KR20160047422A - 비타민 ｄ를 검출하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비타민 D3 및 비타민 D2를 포함하는 비타민 D의 카르바메이트 유도체에 관한 것이다. 상기 화합물은 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 비타민 D 유사체 및 이의 대사산물을 포함하는 비타민 D의 존재 및/또는 총 양을 결정하기 위한 방법 및 키트에서 유용하다.
Description
배경기술
본 발명은 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 비타민 D 유사체 및 이의 대사산물을 포함하는 비타민 D의 존재 및/또는 양을 결정하기 위한 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.
용어 "비타민 D"는 지용성 세코스테로이드(secosteroid)의 그룹을 의미한다. 인간에서, 비타민 D는 콜레칼시페롤(cholecalciferol)(비타민 D3) 또는 에르고칼시페롤(ergocalciferol)(비타민 D2)로서 섭취될 수 있고 태양 노출이 적당할 때 신체도 이를 합성할 수 있으므로 (콜레스테롤로부터) 독특하다. 이러한 후자의 속성으로 인해, 비타민 D는 대다수가 필수 영양소로 고려하지만 일부에 의해 중요하지 않은 식이 비타민으로 간주된다. 비타민 D는 칼슘 이온 항상성의 양성 조절에서 중요한 생리학적 역할을 담당한다. 비타민 D3은 동물에 의해 합성되는 비타민의 형태이다. 이것은 또한 비타민 D2와 같이 유제품 및 특정 식품에 첨가되는 일반적인 보충물이다.
식이 및 본질적으로 합성된 비타민 D3 둘 모두는 생리활성 대사산물을 생성하기 위해 대사 활성화를 거쳐야 한다. 인간에서, 비타민 D3 활성화의 초기 단계는 주로 간에서 발생하고, 중간체 대사산물 25-하이드록시콜레칼시페롤 (칼시디올(calcidiol)로도 지칭됨), 칼시페디올(calcifediol), 25-하이드록시콜레칼시페롤, 또는 25-하이드록시비타민 D3을 형성하기 위한 하이드록실화를 포함한다. 칼시디올은 순환 시스템에서 비타민 D3의 주요 형태이다. 비타민 D2 또한 25-하이드록시비타민 D2로의 유사한 대사 활성화를 겪는다. 이러한 화합물은 총괄적으로 25-하이드록시비타민 D (약어 25(OH)D)로 불리며 이들은 비타민 D 상태를 결정하기 위해 혈청에서 측정되는 주요 대사산물이다.
생물학적 샘플 중 비타민 D 수준을 평가하는 것은 비타민 D 결핍이 포유동물에서 다수의 질병과 관련되므로 중요하다. 샘플에서 비타민 D, 비타민 D 유사체 및 이의 대사산물의 농도를 정확하고 민감하게 결정하기 위한 시약 및 방법에 대한 요구가 있다.
개요
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
상기 식에서, Z는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고, 이는 비치환될 수 있거나 이들 중 하나 이상은 하이드록시, 저급 알콕시, 옥소 및 옥심 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있으며;
R은 -O-석신이미딜, -NH-O-(A)k-R2 (여기서, R2는 신호 생성 시스템의 구성원이다), -(CH2)nCOOH, -(CH2)mCOONHS (NHS는 N-하이드록시석신이미드이다), 소분자, 소분자에 대한 결합 파트너, 또는 지지체이고; A는 연결기이고; k는 0 또는 1이고; n은 1 내지 5의 정수이고 m은 1 내지 5의 정수이고;
R4는 H, OH 또는 저급 알콕시이다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 하기 화학식의 화합물:
또는 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
상기 식에서, R'는 -O-석신이미딜 또는 -NH-O-(A)k-R2 (여기서 R2는 신호 생성 시스템의 구성원이다), -(CH2)nCOOH, -(CH2)mCOONHS (NHS는 N-하이드록시석신이미드이다), 소분자, 소분자에 대한 결합 파트너, 또는 지지체이고; A는 k가 0일 때 직접 결합이고, k가 1일 때 연결기이며; k는 0 또는 1이고; n은 1 내지 5의 정수이고 m은 1 내지 5의 정수이며;
R1은 H, OH, 또는 보호된 OH이고;
R4는 H, OH 또는 저급 알콕시이다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 하기 화학식의 화합물:
또는 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
상기 식에서, L은 자분(magnetic particles), 아크리디늄 에스테르, 자분과 아크리디늄 에스테르의 조합물, 화학발광 입자 및 증감제 입자로 구성된 군으로부터 선택되고; R1'은 OH이고 A'는 결합 또는 연결기이다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 비타민 D의 존재 및 양 중 하나 또는 둘 모두를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서 샘플, 상기 기재된 화합물 및 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원을 포함하는 매질 중의 조합물이 제공된다. 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서 내인성 결합 물질로부터 비타민 D를 방출시키기 위한 방출제는 샘플의 전처리제로서 또는 검정 매질에 포함된다. 조합물은 복합체를 형성하기 위해 화합물을 특이적 결합 구성원에 결합시키는 조건에 적용된다. 복합체의 양이 측정되며, 복합체의 양은 샘플에서 비타민 D의 존재 및 양 중 하나 또는 둘 모두와 관련된다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 비타민 D의 존재 및 양 중 하나 또는 둘 모두를 결정하는 방법에 관한 것이다. 샘플, 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원 및 하기 화학식의 화합물:
또는 하기 화학식의 화합물을 포함하는 조합물이 제공된다:
상기 식에서, R"은 -NH-O-A"-R2'이고, 여기서 R2'는 신호 생성 시스템의 구성원이며, A"는 결합 또는 연결기이고,
R1"은 H 또는 OH이다.
임의로, 방출제도 포함된다. 조합물은 복합체를 형성하기 위해 화합물을 특이적 결합 구성원에 결합시키는 조건에 적용되며, 복합체의 양이 측정된다. 복합체의 양은 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양과 관련된다.
도 1은 본원에 기재된 원리에 따른 예에 부합하는 화합물의 합성 개략도이다.
도 2는 본원에 기재된 원리에 따른 예에 부합하는 화합물의 합성 개략도이다.
도 2는 본원에 기재된 원리에 따른 예에 부합하는 화합물의 합성 개략도이다.
특수한 구체예의 상세한 설명
화합물
상기 언급된 대로, 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
상기 식에서, Z는, 예를 들어, 1 내지 10개, 또는 1 내지 9개, 또는 1 내지 8개, 또는 1 내지 7개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 5개, 또는 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개, 또는 2 내지 10개, 또는 2 내지 9개, 또는 2 내지 8개, 또는 2 내지 7개, 또는 2 내지 6개, 또는 2 내지 5개, 또는 2 내지 4개, 또는 2 내지 3개, 또는 3 내지 10개, 또는 3 내지 9개, 또는 3 내지 8개, 또는 3 내지 7개, 또는 3 내지 6개, 또는 3 내지 5개, 또는 3 내지 4개, 또는 4 내지 10개, 또는 4 내지 9개, 또는 4 내지 8개, 또는 4 내지 7개, 또는 4 내지 6개, 또는 4 내지 5개, 또는 5 내지 10개, 또는 5 내지 9개, 또는 5 내지 8개, 또는 5 내지 7개, 또는 5 내지 6개, 또는 6 내지 10개, 또는 6 내지 9개, 또는 6 내지 8개, 또는 6 내지 7개, 또는 7 내지 10개, 또는 7 내지 9개, 또는 7 내지 8개, 또는 8 내지 10개, 또는 8 내지 9개, 또는 9 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고, 이는 비치환될 수 있거나 이들 중 하나 이상은 하이드록시, 1 내지 5개, 또는 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개, 또는 2 내지 5개, 또는 2 내지 4개, 또는 2 내지 3개, 또는 3 내지 5개, 또는 3 내지 4개, 또는 4 내지 5개의 탄소 원자의 알콕시, 옥소 및 옥심 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있으며;
R은 -O-석신이미딜, -NH-O-(A)k-R2 (여기서, R2는 신호 생성 시스템의 구성원이다), -(CH2)nCOOH, -(CH2)mCOONHS (NHS는 N-하이드록시석신이미드이다), 소분자, 소분자에 대한 결합 파트너, 또는 지지체이고; A는 k가 0일 때 결합이고 k가 1일 때 연결기이며; k는 0 또는 1이고; n은 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이고;
R4는 H, OH 또는 저급 알콕시이다.
용어 "알킬"은 선형, 분지형, 또는 고리형 배치의 지정된 수의 탄소 원자의 알킬기를 포함한다. "알킬"의 예는 비제한적으로 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 2차- 및 3차-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 노르보르닐을 포함한다.
용어 "알케닐"은 선형- 또는 분지형-배치의 명시된 수의 탄소 원자 및 사슬을 따라 어느 지점에서 발생할 수 있는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합의 탄화수소 사슬을 포함하고, 이의 예는 비제한적으로 예를 들어 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 디메틸 펜테닐을 포함한다.
용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 명시된 수의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타내고, 예를 들어 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐, 및 2-부티닐을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "알콕시"는 선형, 분지형 또는 고리형 배치의 지정된 수의 탄소 원자의 알킬기를 포함하고, 여기서 알킬기는 부모 화합물에 연결되기 위한 에테르 산소를 포함한다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 연결기 A는 예를 들어 약 2000 미만, 또는 약 1500 미만, 또는 약 1000 미만, 또는 약 500 미만, 또는 약 300 미만, 또는 약 200 미만, 또는 약 150 미만의 분자량을 갖는다. 연결기는 수소를 세지 않고, 약 2 내지 약 200개 원자, 또는 4 내지 약 150개 원자, 또는 약 5 내지 약 100개 원자, 또는 약 5 내지 약 50개 원자, 또는 약 5 내지 약 25개 원자를 포함할 수 있고, 예를 들어, 각각 독립적으로 탄소, 산소, 황, 질소, 및 인으로 구성된 군으로부터 선택되는 2 내지 약 100개 원자, 또는 3 내지 약 90개 원자, 또는 약 4 내지 약 80개 원자, 또는 약 5 내지 약 7개 원자, 또는 약 10 내지 약 50개 원자, 또는 약 10 내지 약 25개 원자, 또는 약 5 내지 약 20개 원자, 또는 약 5 내지 약 10개 원자의 사슬을 포함할 수 있다. 연결기에서 헤테로원자의 수는 연결기의 크기에 의존적이고, 일부 예에서, 그 수는 예를 들어 0 내지 약 30개, 또는 1 내지 약 25개, 또는 약 2 내지 약 20개, 또는 약 2 내지 약 15개, 또는 약 2 내지 약 10개, 또는 약 3 내지 약 10개, 또는 약 3 내지 약 5개의 범위이다.
헤테로원자는 하나 이상의 작용기의 형태일 수 있고, 예를 들어 아민 (일차, 이차, 또는 삼차), 카르바메이트, 에테르, 에스테르, 아미드, 우레아, 설폰아미드, 티오에테르, 하이드라존, 하이드라지드, 아미딘, 및 포스페이트 에스테르 중 하나 이상을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 본원에 기재된 원리에 따른 한 예에서, 연결기는 원자의 수가 탄소 원자를 포함하는 약 6 내지 약 20개, 또는 약 6 내지 약 15개, 또는 약 6 내지 약 10개, 또는 약 7 내지 약 20개, 또는 약 7 내지 약 15개, 또는 약 7 내지 약 10개, 또는 약 7 내지 약 9개, 또는 약 7 내지 약 8개, 또는 약 7개 원자의 사슬에 이차 아민 작용기 형태의 2개의 질소 원자 및 하나의 카르보닐기를 포함한다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 연결기는 거대분자이고 중합성일 수 있다. 중합성 거대분자는 일반적으로 약 1 내지 약 10,000개 모노머 단위(monomer unit) 또는 그 초과의 길이, 또는 약 10 내지 약 10,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 100 내지 약 10,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 500 내지 약 10,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 1,000 내지 약 10,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 2,000 내지 약 10,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 3,000 내지 약 10,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 5,000 내지 약 10,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 10 내지 약 8,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 100 내지 약 8,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 1,000 내지 약 8,000개 모노머 단위의 길이, 또는 약 100 내지 약 7,000개 모노머 단위 등의 길이이다. 모노머 단위의 수는 모노머 단위 사슬의 원자의 수, 모노머 단위의 조성 등에 의존적이다.
중합성 거대분자의 분자량은 적어도 약 2,000이다. 분자량은 약 2,000 내지 약 10,000,000 또는 그 초과, 또는 약 2,000 내지 약 8,000,000, 또는 약 2,000 내지 약 6,000,000, 또는 약 2,000 내지 약 5,000,000 또는 약 2,000 내지 약 4,000,000, 또는 약 2,000 내지 약 3,000,000 또는 약 2,000 내지 약 2,000,000, 또는 약 2,000 내지 약 1,000,000, 또는 약 5,000 내지 약 10,000,000 또는 그 초과, 또는 약 5,000 내지 약 8,000,000, 또는 약 5,000 내지 약 6,000,000, 또는 약 5,000 내지 약 5,000,000 또는 약 5,000 내지 약 4,000,000, 또는 약 5,000 내지 약 3,000,000 또는 약 5,000 내지 약 2,000,000, 또는 약 5,000 내지 약 1,000,000, 또는 약 10,000 내지 약 10,000,000 또는 그 초과, 또는 약 10,000 내지 약 8,000,000, 또는 약 10,000 내지 약 6,000,000, 또는 약 10,000 내지 약 5,000,000 또는 약 10,000 내지 약 4,000,000, 또는 약 10,000 내지 약 3,000,000 또는 약 10,000 내지 약 2,000,000, 또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 등일 수 있다.
