸
塩，0.1 ＭＮaＣｌ，2.9 mg／mlメルチオレート，0.1
％ＢＳＡ，0.1 ％アジドナトリウム，pH7.4 ）0.1 mlあ
たり粒子50μｇの濃度にまで稀釈された。
【００５９】Ｂ．アッセイ法 増加する既知量のＴ4 を含む一連のスタンダード（0.05
ml）を12×75mmプラスチック管に加えた。それから、緩
衝液Ａ中に10×106 ＲＬＵ（相対的光単位 relative li
ghs units ）を含むようにＡで調製されたＴ4 −ルミソ
ーム0.1 mlを加え、次いでＡで作成されたモノクローナ
ル抗Ｔ4 抗体と共に固定された常磁性粒子0.5 mlを加え
た。それらの管を室温で１時間インキュベートし、試験
管中の常磁性粒子を磁気的に分離するために有用な、特
別に設計した台（rach）（チバコーニング・ディアグノ
スチックス社，メドフィールド，ＭＡ）の磁場に置い
た。磁場は粒子を上澄液から分離した。その後上澄液を
傾浮した。粒子を１mlの燐酸緩衝食塩水中で１回洗い、
うず巻き状に攪拌し、磁気的に分離した。粒子を脱イオ
ン水中0.1 ％（Ｗ／Ｖ）トライトンＸ−100 0.1 mlに再
懸濁させた。
【００６０】それから管をルミノメーター（マジックR
ライト分析器，チバコーニングディアグノスティック
社，メドゥフィールド，ＭＡ）中に置いた。0.1 ＮＨＮ
Ｏ3 中0.1 ％過酸化水素溶液0.3 mlをルミノメーターを
経て各管に加えた。その後、ＡＲＱＵＡＤ界面活性剤
［アルマークケミカルス（Armark Chemicals），シカ
ゴ，イリノイ］含有0.25ＮＮa ＯＨ0.3 mlの添加によっ
て光の放出が誘発された。各管で測定されたＲＬＵを第
１図に示すようにそれぞれ対応するＴ4 濃度に対してプ
ロットした。
【００６１】実施例11 遊離Ｔ 4 アッセイ 増加する既知濃度の遊離Ｔ4 を含む一連の血清−基礎−
スタンダードを12×75mmプラスチック管に加えた。10×
106 ＲＬＵを含む、実施例10Ａで調製したＴ4−ルミソ
ーム0.1 mlを加え、次いで緩衝液Ｂからメチルオレート
を除いた液で実施例10Ａにおいて作成したような常磁性
粒固定・抗Ｔ4 抗体0.5 mlを添加した。反応は室温で１
時間行われ、その後、実施例10と同様に、管を処理し
て、読み取った。第２図は各管で測定されたＲＬＵをそ
の対応する遊離Ｔ4 濃度に対してプロットすることによ
り得られた。
【００６２】実施例12 クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）アッセイ Ａ．試薬の調製 クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）およびクレアチ
ニンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）に対するモノクローナル
抗体を、ピラン（Pirane）らの方法［臨床化学（Clinic
al Chemistry），33巻，1517−1520ページ（1987）］に
よってつくった。
【００６３】ルミソームの作成は、バーベット（Barbe
t）ら（J.Supramolecular Structure16巻，243 −258
ページ，1981）の方法によって合成されたジチオピリジ
ルジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ
ＴＰ−ＤＰＰＥ）１mlを脂質混合物に加えたことを除け
ば、実施例８に記載のように行った。乾燥脂質膜をＤＭ
ＡＥ−ＡＮＤＳ，２mg／mlで水和し、最終的ルミソーム
標本を0.1 Ｍ燐酸ナトリウム，0.15ＭＮa Ｃｌ，0.005
ＭＥＤＴＡ，pH7.5 で稀釈した。
【００６４】抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体を、バー
ベットらの方法（J.SupramolecularStructure 16巻，2
43 −258 ページ，1981）によって、ＤＴＰ−ＤＰＰＥ
含有ルミソームに結合させた。抗ＣＫＭＢ抗体を担うル
ミソームを緩衝液Ｃ（0.1 Ｍ１，４−ピペラジンジエタ
ンズルフォン酸，0.15ＭＮa Ｃｌ，0.001 ＭＥＤＴＡ，
0.1 ％Ｎa Ｎ3 ，0.1 ％ＢＳＡ，pH6.5 ）で稀釈した。
【００６５】抗−ＣＫＢＢモノクローナル抗体を、抗−
Ｔ4 抗体に関して実施例10に述べたように、常磁性粒子
上に固定し、緩衝液Ｃ１mlあたり粒子100 μｇの最終濃
度になるように緩衝液Ｃで稀釈した。
【００６６】Ｂ．アッセイ法 増加する既知濃度のヒト心臓ＣＫＭＢを含む一連の血清
−基礎スタンダード（0.1 ml）を12×75mmプラスチック
管に加えた。Ａでつくられた、10×106 ＲＬＵを含む、
抗−ＣＫＭＢ抗体を担うルミソーム0.1 mlを各管に加
え、その後それらの管を室温で30分間インキュベートし
た。それから各管にＡでつくった抗−ＣＫＢＢ抗体を担
う常磁性粒子50μｇを加え、これらの管を室温でさらに
30分間インキュベートした。その後管を実施例10に記し
