DE68925603T2 - Akridiniumester und Verfahren zum Nachweis von Analyt mit Akridiniumestern und Liposomen - Google Patents
Akridiniumester und Verfahren zum Nachweis von Analyt mit Akridiniumestern und LiposomenInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft Acridiniumester und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten unter Verwendung von Acridiniumestern und Liposomen; sie betrifft insbesondere: ein Verfahren für den Nachweis eines Analyten in einer Flüssigprobe unter Verwendung von Acridiniumestern, die innerhalb der Wände von Liposomen (Lumisomen) eingeschlossen sind, und als Chemilumineszenzmarker geeignete Acridiniumester, die in Liposomenvesikeln ohne beträchtlichen Verlust des Esters aus den Vesikeln eingeschlossen werden konnen
- Die Verwendung von Liposomen als Träger von Markermolekülen für Immuntests ohne Isotope ist bekannt (s. z.B. US-Patente Nr. 4704355, 4695554, 4656129 und 4193983). Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von Liposomen bei Immuntests ist, daß Liposomen eine große Anzahl Markermoleküle pro Liposomenvesikel tragen konnen. Sie liefern dadurch ein verstärktes Signal bei Immuntests. Irnmuntests, die Liposomen mit eingeschlossenen Makromolekülmarkern wie Enzyme oder kleine organische Markermoleküle wie Fluoreszenz- oder absorbierende Farbstoffe, Spinmarkierungen, Metallchelatoren und Enzymaktivatoren oder -inhibitoren verwenden, sind beschrieben worden (s. z.B. Cricka, L. und Carter, T. Clinical and Biochemical Luminescence, S. 153-178 (Marcel Dekker, Inc., New York und Basel, 1982)). Vor dieser Erfindung wurden Chemilumineszenzmarker wie die in Ann. Clin. Biochem. 25, S. 27 (1988); Clin. Chem. 31, S. 664 (1985); EP- A-82636 und US-Patent Nr. 4745181 beschriebenen Acridiniumester nur als Markierungen für Immuntests verwendet, indem sie direkt an biologische Moleküle wie Antigene oder Antikörper konjugiert wurden. Die Acridiniumester des Standes der Technik und andere Chemilumineszenzverbindungen sind aufgrund ihrer lipophilen Natur für den Einschluß in Liposomen ungeeignet, da sie schnell durch die Liposomenwand entweichen. Außerdem können nur wenige Markermoleküle pro Liposomenvesikel eingeschlossen werden, da die Acridiniumester und die anderen Chemilumineszenzverbindungen begrenzt wasserlöslich sind. Dieses führt zu einer relativ niedrigen Signalverstärkung.
- Folglich betrifft ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten unter Verwendung von Acridiniumestern. Ein Gegenstand der Erfindung betrifft auch hydrophile Acridiniumester, die für den Einschluß in Liposomen für die Verwendung als Chemilumineszenzmarker geeignet sind.
- Die Erfindung stellt ein Liposom bereit, dadurch gekennzeichnet, daß es einen darin eingeschlossenen Acridiniumester umfaßt. (Hier wird der Ausdruck "Lumisom" verwendet.)
- Solche Lumisomen umfassen bevorzugt die ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellten Acridiniumester, die der folgenden allgemeinen Formel entsprechen:
- wobei R&sub1; Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Aralkyl ist, die eine oder mehrere Heteroatome enthalten können;
- R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub7; unabhängig voneinander Wasserstoff, Amino, Alkoxyl, Hydroxyl, -COOH, Halogenid, Nitro, -CN, -SO&sub3;H, -NHC(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR oder -SCN sind, wobei R Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Aralkyl ist, die eine oder mehrere Heteroatome enthalten können;
- R&sub4; und R&sub8; unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aralkyl oder Alkoxyl sind;
- R&sub6; -COOH, -R-In oder -Q-R-In ist, wobei R ein Diradikal ist, abgeleitet von Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Aralkyl, die ein oder mehrere Heteroatome enthalten können; Q -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -SO&sub3;, Diazo, -NHC(S)NH-, -NHC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)NH- oder -NHC(N&spplus;H&sub2;)-; I -SO&sub3;H, -OSO&sub3;H, -PO(OH)&sub2;, -OPO(OH)&sub2; oder -COOH ist; und n eine ganze Zahl von wenigstens 1 ist; und
- X ein Anion ist.
- Bestimmte bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen sind wie folgt: wobei R&sub1; und R bis zu 24 Kohlenstoffatome enthalten können und/oder bis zu 20, vorzugsweise bis zu 10 Heteroatome enthalten können, die aus Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor und Schwefel ausgewählt werden können; R&sub1; vorzugsweise C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl ist; und/oder wobei R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub7; unabhängig voneinander Wasserstoff, Amino, -COOH, -CN, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyl, Nitro, Halogenid, -SO&sub3;H oder -SCN, vorzugsweise Wasserstoff, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyl, Nitro, Amino oder -SO&sub3;H sind, und/oder wobei X ein Halogenid, CH&sub3;SO&sub4;&supmin;, FSO&sub3;&supmin;, CF&sub3;SO&sub3;&supmin;, C&sub4;F&sub9;SO&sub3;&supmin; oder OSO&sub2;-Ph-CH&sub3;, vorzugsweise ein Halogenid ist; und/oder wobei Q -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, Diazo, -NHC(S)NH-, -NHC(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH- oder -NHC(N&spplus;H&sub2;)- ist; und/oder wobei R&sub4; und R&sub8; unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder Alkoxyl sind, die bis zu 8 Kohlenstoffatome enthalten können, vorzugsweise C&sub1;- C&sub4;-Alkyl; und/oder wobei R&sub6; -Q-R-In ist; und/oder wobei I - SO&sub3;H, -OSO&sub3;H, -PO(OH)&sub2;, -OPO(OH)&sub2; oder -COOH ist; und/oder wobei n eine ganze Zahl von bis zu 20, vorzugsweise bis zu 10 ist. Insbesondere ist bevorzugt, daß X ein Bromid ist, R&sub1;, R&sub4; und R&sub8; Methyl sind; R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub7; Wasserstoff sind; und R&sub6; ausgewählt ist aus Aminomethansulfonsäure [die auch als Sulfomethylcarbamoyl bezeichnet wird, wenn sie an -CO- gebunden ist; s. Beispiel 2 unten], 7-Amino-1,3-naphthalendisulfonsäure [die auch als N-7-(1,3-Disulfonaphthalenyl)carbamoyl bezeichnet wird, wenn sie an -CO- gebunden ist; s. Beispiel 3 unten], S-(3-Sulfopropyl)cystein [das auch als N- [1-Carboxyl-2-(3-sulfopropylthio)ethyl]carbamoyl bezeichnet wird, wenn es an -CO- gebunden ist; s. Beispiel 4 unten), 2- Aminoethylhydrogensulfat [das auch als N-(2-Sulfonyloxyethyl)carbamoyl bezeichnet wird, wenn es an -CO- gebunden ist; s. Beispiel 5 unten], 2-Aminoethylphosphonsäure [die auch als N-(2-Phosphonoethyl)carbamoyl bezeichnet, wird wenn sie an -CO- gebunden ist; s. Beispiel 6 unten), und 2-Aminoethyldihydrogenphosphat [das auch als N-(2-Phosphonooxyethyl)carbamoyl bezeichnet wird, wenn es an -CO- gebunden ist; s. Beispiel 7 unten].
- Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Lumineszenztest- Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Lumisom, gekuppelt an mindestens ein biologisch aktives Molekül, umfaßt, das aus Antikörpern, Antigenen, Haptenen und Nukleinsäure(n) ausgewählt sein kann.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren für die Bestimmung eines Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kombinieren einer Probenflüssigkeit, eines Lumisoms oder eines Konjugates und eines ersten Rezeptors für den Analyten und anschließendes Bestimmen der mit dem Analyten assoziierten Lumisomenmarkierungsmenge umfaßt; oder, wenn der Analyt ein Element eines spezifischen Bindungsliganden/Antiligandenpaares ist, Nachweisen des Wertes der nachweisbaren Lumisomenmarkierung im Vergleich zur Bestimmung der nachweisbaren Markierung einer Probe mit einer bekannten Analytmenge.
- Bei einem solchen Verfahren kann der Analyt ein Antigen, ein Hapten, eine DNA-Sonde oder eine RNA-Sonde sein und/oder der Rezeptor kann ein Antikörper sein. Wie bei einem solchen Verfahren erwünscht, wird die Probenflüssigkeit mit einem einen zweiten Rezeptor für den Analyten umfassenden Festträger vor, gleichzeitig mit oder nach dem Vereinigen der Probenflüsigkeit mit dem Lumisom kombiniert.
- Bezüglich der begleitenden veranschaulichenden Zeichnungen ist:
- Figur 1 eine Standard-Kurve für den Gesamt-T&sub4;-Test unter Verwendung von erfindungsgemäßen Lumisomen
- Figur 2 eine Standard-Kurve für den Freies-T&sub4;-Test unter Verwendung von erfindungsgemäßen Lumisomen.
- Figur 3 eine Standard-Kurve für einen CKMB-Test unter Verwendung von erfindungsgemäßen Lumisomen.
- Figur 4 ein Vergleich zweier Standard-Kurven für einen TSH-Test, wobei die obere Kurve einen TSH-Test unter Verwendung von erfindungsgemäßen Lumisomen und die untere Kurve einen TSH-Test unter Verwendung von direkt mit Acridiniumester markiertem Antikörper darstellt.
- Figur 5 ein Vergleich zweier Standard-Kurven für einen TSH-Test, wobei die obere Kurve einen TSH-Test unter Verwendung von erfindungsgemäßen Lumisomen und verkürzten Inkubationszeiten und die untere Kurve einen TSH-Test unter Verwendung von direkt mit Acridiniumester markiertem Antikörper und üblichen Inkubationszeiten darstellt.
- Für die vorliegenden Zwecke bedeuten diese Ausdrücke folgendes:
- Analyt - die zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, die ein Mono- oder Polyepitop-, ein Antigen- oder ein Hapten-Ligand sein kann. Der Analyt kann ein DNA- oder RNA-Stück sein.
- Antigen - eine beliebige Substanz, die in Vertebraten eine Immunreaktion hervorrufen kann, insbesondere mit der Erzeugung spezifischer Antikörper.
- Hapten - ein unvollständiges Antigen, das selbst keine Immunreaktion hervorrufen kann, das jedoch, wenn es angemessen an ein anderes Molekül gebunden ist, Antikörper produzieren kann, die das Hapten spezifisch erkennen.
- Epitop - eine spezifische chemische und räumliche Konfiguration, die durch einen Antikörper spezifisch erkannt wird.
- Ligand - eine beliebige Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann.
- Ligandenanlogon - ein modifizierter Ligand, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor kompetieren kann, wobei die Modifikation Mittel bereitstellt, mit denen ein modifizierter Ligand an ein anderes Molekül gebunden werden kann.
- Rezeptor - eine beliebige Verbindung, die eine besondere räumliche und polare Organisation eines Moleküls, d.h. Epitopstelle, erkennen kann. Beispielhafte Rezeptoren sind u.a. Antikörper, Enzyme, Antikörperfragmente wie Fab- Fragmente, DNA- oder RNA-Fragmente, Lectine, Bestandteile des Komplementsystems, Conglutin, Rheumafaktoren, Hormone, Avidin, Staphylokokken-Protein A und dergleichen.
- Antiligand - ein Rezeptor für einen Liganden.
- DNA-Sonde - DNA-Stück, das spezifische DNA- oder RNA- Sequenzen erkennt, indem es an komplementäre DNA oder RNA hybridisiert
- RNA-Sonde - RNA-Stück, das spezifische DNA- oder RNA- Sequenzen erkennt, indem es an komplementäre DNA oder RNA hybridisiert.
- Liposomen - Körper aus einem oder vielen Kompartimenten, die erhalten werden, wenn Lipide, insbesondere Lipidgemische, in wäßriger Suspension dispergiert werden. Die Wände oder Membranen bestehen aus einer kontinuierlichen Lipid- Doppelschicht.
- Lumisomen - Liposomen, die einen eingeschlossenen Acridiniumester umfassen.
- Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Acridiniumester können beliebige Acridiniumester sein, die in einem Liposom eingeschlossen sind und ein Chemilumineszenzsignal erzeugen können.
- Eine ionisierbare Gruppe für die vorliegenden Zwecke ist eine funktionelle Gruppe, die eine positive oder negative Nettoladung in einem bestimmten pH-Bereich behält. Die funktionelle Gruppe behält bevorzugt eine positive oder negative Nettoladung im pH-Bereich von 2-10, bevorzugt von 5- 9. Sie kann verschiedene ionisierbare Gruppen darstellen, mit der Maßgabe, daß die ionisierbare Gruppe den Einschluß des Acridiumesters in dem Liposom nicht beeinträchtigt.