중합성 거대분자는 선형 또는 또는 분지형 또는 이의 조합일 수 있다. 선형 폴리머는 원자의 선형 사슬을 포함하고, 분지형 폴리머는 원자의 분지형 사슬을 포함한다. 선형 사슬의 각 원자는 수소 대신 하나 이상의 치환기를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리머(polymer)는 하나를 초과하는 유형의 모노머 단위를 포함하는 코폴리머(copolymer)일 수 있다. 일부 구체예에서, 중합성 거대분자의 모노머 단위 중 하나 이상은 탄소 원자 및 하나 이상의 헤테로원자(heteroatom), 예컨대 산소, 황, 질소, 인 등을 포함한다.
중합성 거대분자는 자연-발생 물질 또는 합성 작제물일 수 있다. 일부 구체예에서, 중합성 거대분자는 폴리펩티드(polypeptide)이다. 자연-발생 폴리펩티드의 예는 예시로서 단백질, 예컨대 인간 또는 다른 동물 공급원에서 비롯될 수 있는 알부민(albumin) 및 글로불린(globulin)을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 알부민은 예를 들어 인간 혈청 알부민 및 소 혈청 알부민을 포함한다. 글로불린은 예를 들어 감마 글로불린(gamma globulin) 및 면역글로불린(immunoglobulin)을 포함한다. 그 밖의 중합성 거대분자의 예는 예시로서 덴드리머(dendrimer), 중합성 카르복실레이트 (예컨대, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산, 폴리갈락투론산, 폴리메타크릴산 등), 중합성 아민 (예컨대, 폴리에틸렌 아민, 폴리리신, 폴리글루타민, 폴리에틸렌 이민, 폴리알릴아민 등), 중합성 에테르 (폴리에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌 옥사이드 등), 중합성 티오에테르 (예컨대, 폴리에틸렌 티오에테르 등), 중합성 설프하이드릴 (예컨대, 폴리시스테인) 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
상기 언급된 대로, 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, R2는 신호 생성 시스템의 구성원일 수 있다. 신호 생성 시스템은 하나 이상의 구성요소를 지닐 수 있고, 적어도 하나의 구성요소는 표지이다. 신호 생성 시스템은 샘플 중 비타민 D의 존재와 관련된 신호를 발생시킨다. 신호 생성 시스템은 측정가능한 신호를 생성하는데 필요한 모든 시약을 포함한다. 신호 생성 시스템의 그 밖의 구성요소가 현상액에 포함될 수 있고, 이는 예를 들어 기질, 인핸서(enhancer), 활성제, 화학발광 화합물, 보조인자, 억제제, 스캐빈져(scavenger), 금속 이온, 및 신호 발생 물질의 결합에 요구되는 특이적 결합 물질을 포함할 수 있지만 이로 한정되는 것은 아니다. 신호 생성 시스템의 그 밖의 구성요소는 예를 들어 조효소, 효소 생성물과 반응하는 물질, 그 밖의 효소 및 촉매일 수 있다. 신호 생성 시스템은 외부 수단에 의해, 전자기 방사를 이용하여, 바람직하게는 육안 검사에 검출가능한 신호를 제공한다. 예시적인 신호 생성 시스템은 관련 기재가 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 5,508,178호에 기재되어 있다.
용어 "표지"는 폴리(아미노산) 표지 및 비-폴리(아미노산) 표지를 포함한다. 용어 "폴리(아미노산) 표지 모이어티(poly(amino acid) label moieties)"는 단백질, 예컨대, 비제한적으로 예를 들어 효소, 항체, 펩티드, 및 면역원인 표지를 포함한다. 예를 들어, 효소와 같은 표지 단백질의 경우, 분자량 범위는 약 10,000 내지 약 600,000, 또는 약 10,000 내지 약 300,000 분자량일 것이다. 예를 들어 단백질의 약 200,000 분자량 당 본원에 기재된 원리에 따른 적어도 하나의 화합물 (유사체 그룹), 또는 약 150,000 분자량 당 적어도 약 하나, 또는 약 100,000 분자량 당 적어도 약 하나, 또는 약 50,000 분자량 당 적어도 약 하나의 화합물이 일반적으로 존재한다. 효소의 경우에, 유사체 그룹의 수는 일반적으로 1 내지 약 20개, 약 2 내지 약 15개, 약 3 내지 약 12개, 또는 약 6 내지 약 10개이다.
효소는 예시로서 예를 들어 산화환원 효소, 예컨대 데하이드로게나제, 예컨대, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 및 락테이트 데하이드로게나제; 염료 전구체를 염료로 산화시키기 위해 과산화수소의 생성 및 과산화수소의 이용에 수반되는 효소, 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제 및 마이크로퍼옥시다제; 하이드롤라제, 예컨대 알칼리 포스파타제 및 β-갈락토시다제; 루시퍼라제, 예컨대 반딧불이 루시퍼라제, 및 박테리아 루시퍼라제; 트랜스퍼라제; 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 이용하는 효소, 즉 퍼옥시다제, 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된, 비제한적으로, 예를 들어 사카라이드 옥시다제, 예컨대 글루코스 및 갈락토스 옥시다제, 또는 헤테로사이클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제와 같은 효소의 조합물을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "비-폴리(아미노산) 표지"는 단백질이 아닌 표지를 포함한다. 비-폴리(아미노산) 표지는 직접 검출될 수 있거나 검출가능한 신호를 생성하는 반응을 통해 검출될 수 있다. 비-폴리(아미노산) 표지는 동위원소이거나 비-동위원소일 수 있고, 예시로서 예를 들어 방사성동위원소, 발광 화합물 (비제한적으로, 예를 들어 아크리디늄 에스테르, 형광 화합물 및 화학발광 화합물을 포함한다), 촉매를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 프로모터(promotor), 염료, 조효소, 효소 기질, 방사성 기, 및 증폭가능한 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있지만 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 예에서, 비-폴리(아미노산) 표지는 예를 들어 방사성동위원소, 발광 (예컨대, 아크리디늄 에스테르), 미립자 (예컨대, 미결합된 것으로부터 분리될 수 있는 결합된 자분, 탁도 및 비탁법에 의해 측정될 수 있는 라텍스 입자(latex particle), 및 화학발광 비드(chemiluminescence bead) (예컨대, LOCI 케미비드(LOCI chemibead))이다.
상기 언급된 대로, 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, R2는 약 200 내지 약 2,000, 또는 약 200 내지 약 1,500, 또는 약 200 내지 약 1,000, 또는 약 200 내지 약 500의 분자량의 소 유기 분자일 수 있다. 그러한 소 유기 분자는 비제한적으로 예를 들어 바이오틴(biotin), 형광 분자 (예컨대, 플루오레세인(fluorescein) 및 로다민(rhodamine), 예를 들어), 화학발광 분자, 및 디니트로페놀을 포함한다. 소 유기 분자에 대한 결합 파트너는 소 분자를 특이적으로 인지하고 이에 결합하는 분자이다. 소분자에 대한 결합 파트너는 소분자의 특성에 의해 정의되고, 비제한적으로 예를 들어 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 소 유기 분자에 대한 항체 (비제한적으로, 예를 들어 형광 분자에 대한 항체 (예컨대 플루오레세인에 대한 항체 및 로다민에 대한 항체)를 포함한다), 화학발광 분자에 대한 항체, 및 디니트로페놀에 대한 항체를 포함한다.
상기 언급된 대로, 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, R2는 유기 또는 무기, 고체 또는 유체, 수불용성 물질로 구성될 수 있고 투명하거나 부분적으로 투명할 수 있는 지지체일 수 있다. 지지체는, 예를 들어, 비제한적으로, 입자 (미립자 지지체), 예를 들어, 비드, 필름(film), 막, 튜브(tube), 웰(well), 스트립(strip), 로드(rod), 섬유, 또는 평면, 예컨대, 예를 들어 플레이트(plate) 또는 페이퍼(paper)와 같은 임의의 다수의 형상을 지닐 수 있다. 지지체는 이것이 이용되는 매질에 현탁될 수 있거나 현탁되지 않을 수 있다. 현탁될 수 있는 지지체의 예는 예를 들어 중합성 물질, 예컨대 라텍스, 지질 이중층 또는 리포솜(liposome), 오일 점적, 세포 및 하이드로겔(hydrogel), 및 자분이다. 그 밖의 지지체 조성물은 그 자체로 또는 다른 물질과 함께 이용되는, 예를 들어, 폴리머, 예컨대, 예시로서 비제한적으로, 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4 메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트)를 포함한다. 지지체는 예를 들어 염료, 촉매 또는 그 밖의 검출가능한 기로 표지되거나 추가로 표지되지 않을 수 있다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 지지체는 입자일 수 있다. 입자는 적어도 약 0.02 마이크론 내지 약 100 마이크론 이하의 평균 직경을 갖는다. 일부 예에서, 입자는 약 0.05 마이크론 내지 약 20 마이크론, 또는 약 0.3 마이크론 내지 약 10 마이크론의 평균 직경을 갖는다. 입자는 바람직하게는 일반적으로 약 0.7 g/mL 내지 약 1.5 g/mL의 물에 가까운 밀도의 유기 또는 무기, 팽윤성 또는 비-팽윤성, 다공성 또는 비-다공성일 수 있고, 투명하거나, 부분적으로 투명하거나, 불투명할 수 있는 물질로 구성될 수 있다. 입자는 예를 들어 생물학적 물질, 예컨대 세포 및 미생물, 예컨대, 적혈구, 백혈구, 림프구, 하이브리도마(hybridoma), 스트렙토코쿠스(streptococcus), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 및 이. 콜라이(E. coli), 바이러스(virus) 등일 수 있다. 입자는 유기 및 무기 폴리머, 리포솜, 라텍스 입자, 자분 또는 비-자분, 인지질 소포, 킬로마이크론(chylomicron), 지단백질 등으로 구성된 입자일 수도 있다. 일부 예에서, 입자는 이산화크롬 (chrome) 입자 또는 라텍스 입자이다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 상기 화학식의 Z는 -(CH2)sC(CH3)2-R1이고, 여기서 s는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5, 또는 3, 또는 2, 또는 1의 정수이고, R1은 H, OH, 또는 보호된 OH이다. 특정 예에서, R1은 OH이다.