たように処理し、読みとった。但し洗浄段階には燐酸緩
衝食塩水の代りに緩衝液ＣからＢＳＡを除いた液を用い
た。第３図に示すように、各管で測定したＲＬＵを、そ
の対応するＣＫＭＢ濃度に対してプロットした。
【００６７】Ｃ．４つのヒト血清試料をＢに記載の方法
を用いて試験し、＜１，21，24，68μｇ／mlＣＫＭＢの
濃度をそれぞれ測定した。これら４試料を、ＣＫＭＢマ
ジックR ライトアッセイ（チバコーニングディアグノス
ティック社，メドゥフィールド，ＭＡ，02052 ）を用い
て測定したとき、＜１，18，24，72μｇ／mlのＣＫＭＢ
値がそれぞれ確認され、二つのアッセイ間で良く一致す
ることが示された。
【００６８】実施例13 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）アッセイ Ａ．試薬の調製 抗ＴＳＨモノクローナル抗体は、抗−Ｔ4 抗体の製法に
関して実施例10に記載した方法でＴＳＨ免疫マウスから
つくられた。ＤＭＡＥ−ＡＮＤＳを担ったＤＴＰ−ＤＰ
ＰＥ含有ルミソームおよび常磁性粒子上に固定された抗
ＴＳＨの製法は実施例12に記載の通りである。これらの
試薬は緩衝液Ｃで稀釈された。
【００６９】Ｂ．アッセイ法 増加する既知濃度のＴＳＨを含む一連の血清−基礎スタ
ンダード（0.1 ml）を12×75mmプラスチック管に加え
た。Ａでつくられた、８×106 ＲＬＵを含む、抗−ＴＳ
Ｈ抗体を担うルミソーム0.1 mlを加え、それから管を室
温で２時間インキュベートした。Ａでつくられた常磁性
粒子固定−抗ＴＳＨ抗体をそれから加え（0.5 ml）、管
をさらに30分間室温でインキュベートした。その後実施
例11に記載したように管を処理し、読みを取った。
【００７０】Ｃ．ＴＳＨアッセイをＢに記載したのと同
じ方法で行った。但し抗−ＴＳＨ抗体を担うルミソーム
の代りに、２′，６′−ジメチル−４′−（Ｎ−スクシ
ンイミジルオキシカルボニル）フェニル10−メチル−ア
クリジニウム−９−カルボキシレートメトサルフェート
（ＤＭＡＥ−ＮＨＳ）で直接標識化した、Ａでつくった
抗ＴＳＨ抗体を用いた。
【００７１】Ｄ．２種類の標識を用いてＢおよびＣに記
載した方法によって作成した標準曲線を第４図に示す。
その結果は、標識として親水性アクリジニウムエステル
類似体を封入したルミソームを用いることによって、ア
ッセイの低末端におけるシグナル対ノイズ比が著しく増
加することを示している。このシグナル対ノイズ比の増
加は、アッセイの感度、精度、速度を改善するから好都
合である。
【００７２】Ｅ．Ｂに記載のアッセイを、より短いイン
キュベーション時間を用いて行った（第５図参照）。第
一のインキュベーション時間が2.5 分で、第二のインキ
ュベーション時間も2.5 分であったときでさえ、このア
ッセイの感度は十分であることがわかった。ＤＭＡＥ−
ＮＨＳで直接標識化した抗−ＴＳＨ抗体を用い、短いイ
ンキュベーション時間を用いたとき、十分感度の良い標
準曲線を得ることはできなかった。驚くべきことに、短
時間のルミソームアッセイにおけるシグナル対ノイズ比
は、従来の2.0 時間／0.5 時間アッセイのそれより高か
った（第５図）。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は本発明による、ルミソームを用いて行
った総Ｔ4 アッセイのための標準曲線である。
【図２】第２図は本発明による、ルミソームを用いて行
った遊離Ｔ4 アッセイのための標準曲線である。
【図３】第３図は本発明による、ルミソームを用いて行
ったＣＫＭＢアッセイのための標準曲線である。
【図４】第４図はＴＳＨアッセイのための２本の標準曲
線の比較である。上の曲線は本発明のルミソームを用い
るＴＳＨアッセイをあらわし、下の曲線はアクリジニウ
ムエステルで直接標識化した抗体を用いるＴＳＨアッセ
イをあらわす。
【図５】第５図はＴＳＨアッセイのための２本の標準曲
線の比較である。上の曲線は、本発明のルミソームと短
いインキュベーション時間を用いるＴＳＨアッセイをあ
らわし、下の曲線はアクリジニウムエステルで直接標識
化した抗体と通常のインキュベーション時間を用いるＴ
ＳＨアッセイをあらわす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ 33/544 33/544 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C09B 15/00 C07D 219/00 - 219/16 C09K 11/06 G01N 21/76 G01N 33/532 - 33/535 G01N 33/544 - 33/553 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 構造式 【化１】 を有し、ここでＲ１は０〜２０個のヘテロ原子を含むア
    ルキル，アルケニル，アルキニル，アリールまたはアラ
    ルキルであり、 Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は水素，アミノ，アルコキシ