- Wie in der vorstehenden allgemeinen Formel gezeigt, können die R&sub5;- und R&sub6;-Stellungen in den erfindungsgemäßen Acridiniumestern untereinander ausgetauscht werden.
- Die erfindungsgemäßen Acridiniumester sind stark wasserlöslich und können in hohen Konzentrationen in Liposomen eingeschlossen werden. Sobald die erfindungsgemäßen Acridiniumester in den Liposomen sind, bleiben sie für längere Zeiträume eingeschlossen und treten nicht nennenswert aus.
- Der Fachmann erkennt, daß die erfindungsgemäßen Acridiniumester, obwohl ihrer Verwendbarkeit mit Liposomen beschrieben wurde, auch bei anderen Anwendungen, bei denen Acridiniumester verwendet werden, geeignet sind, wie als Markierung von Liganden oder Analyten (wie Antigene), Markierung spezifischer Bindungspartner von Liganden oder Analyten (wie die entsprechenden Antikörper) oder als Markierung von Nukleinsäuren und Nukleinsäure umfassenden Moleküle.
- Erfindungsgemäß geeignete Lumisomen können nach einem der verschiedenen bekannten Verfahren zum Herstellen von unilamellaren Liposomenvesikeln oder multilamellaren Liposomenvesikeln hergestellt werden. Lumisomen sind Körper aus einem oder vielen Kompartimenten, die erhalten werden, wenn Lipide oder Lipidgemische in einer wäßrigen Suspension dispergiert werden, die die erfindungsgemäß geeigneten Acridiniumester enthält.
- Bei einem Beispiel für ein Herstellungsverfahren von Lumisomen werden Lipide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst und in einem geeigneten Gefäß untergebracht. Unter Verdampfen des organischen Lösungsmittels bildet sich ein trockener Lipidfilm auf der Innenoberfläche des Gefäßes. Die wäßrige Lösung, die die in den Lumisomen einzuschließenden Acridiniumester enthält, wird dann in dem Gefäß mit dem Lipidfilm in Kontakt gebracht. Der Lipidfilm wird dann in der wäßrigen Lösung durch heftiges Schütteln oder Ultraschallbehandlung dispergiert.
- Es gibt viele andere Verfahren für die Bildung von Liposomen, die sich zur Herstellung der erfindungsgemäß geeigneten Lumisomen eignen. Es obliegt dem Fachmann, das für eine erwünschte Verwendung am besten geeignete Verfahren auszuwählen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Liposomen ist in der Parallelanmeldung mit der US-Anmeldungs- Nr. 940571, eingereicht am 11. Dezember 1986, hier durch Bezugnahme aufgenommen, offenbart.
- Das Lumisom kann mit einem Liganden, einem Ligandenanalogon oder Antiliganden mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren derivatisiert werden. Je nach der beabsichtigten Verwendung des Lumisoms kann der Ligand, das Ligandenanalogon oder der Antiligand ein Antigen, Hapten, Antikörper, eine Nukleinsäure, DNA, RNA, Avidin oder ein anderer Rezeptor sein.
- Die so gebildeten Lumisomen können als Indikatoren in Tests verwendet werden, in denen ein Analyt in einer Probenflüssigkeit nachgewiesen werden soll. Der Typ des eingesetzten Tests und/oder der nachzuweisende Analyt bestimmt/en den/das zur Bildung des Lumisoms verwendeten Liganden, Ligandenanalogon oder Antiliganden. Wird z.B. ein Kompetitionstest zur Bestimmung eines Antigens oder Haptens verwendet, ist der/das eingesetzte Ligand oder Ligandenanalogon entweder der Analyt oder dessen Analogon.
- Soll ein Sandwichtest verwendet werden, ist der/das eingesetzte Ligand, Ligandenanalogon oder Antiligand spezifisch für den zu untersuchenden Analyten. Beispielsweise kann ein Antikörper wie ein monoklonaler Antikörper, hervorgerufen als Antwort auf den zu untersuchenden Analyten, verwendet werden, um das Lumisom zu derivatisieren.
- Ein Beispiel für einen Test zum Nachweis einer DNA- oder RNA-Sonde mit Hilfe der erfindungsgemäßen Lumisomen ist wie folgt: Die DNA- oder RNA-Sonde wird mit einem Liganden wie einem Hapten oder einem modifizierten biotinylierten Nukleotid markiert. Die DNA- oder RNA-Sonde kann mit komplementärer DNA oder RNA hybridisieren und wird auf einem Festträger immobilisiert. Die immobilisierte Probe wird anschließend mit Lumisomen umgesetzt, die einen Rezeptor für den Liganden wie einen Antikörper, oder falls die Sonde biotinyliert ist, Avidin umfassen. Die Lumisomen werden aufgebrochen und die Menge des durch den eingeschlossenen Acridiniumester erzeugten Signals wird gemessen.
- Ersatzweise kann ein Rezeptor ohne Markierung verwendet werden, der das Sonde/komplementäre DNA- oder RNA-Hybrid erkennt und daran bindet, wie ein Anti-Hybrid-Antikörper.
- Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.
- Ein Gemisch aus 2',6'-Dimethyl-4'-benzyloxycarbonylphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat-methosulfat (7,9, 13,4 mMol) (wie in US-Patent Nr. 4745181 beschrieben hergestellt), 150 ml Eisessig und 46 ml 48%igem Bromwasserstoff wurde 3 Stunden lang bei 100ºC-105ºC erhitzt und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Zu dem Gemisch wurden 400 ml wasserfreier Ethylether gegeben, um ein zweites Gemisch zu bilden, das dann 3 Tage lang gekühlt wurde. Das zweite Gemisch wurde anschließend unter Erzeugung eines gelben kristallinen Rückstands filtriert. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Ethylether gewaschen und an der Luft getrocknet.