본원에 기재된 원리에 따른 특정 에에서, s는 3이고, 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, R'는 -O-석신이미딜 또는 -NH-O-(A)k-R2 (여기서 R2는 신호 생성 시스템의 구성원이다), -(CH2)nCOOH, -(CH2)mCOONHS (NHS는 N-하이드록시석신이미드이다), 소분자, 소분자에 대한 결합 파트너, 또는 지지체이고; k는 0 또는 1이고; A는 k가 0일 때 결합이고, k가 1일 때 연결기이며; n은 1 내지 5의 정수이고 m은 1 내지 5의 정수이며;
R1은 H, OH, 또는 보호된 OH이다. 특정 예에서, R1은 OH이고;
R4는 H, OH 또는 저급 알콕시이다. 특정 예에서, R4는 H이다. 또 다른 특정 예에서, R4는 OH이다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 상기 화학식의 Z는 -(CH=CH)(CH2)vCH(CH3)(CH3)2-R1이고, 여기서 v는 0 내지 5, 또는 0 내지 4, 0 내지 3, 또는 0 내지 2, 또는 0 내지 1, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5, 또는 3, 또는 2, 또는 1의 정수이고, R1은 H, OH, 또는 보호된 OH이다. 특정 예에서, R1은 OH이다. 본원에 기재된 원리에 따른 특정 예에서, v는 0이고, 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, R'는 -O-석신이미딜 또는 -NH-O-(A)k-R2 (여기서 R2는 신호 생성 시스템의 구성원이다), -(CH2)nCOOH, -(CH2)mCOONHS (NHS는 N-하이드록시석신이미드이다), 소분자, 소분자에 대한 결합 파트너, 또는 지지체이고; k는 0 또는 1이고; A는 k가 0일 때 결합이고, k가 1일 때 연결기이며; n은 1 내지 5의 정수이고 m은 1 내지 5의 정수이며;
R1은 H, OH, 또는 보호된 OH이다. 특정 예에서, R1은 OH이고;
R4는 H, OH 또는 저급 알콕시이다. 특정 예에서, R4는 H이다. 또 다른 특정 예에서, R4는 OH이다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 또 다른 모이어티에 직접 또는 연결기의 매개를 통한 카르바메이트 연결을 포함하는 25-OH 비타민 D2의 유도체 및 25-OH 비타민 D3의 유도체에 관한 것이다. 모이어티는 신호 생성 시스템의 구성원, 지지체 또는 특이적 결합 쌍의 구성원일 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, L은 자분, 아크리디늄 에스테르, 자분과 아크리디늄 에스테르의 조합물 (예컨대, 아크리디늄 에스테르 표지된 상자성 입자), 화학발광 입자 및 증감제 입자로 구성된 군으로부터 선택되고; 상기 기재된 대로 R1'은 OH이고 A'는 결합 또는 연결기이다. 일부 예에서, 연결기는 화학식 -(CH2)p-C(O)-(W)b-(CH2)q-(X)c-(CH2)r-을 갖고, 여기서 W 및 X는 각각 독립적으로 -NH- 및 -O-이고, b 및 c는 각각 독립적으로 0 또는 1이고, p는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이고, q는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이고, r은 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이다. 일례에서, b 및 c는 각각 1이고, p는 1이고, q는 2이고, r은 1이다. 일부 예에서, 연결기는 하기 화학식 -(CH2)p-C(O)-NH-(CH2)q-NH-(CH2)r-을 갖고, 여기서 p, q 및 r은 상기 정의된 바와 같다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, L은 자분, 아크리디늄 에스테르, 자분과 아크리디늄 에스테르의 조합물 (예컨대, 아크리디늄 에스테르 표지된 상자성 입자), 화학발광 입자 및 증감제 입자로 구성된 군으로부터 선택되고; 상기 기재된 대로 R1'은 OH이고 A'는 결합 또는 연결기이다. 일부 예에서, 연결기는 화학식 -(CH2)p-C(O)-(W)b-(CH2)q-(X)c-(CH2)r-을 갖고, 여기서 W 및 X는 각각 독립적으로 -NH- 및 -O-이고, b 및 c는 각각 독립적으로 0 또는 1이고, p는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이고, q는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이고, r은 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3, 또는 1 내지 2, 또는 2 내지 5, 또는 2 내지 4, 또는 2 내지 3, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4, 또는 4 내지 5의 정수이다. 일례에서, b 및 c는 각각 1이고, p는 1이고, q는 2이고, r은 1이다. 일부 예에서, 연결기는 하기 화학식 -(CH2)p-C(O)-NH-(CH2)q-NH-(CH2)r-을 갖고, 여기서 p, q 및 r은 상기 정의된 바와 같다.
자분은 상자성 입자, 철자성 입자 및 반자성 입자를 포함한다. 그러한 입자는 비제한적으로 예를 들어 크롬, 구리, 코발트, 알루미늄, 망간, 철 및 니켈을 포함하는 주기율표의 4-7족의 전이 금속을 포함한다.
화학발광 입자는 이와 결합된 화학발광 화합물을 갖는 입자이다. 본원에서 사용되는 구 "~와 결합된(associated therewith)"은 화합물, 예컨대 화학발광 화합물 및 입자가 예를 들어 직접 또는 간접 결합, 흡착, 흡수, 혼입, 또는 용해에 의해 결합될 수 있는 것을 의미한다. 이용될 수 있는 화학발광 화합물의 예는 관련 기재가 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 5,340,716호 및 6,251,581호에 개시된 것들이다. 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 화학발광 화합물은 직접 여기 또는 광에 의해 감작된 여기시에 또는 일중항 산소와의 반응시에 화학 반응이 일어나서, 일반적으로 250 내지 1200 nm의 파장 범위 내에서 동시 또는 연속 발광으로 분해될 수 있는 준안정한 반응 생성물을 형성하는 광활성화가능한 물질이다. 용어 "광활성화가능한"은 "광화학적으로 활성화가능한" 것을 포함한다. 일례에서, 화학발광 화합물은 일중항 산소와 반응하여 디옥세탄 또는 디옥세타논을 형성하는 것들이다. 후자는 일반적으로 전자가 풍부한(electron rich) 올레핀이다. 그러한 예시적인 전자가 풍부한 올레핀은 에놀 에테르, 에나민, 9-알킬리덴-N-알킬아크리단, 아릴비닐에테르, 디옥센, 아릴이미다졸, 9-알킬리덴-크산탄 및 루시게닌(lucigenin)이다. 그 밖의 화합물은 루미놀(luminol) 및 기타 프탈하이드라지드 및 광화학적으로 불안정한 보호기에 의해 보호됨에 의해 화학발광 반응을 겪는 것으로부터 보호되는 화학발광 화합물을 포함하고, 그러한 화합물은, 예를 들어, 반딧불이 루시페린, 아쿠아포린(aquaphorin), 및 루미놀을 포함한다. 이용될 수 있는 그러한 화학발광 화합물의 예는 관련 기재가 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 5,709,994호에 개시된 것들이다.
증감제 입자는 이와 결합된 증감제 화합물을 갖는 입자이고, 이는 비제한적으로 광증감제 화합물을 포함한다. 이용될 수 있는 증감제 화합물의 예는 관련 기재가 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 5,340,716호 및 6,251,581호에 개시된 것들이다.
광증감제는 일반적으로 광을 이용한 여기에 의해 일중항 산소를 발생시키는 증감제이다. 일부 예에서, 광증감제는 화학발광 화합물보다 긴 파장에서 흡수되고 화학발광 화합물보다 낮은 에너지 트리플렛(energy triplet)을 지닌다. 광증감제는 광활성화가능할 수 있다 (예컨대, 염료 및 방향족 화합물). 광증감제는 일반적으로 다수의 컨쥬게이션된(conjugated) 이중 또는 삼중 결합과 함께, 보통 공유적으로 결합된 원자로 구성되는 화합물이다. 화합물은 200-1100 nm, 일반적으로 300-1000 nm, 바람직하게는 450-950 nm 파장 범위에서 광을 흡수할 것이다. 전형적인 광증감제는 예를 들어 아세톤, 벤조페논, 9-티옥산톤, 에오신, 9,10-디브로모안트라센, 메틸렌 블루, 메탈로-포르피린 (예컨대, 헤마토포르피린), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 클로로필(chlorophyll), 로즈 뱅갈(rose bengal), 벅민스터풀러렌(buckminsterfullerene), 및 이러한 화합물의 유도체를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 그 밖의 광증감제의 예는 문헌[N.J. Turro, "Molecular Photochemistry", page 132, W. A. Benjamin Inc., N.Y. 1965]에 열거된다. 광증감제는 활성화가 일중항 산소에 의한 것인 광활성화를 돕는다. 일반적으로, 광증감제는 광을 흡수하고, 이렇게 형성된 여기된 광증감제는 산소를 활성화시켜 일중항 산소를 생성하고, 이는 화학발광 화합물과 반응하여 준안정한 발광 중간체를 제공한다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, L, p, q 및 r은 상기 정의된 바와 같다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, L, p, q 및 r은 상기 정의된 바와 같다.
화합물의 제조
본원에 기재된 원리에 따른 화합물을 제조하는 방법의 예는 예시로서 도 1 및 2를 참조로 하여 기재되어 있으나 이로 한정되는 것은 아니다. 그 밖의 접근법을 이용하여 본원에 기재된 원리와 일치하는 화합물을 형성할 수 있다. 도 1을 참조하면, 25-OH VD3 (I)을 처리하여 석신이미딜 카르보네이트 유도체 II를 형성한다. 예를 들어, I은 무수 극성 유기 용매에서 염기의 존재 하에 디석신이미딜 카르보네이트와 조합될 수 있다. 염기는, 예를 들어, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민일 수 있다. 무수 극성 유기 용매는, 예를 들어, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 테트라하이드로푸란 (THF), 디메틸포름아미드 (DMF) 또는 디메틸설폭사이드 (DMSO)일 수 있다. 반응 동안 온도는 약 18℃ 내지 약 25℃이거나, 대략 실온이다. 반응물들은 반응 동안 예를 들어 교반 또는 진탕에 의해 교반된다. 반응의 기간은 약 2시간 내지 약 24시간, 또는 약 15 내지 약 21시간, 또는 약 18시간이다.
카르바메이트 III (25-OH 비타민 D3 3-카르바메이트, p = 1)은, 예를 들어, 석신이미딜 카르보네이트 유도체 II를 무수 극성 유기 용매에서 염기의 존재 하에 카르복시메톡실아민 헤미하이드로클로라이드 (CMO)의 현탁액과 조합시킴에 의해 II로부터 제조될 수 있다. 염기는, 예를 들어, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민일 수 있다. 무수 극성 유기 용매는, 예를 들어, DMF 또는 DMSO일 수 있다. 상기 반응물을 함유하는 반응 용기를 가열조에서 반응 동안 약 18℃ 내지 약 25℃, 또는 약 22℃의 가열조 온도로 유지한다. 반응물은 반응 동안 예를 들어 교반 또는 진탕에 의해 교반된다. 반응의 기간은 약 15 내지 약 21시간, 또는 약 18시간이다. 유기 용매는 증발에 의해 제거되며, 이는 반응 용기의 내용물을 진공으로 처리함에 의해 가속될 수 있다. 잔류물을, 예를 들어 에틸 아세테이트 또는 디클로로메탄과 같은 극성 유기 용매와 조합시킨 다음, 무기염의 수용액, 예컨대 염수 또는 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척할 수 있다. 유기상을, 예를 들어, 무수 무기염, 예컨대 소듐 설페이트 또는 마그네슘 설페이트와 혼합시킴에 의해 건조시킬 수 있다. 건조 후에, 유기상을 처리하여 유기상이, 예를 들어 여과 또는 디캔팅(decantation)되게 하여 임의의 고체 물질을 분리할 수 있다. 유기 용매는 증발에 의해 제거되며, 이는 반응 용기의 내용물을 진공으로 처리함에 의해 가속될 수 있다. 생성된 건조 생성물을 크로마토그래피 수단, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC), 고 난류 액체 크로마토그래피 (HTLC), 또는 가스 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 생성물을, 예를 들어, DMSO 또는 DMF와 같은 무수 극성 유기 용매에 저장할 수 있다.
카르바메이트 III은, 예를 들어, 입자와 같은 고체 지지체의 연결기로의 커플링(coupling)을 위해 활성화될 수 있다. 본원에 기재된 원리에 따른 일례에서, 카르바메이트 III은 설포-NHS 에스테르 IV의 형성에 의해 활성화된다. 반응은, 카르바메이트 III을, 예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디미이드 (EDAC)의 존재 하에, 예를 들어, DMSO와 같은 무수 극성 유기 매질에서, 약 15℃ 내지 약 40℃, 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도, 또는 주위 온도에서 약 10시간 내지 약 25시간, 또는 약 12시간 내지 약 20시간, 또는 약 18의 기간 동안 활성화제, 예컨대 설포-NHS와 조합시킴에 의해 수행된다. 매질은 예를 들어 회전 또는 교반에 의한 것과 같이 교반된다.
도 2를 참조하면, 입자, 예를 들어, 그 안에 혼입된 화학발광 화합물 (염료)을 갖고 내부 아미노덱스트란 층 및 외부 덱스트란 알데하이드 층을 갖는 라텍스 입자 (본 예에서 EPRM으로 지정됨)는 관련 기재가 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 7,179,660호에 기재된 것과 유사한 절차에 의해 제조된다. 외부 덱스트란 알데하이드 층 상의 알데하이드기는 환원성 아민화 조건 하에 에틸렌 디아민과 반응하여, 에틸렌 사슬 및 말단 아민기를 포함하는 펜던트 모이어티(pendant moieties)를 지니는 입자 시약인 시약 V (EPRM-EDA)를 형성한다. 환원성 아민화 조건은, 예를 들어, 금속 하이드라이드 (예컨대, 소듐 보로하이드라이드 또는 포타슘 보로하이드라이드), 소듐 시아노보로하이드라이드, 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드와 같은 환원제의 이용을 포함한다. 반응은 반응 동안 약 20℃ 내지 약 100℃, 또는 약 30℃ 내지 약 50℃의 온도에서, 약 1시간 내지 약 48시간, 또는 약 5시간 내지 약 24시간의 기간 동안 수성 매질에서 수행된다. 외부 덱스트란 알데하이드 층과의 펜던트 모이어티의 연결 지점은 이차 아민 연결을 포함한다.
설포-NHS 에스테르 IV (예를 들어, DMSO 또는 DMF와 같은 무수 극성 유기 용매에서)는 입자 시약 V (예를 들어, DMSO 또는 DMF와 같은 무수 극성 유기 용매에서, 예를 들어, GAFAC® 또는 TWEEN® 20과 같은 계면활성제 이용)와 조합된다. 반응 혼합물은, 예를 들어, 교반 또는 진탕에 의해 교반된다. 반응 동안 온도는 약 18℃ 내지 약 25℃, 또는 대략 실온이다. 반응물은 예를 들어 교반 또는 진탕에 의해 반응 동안 교반된다. 반응 기간은 예를 들어 약 2시간 내지 약 24시간, 또는 약 15 내지 약 21시간이다. 생성된 입자 (VI)는 1회 이상의 세척 및 정제 기법, 예컨대 정용여과 및 초음파처리에 의해 처리될 수 있다.