    ル，ヒドロキシル， ヘテロ原子を含むアルキル，アルケニル，アルキニル，
    アリールまたはアラルキルであり； Ｒ４およびＲ８は水素，アルキル，アルケニル，アルキ
    ニル，アラルキルまたはアルコキシルであり； Ｘはアニオン； Ｒ６は−Ｒ−Ｉ（ｎ）またはＱ−Ｒ−Ｉ（ｎ）で、ここ
    でＲは上と同様に定めら Ｉは−ＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、ま
    たは−ＯＰＯ（ＯＨ）２から成る群から選択されるイオ
    ン化可能基で；ｎは１から２０であるアクリジニウムエ
    ステルを含むルミソームに生物学的活性を有する少なく
    とも１つの分子が結合して成る、発光アッセイに使用さ
    れる発光結合物。
  2. 【請求項２】 分析物を含む疑いのある試料液を標識お
    よび分析物のための第一のレセプターを含むリポソーム
    と一緒にし、その後分析物と結合した標識を測定するこ
    とから成る分析物を測定するためのアッセイにおいて、
    前記リポソームとしてルミソームを使用し、該ルミソー
    ムは生物学的活性を有する少なくとも１つの分子と結合
    されており、かつ前記ルミソームは、構造式 【化２】 を有し、ここでＲ１は０〜２０個のヘテロ原子を含むア
    ルキル，アルケニル，アルキニル，アリールまたはアラ
    ルキルであり、 Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は水素，アミノ，アルコキシ
    ル，ヒドロキシル， ヘテロ原子を含むアルキル，アルケニル，アルキニル，
    アリールまたはアラルキルであり； Ｒ４およびＲ８は水素，アルキル，アルケニル，アルキ
    ニル，アラルキルまたはアルコキシルであり； Ｘはアニオン； Ｒ６は−Ｒ−Ｉ（ｎ）またはＱ−Ｒ−Ｉ（ｎ）で、ここ
    でＲは上と同様に定めら Ｉは−ＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、ま
    たは−ＯＰＯ（ＯＨ）２から成る群から選択されるイオ
    ン化可能基で；ｎは１から２０であるアクリジニウムエ
    ステルを含有することを特徴とするアッセイ。
  3. 【請求項３】 分析物が配位子と抗配位子とから成る特
    異的結合対のメンバーであり、検出可能標識の値を、既
    知量の分析物を含む試料の検出可能標識の測定値と比較
    して決定する、分析物を測定するためのアッセイにおい
    て、ルミソームをリポソームとして使用し、該ルミソー
    ムは生物学的活性を有する少なくとも１つの分子と結合
    されており、かつ前記ルミソームは、構造式 【化３】 を有し、ここでＲ１は０〜２０個のヘテロ原子を含むア
    ルキル，アルケニル，アルキニル，アリールまたはアラ
    ルキルであり、 Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７は水素，アミノ，アルコキシ
    ル，ヒドロキシル， ヘテロ原子を含むアルキル，アルケニル，アルキニル，
    アリールまたはアラルキルであり； Ｒ４およびＲ８は水素，アルキル，アルケニル，アルキ
    ニル，アラルキルまたはアルコキシルであり； Ｘはアニオン； Ｒ６は−Ｒ−Ｉ（ｎ）またはＱ−Ｒ−Ｉ（ｎ）で、ここ
    でＲは上と同様に定めら Ｉは−ＳＯ３Ｈ）−ＯＳＯ３Ｈ、−ＰＯ（ＯＨ）２、ま
    たは−ＯＰＯ（ＯＨ）２から成る群から選択されるイオ
    ン化可能基で；ｎは１から２０であるアクリジニウムエ
    ステルを含有することを特徴とするアッセイ。
JP8179488A 1988-08-01 1996-07-09 発光結合物およびそれを用いたアッセイ Expired - Lifetime JP2822320B2 (ja)

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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656426A (en) * 1988-08-01 1997-08-12 Chiron Diagnostics Corporation Functionaized hydrophilic acridinium esters
CA1339491C (en) * 1988-09-26 1997-10-07 Say-Jong Law Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium ester and uses thereof
US5155022A (en) * 1991-02-08 1992-10-13 Becton, Dickinson And Company Assay for lyme disease
