CN114556100A - 用于治疗休克的疗法指引和/或疗法监测 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题内容是一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法包括下述步骤：*确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；*将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较，其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则所述对象被预测为将发生难治性休克或被诊断为患有难治性休克。另一个主题内容涉及用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂和抗ADM抗体。

Description

用于治疗休克的疗法指引和/或疗法监测
本发明涉及在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法和用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3抑制剂和抗ADM抗体以及治疗所述休克或难治性休克的方法。
背景技术
二肽基肽酶3，也被称为二肽基氨肽酶III、二肽基芳基酰胺酶III、二肽基肽酶III、脑啡肽酶B或红细胞血管紧张肽酶，简称为DPP3、DPPIII，是一种从生理活性肽例如脑啡肽和血管紧张肽移除二肽的金属肽酶。
Ellis&Nuenke 1967在纯化的牛垂体前叶提取物中首次鉴定到DPP3并测量了它的活性。所述被列为EC 3.4.14.4的酶具有约83kDa的分子质量，并且在原核生物和真核生物中高度保守(Prajapati&Chauhan2011)。人类变体的氨基酸序列描述在SEQ ID NO 1中。二肽基肽酶III是一种遍在表达的主要在胞质溶胶中的肽酶。尽管缺少信号序列，但几项研究报告了膜活性(Lee&Snyder 1982)。
DPP3是一种属于肽酶家族M49的锌依赖性外肽酶。它对从3/4至10个氨基酸的各种不同组成的寡肽具有广泛的底物特异性，并且也能在脯氨酸后切割。已知DPP3从其底物包括血管紧张肽II、III和IV、Leu-和Met-脑啡肽、内吗啡肽1和2的N-端水解二肽。金属肽酶DPP3在pH 8.0-9.0下具有最适活性，并且可以通过添加二价金属离子例如Co2+和Mg2+来激活。
DPP3的结构分析揭示出催化基序HELLGH(hDPP3 450-455)和EECRAE(hDPP3 507-512)以及对底物结合和水解来说重要的下述氨基酸：Glu316，Tyr318，Asp366，Asn391，Asn394，His568，Arg572，Arg577，Lys666和Arg669(Prajapati&Chauhan2011；Kumar等， 2016；编号针对人类DPP3的序列，参见SEQ ID NO.1)。考虑到参与底物结合和水解的所有已知氨基酸或序列区域，可以将人类DPP3的活性位点定义为第316与669位氨基酸之间的区域。
DPP3的最主要的底物是血管紧张肽II(Ang II)，即肾素–血管紧张肽系统(RAS)的主要效应物。RAS在心血管疾病(Dostal等，1997.J Mol Cell Cardiol；29:2893–902；Roks 等，1997.Heart Vessels.Suppl12:119–24)、脓毒症和脓毒性休克(Corrêa等，2015.Crit Care2015；19:98)中被激活。具体来说，已显示Ang II调节许多心血管功能，包括血压的控制和心脏重塑。
DPP3在细胞生理学中的确切生物学功能尚不清楚，但最近的发现表明它不仅在蛋白质代谢中、而且在疼痛调节和炎性过程中发挥作用(Prajapati&Chauhan2011)。此外，DPP3在输注AngII的高血压小鼠中降低血压但不改变心率(Pang等，2016)。然而，当注射DPP3时，正常血压小鼠的血压没有变化。
在输注Ang II的小鼠中，由DPP3和血管紧张肽受体拮抗剂一起给药引起的血压降低与单独的DPP3注射或单独的血管紧张肽受体拮抗剂引起的血压降低相近(Pang等， 2016.Hypertension68:630–41)。
血管紧张肽II(AngII)是由身体天然产生的一种肽类激素，其通过血管收缩和钠重吸收来调控血压。Ang II给药的血液动力学效应已成为大量临床研究的主题，证实了对全身和肾血流量具有显著影响(Harrison-Bernard 2009.Adv.Physiol Edu.33(4): 270)。
目前正在讨论AngII治疗对血管舒张性休克和脓毒性休克的有益效果(Khanna,A. 等，2017；Antonucci,E.等，2017；Tumlin,J.A.等，2018)。用血管紧张肽II治疗的血管舒张性休克(占脓毒性休克中的80％)患者更可能存活到28天，并显示出低血压的显著校正(Khanna,A.等，2017；Tumlin,J.A.等，2018)。
据推测，血管紧张肽转化酶(ACE)在休克患者中高度失调，导致血管紧张肽I/II的比率改变，并且血管紧张肽II输注可以弥补这种失调(Tumlin,J.A.等，2018)。
最近，产生、表征和验证了特异性检测人类体液(例如血液、血浆、血清)中的DPP3的两种测定法：检测DPP3蛋白浓度的发光免疫测定法(LIA)和特异性检测DPP3活性的酶捕获活性测定法(ECA)(Rehfeld等，2019JALM3(6):943-953)。在两种方法中，在进行DPP3蛋白或活性的真正检测之前，清洗步骤除去所有干扰物质。两种方法都是高度特异的，并允许可重复地检测血液样品中的DPP3。
本发明的目的是提供一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法。
本发明的另一个目的是提供用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3抑制剂和抗ADM抗体。
本发明的主题内容是一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较，
其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则所述对象被预测为将发生难治性休克或被诊断为患有难治性休克。