- Eine Lösung aus 2',6'-Dimethyl-4'-carboxylphenyl-10- methylacridinium-9-carboxylatbromid (DMAE-COOH, 20 mg, 0,043 mmol) in 2 ml Dimethylformamid (DMF)/CHCl&sub3; (1:1) wurde unter Bildung eines Reaktionsgemisches in einem Eisbad gekühlt, mit Triethylamin (31 µl, 0,215 mmol) und Ethylchlorformiat (6,1 µl, 0,065 mmol) behandelt. Nach 30 Min. wurde das Reaktionsgemisch verdampft. Der Rückstand aus der Verdampfung wurde in 2 ml DMF aufgenommen, mit Triethylamin (31 µl, 0,215 mmol) und Aminomethansulfonsäure (9,5 mg, 0,086 mmol) unter Bildung eines zweiten Reaktionsgemisches behandelt. Das zweite Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und verdampft. Das so gebildete Rohprodukt wurde auf einer analytischen TLC-Platte (Silicagel 60, F254, Merck & Co., Inc. Rahway, N.J.) gereinigt und mit Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4) entwickelt. Die gelbe Bande, die sich auf der Platte (Rf = 0,38) entwickelte (die auch unter langwelligem und kurzwelligem UV-Licht nachgewiesen werden konnte), wurde von der Platte entnommen und mit dem gleichen Lösungsmittelsystem eluiert. Das so entstandene Eluat wurde verdampft und der Rückstand aus der Verdampfung wurde unter Bildung eines Gemischs mit Methanol verrieben. Dieses Gemisch wurde anschließend durch eine auf einem Spritzenfilterhalter befestigte Polycarbonatmembran (13 mm Durchmesser, 0,2 µm Porengröße) (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) filtriert. Das so entstandene Filtrat wurde unter Bildung von DMAE-AMS (15 mg, 62%) verdampft.
- Eine Lösung aus 2',6'-Dimethyl-4'-carboxylphenyl-10- methylacridinium-9-carboxylatbromid (DMAE-COOH, 18 mg, 0,038 mMol) in 3,6 ml eines Gemischs aus Dioxan/Wasser (1:1) wurde unter Bildung eines Reaktionsgemisches mit 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (37 mg, 0,193 mMol, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) 5 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Eine Lösung aus 7- Amino-1,3-naphthalendisulfonsäure (ANDS, 26 mg, 0,076 mMol, Aldrich Chemical Co., Inc.) in 0,9 ml Wasser wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Dieses wurde anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und verdampft.
- Der Rückstand aus der Verdampfung wurde in einer möglichst geringen Menge 0,1 M Natriumcarbonat gelöst, um eine Lösung mit neutralem pH-Wert zu erhalten. Diese Lösung wurde mit einer gleichen Menge Methanol gemischt und auf einer 20x20 cm präparativen TLC-Platte (Silicagel 60, F254, Merck & Co., Inc.) gereinigt und mit Chloroform/Methanol/Wasser (55:40:5) entwickelt. Die sich entwickelnde gelbe Bande ((Rf = 0,4) wurde auf die gleiche Weise behandelt wie die in Beispiel 1 beschriebene gelbe Bande, wobei DMAE-ANDS (15 mg, 50%) entstand. Massenspektroskopieanalyse mit schnellen Atomstrahlen (FAB) (von Oneida Research Services, Whitesboro, N.Y.) im positiven lonenmodus ergab einen M&spplus;-Peak von 671, einen M&spplus;-Na-Peak von 693 und einen einen M&spplus;-2Na-Peak von 715. Im negativen lonenmodus wurde ein Bromid-Peak von 80 nachgewiesen.
- Eine Lösung aus 2',6'-Dimethyl-4'-carboxylphenyl-10- methylacridinium-9-carboxylatbromid (DMAE-COOH, 50 mg, 0,107 mMol) in 10 ml DMF/CHCl&sub3; (1:1) wurde in einem Eisbad gekühlt, mit Triethylamin (77 µl, 0,535 mMol) und Ethylchlorformiat (20 µl, 0,214 mMol) behandelt, so daß ein Reaktionsgemisch entstand. Nach 30 Min. wurde das Reaktionsgemisch verdampft. Der Rückstand aus der Verdampfung wurde in 10 ml DMF/CHCl&sub3; (1:1) aufgenommen, mit Triethylamin (77 µl, 0,535 mMol) und S-3-Sulfopropyl-L-cystein (51 mg, 0,214 mMol) (hergestellt durch das Verfahren von U.T. Ruegg und J. Rudinger, J. Peptide Protein Res. 6, 447, 1974) unter Bildung eines zweiten Reaktionsgemisches behandelt. Das zweite Reaktionsgemisch wurde bei 60ºC-70ºC über Nacht erhitzt und verdampft.
- Der Rückstand aus der Verdampfung wurde auf einer 20x20 cm präparativen TLC-Platte (Silicagel 60, F254, Merck & Co., Inc.) gereinigt und mit Chloroform/Methanol/Wasser (55:40:5) entwickelt. Die sich entwickelnde gelbe Bande (Rf = 0,4) (die auch unter langwelligem und kurzwelligem UV-Licht nachgewiesen werden konnte) wurde auf die gleiche Weise behandelt wie die in Beispiel 1 beschriebene gelbe Bande, wobei DMAE-SCYS (37 mg, 36%) entstand. FAB-Massenspektralanalyse im positiven Ionenmodus ergab einen M&spplus;-Peak von 611, einen M&spplus;-Na-Peak von 633 und einen M&spplus;-Na,K- Peak von 673.
- Eine Lösung aus 2',6'-Dimethyl-4'-carboxylphenyl-10- methylacridinium-9-carboxylatbromid (DMAE-COOH, 35 mg, 0,075 mMol) in 5 ml DMF wurde in einem Eisbad gekühlt, mit Triethylamin (44 µl, 0,31 mMol) und Ethylchlorformiat (8,5 µl, 0,090 mMol) behandelt. Nach 20 Minuten wurde Aminoethylhydrogensulfat (Aldrich, 30 mg, 0,21 mMol) zugegeben, so daß ein Reaktionsgemisch entstand, und das Eisbad wurde entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und verdampft. Der Rückstand aus der Verdampfung wurde mit 5 ml eines Gemischs aus Chloroform/Methanol/Wasser (73:24:3) verrieben und filtriert, um unlösliche Substanzen zu entfernen.
- Das so entstandene Filtrat wurde eingeengt, auf einer 20x20 cm präparativen TLC-Platte (Silicagel 60, F254, Merck & Co., Inc.) gereinigt und mit Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4) entwickelt. Die sich entwickelnde gelbe Bande (Rf = 0,48) (die auch unter langwelligem und kurzwelligem UV-Licht nachgewiesen werden konnte) wurde auf die gleiche Weise behandelt wie die in Beispiel 1 beschriebene gelbe Bande, wobei DMAE-AEOS (14 mg, 32%) entstand.