본원에 기재된 원리에 따른 비타민 D2 유도체는 본원에 기재된 원리에 따른 비타민 D3 유도체의 제조에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
본 화합물을 이용한 비타민 D에 대한 검정법의 일반적인 설명
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예는 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 비타민 D의 존재 및 양 중 하나 또는 둘 모두를 결정하는 방법에 관한 것이고, 본원에서 "비타민 D에 대한 검정법"으로서 언급될 수 있다. 상기 검정에서, 샘플, 신호 생성 시스템의 구성원을 포함하는 상기 기재된 화합물 및 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원을 포함하는 조합물이 매질 중에 제공된다. 검정에 관해 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비타민 D"는 25-하이드록시콜레칼시페롤 (칼시디올로도 언급됨), 칼시페디올, 25-하이드록시콜레칼시페롤, 또는 25-하이드록시비타민 D (약어 25(OH)D); 칼시디올; 1,25-디하이드록시비타민 D3 (칼시트리올; 1,25(OH)2D3); 1,25-디하이드록시 비타민 D4; 1,25-디하이드록시 비타민 D5; 및 1,25-디하이드록시 비타민 D6 (상기 모두의 대사산물 포함) 중 하나 이상을 의미한다.
본원에 기재된 원리에 따른 한 특정한 예는 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 비타민 D의 존재 및 양 중 하나 또는 둘 모두를 결정하는 방법에 관한 것이다. 샘플, 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원 및 하기 화학식의 화합물:
또는 하기 화학식의 화합물을 포함하는 조합물이 제공된다:
상기 식에서, R"는 -NH-O-A"-R2'이고, 여기서 R2'는 상기 정의된 대로 신호 생성 시스템의 구성원이며, A"는 상기 정의된 대로 결합 또는 연결기이고, R1"은 H 또는 OH이다. 조합물은 상기 화합물이 특이적 결합 구성원에 결합하여 복합체를 형성하는 조건에 놓이며, 복합체의 양이 측정된다. 복합체의 양은 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양과 관련된다.
특이적 결합 구성원은 표면 상에 또는 공동에 영역을 갖는, 두 상이한 분자들 중 하나인 특이적 결합 쌍의 구성원이고, 이는 다른 분자에 특이적으로 결합하므로 다른 분자의 특정 공간 및 극성 조직에 상보적인 것으로서 정의된다. 특이적 결합 쌍의 구성원은, 예를 들어 비록 다른 특이적 결합쌍, 예컨대 바이오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 효소-기질, 핵산 듀플렉스(nucleic acid duplexes), IgG 단백질 A, 폴리뉴클레오티드 쌍, 예컨대 DNA-DNA, DNA-RNA가 면역학적 쌍은 아니지만 "sbp 구성원"이라는 용어의 범위 내에 포함되긴 하나, 일반적으로 항원 항체와 같은 면역학적 쌍의 구성원일 것이다.
특이적 결합은 다른 분자가 실질적으로 덜 인지되는 것에 비해 두 상이한 분자들 중 하나가 다른 하나에 비해 특정하게 인지되는 것을 포함한다. 반면, 비특이적 결합은 특수한 표면 구조와 비교적 무관한 분자들 간의 비공유적 결합을 포함한다. 비특이적 결합은 분자들 간의 소수성 상호작용을 포함하는 여러 요인에서 비롯될 수 있다. 바람직한 결합 파트너는 항체이다.
본원에 기재된 원리에 따른 검정법의 일부 예에서, 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원은 완전한 면역글로불린 분자 또는 이의 단편일 수 있는 비타민 D에 대한 항체이다. 항체는 다양한 부류 및 아이소형(isotype), 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, 및 IgM을 포함한다. 이의 단편은 Fab, Fv 및 F(ab')2, Fab' 등을 포함할 수 있다. 또한, 비타민 D에 대한 결합 친화성이 유지되는 한 적절한 면역글로불린의 응집물, 폴리머, 및 컨쥬게이트(conjugate) 또는 이들의 단편을 이용할 수 있다. 비타민 D에 대한 항체는, 예를 들어 숙주의 면역화 및 혈청 (폴리클로날(polyclonal))의 수집, 연속 하이브리드 세포주(continuous hybrid cell lines)의 제조 및 분비된 단백질 (모노클로날(monoclonal))의 수집 또는 뉴클레오티드 서열 또는 자연 항체의 특이적 결합에 요구되는 아미노산 서열을 적어도 코딩하는 이의 돌연변이된 형태의 클로닝(cloning) 및 발현을 포함하는 기법에 의해 제조될 수 있다.
분석하려는 샘플은 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플이다. 샘플은 생물학적 샘플 또는 비-생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 포유동물 피검체 또는 비-포유동물 피검체로부터 유래될 수 있다. 포유동물 피검체는, 예컨대 인간 또는 그 밖의 동물 종일 수 있다. 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 림프액, 정액, 질 점액, 대변, 소변, 척수액, 침, 대변, 뇌척수액, 눈물, 점액 등과 같은 생물학적 유체; 털, 피부, 기관으로부터의 섹션(section) 또는 절제 조직 또는 다른 신체 부위 등과 같은 생물학적 조직 등을 포함한다. 많은 예에서, 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청이다. 비제한적으로, 예를 들어 폐기 스트림(waste stream)을 포함하는 비-생물학적 샘플이 또한 본원에 기재된 원리에 따른 화합물을 이용하여 분석될 수 있다.
샘플은, 예를 들어, 하기에서 보다 충분히 논의되는 검정 매질일 수 있는 임의의 편리한 매질에서 제조될 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어, 혈액 세포를 용해시키기 위해, 샘플에 전처리가 이용될 수 있다. 일부 예에서, 그러한 전처리는 이후에 검정을 방해하지 않는 매질에서 수행된다.
매질 중의 조합물은 화합물이 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원에 결합하여 복합체를 형성하는 조건으로 처리된다. 복합체의 양이 측정되며, 여기에서 복합체의 양은 샘플 중 비타민 D의 존재 및 양 중 하나 또는 둘 모두와 관련된다.
비타민 D에 대한 검정은 임의의 검정 구성요소 또는 생성물의 분리 없이 (동종) 또는 분리와 함께 (이종) 수행될 수 있다. 이종 검정법은 일반적으로 1회 이상의 분리 단계를 포함하고, 경쟁적 또는 비-경쟁적일 수 있다. 면역검정은 표지되거나 표지되지 않은 시약을 포함할 수 있다. 표지되지 않은 시약을 포함하는 면역검정은 보통 본원에 기재된 원리에 따라 면역원성 컨쥬게이트로부터 제조되는 하나 이상의 항체를 포함하는 비교적 큰 복합체의 형성을 포함한다. 그러한 검정은,예를 들어, 항체 복합체의 검출을 위한 면역침전 및 응집 방법 및 상응하는 광 산란 기법, 예컨대 비탁법 및 비탁분석법을 포함한다. 표지된 면역검정은 비제한적으로 예를 들어 화학발광 면역검정, 효소 면역검정, 형광 편광 면역검정, 방사성면역검정, 억제 검정, 유도 발광 검정, 및 형광 산소 채널링 검정을 포함한다.
면역검정법의 한 일반적인 그룹은 본원에 기재된 원리에 따른 제한된 농도의 화합물을 이용하는 면역검정법을 포함한다. 면역검정법의 또 다른 그룹은 본원에 기재된 원리에 따른, 예를 들어, 과량의 화합물과 같은 하나 이상의 과량의 주요 시약의 이용을 포함한다. 면역검정법의 또 다른 그룹은 본원에 기재된 원리에 따른 화합물이 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원에 결합하여 샘플 중에 존재할 수 있는 비타민 D와 경쟁할 때, 본원에 기재된 원리에 따른 표지된 시약이 표지 신호를 조절하는 분리-없는 동종 검정법을 포함한다.
상기 언급된 대로, 검정은 임의의 검정 구성요소 또는 생성물의 분리 없이 (동종) 또는 분리와 함께 (이종) 수행될 수 있다. 동종 면역검정은 문헌[Rubenstein, et al., 미국특허 3,817,837호, 컬럼 3, 6열 내지 컬럼 6, 64열]에 기재된 EMIT® 검정 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL); 문헌[Ullman, et al., 미국특허 3,996,345호, 컬럼 17, 59열 내지 컬럼 23, 25열]에 기재된 것들과 같은 면역형광 방법; 문헌[Maggio, et al., 미국특허 4,233,402호, 컬럼 6, 25열 내지 컬럼 9, 63열]에 기재된 것들과 같은 효소 채널링 면역검정("ECIA"); 예를 들어, 특히, 미국특허 5,354,693호에 기재된 형광 편광 면역검정("FPIA"); 및 효소결합 면역흡수 검정 ("ELISA")과 같은 효소 면역검정에 의해 예시된다. 예시적인 이종 검정은 문헌[Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39:1157 (1960)]에 기재된 방사성면역검정이다. 상기 기재의 관련 부분은 모두 본원에 참조로서 포함된다.
그 밖의 효소 면역검정은 예를 들어 문헌[Ngo and Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288]에서 논의된 효소 조절 매개된 면역검정 ("EMMIA"); 문헌[Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904]에 기재된 기질 표지된 형광 면역검정 ("SLFIA"); 문헌[Khanna, et al., Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240]에 기재된 조합 효소 공여체 면역검정 ("CEDIA"); 입자 강화된 혼탁 억제 면역검정 ("PETINIA"), 입자 강화된 혼탁 면역검정 ("PETIA")과 같은 동종 입자 표지된 면역검정; 미국특허 7,186,518, 5,147,529, 5,128,103, 5,158,871, 4,661,408, 5,151,348, 5,302,532, 5,422,284, 5,447,870, 및 5,434,051호에 기재된 친화성 이산화크롬 매개된 면역검정("ACMIA") 검정 포맷이고, 이들의 기재는 그 전문이 본원에 포함된다.
그 밖의 검정은 미국특허 6,355,803; 6,673,560; 7,097,995 및 7,319,041호에서 논의된 것들과 같은 아크리디늄 에스테르 표지 검정을 포함하며, 이의 관련 기재는 본원에 참조로서 포함된다. 아크리디늄 에스테르 표지 검정의 특정한 예는 고체상으로서 상자성 입자를 이용하는 아크리디늄 에스테르 표지 면역검정 ("ADVIA" 면역검정)이다. 그 밖의 검정은 솔 입자 면역검정 ("SPIA"), 분산 염료 면역검정 ("DIA"); 금속면역검정 ("MIA"); 효소 막 면역검정 ("EMIA"); 및 발광면역검정 ("LIA")을 포함한다. 그 밖의 유형의 검정은 비타민 D 분석물의 결합시에 본 컨쥬게이트의 광학, 음향 및 전기적 특성에서의 변화를 모니터하는 것을 포함하는 면역센서 검정을 포함한다. 그러한 검정은, 예를 들어, 광학 면역센서 검정, 음향 면역센서 검정, 반도체 면역센서 검정, 전기화학적 변환기 면역센서 검정, 전위차 면역센서 검정, 전류측정 전극 검정을 포함한다.
이종 검정은 일반적으로 1회 이상의 분리를 포함하고, 경쟁적 또는 비-경쟁적일 수 있다. 다양한 경쟁적 및 비-경쟁적 이종 검정 포맷은 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Davalian, et al., 미국특허 5,089,390호, 컬럼 14, 25열 내지 컬럼 15, 9열]에 기재되어 있다. 경쟁적 이종 검정의 예에서, 결합된 비타민 D에 대한 항체를 갖는 지지체는 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플 및 본원에 기재된 원리에 따른 표지된 화합물을 함유하는 매질과 접촉한다. 샘플 중의 비타민 D는 비타민 D 항체와의 결합에 대해, 검출가능한 표지를 지니는 본원에 기재된 원리에 따른 화합물과 경쟁한다. 지지체 및 매질을 분리시킨 후에, 지지체 또는 매질의 표지 활성을 통상적인 기법에 의해 결정하고, 샘플 중 비타민 D 분석물의 양과 관련시킨다. 상기 경쟁적 이종 검정의 변형에서, 지지체는 표지된 시약으로서 본원에 기재된 원리에 따른 표지된 화합물을 포함하고, 비타민 D 항체는 표지를 포함한다.
일부 예에서, 분석하려는 샘플은 검정 매질에서 비타민 D에 대한 항체 및 본원에 기재된 원리에 따른 표지된 화합물과 조합된다. 매질은 표지된 화합물 및 비타민 D에 대한 항체를 포함하는 복합체의 존재 및 양 중 하나 또는 둘 모두에 대해 조사되는데, 여기서 그러한 복합체의 존재 및/또는 양은 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양을 나타낸다.