本发明的主题内容是一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平，和
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较，和
·确定所述对象的体液样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平，和
·将所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平与预定阈值进行比较，
其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平和/或所述DPP3水平高于所述预定阈值，则所述对象被预测为将发生难治性休克或被诊断为患有难治性休克。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的特定实施方式中，所述休克选自由低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个特定实施方式中，所述休克选自由低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性或脓毒性休克。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的特定实施方式中，所述休克选自：
·在心源性休克的情况下，所述对象已患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者
·在低血容量休克的情况下，所述对象可能已患有出血性疾病包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂背景中的自发性出血，或非出血性疾病包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/不显性失水(例如烧伤、中暑)或胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤背景中的第三间隙体液丧失，或者
·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者
·在分布性休克的情况下，所述患者患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个实施方式中，所述方法用于治疗的启动和/或终止和/或分层和/或指引。
当在本文中使用时，术语“疗法指引”或“治疗的指引”是指在一种或多种生物标志物和/或临床参数和/或临床评分的值的基础上应用某些疗法或医学干预。
在本发明的情形中，术语“疗法监测”是指监测和/或调整所述患者的治疗，例如通过获得对疗法功效的反馈。
术语“疗法分层”具体来说是指将患者分组或分类成不同的组，例如根据分类接受或不接受治疗性措施的疗法组。
术语“预测”是指将结果的可能性与在分析物测量中获得的结果相关联。其实例是样品中的某种标志物例如DPP3的测量，将其实测水平与将发生休克或已发生休克的对象发生难治性休克的可能性相关联。
本发明还包括一种在将发生休克或已发生休克的对象中短期预测难治性休克的方法，其中短期是指等于或小于14天，优选地等于或小于7天，更优选地等于或小于3天，最优选地等于或小于48小时的时间段。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个实施方式中，如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，在所述治疗被启动和/或维持和/或暂停和/或终止。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个实施方式中，如果所述确定的DPP3和/或肾上腺髓质素原和/或其片段的水平高于所述预定阈值，则所述治疗被启动和/或维持和/或暂停和/或终止。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的优选实施方式中，所述治疗选自血管加压药、血管紧张肽受体激动剂或其前体和/或DPP3活性抑制剂。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个优选实施方式中，所述治疗选自血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂和抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个实施方式中，确定DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平并与预定阈值进行比较。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个实施方式中，所述DPP3水平通过将所述体液样品与特异性结合DPP3的捕获结合剂相接触来确定。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个优选实施方式中，用于确定所述DPP3水平的所述捕获结合剂可以选自抗体、抗体片段或非IgG支架。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的特定实施方式中，所述捕获结合剂是抗体。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个特定实施方式中，所述捕获结合剂是单克隆抗体。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的另一个实施方式中，所述体液样品选自全血、血浆和血清。
在所述在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法的特定实施方式中，所述诊断或预测的方法进行至少两次。
休克的特征在于氧气输送减少和/或氧气消耗增加或氧气利用不足，导致细胞和组织缺氧。它是一种危及生命的循环衰竭病症，最常见的表现为低血压(收缩压低于90mmHg或MAP低于65mmHg)。休克根据基本病因分为四种主要类型：低血容量休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克(Vincent和DeBacker2014.N.Engl.J.Med.370(6):583)。