- Eine Lösung aus 2',6'-Dimethyl-4'-carboxylphenyl-10- methylacridinium-9-carboxylatbromid (DMAE-COOH, 100 mg, 0,215 mMol) in 20 ml 25% DMF in Chloroform wurde in einem Eisbad gekühlt, mit Triethylamin (180 µl, 1,30 mMol) und Ethylchlorformiat (62 µl, 0,65 mMol) behandelt, so daß ein Reaktionsgemisch entstand. Nach 30 Min. wurde das Reaktionsgemisch verdampft. Der Rückstand aus der Verdampfung wurde in 12 ml DMF aufgenommen. Zu dieser so entstandenen Lösung wurde Triethylamin (300 µl, 2,15 mMol) und 2- Aminoethylphosphonsäure (80 mg, 0,64 mMol, Aldrich Chemical Co., Inc.) in 5 ml Wasser gegeben, um ein zweites Reaktionsgemisch zu bilden. Das zweite Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und verdampft. Der Rückstand aus der Verdampfung wurde in 2-3 ml Chloroform/Methanol/Wasser (73:24:3) aufgenommen, auf einer 20x20 cm präparativen TLC-Platte (Silicagel 60, F254, Merck & Co., Inc.) gereinigt und mit Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4) entwickelt. Die sich auf der Platte entwickelnde gelbe Bande (Rf = 0,45) (die auch unter langwelligem und kurzwelligem UV-Licht nachgewiesen werden kann) wurde auf die gleiche Weise behandelt wie die in Beispiel 1 beschriebene gelbe Bande, wobei DMAE-AEP (72 mg, 58%) entstand.
- FAB-Massenspektralanalyse im positiven Ionenmodus ergab einen M&spplus;-Peak von 493 und einen M&spplus;-Na-Peak von 515.
- Eine Lösung aus 2',6'-Dimethyl-4-carboxylphenyl-10- methylacridinium-9-carboxylatbromid (DMAE-COOH, 100 mg, 0,215 mMol) in 20 ml 25% DMF in Chloroform wurde in einem Eisbad gekühlt, mit Triethylamin (180 µl, 1,30 mMol) und Ethylchlorformiat (62 µl, 0,65 mMol) behandelt, so daß ein Reaktionsgemisch entstand. Nach 30 Min. wurde das Reaktionsgemisch verdampft. Der Rückstand aus der Verdampfung wurde in 12 ml DMF aufgenommen. Zu dieser so entstandenen Lösung wurde Triethylamin (300 µl, 2,15 mMol) und 2- Aminoethyldihydrogenphosphat (91 mg, 0,64 mmol, Aldrich Chemical Co., Inc.) in 5 ml Wasser gegeben, um ein zweites Reaktionsgemisch zu bilden. Das zweite Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und verdampft. Der Rückstand aus der Verdampfung wurde in 2-3 ml Chloroform/Methanol/Wasser (73:24:3) aufgenommen, auf einer 20x20 cm präparativen TLC-Platte (Silicagel 60, F254, Merck & Co., Inc.) gereinigt und mit Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4) entwickelt. Die sich entwickelnde gelbe Bande (Rf = 0,45) (die auch unter langwelligem und kurzwelligem UV-Licht nachgewiesen werden konnte) wurde auf die gleiche Weise behandelt wie die in Beispiel 1 beschriebene gelbe Bande, wobei DMAE-AEOP (100 mg, 79%) entstand.
- FAB-Massenspektralanalyse im positiven Ionenmodus ergab einen M&spplus;-Peak von 509.
- Lumisomen wurden wie folgt hergestellt:
- Chloroformlösungen, die 25 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin, 13,5 mg Cholesterin und 2,2 mg Dipalmitoylphosphatidylglycerin enthielten, wurden auf einer runden Flachglasschale mit 7 cm Durchmesser luftgetrocknet und 16 Stunden lang in einem Vakuum untergebracht, um trockene Lipidfilme herzustellen. Die Acridiniumester DMAE-COOH, DMAE- AMS und DMAE-ANDS wurden jeweils in einer Lösung aus 0,215 M Saccharose, 0,25 mM EDTA, pH-Wert 7(0,1-0,26 mg/ml) gelöst. Die Acridiniumester DMAE-SCYS, DMAE-AEOS, DMAE-AEP und DMAE- AEOP wurden jeweils in einer Lösung aus 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4 (0,1-0,26 mg/ml) gelöst. Zu einem separaten getrockneten Lipidfilm wurde jeweils ein Drei-Milliliter-Aliquot jeder so hergestellten Acridiniumesterlösung zugegeben und bei 45ºC 10 Minuten lang leicht gemischt, um eine Lumisomensuspension herzustellen. Jede so hergestellte Suspension, die DMAE-COOH, DMAE-AMS und DMAE-ANDS enthielt, wurde durch Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 0,4 und 0,2 Mikron extrudiert und dann 4 Mal durch Ultrazentrifugationen bei 45000 U/Min während 30 Min in TRIS-Puffer (0,1 M TRIS, 0,03 M NaCl, 0,01% NaN&sub3;, 0,5 mM EDTA, pH-Wert 7,8) gewaschen, so daß ein Lumisomen-Pellet entstand. Die so entstandenen Lumisomen-Pellets wurden jeweils in 10 ml TRIS-Puffer resuspendiert. Jede Lumisomensuspension, die DMAE-SCYS, DMAE-AEOS, DMAE-AEP und DMAE-AEOP enthielt, wurde durch Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 0,4 und 0,2 Mikron extrudiert und dann 4 Mal durch Ultrazentrifugationen bei 45000 U/min während 30 Min in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4, gewaschen, so daß ein Lumisomen-Pellet entstand. Die so entstandenen Lumisomen- Pellets wurden jeweils in 10 ml 50 mM Natriumphosphat, pH- Wert 7,4, resuspendiert. Eine Probe jedes resuspendierten Lumisomen-Pellets wurde mit 0,1%igem TRITON-X-100-Detergens (Gewicht/Volumen) gemischt, um die Gesamtmenge an eingeschlossenem Acridiniumester zu bestimmen. Aliquote jedes resuspendierten Lumisomen-Pellets wurden 7 Tage lang bei 4ºC und 37ºC inkubiert. Die Aliquote wurden anschließend 2 Stunden lang bei 45000 U/Min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde eine Probe von jedem überstand entnommen und mit 0,1%igem TRITON-X-100 gemischt. Die Konzentration an Acridiniumester in jedem überstand wurde dann mit dem Ciba Corning Magic LITE-Analysator (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA) bestimmt. Der prozentuale Ausstrom an Acridiniumester wurde dann berechnet, indem die Menge an Acridiniumester im überstand mit der Gesamtmenge an ursprünglich in den Lumisomen eingeschlossenem Acridiniumester verglichen wurde. Tabelle 1 Ausstrom von Acridiniumestern aus Lumisomen Acridiniumester % Ausstrom bei ºC/ 7Tage