본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 분석하려는 샘플은, 예를 들어, 비타민 D에 결합하는 혈장 또는 혈청 단백질과 같은 내인성 결합 물질로부터 비타민 D를 방출하도록 전처리된다. 내인성 결합 물질로부터 비타민 D의 방출은, 예를 들어, 순차적으로 이용되는 분해제 또는 방출제 또는 분해제와 방출제의 조합물의 첨가에 의해 수행될 수 있다. 분해제는 내인성 결합 물질을 파괴시켜 이들이 더 이상 비타민 D에 결합하지 못하게 하는 것이다. 그러한 작용제는 비제한적으로 프로테이나제 K(proteinase K) 및 프로테이나제 K 및 단백질 변성제, 예컨대, 세척제 (예를 들어, 소듐 도데실 설페이트)를 포함한다. 내인성 결합 물질로부터 비타민 D를 방출시키기 위한 방출제는 예시로서 산성 변성제, 예컨대 살리실산, 와파린(warfarin), 설폰산, 톨루엔 설폰산, 나프탈렌 설폰산, 아닐리노나프탈렌 설폰산 (ANS) (예컨대, 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산 (1,8-ANS) 및 8-아닐리노나프탈렌-1-설폰산 (8-ANS) 포함), 살리실산 및 상기의 유도체를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 기간, 온도, pH 및 매질 중 방출제의 농도와 같은 분해 또는 방출 작용을 수행하기 위한 조건은 예를 들어 내인성 결합 물질의 특성, 샘플의 특성, 및 방출제의 특성에 의존적이다. 일반적으로, 상기 조건은 요망되는 효과 또는 기능을 달성하기에 충분하다. 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 방출제의 효과적인 농도는 약 0.01 내지 약 20 mg/mL, 또는 약 0.01 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.01 내지 약 5 mg/mL, 또는 약 0.1 내지 약 20 mg/mL, 또는 약 0.1 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.1 내지 약 5 mg/mL, 또는 약 0.1 내지 약 1 mg/mL이다. 내인성 결합 물질로부터 비타민 D를 방출하기 위한 샘플의 전처리는 검정을 수행하기 전에 분리 단계로서 또는 검정에서 제 1 단계로서 수행될 수 있다. 어떠한 경우든, 하나 이상의 시약은 분해제 및/또는 방출제의 작용을 중단시키는데 요구될 수 있다.
검정을 수행하기 위한 조건은 일반적으로 최적의 검정 민감도를 제공하는 중간 pH에서의 수성 완충된 매질에서 검정을 수행하는 것을 포함한다. 수성 매질은 단독으로 물일 수 있거나 0.1 내지 약 40 부피 퍼센트의 공용매를 포함할 수 있다. 매질에 대한 pH는 예를 들어 약 4 내지 약 11의 범위, 또는 약 5 내지 약 10의 범위, 또는 약 6.5 내지 약 9.5의 범위일 것이다. pH는 보통 임의의 특이적 결합 쌍의 결합 구성원들의 최적 결합, 신호 생성 시스템의 구성원과 같은 검정의 다른 시약에 최적인 pH 등등의 사이에서 타협될 것이다. 다양한 완충제를 이용하여 요망되는 pH를 달성하고 검정 동안 pH를 유지할 수 있다. 예시적인 완충제는 예시로서 예를 들어 보레이트, 포스페이트, 카르보네이트, TRIS, 바르비탈(barbital), PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS, 및 BICINE를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 이용되는 특정 완충제는 중요하지 않지만, 개별 검정에서 하나 또는 또 다른 완충제가 바람직할 수 있다.
다양한 보조 물질이 검정 방법에 이용될 수 있다. 예를 들어, 완충제 외에, 매질은 매질 및 이용되는 시약에 대한 안정화제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 첨가제 외에, 단백질, 예컨대, 알부민; 유기 용매, 예컨대 포름아미드; 사차 암모늄 염; 다음이온, 예컨대 덱스트란 설페이트; 결합 증강제, 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜; 다당류, 예컨대 덱스트란 또는 트레할로스(trehalose)가 포함될 수 있다. 매질은 또한 혈전의 형성을 억제하는 작용제를 포함할 수 있다. 그러한 작용제는 당 분야에 잘 알려져 있고, 비제한적으로 예를 들어 EDTA, EGTA, 시트레이트, 헤파린(heparin)을 포함한다. 매질은 또한 하나 이상의 보존제, 예컨대, 비제한적으로 예를 들어 소듐 아지드, 네오마이신 설페이트, PROCLIN® 300, 스트렙토마이신을 포함할 수 있다. 매질은 하나 이상의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 물질은 이용되는 경우 요망되는 효과 또는 기능을 달성하기에 충분한 농도 또는 양으로 존재한다.
1회 이상의 인큐베이션 기간은 상기 언급된 것들을 포함하는 검정에 이용되는 다양한 시약들의 첨가 사이에 임의의 간격을 포함하는 하나 이상의 간격으로 매질에 이용될 수 있다. 매질은 일반적으로 시약의 다양한 구성요소의 결합 및 샘플 중 비타민 D의 결합이 발생하기에 충분한 온도와 시간 동안 인큐베이션(incubation)된다. 상기 방법을 수행하기 위해 일반적으로 보통 온도가 이용되고, 측정의 기간 동안 보통 일정한 온도, 바람직하게는 실온이 이용된다. 일부 예에서, 인큐베이션 온도는 예를 들어 약 5℃ 내지 약 99℃, 또는 약 15℃ 내지 약 70℃, 또는 약 20℃ 내지 약 45℃의 범위이다. 인큐베이션을 위한 기간은, 일부 에에서, 예를 들어 약 0.2초 내지 약 24시간, 또는 약 1초 내지 약 6시간, 또는 약 2초 내지 약 1시간, 또는 약 1분 내지 약 15분이다. 기간은 매질의 온도 및 결합 속도 상수, 농도, 결합 상수 및 해리 속도 상수에 의해 결정되는 다양한 시약의 결합 속도에 의존적이다.
비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플 중 비타민 D를 결정하기 위한 방법의 예에서, 조합물이 매질 중에 제공되고, 조합물은 샘플, 방출제 (샘플이 내인성 결합 물질로부터 비타민 D를 방출하도록 전처리되지 않은 경우), 비타민 D에 대한 항체, 및 본원에 기재된 원리에 따른 표지된 화합물 (여기서 표지는 폴리(아미노산) 표지 또는 비-폴리(아미노산) 표지이다)을 포함한다. 매질은 비타민 D 및 비타민 D에 대한 항체를 포함하는 복합체 또는 표지된 화합물 및 비타민 D에 대한 항체를 포함하는 복합체 중 하나 또는 둘 모두의 존재 및 양 중 어느 하나 또는 둘 모두에 대해 조사된다. 복합체들 중 하나 또는 둘 모두의 존재 및/또는 양은 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양을 나타낸다.
일부 공지된 검정은 제 1 및 제 2 신호 생성 시스템 (sps) 구성원을 이용하는 sps을 활용한다. "제 1" 및 "제 2"의 지정은 완전히 임의적이며, sps 구성원 간에 임의의 순서 또는 순위 또는 본 방법에서 sps 구성원의 임의의 첨가 순서를 제안하려는 것이 아니다. sps 구성원들은 sps 중 한 구성원의 활성화가 예컨대, 광 또는 활성화 생성물과 같은 생성물을 제공하고, 이는 sps의 또 다른 구성원의 활성화를 발생시킨다는 점에서 관련이 있을 수 있다.
검정의 일부 구체예에서, sps 구성원은 증감제, 예컨대 광증감제, 및 화학발광 조성물을 포함하고, 이 때 증감제의 활성화는 화학발광 조성물을 활성화시키는 생성물을 발생시킨다. 제 2 sps 구성원은 일반적으로 결합되고/거나 결합되지 않은 sps 구성원의 양, 즉 검출하려는 비타민 D 분석물 또는 본원에 기재된 원리에 따른 화합물에 결합되거나 결합되지 않은 sps 구성원의 양과 관련된 검출가능한 신호를 발생시킨다. 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 증감제 시약 또는 화학발광 시약 중 어느 하나는 본 화합물 시약을 포함한다.
특정한 예에서, 유도성 발광 면역검정을 이용할 수 있다. 유도성 발광 면역검정은 미국특허 5,340,716호 (Ullman)에서 언급되며, 이의 기재는 본원에 참조로서 포함된다. 한 접근법에서, 검정은 결합된 광증감제를 갖는 입자를 이용하고, 여기서 본원에 기재된 원리에 따른 화합물은 입자에 결합한다 (입자-화합물 시약). 화학발광 시약은 비타민 D에 대한 항체를 포함한다. 비타민 D 분석물은 비타민 D에 대한 항체와의 결합에 대해 입자-화합물 시약과 경쟁한다. 비타민 D 분석물이 존재하는 경우, 더 적은 수의 입자-화합물 시약의 분자가 광증감제 시약과 근접하게 된다. 따라서, 검정 신호가 감소할 것이다. 광증감제는 일중항 산소를 발생시키고, 2개의 표지가 근접할 때 화학발광 시약을 활성화시킨다. 활성화된 화학발광 시약은 후속하여 광을 생성한다. 생성된 광의 양은 형성된 복합체의 양과 관련되고, 이는 다시 샘플에 존재하는 비타민 D 분석물의 양과 관련된다.
유도성 발광 면역검정의 또 다른 특정 예에서, 검정은 결합된 화학발광 화합물을 갖는 입자를 이용하고, 본원에 기재된 원리에 따른 화합물은 입자에 결합한다 (입자-화합물 시약). 광증감제 시약은 비타민 D에 대한 항체를 포함한다. 비타민 D 분석물은 비타민 D에 대한 항체와의 결합에 대해 입자-화합물 시약과 경쟁한다. 비타민 D 분석물이 존재하는 경우, 더 적은 수의 입자-화합물 시약의 분자가 광증감제 시약과 근접하게 된다. 따라서, 검정 신호가 감소할 것이다. 광증감제는 일중항 산소를 발생시키고, 2개의 표지가 근접할 때 입자-화합물 시약의 화학발광 화합물을 활성화시킨다. 활성화된 화학발광 화합물은 후속하여 광을 생성한다. 생성된 광의 양은 형성된 복합체의 양과 관련되고, 이는 다시 샘플에 존재하는 비타민 D 분석물의 양과 관련된다.
유도성 발광 검정의 또 다른 특정 예에서, 소분자에 대한 결합 파트너, 예컨대 아비딘 또는 스트렙타비딘 (바이오틴에 대한 결합 파트너이다)에 컨쥬게이션된 광증감제 입자가 이용된다. 바이오틴을 포함하는 본원에 기재된 원리에 따른 화합물 (화합물-바이오틴 시약)도 이용된다. 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원을 포함하는 화학발광 시약이 검출 시스템의 일부로서 이용된다. 반응 매질은, 광증감제 입자의 아비딘 또는 스트렙타비딘이 아비딘과 바이오틴 간의 결합에 의해 화합물-바이오틴 시약에 결합하도록 그리고 또한 화학발광 시약의 일부인 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원이 비타민 D 분석물 또는 현재 광증감제 입자에 부착되어 있는 본원에 기재된 원리에 따른 화합물에 결합하도록 인큐베이션된다. 그 후, 매질에 광을 조사하여 광증감제를 여기시키며, 광증감제는 산소를 일중항 상태로 활성화시키는 여기된 상태일 수 있다. 현재 비타민 D 분석물의 존재로 인해 보다 적은 화학발광 시약이 광증감제와 근접하므로, 화학발광 시약은 일중항 산소에 의해 덜 활성화되고 덜 발광한다. 이어서 매질은 발광 또는 방출된 광의 존재 및/또는 양에 대해 조사되고, 이의 존재는 비타민 D 분석물의 존재 및/또는 양과 관련되며, 신호의 감소는 비타민 D 분석물의 존재시에 관찰된다.
유도성 발광 검정의 또 다른 특정 예에서, 소분자에 대한 결합 파트너, 예컨대 아비딘 또는 스트렙타비딘 (바이오틴에 대한 결합 파트너이다)에 컨쥬게이션된 광증감제 입자가 이용된다. 컨쥬게이트 시약은 바이오틴에 컨쥬게이션된 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원을 포함한다. 본원에 기재된 원리에 따른 화합물이 이용되고, 화학발광 입자에 부착된 화합물 (화학발광-화합물 시약)이 또한 이용된다. 반응 매질은, 광증감제 입자의 아비딘 또는 스트렙타비딘이 아비딘과 바이오틴 간의 결합에 의해 항체-바이오틴 시약에 결합하도록 그리고 또한 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원이 존재하는 경우 샘플 중의 비타민 D 및 화학발광-화합물 시약의 일부인 본원에 기재된 원리에 따른 화합물에 결합하도록 인큐베이션된다. 그 후, 매질에 광을 조사하여 광증감제를 여기시키며, 광증감제는 산소를 일중항 상태로 활성화시키는 여기된 상태일 수 있다. 현재 비타민 D 분석물의 존재로 인해 보다 적은 화학발광-화합물 시약이 광증감제와 근접하므로, 화학발광 시약은 일중항 산소에 의해 덜 활성화되고 덜 발광한다. 이어서 매질은 발광 또는 방출된 광의 존재 및/또는 양에 대해 조사되고, 이의 존재는 비타민 D 분석물의 존재 및/또는 양과 관련되며, 신호의 감소는 비타민 D 분석물의 존재시에 관찰된다.