US5436155A (en) * 1991-12-31 1995-07-25 Arch Development Corporation Isolated DNA encoding a somatostatin receptor
US5395752A (en) * 1993-03-19 1995-03-07 Ciba Corning Diagnostics Corp. Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays
US5491072A (en) * 1993-05-17 1996-02-13 Lumigen, Inc. N-alkylacridan carboxyl derivatives useful for chemiluminescent detection
US5731148A (en) * 1995-06-07 1998-03-24 Gen-Probe Incorporated Adduct protection assay
EP0761652A1 (en) * 1995-08-01 1997-03-12 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Acridinium compound having a plurality of luminescent groups and binding groups, and conjugate thereof
DE69940433D1 (de) 1998-08-11 2009-04-02 Siemens Healthcare Diagnostics Im nahen infrarot chemilumineszente akridinium derivate und ihre verwendung
US6723851B2 (en) * 2001-10-31 2004-04-20 Quest Diagnostics Investment Incorporated Chemiluminescent compounds and use thereof
WO2007062676A1 (en) 2005-12-01 2007-06-07 B.R.A.H.M.S. Aktiengesellschaft Methods for the diagnosis and treatment of critically ill patients with endothelin, endothelin agonists and adrenomedullin antagonists
ES2392900T3 (es) * 2006-10-13 2012-12-14 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Ésteres de acridinio estables con emisión de luz rápida
PL2780717T3 (pl) 2011-11-16 2017-06-30 Sphingotec Gmbh Oznaczenia adrenomeduliny i sposoby do oznaczania dojrzałej adrenomeduliny
WO2013072513A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for use in therapy of an acute disease or acute condition of a patient for stabilizing the circulation
AU2012338730B2 (en) 2011-11-16 2017-07-06 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold for reducing the risk of mortality in a patient having a chronic or acute disease or acute condition
DK2594588T3 (da) 2011-11-16 2014-07-21 Adrenomed Ag Anti-Adrenomedullin (ADM)-antistof eller anti-ADM-antistoffragment eller anti-ADM-ikke-Ig-protein-scaffold til anvendelse i terapi
US20140328853A1 (en) 2011-11-16 2014-11-06 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for prevention or reduction of organ dysfunction or organ failure in a patient having a chronic or acute disease or acute condition