- Lumisomen mit eingeschlossenem DMAE-ANDS wurden nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß DMAE-ANDS vor der Zugabe zu dem trockenen Lipidfilm in den vier in Tabelle 2 aufgeführten Puffern gelöst wurde. Die Puffer wurden dann verwendet, um die vier Lumisomenpräparate in Tabelle 2 zu waschen, resuspendieren bzw. auf zubewahren. Die so hergestellten Lumisomen wurden in ihren entsprechenden Puffern 35 Tage lang bei entweder 4ºC oder 37ºC aufbewahrt und dann bei 45000 U/Min 2 Stunden lang zentrifugiert. Die Konzentration von DMAE-ANDS in jedem überstand wurde dann mit dem Ciba Corning Magic LITE- Analysator bestimmt. Der prozentuale Ausstrom an DMAE-ANDS wurde dann berechnet, indem die Menge an DMAE-ANDS im überstand mit der Menge an ursprünglich in den Lurnisomen eingeschlossenem DMAE-ANDS verglichen wurde. Tabelle 2 Wirkung verschiedener Puffer auf den Ausstrom von DMAE-ANDS aus Lumisomen nach 35 Tagen bei 4ºC und bei 37ºC Puffer ( mM) % Ausstrom bei ºC Natriumphosphat pH-Wert Natriumacetat pH-Wert Natriumtartrat pH-Wert Natrium-HEPES pH-Wert
- Thyroxin-(T&sub4;)-Lumisomen mit eingeschlossenem DMAE-AMS wurden wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt, ausgenommen daß 0,16 mg Dipalmitoylphosphatidylethanolaminsuccinylthyroxin (hergestellt wie beschrieben in der US-Anmeldung mit der Anmeldenummer 094667, eingereicht am 9. September 1987, hier durch Bezugnahme aufgenommen) zu dem Lipidgemisch gegeben wurde. DMAE-AMS in einer Konzentration von 0,2 mg/ml in Phosphatpuffer wurde für die Hydratation des Lipidfilms verwendet. Das endgültige Lumisomenpräparat wurde in Puffer A (0,02 M Tris, 0,1 M NaCl, 0,001 M EDTA, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Natriumazid, pH-Wert 7,8) verdünnt.
- In Mäusen (A/J) wurden durch Immunisieren mit einem BSA- T&sub4;-Konjugat und anschließendes Fusionieren der Milzzellen mit Sp2/0-Ag-14-Myelomzellen monoklonale anti-T&sub4;-Antikörper hergestellt. Hierbei wurde das von Köhler und Milstein in Nature (London), Bd. 256, S. 495-497 (1975), beschriebene Verfahren angewendet. Anti-T&sub4;-Antikörper sezernierende Hybridomzellen wurden mit einem Radioimmuntest unter Verwendung des folgenden Verfahrens nachgewiesen: Zellüberstände wurden 1:5 in phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,1% (Gewicht/Volumen) Rinder-Gammaglobulin enthielt, verdünnt. Es wurden 100 µl jedes verdünnten überstandes und 100 µl ¹²&sup5;I-markiertes T&sub4; zu einem Teströhrchen gegeben und eine (1) Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ziegeanti-Maus-IgG, gekuppelt an paramagnetische Teilchen&sub1; wurden zu jedem Röhrchen während zehn (10) Minuten bei Raumtemperatur gegeben. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt und gezählt. Positive Zellen (d.h. solche, die Zählimpulse über dem Hintergrund erzeugten) wurden zu 0,1 Zellen/Loch plattiert und anschließend nach Wachsen erneut getestet.
- Neugewachsene Zellen, die positiv waren, wurden dann intraperitoneal in mit Pristan inituerte Mäuse (CAF) injiziert. Aus diesen Mäusen wurde Ascitesflüssigkeit nach 3- 5 Wochen gesammelt. Der anti-T&sub4;-Antikörper wurde aus der Ascitesflüssigkeit durch Protein-A-Säulenchromatographie unter Verwendung des Affi-Gel-Protein-A-MAPS-II-Kits (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) gereinigt, wobei nach dem dem Kit beigelegten schriftlichen Protokoll vorgegangen wurde. Der anti-T&sub4;-Antikörper wurde an paramagnetischen Teilchen wie von Groman et al., Biotechniques 3:156-160 (1985) beschrieben immobilisiert. Die antikörperderivatisierten Teilchen wurden auf eine Konzentration von 50 µg Teilchen pro 0,1 ml Puffer B (0,03 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 2,9 mg/ml Merthiolat und 0,1% BSA, 0,1% Natriumazid, pH-Wert 7,4) verdünnt.
- Eine Reihe von Standards (0,05 ml) mit bekannten steigenden T&sub4;-Mengen wurde in 12x75 mm Kunststoffröhrchen gegeben. Dann wurden 0,1 ml der in A mit 10x10&sup6; RLU (relative Lichteinheiten) hergestellten T&sub4;-Lumisomen in Puffer A zugegeben. Anschließend wurden 0,5 ml der wie in A hergestellten, mit monoklonalem anti-T&sub4;-Antikörper immobilisierten paramagnetischen Teilchen zugegeben. Die Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann in einem Magnetfeld in einem speziell entworfenen, für magnetische Trennung von paramagnetischen Teilchen in Teströhrchen geeigneten Gestell (erhältlich bei Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA) untergebracht. Das Magnetfeld trennte die Teilchen von dem Überstand, und der Überstand wurde dann dekantiert. Die Teilchen wurden einmal in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, mit einem Vortexer gemischt und magnetisch getrennt. Die Teilchen wurden in 0,1 ml TRITON-X-100, 0,1%ig (w/v) in deionisiertem Wasser, resuspendiert.