예시로서 그리고 비제한적으로, 비타민 D를 검출하기 위한 검정 포맷의 또 다른 예는 ACMIA 검정 포맷이다. ACMIA 검정 포맷의 경우, 비타민 D 또는 비타민 D 유사체 (크롬 입자 시약)로 코팅된 크롬 입자는 제 1 구성요소로서 이용된다. 제 2 구성요소는 비타민 D에 대한 항체이다. 항체-효소 컨쥬게이트를 형성하기 위해 리포터 효소(reporter enzyme)(예를 들어, β-갈락토시다제)와 가교되는 이러한 항체는 과량, 즉 샘플에 존재할 수 있는 모든 비타민 D 분석물에 결합하는데 요구되는 것보다 많은 양으로 반응 용기에 첨가된다. 미리 방출제로 처리된 샘플을 샘플 중 비타민 D와 결합하는 비타민 D에 대한 항체로 처리한다. 항체-효소 컨쥬게이트를 매질에서 샘플과 혼합시켜, 비타민 D 분석물이 항체와 결합하게 한다. 이어서, 크롬 입자 시약을 첨가하여 임의의 과량의 항체-효소 컨쥬게이트와 결합시킨다. 그 후, 현탁액 중의 크롬 입자 및 과량의 항체-효소를 모두 당기는 자석을 이용하고, 상청액을 최종 반응 컨테이너로 보낸다. 리포터 효소의 기질을 최종 반응 컨테이너에 첨가하고, 효소 활성을 시간 경과에 따른 흡광도의 변화로서 분광학적으로 측정한다. 이러한 신호의 양은 샘플 중 비타민 D의 양과 관련된다.
본원에 기재된 원리에 따른 비타민 D에 대한 검정법의 또 다른 예는 고형상으로서 상자성 입자를 이용한 아크리디늄 에스테르 표지 면역검정 (ADVIA 면역검정)이다. 비타민 D 검정의 이러한 예에 이용되는 검출 시스템은 소분자 컨쥬게이트 또는 포획 컨쥬게이트로서 소분자-표지된 비타민 D (포획 모이어티), 고형상 (SP)으로서 소분자-코팅된 상자성 라텍스 입자에 대한 결합 파트너, 및 비타민 D에 대한 아크리디늄 에스테르 표지된 항체 (검출 항체)를 포함한다. 소분자는, 예를 들어, 바이오틴 또는 플루오레세인일 수 있고, 개별적인 결합 파트너는 스트렙타비딘 또는 플루오레세인에 대한 항체일 수 있다. 비타민 D는 소분자에 직접 또는, 예를 들어 단백질, 예컨대 우태아 알부민(BSA)과 같은 연결기를 통해 연결될 수 있다. 환자 샘플 중 비타민 D는 아크리디늄 에스테르 표지된 검출 항-비타민 D 항체와의 결합에 대해 포획 모이어티의 비타민 D와 경쟁한다. 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플은 1,8-ANS로 전처리된다. 검정은 Centaur®, Centaur® XP 또는 Centaur® CP 장치 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE) 상에서 그와 함께 제공된 제조사의 지침에 따라 수행될 수 있다.
본원에 기재된 원리에 따른 비타민 D에 대한 검정법의 또 다른 예는 고형상으로서 상자성 입자를 이용한 아크리디늄 에스테르 표지 면역검정 (ADVIA 면역검정)이다. 비타민 D 검정의 이러한 예에 이용되는 검출 시스템은 바이오틴 컨쥬게이트 또는 포획 컨쥬게이트로서 비타민 D에 대한 소분자-표지된 항체 (포획 항체), 고형상 (SP)으로서 스트렙타비딘-코팅된 상자성 라텍스 입자, 및 아크리디늄 에스테르 표지된 비타민 D (검출 합텐(detection hapten))를 포함한다. 아크리디늄 에스테르 표지는 비타민 D에 직접 결합하여 검출 합텐을 형성할 수 있거나, 예를 들어, 단백질, 예컨대 BSA를 포함하는 연결기가 이용될 수 있다. 환자 샘플 중 비타민 D는 항-비타민 D 항체와의 결합에 대해 아크리디늄 에스테르 표지된 검출 합텐과 경쟁한다. 비타민 D를 함유할 것으로 의심되는 샘플은 1,8-ANS로 전처리된다. 검정은 Centaur®, Centaur® XP 또는 Centaur® CP 장치 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE) 상에서 그와 함께 제공된 제조사의 지침에 따라 수행될 수 있다. 상기 아크리디늄 에스테르 검정의 변형에서, 소분자는, 예를 들어, 바이오틴 또는 플루오레세인일 수 있다.
검정될 수 있는 샘플 중 비타민 D 분석물의 농도는 일반적으로 예를 들어 약 10-5 내지 약 10-17 M, 또는 약 10-6 내지 약 10-14 M로 다양하다. 검정이 정성적, 반-정량적 또는 정량적 (샘플에 존재하는 비타민 D 분석물의 양에 대하여)일지 여부, 특정 검정 기법 및 비타민 D 분석물의 예상 농도와 같은 고려사항이 일반적으로 다양한 시약의 농도를 결정한다.
검정 매질에서 다양한 시약의 농도는 일반적으로 관심 비타민 D 분석물의 농도 범위, 검정의 특성 등에 의해 결정될 것이다. 그러나, 각 시약의 최종 농도는 일반적으로 관심 범위에 걸쳐 검정의 민감도를 최적화하기 위해 경험적으로 결정된다. 즉, 유의한 비타민 D 분석물의 농도에서의 변화는 정확하게 측정가능한 신호 차이를 제공하여야 한다. 신호 생성 시스템의 특성 및 분석물의 특성과 같은 고려사항이 일반적으로 다양한 시약의 농도를 결정한다.
상기 언급된 대로, 샘플 및 시약은 매질 중에 조합하여 제공된다. 매질로의 첨가 순서는 변할 수 있지만, 본원에 기재된 검정 포맷의 일부 구체예에 대해 특정 선호도가 있을 것이다. 가장 단순한 첨가 순서는, 물론, 모든 물질을 동시에 첨가하고, 동종 검정에서와 같이 검정 매질이 신호에 미치는 영향을 결정하는 것이다. 대안적으로, 각각의 시약, 또는 시약의 그룹을 순차적으로 조합시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 인큐베이션 단계가 상기 논의된 각 첨가 이후에 수반될 수 있다. 이종 검정에서, 세척 단계가 또한 1회 이상의 인큐베이션 단계 이후에 이용될 수 있다.
조사 단계
검정 방법의 다음 단계에서, 매질은 비타민 D 분석물 및 비타민 D에 대한 항체를 포함하는 복합체의 존재 및/또는 본원에 기재된 원리에 따른 화합물 시약 및 비타민 D에 대한 항체를 포함하는 복합체의 존재에 대해 조사된다. 복합체들 중 하나 또는 둘 모두의 존재 및/또는 양은 샘플 중 비타민 D 분석물의 존재 및/또는 양을 나타낸다.
구 "비타민 D 분석물의 양을 측정한다"는 비타민 D의 정량적, 반정량적 및 정성적 결정을 의미한다. 정량적, 반정량적 및 정성적인 방법, 뿐만 아니라 비타민 D 분석물을 결정하기 위한 모든 다른 방법은 비타민 D 분석물의 양을 측정하는 방법으로 간주된다. 예를 들어, 비타민 D 분석물을 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 비타민 D 분석물의 존재 또는 부재만을 검출하는 방법이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다. 용어 "검출하는" 및 "결정하는", 뿐만 아니라 측정을 위한 다른 일반적인 동의어는 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
다수의 구체예에서, 매질의 조사는 매질로부터 신호의 검출을 포함한다. 신호의 존재 및/또는 양은 샘플 중 비타민 D 분석물의 존재 및/또는 양과 관련된다. 특정한 검출 방식은 신호 생성 시스템의 특성에 의존적이다. 상기 논의된 대로, 신호 생성 신호의 표지가 외부 수단에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 수많은 방법이 있다. 신호 생성 시스템의 활성화는 신호 생성 시스템 구성원의 특성에 의존적이다.
측정 동안의 온도는 일반적으로 예를 들어 약 10℃ 내지 약 70℃ 또는 약 20℃ 내지 약 45℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃의 범위이다. 한 접근법에서, 표준 곡선은 공지된 농도의 비타민 D 분석물을 이용하여 형성된다. 교정기 및 다른 제어기도 이용될 수 있다.
매질 중 비타민 D 분석물의 양과 관련된 발광 또는 임의의 표지로부터 생성된 광은, 예컨대 광전자증배관 또는 포토다이오드(photodiode)를 이용함에 의해서나, 그 양을 결정하기 위한 임의의 다른 편리한 수단에 의해, 시각적으로, 사진에 의해, 광량측정에 의해, 분광측정에 의해 측정될 수 있다. 신호의 존재 및/또는 양에 대한 조사는 일반적으로 단순히 신호를 판독하는 단계인 신호의 검출도 포함한다. 신호는 일반적으로 기계를 이용하여 판독하며, 기계의 특성은 신호의 특성에 따라 좌우된다. 기계는, 비제한적으로 예를 들어 분광광도계, 형광계, 흡수 분광계, 발광측정계, 및 화학발광측정계일 수 있다.
검정을 수행하기 위한 시약을 포함하는
키트
지지체도 포함할 수 있는 신호 생성 시스템의 구성원에 부착된 본원에 기재된 원리에 따른 화합물을 포함하는 시약, 및 비타민 D 분석물에 대한 특정 검정을 수행하기 위한 다른 시약은 비타민 D 분석물의 결정을 위한 검정을 편리하게 수행하는데 유용한 키트에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 입자와 결합된, 예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 바이오틴-결합 파트너, 본원에 기재된 원리에 따른 바이오티닐화된 화합물(biotinylated compound) 및 비타민 D 분석물에 대한 표지된 항체를 패키징된 조합물로 포함한다. 키트는 검정을 수행하기 위한 다른 시약들을 추가로 포함할 수 있고, 이들의 특성은 특정한 검정 포맷에 의존적이다.
시약들은 각각 분리된 컨테이너에 있을 수 있거나, 다양한 시약들은 시약의 교차 반응성 및 안정성에 따라 하나 이상의 컨테이너에서 조합될 수 있다. 키트는 검정을 수행하기 위해 별도로 패키징된 다른 시약들, 예컨대 추가의 특이적 결합 쌍 구성원, 신호 생성 시스템 구성원, 및 보조 시약을 추가로 포함할 수 있다.
키트에서 다양한 시약들의 상대적인 양은 본 방법 동안 발생해야 하는 반응들을 실질적으로 최적화하는 시약의 농도를 제공하고 추가로 검정의 민감도를 실질적으로 최적화하기 위해 광범하게 다양할 수 있다. 적절한 환경 하에 키트의 시약들 중 하나 이상은 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있고, 이는 용해시에 본원에 기재된 원리에 따른 화합물 시약을 이용한 방법 또는 검정을 수행하는데 적절한 농도를 지닌 시약 용액을 제공할 것이다. 키트는 본원에 기재된 원리에 따른 화합물 시약을 포함하는 시약을 활용하는 방법의 기재된 설명을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 표현 "적어도"는 명시된 품목의 수가 언급된 수와 동일하거나 그 보다 클 수 있음을 의미한다. 본원에서 사용된 표현 "약"은 언급된 수가 플러스 또는 마이너스로 10%만큼 상이할 수 있음을 의미하고; 예를 들어, "약 5"는 4.5 내지 5.5의 범위를 의미한다.
하기 논의는 예시로서 비제한적으로 본원에 기재된 원리에 따른 특수한 예들에 관한 것이며; 특수한 예들은 본 기재 및 첨부된 청구항의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 다수의 변형 및 대안적인 조성물, 방법, 시스템이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으며 고안될 수 있다.
실시예
달리 언급되지 않는 한, 하기 실험의 재료들은 Sigma-Aldrich Chemical Corporation (St. Louis MO) 또는 Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI)로부터 구입할 수 있다. 본원에 기재된 부 및 백분율은 달리 지시되지 않는 한 중량 대 부피를 기준으로 한다.