SG11201402354YA (en) 2011-11-16 2014-06-27 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for regulating the fluid balance in a patient having a chronic or acute disease
CN103308673B (zh) 2012-03-08 2017-05-31 思芬构技术有限公司 用于预测雌性对象中发生心血管事件的风险的方法
CN103308670B (zh) 2012-03-08 2017-06-09 思芬构技术有限公司 用于预测对象患糖尿病和/或代谢综合征的风险的方法
CN103308689B (zh) 2012-03-08 2017-04-12 思芬构技术有限公司 用于预测雌性对象中患上癌症的风险或诊断癌症的方法
EP2904398B1 (en) 2012-10-02 2018-04-11 SphingoTec GmbH A method for predicting the risk of getting cancer in a female subject
EP3361260B1 (en) 2012-10-02 2020-06-10 sphingotec GmbH A method for diagnosing or monitoring kidney function
RU2677895C2 (ru) 2013-01-08 2019-01-22 Сфинготек Гмбх Уровни гормона роста натощак в качестве прогностического маркера сердечно-сосудистого риска
CA2897245A1 (en) 2013-01-08 2014-07-17 Sphingotec Gmbh A method for predicting the risk of getting cancer or diagnosing cancer in a subject
US20160324881A1 (en) 2013-12-30 2016-11-10 Oncoprevent Gmbh Neurokinin-1 Receptor Antagonists For Use In A Method Of Prevention Of Cancer
EP3002589A1 (en) 2014-10-01 2016-04-06 sphingotec GmbH A method for stratifying a female subject for hormone replacement therapy
SG11201706460QA (en) 2015-02-27 2017-09-28 Sphingotec Gmbh A method for predicting the risk of obesity in a subject
US20190145981A1 (en) 2016-04-21 2019-05-16 Sphingotec Therapeutics Gmbh Methods for determining dpp3 and therapeutic methods
RU2019103403A (ru) 2016-07-08 2020-08-10 Сфинготек Гмбх Адреномедуллин для оценки застоя у индивидуума с острой сердечной недостаточностью
EP3309550A1 (en) 2016-10-12 2018-04-18 sphingotec GmbH Method for the detection of apolipoprotein e4
EP3339324A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 sphingotec GmbH Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for use in intervention and therapy of congestion in a patient in need thereof
BR112019011713A2 (pt) 2016-12-16 2019-10-15 Adrenomed Ag anticorpo anti-adrenomedulina (adm) ou fragmento de anticorpo anti-adm ou arcabouço anti-adm não ig para uso na intervenção e terapia da congestão em um paciente com necessidade da mesma
MX2019014441A (es) 2017-05-30 2020-02-10 Sphingotec Gmbh Un metodo in vitro para diagnosticar o monitorear la funcion renal o diagnosticar disfuncion renal.