- Die Röhrchen wurden dann in einem Luminometer (MAGIC LITE Analysator, Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA) untergebracht. Von dem Luminometer wurden zu jedem Röhrchen 0,3 ml einer Lösung aus 0,1% Wasserstoffperoxid in 0,1 N HNO&sub3; gegeben. Die Lichtemission wurde durch Zugabe von 0,3 ml 0,25 N NaOH, die ARQUAD-Oberflächenmittel (Armark Chemicals, Chicago, Illinois) enthielt, getriggert. Die für jedes Röhrchen gemessene RLU wurde gegen die entsprechende T&sub4;-Konzentration aufgetragen, siehe Figur 1.
- Eine Reihe von Serumstandards, die bekannte steigende Konzentrationen an freiem T&sub4; enthielten, wurden zu 12x75 mm Kunststoffröhrchen gegeben. Es wurden 0,1 ml der in Beispiel 10A hergestellten T&sub4;-Lumisomen mit 10x10&sup6; RLU zugegeben.
- Anschließend wurden 0,5 ml anti-T&sub4;-Antikörper, immobilisiert an paramagnetischen Teilchen, wie in Beispiel 10A hergestellt, in Puffer B ohne Merthiolat zugegeben. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt, und die Röhrchen wurden wie in Beispiel 10 weiter verarbeitet und gemessen. Die Figur 2 zeigt die Standardkurve, erhalten durch Auftragen der für jedes Röhrchen gemessenen RLU gegen die entsprechende Konzentration an freiem T&sub4;
- Monoklonale Antikörper gegen Kreatinkinase MB (CKMB) und Kreatinkinase BB (CKBB) wurden wie von Piran et al., Clinical Chemistry 33:1517-1520 (1987) beschrieben hergestellt.
- Lumisomen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß 1 mg Dithiopyridyldipalmitoylphosphatidylethanolamin (DTP-DPPE), hergestellt nach Barbet et al., J. Supramolecular Structure 16: 243-258 (1981), zu dem Lipidgemisch gegeben wurde. Der trockene Lipidfilm wurde mit DMAE-ANDS, 2 mg/ml, hydratisiert. Das endgültige Lumisomenpräparat wurde in 0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl und 0,005 M EDTA, pH-Wert 7,5 verdünnt.
- Der monoklonale anti-CKMB-Antikörper wurde an die DTP- DPPE-haltigen Lumisomen nach dem Verfahren von Barbet et al., J. Supramolecular Structure 16:243-258 (1981) gekuppelt. Die anti-CKMB-Antikörper-haltigen Lumisomen wurden in Puffer C (0,1 M 1,4-Piperazindiethansulfonsäure, 0,15 M NaCl, 0,001 M EDTA, 0,1% NaN&sub3;, 0,1% BSA, pH-Wert 6,5) verdünnt.
- Der monoklonale anti-CKBB-Antikörper wurde auf paramagnetischen Teilchen wie in Beispiel 10 für den anti-T&sub4;- Antikörper beschrieben immobilisiert und in Puffer C auf eine Endkonzentration von 100 µg Teilchen pro ml Puffer C verdünnt.
- Eine Reihe von Serumstandards (0,1 ml) mit bekannten steigenden Konzentrationen an menschlichem CKMB aus dem Herzen wurde in 12x75 mm Kunststoffröhrchen gegeben. 0,1 ml der in A hergestellten anti-CKMB-Antikörper-haltigen Lurnisomen, die 10x10&sup6; RLU enthielten, wurde in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden zu jedem Röhrchen 50 µg der in A präparierten anti-CKBB-Antikörperhaltigen paramagnetischen Teilchen gegeben, und die Röhrchen wurden weitere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden dann wie in Beispiel 10 verarbeitet und gemessen, mit der Ausnahme, daß Puffer C ohne BSA statt phosphatgepufferter Salzlösung in dem Waschschritt verwendet wurde. Die für jedes Röhrchen gemessene RLU wurde gegen die entsprechende CKMB-Konzentration aufgetragen, siehe Figur 3.
- C. Vier Proben menschlicher Seren wurden unter Verwendung des in B beschriebenen Verfahrens getestet und Konzentrationen von < 1, 21, 24 bzw. 68 ng/ml CKMB wurden bestimmt. Wenn diese vier Proben mit dem CKMB Magic LITE Test (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA 02052) getestet wurden, wurden CKMB-Werte von < 1, 18, 24 bzw. 72 ng/ml bestimmt. Dies zeigt, daß die beiden Tests gut miteinander übereinstimmen.
- Monoklonale anti-TSH-Antikörper wurden aus TSH- immunisierten Mäusen wie in Beispiel 10 für die Herstellung von anti-T&sub4;-Antikörpern beschrieben hergestellt. DTP-DPPE- enthaltende, mit DMAE-ANDS beladene Lumisomen und an paramagnetischen Teilchen immobilisiertes anti-TSH wurden wie in Beispiel 12 beschrieben hergestellt. Diese Reagenzien wurden in Puffer C verdünnt.
- Eine Reihe von Serumstandards (0,1 ml) mit bekannten steigenden TSH-Konzentrationen wurde in 12x75 mm Kunststoffröhrchen gegeben. 0,1 ml der in A hergestellten anti-TSH-Antikörper-haltigen Lumisomen, die 8x10&sup6; RLU enthielten, wurde zugegeben, und die Röhrchen wurden dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde wie in A präparierter an paramagnetischen Teilchen immobilisierter anti-TSH-Antikörper zugegeben (0,5 ml), und die Röhrchen wurden dann weitere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden dann wie in Beispiel 11 beschrieben verarbeitet und gemessen.
- C. Der TSH-Test wurde mit dem gleichen Verfahren wie in B beschrieben durchgeführt, ausgenommen, daß die anti-TSH- Antikörper-haltigen Lumisomen durch den in A hergestellten anti-TSH-Antikörper ersetzt wurden, der direkt mit 2',6'- Dimethyl-4'-(N-succinimidyloxycarbonyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatmethosulfat (DMAE-NHS) markiert wurde.
- D. Die durch die in B und C beschriebenen Verfahren unter Verwendung der beiden Markierungsarten erhaltenen Standardkurven sind in Figur 4 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß das Signal- zu Hintergrund-Verhältnis unter Verwendung von Lumisomen, die das hydrophile Acridiniumesteranalogon als Markierung einschließen, im unteren Bereich des Tests beträchtlich ansteigt. Dieser Anstieg des Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisses ist vorteilhaft, da dadurch die Testempfindlichkeit, Genauigkeit und Geschwindigkeit verbessert wird.