정의:
mg = 밀리그램
g = 그램(들)
ng = 나노그램(들)
mL = 밀리리터(들)
μL = 마이크로리터(들)
μmol = 마이크로몰
℃ = 섭씨 도
min = 분(들)
sec = 초(들)
hr = 시간(들)
w/v = 중량 대 부피
TLC = 박막 크로마토그래피
HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피
EtOAc = 에틸 아세테이트
DMF = 디메틸포름아미드
DMSO = 디메틸설폭사이드
MeOP = 1-메톡시-2-프로판올
MES = 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산
DI = 증류된
UPA = 초 입자 분석기
LOCI = 발광 산소 채널링 면역검정
BSA = 소 혈청 알부민
BGG = 소 감마 글로불린
mIgG = 마우스 면역글로불린
MS = 질량 분석법
EPRM
-EDA
비드의
제조
EPRM 비드 (2000 mg, 20.0 mL)를 40-mL 바이알(vial)에 첨가하였다. EPRM 비드를 미국특허 7,179,660호에 기재된 것과 유사한 절차에 의해 제조하였고, 화학발광 화합물은 유로퓸 킬레이트를 지닌 2-(4-(N,N, 디-테트라데실)-아닐리노-3-페닐 티옥센이었다. EDA (800 mg, 890 μL)를 10 mL의 MES pH 6 완충제 ("완충제") 및 약 4.2 mL의 6N HCl과 합쳤다. 혼합물의 pH는 약 6.9이거나, 약 6.9로 조정되었다. EDA 용액을 볼텍싱(vortexing)과 함께 EPRM 비드에 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 실온에서 흔들었다. 소듐 시아노보로하이드라이드 (400 mg)를 15 mL 바이알에서 10 mL의 DI 수와 합치고, 조합물을 상기로부터의 비드 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 18-20시간 동안 진탕시켰다. 비드를 6개의 40 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. MES 완충제를 첨가하여 부피가 35 mL가 되게 하고, 혼합물을 19,000 rpm에서 30분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 디캔팅하고, 비드를 교반-막대를 이용하여 2 mL의 완충제에 재현탁시키고, 추가의 완충제를 35 mL로 첨가하였다. 혼합물을 차게 유지하기 위해 얼음을 이용하면서, 혼합물을 18 와트의 전력으로 30초 동안 초음파처리하였다. 모든 활성 화학물질을 제거하기 위해 세척/초음파처리 단계를 4회 수행하였다. 마지막 MES 완충제 원심분리 후에, 5% MeOP 및 0.1% Tween® 20을 함유하는 2 mL의 완충제 ("제 2 완충제")를 재현탁 단계를 위해 튜브에 첨가하였다. 추가의 제 2 완충제를 초음파처리 전에 35 mL로 첨가하였다. 비드 현탁액을 19,000 rpm에서 30분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 폐기하였다. 최종 초음파처리는 25 mg/희석액 mL를 제공하기 위해 각 튜브에서 12 mL의 제 2 완충제를 이용하였다. 입자 크기는 UPA 기계 상에서 측정시 277 nm였다.
EPRM 케미비드는 관련 기재가 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 6,153,442호 및 미국특허공개 20050118727A호에 기재된 방법과 유사한 방식으로 제조되었다. EPRM 케미비드는 유리 알데하이드 작용기를 갖는 덱스트란 알데하이드 외층 및 아미노덱스트란 내층을 포함한다. 예를 들어, 관련 기재가 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 5,929,049호, 7,179,660호 및 7,172,906호를 참조하라. 반응은 약 0 내지 약 40℃의 온도에서 약 16 내지 약 64시간의 기간 동안 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6의 pH에서, 예를 들어 MES와 같은 적합한 완충제를 이용한 완충된 수성 매질에서 수행되었다. 예를 들어, 카르복시메톡시아민 헤미하이드로클로라이드 (CMO)와 같은 적합한 켄칭제의 첨가에 의해 반응물을 켄칭시키고, 후속하여 입자를 세척하였다.
외부 덱스트란 알데하이드 층 상의 알데하이드 기는 환원성 아민화 조건 하에 에틸렌 디아민과 반응하여 에틸렌 사슬 및 말단 아민기를 포함하는 펜던트 모이어티를 지니는 시약 EPRM-EDA를 형성하였다. 환원성 아민화 조건은, 예를 들어, 금속 하이드라이드와 같은 환원제의 이용을 포함한다. 반응은 수성 매질에서 약 20℃ 내지 약 100℃의 반응 동안의 온도에서 약 1시간 내지 약 48시간의 기간 동안 수행되었다.
25-OH 비타민 D
3
3-
카르바메이트
(25-OH 비타민 D
2
3-
카르바메이트
)의 합성
도 1을 참조하면, 1 mL 무수 아세토니트릴 중 ChemReagents.com, Sugarland TX로부터 구입한 22 mg (55 μmol) 25-OH VD3 (I), 100 mg (420 μmol) 디석신이미딜 카르보네이트 (DSC), 100 μL 트리에틸아민의 혼합물을 5-ml 플라스크 (호일로 덮음)에서 실온에서 18시간 동안 질소 하에 교반시켜 활성화 25-OH VD3 (II)를 제조하였다. TLC (EtOAc:헥산 = 2:1)는 어떠한 출발 물질도 남아 있지 않음을 나타내었다. 150 mg의 카르복시메톡실아민 헤미하이드로클로라이드 (CMO), 0.3 ml 트리에틸아민 및 1 ml DMF를 10 ml 플라스크에 첨가시킴에 의해 현탁액을 제조하였다. 활성화 25-OH VD3을 함유하는 용액을 CMO 현탁액에 교반하면서 적가하고, 교반을 추가 18시간 동안 지속시켰다. 진공을 적용시켜 용매를 가능한 한 많이 제거하였다 (가열 조 온도는 50℃를 넘지 않아야 한다). EtOAc (25 ml)를 잔류물에 첨가하고, 이를 2 ml의 염수로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시켰다; 용매를 rotavap을 이용하여 제거하였다. 건조 후에 미정제 생성물 (42 mg)을 수득하였고, 이를 HPLC에 의해 정제시켰다. 순수한 생성물 (III) (p = 1) (24 mg)을 고 진공 하에 건조시킨 후 수득하였다. 생성물을 1.2 ml의 무수 DMSO에 용해시켰다. 분취량을 바이알에 옮기고, 이를 -70℃에서 유지하였다.
상기 기재된 것과 유사한 방법을 적용시켜 25-OH VD2를 이용한 25-OH 비타민 D2 3-카르바메이트를 제조하였다.
25-OH 비타민 D
3
3-
석시네이트
(25-OH 비타민 D
2
3-
석시네이트
)의 합성
1 mL 무수 디클로로메탄 중 14.2 mg (35.4 μmol) 25-OH VD3, 8.2 mg (90 μmol) 석신산 무수물, 8.2 mg 이미다졸의 혼합물을 5-ml 플라스크에서 실온에서 24시간 동안 질소 하에 교반시켰다. TLC (EtOAc:헥산 = 2:1)는 어떠한 출발 물질도 남아 있지 않음을 나타내었다. 용매를 진공 하에 50℃ 미만의 가열조를 이용하여 제거시켰다. EtOAc를 잔류물에 첨가시킨 후, 3 x 2ml 염수로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 제거하고 여과시켰다. rotavap을 이용하여 용매를 제거하고, 생성된 물질을 고 진공 하에 건조시켜 18 mg의 미정제 생성물을 수득하였고, 이것은 MS에 의해 25-OH 비타민 D3 3-석시네이트임이 확인되었다.
상기 기재된 것과 유사한 방법을 적용시켜 25-OH VD2를 이용한 25-OH 비타민 D2 3-석시네이트를 제조하였다.
EPRM
-EDA 및 25-OH 비타민 D
3
3-
카르바메이트의
커플링으로 입자 시약 VI 수득
도 1과 2를 참조하면, 카르바메이트 III (상기 기재된 대로 제조된 DMSO 중 10 μL의 분취량)(0.2 mg)을 3323-064-1로 표지된 2-mL 바이알에 첨가하였다. EDAC (6.8 mg) 및 SNHS (9.4 mg) + 2.27 mL 건조 DMSO (3 mg/mL)를 EDAC/SNHS로 표지된 5-mL 바이알에 첨가하였다. EDAC/SNHS 용액 (190 μL)을 바이알 3323-064-1 (1 mg/mL)에 첨가하여 활성화 25-OH 비타민 D3 3-카르바메이트 IV를 제조하였다. 혼합물을 실온에서 18시간 동안 회전시켰다. 16% GAFAC® 계면활성제 용액 (GAF Corporation, Wayne NJ)(0.15%)의 0.4 mL의 분취량을 3.6 mL DI 수를 이용하여 1.6%로 희석시켰다.
비타민 D3 (8.5 mg) 및 850 μL DMSO (10 mg/mL)를 합쳤다. 교반-바가 구비된 10-mL 둥근 바닥 플라스크 (3323-064B로 표시됨)에 2.0 mL (200MG) EPRM-EDA에 이어 상기로부터의 400 μL (4 mg)의 비타민 D3 용액을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다.
교반-바가 구비된 10-mL 둥근 바닥 플라스크 (3323-64A로 표시됨)에 2.0 mL (200 mg)의 EPRM-EDA (상기 기재된 대로 제조됨)에 이어 260 μL의 1.6% GAFAC® 계면활성제 용액 (0.15%)을 적당한 교반과 함께 첨가하였다. 작은 시험 튜브에 504 μL의 무수 DMSO에 이어 상기 기재된 대로 제조된 60 μL (0.06 mg)의 3323-064-1 활성화 비타민 D3-3-카르바메이트 IV를 첨가하고; 혼합물을 EPRM-EDA 비드 혼합물에 첨가하였다. 3323-64A 비드 현탁액의 총 DMSO 함량은 20%였다.
10-mL 둥근 바닥 플라스크 (3323-064B로 표시됨)에 260 μL의 1.6% GAFAC® 계면활성제 용액 (0.15%)을 적당한 교반과 함께 첨가하였다. 작은 시험 튜브에 104 μL의 무수 DMSO에 이어 60 μL (0.06 mg)의 3323-064-1 활성화 비타민 D3-3-카르바메이트 IV를 첨가하였다. DMSO/활성화 비타민 D3-3-카르바메이트 IV를 비드 혼합물에 첨가하였다. 합친 반응물 (비타민 D3/DMSO) + 첨가된 DMSO는 3323-064B 비드 현탁액에 20% DMSO 함량을 제공하였다. 2개의 반응 용기가 실온에서 밤새 교반되게 하였다. 이후 비드를 정용여과에 의해 세척하였다.
각각의 비드 로트(bead lot)는 10% MeOP/1% GAFAC®/MES pH6 완충제와 함께 20 mL 이하의 작업 부피로 취해졌다. 혼합물을 5 부피의 완충제를 이용하여 정용여과시킨 다음, 프로브(probe) 초음파기로 18-21 와트에서 얼음을 이용하여 혼합물을 차게 유지하면서 초음파처리하였다. 정용여과/초음파처리는 50 부피까지 계속되며, 유출 샘플은 35, 40, 45 및 50 부피에서 취해졌다. 완충제를 10 부피로 이용되는 LOCI 합텐 세척 완충제 (50 mM HEPES, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.01% 네오마이신 설페이트, 0.1% TRITON® 405X 및 0.15% PROCLIN® 300, pH 7.2)로 변경하였다. 혼합물을 약 7 mL로 감소시키고, UPA를 수행하였다. 입자 크기는 3323-064A = 289 nm 및 3323-064B = 298 nm였다. 퍼센트 고형물을 결정하고, 둘 모두의 비드 로트를 LOCI 합텐 세척 완충제 pH7.2를 이용하여 10 mg/mL로 만들었다. 수율은 다음과 같았다: 3323-064A = 160.4 mg 및 3323-064B = 183.5 mg.
EPRM
-EDA 및 25-OH 비타민 D
2
3-
카르바메이트의
커플링으로 입자 시약 VII 제공
입자 시약 VI의 제조를 위해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로, 25-OH 비타민 D2 3-카르바메이트를 EPRM-EDA에 커플링시켜 유사한 입자 시약 VII를 제조하였고, 이를 하기 기재된 검정에서 입자 시약 VI 대신 이용하였다. 또한, 입자 시약 VI과 입자 시약 VII의 조합물을 하기 기재된 검정에서 입자 시약 VI 대신 이용하였다.
EPRM
-EDA 및 25-OH 비타민 D
3
3-
석시네이트의
커플링
25-OH 비타민 D3 3-석시네이트 (상기 기재된 대로 제조된 DMSO 중 66 μL의 분취량)(2 mg)를 3323-026-1로 표지된 2-mL 바이알에 첨가하였다. EDAC (20 mg) 및 NHS (20 mg) + 0.8 mL 건조 DMSO (25 mg/mL)를 EDAC/NHS로 표지된 5-mL 바이알에 첨가하였다. EDAC/NHS 용액 (180 μL)을 바이알 3323-026-1 (8.1 mg/mL)에 첨가하여 활성화 비타민 D3-3-석시네이트를 제조하였다. 혼합물을 실온에서 18시간 동안 회전시켰다. 2-mL 원심분리 튜브 3323-026A에 0.5 mL (50 mg)의 EPRM-EDA에 이어 1.4 ml의 MES pH6, 그리고 나서 (119 μL)(0.96 mg)의 활성화 비타민 D3-3-석시네이트를 첨가하였다 (첨가 동안 볼텍싱 이용). 첨가에 의해 비드에 5.9% DMSO 함량을 제공하였다.
3323-026B로 표지된 2-mL 원심분리 튜브에 0.5 mL (50 mg)의 EPRM-EDA에 이어 1.4 ml의 MES pH6, 그리고 나서 69 μL의 DMSO + 30 μL (0.24 mg)의 활성화 비타민 D3-3-석시네이트를 첨가하였다 (첨가 동안 볼텍싱 이용). 첨가 + 추가 DMSO에 의해 비드에 5% DMSO 함량을 제공하였다.