KR20200083509A (ko) 2017-10-25 2020-07-08 4틴4 파마슈티컬스 게엠베하 특이적 dpp3-에피토프에 대하여 지시되고 이에 결합하는 dpp3 결합제 및 산화적 스트레스와 연관되는 질환 / 급성 병태의 예방 또는 치료에서의 그의 용도
KR20200135947A (ko) 2018-02-08 2020-12-04 스핑고텍 게엠베하 치매의 진단 및/또는 예측을 위한 아드레노메둘린 (adm) 및 치매의 요법 또는 예방에 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 결합제
CN113557031A (zh) 2018-12-21 2021-10-26 4Teen4制药有限公司 使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体的治疗的疗法指导和/或疗法监测
CN114364984A (zh) 2019-08-15 2022-04-15 思芬构技术有限公司 一种诊断或监测儿科患者的肾功能或诊断肾功能障碍的方法
BR112022002856A2 (pt) 2019-08-30 2022-08-09 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Orientação de terapia e/ou monitoramento de terapia para o tratamento de choque
EP3871689A1 (en) 2020-02-26 2021-09-01 sphingotec GmbH Anti-adm-antibodies binding to the free n-terminus for accelerated transition of adm-gly to bio-adm in patients with adm-gly/ bio-adm ratio above a threshold and combination with vitamin c
JP2023515042A (ja) 2020-02-27 2023-04-12 アドレノメト アクチェンゲゼルシャフト ショックの治療若しくは予防において使用するための抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体若しくは抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇ足場
EP4111204A1 (en) 2020-02-27 2023-01-04 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Dpp3 for therapy guidance, monitoring and stratification of nt-adm antibodies in patients with shock
WO2021178987A1 (en) * 2020-03-04 2021-09-10 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Compositions and methods of using modified liposomes
JP2023524931A (ja) * 2020-03-04 2023-06-14 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド イムノアッセイシグナルを増幅するための方法
EP3922993A1 (en) 2020-06-12 2021-12-15 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Dpp3 in patients infected with coronavirus
BR112022017277A2 (pt) 2020-03-16 2022-10-18 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Dpp3 em pacientes infectados com coronavírus
US20210285949A1 (en) 2020-03-16 2021-09-16 Sphingotec Gmbh Pro-adrenomedullin or fragment thereof in patients infected with corona virus and treatments with binder against adrenomedullin
EP4023218A1 (en) 2020-12-02 2022-07-06 S-Form Pharma Combination therapy for patients having acute and/or persistent dyspnea
JP2024519321A (ja) 2021-05-07 2024-05-10 シュピーンゴテック ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 重篤患者におけるコルチコステロイドの療法層別化のための成熟アドレノメデュリン
WO2024023368A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Prediction of an increase of dpp3 in a patient with septic shock

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1461877A (en) * 1974-02-12 1977-01-19 Wellcome Found Assay method utilizing chemiluminescence
GB2112779B (en) * 1981-12-11 1986-10-15 Welsh Nat School Med Aryl acridinium esters as luminescent labelling materials
DE3628573C2 (de) * 1986-08-22 1994-10-13 Hoechst Ag Chemilumineszierende Acridinderivate, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays
US4745181A (en) * 1986-10-06 1988-05-17 Ciba Corning Diagnostics Corp. Polysubstituted aryl acridinium esters
CA1339491C (en) * 1988-09-26 1997-10-07 Say-Jong Law Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium ester and uses thereof

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Publication number Publication date
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