- E. Der in B beschriebene Test wurde unter Verwendung kürzerer Inkubationszeiten (s. Figur 5) durchgeführt. Man fand, daß die Empfindlichkeit des Tests zufriedenstellend war, selbst wenn die erste Inkubationszeit 2,5 Minuten und die zweite Inkubationszeit ebenfalls 2,5 Minuten betrug. Es konnte keine ausreichend empfindliche Standardkurve mit dem direkt mit DMAE-NHS markierten anti-TSH-Antikörper bei kurzen Inkubationszeiten erhalten werden. überraschenderweise war das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis des kurzen Lumisomentests höher als das des herkömmlichen 2, Stunden/0,5 Stunden-Tests (Figur 5).
Claims (11)
1. Liposom, dadurch gekennzeichnet, daß es einen
Acridiniumester darin eingeschlossen enthält.
2. Liposom nach Anspruch 1, wobei der Acridiniumester die
nachfolgende allgemeine Formel aufweist:
wobei R&sub1; Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Aralkyl ist, die
eine oder mehrere Heteroatome enthalten können;
R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub7; sind unabhängig voneinander Wasserstoff,
Amino, Alkoxyl, Hydroxyl, -COOH, Halogenid, Nitro, -CN,
-SO&sub3;H, -NHC(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR oder -SCN,
wobei R Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Aralkyl ist, die
eine oder mehrere Heteroatome enthalten können;
R&sub4; und R&sub8; sind unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl,
Alkenyl, Alkinyl, Aralkyl oder Alkoxyl;
R&sub6; ist -COOH, -R-I oder -Q-R-In, wobei R ein Diradikal
ist, abgeleitet von Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder
Aralkyl, die eine oder mehrere Heteroatome enthalten
können; Q ist -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -SO&sub3;, Diazo,
-NHC(S)NH-, -NHC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)-,
-C(O)NH- oder -NHC(N&spplus;H&sub2;)-; I ist -SO&sub3;H, -OSO&sub3;H, -PO(OH)&sub2;, -OPO(OH)&sub2;
oder -COOH; und n ist ein Ganzzahliges von wenigstens 1;
und
X ist ein Anion.
3. Liposom nach Anspruch 2, wobei R&sub1; und R bis zu 24
Kohlenstoffatome enthalten können und/oder bis zu 20
Heteroatome enthalten können, die aus Stickstoff, Sauerstoff,
Phosphor und Schwefel ausgewählt werden können; R&sub1; ist
C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl; und/oder wobei R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub7; unabhängig
voneinander Wasserstoff, Amino, -COOH, -CN, Hydroxyl,
C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyl, Nitro, Halogenid, -SO&sub3;H oder -SCN sind;
und/oder wobei X ein Halogenid, CH&sub3;SO&sub4;&supmin;, FSO&sub3;&supmin;, CF&sub3;SO&sub3;&supmin;,
C&sub4;F&sub9;SO&sub3; oder OSO&sub2;-Ph-CH&sub3; ist; und/oder wobei Q -O-, -S-,
-NH-, -C(O)-, Diazo, -NHC(S)NH-, -NHC(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NH- oder -NHC(N&spplus;H&sub2;)- ist; und/oder wobei R&sub4; und R&sub8;
unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl,
Alkinyl oder Alkoxyl sein können, die bis zu 8
Kohlenstoffatome enthalten können; und/oder wobei R&sub6; -Q-R-In ist;
und/oder wobei I -SO&sub3;H, -OSO&sub3;H, -PO(OH)&sub2;, -OPO(OH)&sub2; oder
-COOH ist; und/oder wobei n ein Ganzzahliges von bis zu 20
ist; und/oder wobei X ein Anion ist.
4. Liposom nach Anspruch 3, wobei R&sub1; und R bis zu 10
Heteroatome enthalten können; und/oder wobei R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub7;
unabhängig voneinander Wasserstoff, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyl, Nitro,
Amino oder -SO&sub3;H sind; und/oder wobei X ein Halogenid ist;
und/oder R&sub4; und R&sub8; unabhängig voneinander C&sub1;-C&sub4;-Alkyl sind;
und/oder wobei n ein Ganzzahliges von bis zu 10 ist.
5. Liposom nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei X ein
Bromid ist, R&sub1;, R&sub4; und R&sub8; Methyl sind; R&sub2;, R&sub3;, R&sub5; und R&sub7;
Wasserstoff sind; und R&sub6; -Q-R-In ist, wobei Q -C(O)- ist
und R-In aus Aminomethansulfonsäure,
7-Amino-1,3-naphthalendisulfonsäure, S-(3-Sulfopropyl)-cystein,
2-Aminoethylhydrogensulfat, 2-Aminoethylphosphonsäure und
2-Aminoethyldihydrogenphosphat ausgewählt ist.
6. Acridiniumester, dadurch gekennzeichnet, daß er wie in
einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert ist, mit der
Einschränkung, daß der Substituent am C4 der Phenoxygruppe
nicht -COOH ist.
7. Lumineszenzassay-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es
ein Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 5 gekoppelt
mit wenigstens einem biologisch aktiven Molekül umfaßt.
8. Konjugat nach Anspruch 7, wobei das biologisch aktive
Molekül aus Antikörpern, Antigenen, Haptenen und
Nucleinsäure(n) ausgewählt ist.
9. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, dadurch
gekennzeichnet, daß es das Kombinieren einer Probenflüssigkeit,
eines Liposoms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder
eines Konjugats nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 und eines
ersten Rezeptors für den Analyten und das anschließende
Bestimmen der mit dem Analyten assoziierten
Liposomenmarkierungsmenge umfaßt; oder, wenn der Analyt ein
Element eines spezifischen Bindungsliganden/Antiliganden
Paares ist, Nachweisen des Wertes der nachweisbaren
Liposomenmarkierung
im Vergleich zur Bestimmung der
nachweisbaren Markierung einer Probe mit einer bekannten
Analytmenge.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Analyt ein Antigen,
ein Hapten, eine DNA-Probe oder eine RNA-Probe und/oder
der Rezeptor ein Antikörper ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die
Probenflüssigkeit mit einem einen zweiten Rezeptor für den Analyten
umfassenden Festträger vor, gleichzeitig mit oder nach
dern Vereinigen der Probenflüssigkeit mit dem Liposom
kombiniert wird.
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