혼합물을 40-mL의 원심분리 튜브에 옮겼다. 10% MeOP 및 1% GAFAC®를 함유하는 MES pH6 완충제를 첨가하여 튜브의 부피가 35 mL가 되게 하였다. 튜브를 18,500 rpm에서 30분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 디캔팅시켰다. 비드를 1 mL의 MES 완충제 혼합물에 교반-막대를 이용하여 재현탁시켰다. 더 많은 MES 완충제 혼합물을 첨가하여 튜브가 35 mL가 되게 하였다. 얼음을 이용하여 튜브를 차게 유지하면서, 튜브를 18-21 와트 전력에서 60초간 초음파처리하였다 (프로브 초음파기). 총 4회의 MES-MeOP-GAFAC® 완충제 세척을 수행하면서 상기와 같이 비드를 원심분리하였다. 마지막 세척 후에, 비드를 상기와 같은 MES 완충제 혼합물 대신 1 mL의 합텐 세척 완충제에 재현탁시켰고, 2회 더 세척을 수행하였다. 비드를 충분한 합텐 세척 완충제에 재현탁시켜 15 mg/현탁액 mL를 수득하였다. 비드를 50% 전력 (컵 초음파기)에서 60초간 초음파처리하였다. 입자 크기를 UPA 기계 상에서 결정하였다. 3323-26A에 대한 입자 크기는 290 nm였고; 3323-26B에 대한 입자 크기는 275 nm였다. 수율은 다음과 같았다: 3323-26A = 33.2 mg 및 3323-26B = 32.3 mg.
비타민 D
분석물에
대한 검정
DIMENSION® VISTA® 분석기 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL) 상에서 LOCI 검정을 위한 프로토콜에 따라서 다양한 양의 25-하이드록시비타민 D3 (샘플 중 총 비타민 D의 측정의 예로서)을 함유하는 샘플 용액을 이용하여 검정을 수행하였다. 이러한 실시예에서 검정은 화학발광 시약으로서, 본원에 기재된 원리에 따른 표지 입자-컨쥬게이트("케미비드(들)")를 이용하고, 여기서 입자-컨쥬게이트의 표지는 라텍스 입자에 함유된 화학발광 화합물이다. 샘플을 먼저 25-하이드록시비타민 D에 대한 바이오티닐화된 항체와 반응시킨 다음 케미비드와 반응시켰다. 케미비드는 샘플로부터의 분석물이 차지하지 않은 모노클로날 항체 결합 부위의 분획에 결합한다. 후속하여, 스트렙타비딘 커플링된 증감제 비드를 반응 혼합물에 첨가하였다. 이는 케미비드/센시비드(sensibead) 쌍의 형성을 발생시켰고, 이의 농도는 25-하이드록시비타민 D3의 농도에 반비례한다. 680 nm에서 조명시, 증감제 비드는 센시비드와 쌍을 이룬 케미비드로 확산되는 일중항 산소를 발생시키고, 올레핀계 염료와 반응하여, 분석물 농도와 반비례하는 화학발광 신호를 대략 612 nm에서 촉발시킨다.
스트렙타비딘-증감제 비드 ("센시비드(들)")는 미국특허 6,153,442호, 7.022,529호, 7,229,842호 및 미국특허 공개 20050118727A호에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 제조되었다. 광증감제는 비스-(트리헥실)-실리콘-t-부틸-프탈로시아닌이었다. 센시비드 시약의 농도는 150 mM NaCl을 함유하는 HEPES 완충제, pH 8.0에서 200 μg/mL였다. 상기 기재된 대로 제조된 EPRM-EDA-25-OH 비타민 D3 입자 시약 VI은 "케미비드 시약"으로서 150 mM NaCl 및 0.1% 세척제를 함유하는 HEPES 완충제, pH 7.2에서 200 μg/mL의 농도로 이용되었다.
바이오티닐화된 항체 시약은 관련 부분이 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 공개 2009/0258435A1호에 기재된 것과 유사한 방식으로 25-하이드록시비타민 D (Bioventix, Farnham, Surrey, UK로부터의 양 모노클로날)에 특이적인 모노클로날 항체를 이용하여 NHS-PEO4-바이오틴 (Pierce Chemical Company, Rockford IL)과의 반응에 의해 항체의 아민기를 바이오티닐화시켜 제조되었다. 바이오티닐화된 항체 시약은 150 mM NaCl 및 16 mg/mL BSA, 1 mg/mL mIgG 및 2 mg/mL BGG를 함유하는 HEPES 완충제 pH 7.2에서 제조되었고, 바이오티닐화된 항체 시약의 농도는 1000 ng/mL였다.
검정은 또한 상기와 같이 수행되었으나, 예외적으로 EPRM-EDA-25-OH 비타민 D3 입자 시약 VI 대신 EPRM-EDA-25-OH 비타민 D3 석시네이트 입자 시약을 이용하였다.
t = 0초에, 20 μL의 바이오티닐화된 항체 시약 및 20 μL의 물을 반응 용기에 첨가하였다. 샘플 12 μL를 21.6초 후에 첨가하고, 이어서 8 μL 물을 첨가하였다. t = 414.0초에, 40 μL의 케미비드 시약을 첨가하고, 이어서 20 mL의 물을 첨가하였다. 그 후 센시비드 시약을 457.2초에 분배시켰다. 측정은 반응 순서의 개시 후 601.2초에 수행되었다.
결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.
표 1
표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 원리에 따른 25-OH-D3-3-카르바메이트 케미비드 시약은 25-OH-D3-3-석시네이트 케미비드 시약에 비해 지속적으로 높은 신호 수를 제공하였다.
상기 검정을 입자 시약 VI 대신 EPRM-EDA에 커플링된 25-OH 비타민 D2 3-카르바메이트 (입자 시약 VII)를 이용하여 반복하였다. 샘플 용액은 다양한 양의 25-하이드록시비타민 D3 (샘플 중 총 비타민 D의 측정의 예로서)을 함유하였다. 결과는 표 2에 요약되어 있다.
표 2
표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 원리에 따른 25-OH-D3-3-카르바메이트 케미비드 시약은 25-OH-D3-3-석시네이트 케미비드 시약에 비해 지속적으로 높은 신호 수를 제공하였다.
상기 검정을 또한 입자 시약 VI 대신 입자 시약 VI 및 입자 시약 VII의 조합물 (중량 기준으로 50/50)을 이용하여 반복하였다. 샘플 용액은 다양한 양의 25-하이드록시비타민 D3 및25-하이드록시비타민 D2의 조합물 (샘플 중 총 비타민 D의 측정의 예로서)을 함유하였다. 수득된 결과는 입자 시약 VI을 이용한 검정에 대해 상기 기재된 바와 유사하였다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 포함된다고 기재된 바와 같이 본원에 참조로서 포함된다.
상기 기재된 예는 본원에 기재된 원리를 나타내는 다수의 특수한 예들 중 단지 일부의 예시임이 이해되어야 한다. 명백하게, 당업자는 하기 청구범위에 의해 정의된 범위를 벗어나지 않으며 많은 다른 장치를 용이하게 고안할 수 있다.
Claims (20)
- 하기 화학식의 화합물:
상기 식에서, Z는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고, 이는 비치환될 수 있거나 이들 중 하나 이상은 하이드록시, 저급 알콕시, 옥소 및 옥심 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있으며;
R은 -O-석신이미딜, -NH-O-(A)k-R2 (여기서, R2는 신호 생성 시스템의 구성원이다), -(CH2)nCOOH, -(CH2)mCOONHS (NHS는 N-하이드록시석신이미드이다), 소분자, 소분자에 대한 결합 파트너, 또는 지지체이고; k는 0 또는 1이고; A는 k가 0일 때 결합이고 k가 1일 때 연결기이며; n은 1 내지 5의 정수이고 m은 1 내지 5의 정수이고;
R4는 H, OH 또는 저급 알콕시이다. - 제 1항에 있어서, Z가 4 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 분지형 알킬기 또는 분지형 알케닐기이고, 분지형 알킬기 또는 분지형 알케닐기의 말단 탄소 원자가 하이드록실을 포함하는 화합물.
- 제 1항에 있어서, R2가 형광 화합물, 화학발광 화합물, 증감제, 효소 및 방사성표지로 구성된 군으로부터 선택되는 신호 생성 시스템의 구성원인 화합물.
- 하기 화학식의 화합물:
또는 하기 화학식의 화합물:
상기 식에서, R'는 -O-석신이미딜 또는 -NH-O-(A)k-R2 (여기서 R2는 신호 생성 시스템의 구성원이다), -(CH2)nCOOH, -(CH2)mCOONHS (NHS는 N-하이드록시석신이미드이다), 소분자, 소분자에 대한 결합 파트너, 또는 지지체이고; k는 0 또는 1이고; A는 k가 0일 때 결합이고, k가 1일 때 연결기이며; n은 1 내지 5의 정수이고 m은 1 내지 5의 정수이며;
R1은 H, OH, 또는 보호된 OH이고;
R4는 H, OH 또는 저급 알콕시이다. - 제 4항에 있어서, R2가 형광 화합물, 화학발광 화합물, 증감제, 효소 및 방사성표지로 구성된 군으로부터 선택되는 신호 생성 시스템의 구성원인 화합물.
- 제 4항에 있어서, R2가 입자를 포함하는 신호 생성 시스템의 구성원인 화합물.
- 제 6항에 있어서, 입자가 형광 화합물, 화학발광 화합물, 증감제 입자 및 자분(magnetic particles)으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
- 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이,
(a) (i) 샘플,
(ii) 제 5항에 따른 화합물, 및
(iii) 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원을 매질에 조합하여 제공하는 단계;
(b) 제 1항의 화합물이 특이적 결합 구성원에 결합하여 복합체를 형성하는 조건 하에 조합물을 두는 단계, 및
(c) 복합체의 양을 측정하는 단계로서, 복합체의 양이 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양과 관련되는 단계를 포함하는 방법. - 하기 화학식의 화합물:
또는 하기 화학식의 화합물:
상기 식에서, L은 자분, 아크리디늄 에스테르, 자분과 아크리디늄 에스테르의 조합물, 화학발광 입자 및 증감제 입자로 구성된 군으로부터 선택되고; R1'은 OH이고 A'는 결합 또는 연결기이다. - 제 9항에 있어서, L이 화학발광 입자인 화합물.
- 제 9항에 있어서, 하기 화학식:
또는 하기 화학식을 갖는 화합물:
상기 식에서, p는 1 내지 5의 정수이고, q는 1 내지 5의 정수이고, r은 1 내지 5의 정수이다. - 제 11항에 있어서, L이 화학발광 입자인 화합물.
- 제 9항에 따른 화합물을 검정에서 하나의 시약으로서 이용하는 것을 포함하는 비타민 D에 대한 검정법.
- 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이,
(a) (i) 샘플,
(ii) 제 9항에 따른 화합물, 및
(iii) 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원을 매질에 조합하여 제공하는 단계;
(b) 제 1항의 화합물이 특이적 결합 구성원에 결합하여 복합체를 형성하는 조건 하에 조합물을 두는 단계, 및
(c) 복합체의 양을 측정하는 단계로서, 복합체의 양이 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양과 관련되는 단계를 포함하는 방법. - 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이,
(a) (i) 샘플,
(ii) 하기 화학식의 화합물:
또는 하기 화학식의 화합물:
, 및
(iii) 비타민 D에 대한 특이적 결합 구성원을 매질에 조합하여 제공하는 단계;
(b) 상기 화합물이 특이적 결합 구성원에 결합하여 복합체를 형성하는 조건 하에 조합물을 두는 단계, 및
(c) 복합체의 양을 측정하는 단계로서, 복합체의 양이 샘플 중 비타민 D의 존재 및/또는 양과 관련되는 단계를 포함하는 방법:
상기 식에서, R"은 -NH-O-A"-R2'이고, 여기서 R2'는 신호 생성 시스템의 구성원이며, A"는 결합 또는 연결기이고,
R1"은 H 또는 OH이다. - 제 15항에 있어서, A"가 -(CH2)p-C(O)-(W)b-(CH2)q-(X)c-(CH2)r-이고, 여기서 W 및 X가 각각 독립적으로 -NH- 또는 -O-이고, b 및 c가 각각 독립적으로 0 또는 1이고, p가 1 내지 5의 정수이고, q가 1 내지 5의 정수이고, r이 1 내지 5의 정수인 방법.
- 제 15항에 있어서, 신호 생성 시스템의 구성원이 증감제 및 화학발광 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 17항에 있어서, 신호 생성 시스템의 구성원이 입자와 결합되는 방법.
- 제 15항에 있어서, 신호 생성 시스템의 구성원이 광증감제이고, 조합물이 화학발광 시약을 추가로 포함하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 신호 생성 시스템의 구성원이 화학발광 화합물이고, 조합물이 광증감제 시약을 추가로 포함하는 방법.
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