低血容量休克的特征在于血管内体积减少，并且可以分为出血性和非出血性两大亚型。出血性低血容量休克的常见原因包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂背景中的自发性出血。非出血性低血容量休克的常见原因包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/不显性失水(例如烧伤、中暑)或在胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤等背景中的第三间隙体液丧失。综述参见Koya和Paul 2018.Shock.StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing； 2019-2018 10月27日。
心源性休克(CS)被定义为由于心输出量减少而导致的关键终末器官灌注不足的状态。值得注意的是，CS形成了范围从轻度灌注不足到深度休克的疾病谱。诊断CS的既定标准是：(i)收缩压≤90mmHg持续>30分钟，或需要血管加压药才能实现血压≥90mmHg；(ii)肺充血或左心室充盈压升高；(iii)具有至少一个下述判据的器官灌注受损迹象：(a)精神状态改变；(b)皮肤湿冷；(c)少尿(<0.5mL/kg/h或<30mL/h)；(d)血清乳酸升高(Reynolds和 Hochman2008.Circulation 117:686–697)。急性心肌梗塞(AMI)继发心室功能障碍是CS的最常见病因，约占病例的80％。机械性并发症例如室间隔(4％)或游离壁破裂(2％)以及急性重度二尖瓣反流(7％)是AMI后CS的较少见病因(Hochman等，2000.J Am Coll Cardiol 36:1063–1070)。非AMI相关CS可能由失代偿性瓣膜心脏病、急性心肌炎、心律失常等引起，具有不同的治疗选项。这意味着美国每年有40 000至50 000名患者，而欧洲则为60 000至70 000名患者。尽管主要通过早期血管重建和后续死亡率降低取得了治疗进展，但根据最近的登记和随机试验，CS仍然是AMI死亡的主要原因，死亡率仍接近40-50％(Goldberg等，2009.Circulation 119:1211–1219)。
阻塞性休克由大血管或心脏本身的物理阻塞造成。有几种病症会导致这种形式的休克(例如心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞、主动脉瓣狭窄)。综述参见Koya和 Paul2018.Shock.StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing；2019-201810月27日。
根据病因，存在四种类型的分布性休克：神经源性休克(交感神经刺激减弱导致血管张力降低)、过敏性休克、脓毒性休克和由肾上腺危象造成的休克。除了脓毒症之外，分布性休克也可以由感染以外的其他病症例如胰腺炎、烧伤或外伤造成的全身炎症反应综合征(SIRS)引起。其他病因包括中毒性休克综合征(TSS)、过敏反应(突然、严重的过敏反应)、肾上腺功能不全(慢性肾上腺功能不全的急性恶化、肾上腺的破坏或切除、由外源类固醇造成的肾上腺功能的抑制、垂体功能减退和激素生产的代谢性障碍)、对药物或毒素的反应、重金属中毒、肝(肝脏)功能不全和中枢神经系统损伤。综述参见Koya和 Paul2018.Shock.StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing；2019-201810月27日。
一般来说，难治性休克被定义为尽管具有足够的容量复苏，但仍需要>0.5μg/kg/min的去甲肾上腺素输注。这些患者的死亡率可能高达94％，并且为了存活，这些患者的评估和管理需要更加激进的方法。术语“难治性休克”在组织灌注不能通过最初使用的校正措施(例如血管加压药)来恢复的情况下使用，并且因此可以被称为“高血管加压药依赖性”或“血管加压药耐药性”休克(Udupa和Shetty2018.Indian J Respir Care7:67-72)。难治性休克患者可能具有诸如低血压(平均动脉压<65mmHg)、心动过速、外周冰冷、毛细血管再充盈时间延长和由缺氧和酸中毒引起的呼吸急促等灌注不足的特点。发热在脓毒性休克中可见。还可以看到其他灌注不足的迹象，例如感觉改变、高乳酸血症和少尿。这些众所周知的休克迹象无助于鉴定问题是在于泵(心脏)还是线路(血管和组织)。不同类型的休克可以共存，并且所有形式的休克都可能变得难治，正如通过对高剂量血管加压药无反应所证实的(Udupa和Shetty2018.Indian J Respir Care 7:67-72)。
在本发明的特定实施方式中，所述难治性休克是血管加压药耐药性的，其被定义为患者对高剂量血管加压药(例如>0.5μg/kg/min去甲肾上腺素)无反应。
对象将发生血管加压药耐药性难治性休克或被诊断为患有血管加压药耐药性难治性休克的诊断和预测的结果可能是给予治疗，例如给药血管紧张肽II抑制剂和/或DPP3抑制剂。此外，另一个结果可能是暂停血管加压药。
在所述用于在可能发生休克的对象中预测难治性休克、特别是血管加压药耐药性休克的方法的优选实施方式中，预测了所述对象是否在从获取样品的时间点起14天内、或特别是10天内、或特别是7天内、或特别是5天内、或特别是48小时内、或特别是24小时内或特别是24至48小时之间将发生难治性休克、特别是血管加压药耐药性休克。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，并确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
本发明的另一个实施方式涉及根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中
·所述对象可能已患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或其中所述对象患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞(在心源性休克的情况下)，或
·所述对象可能已患有出血性疾病包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂背景中的自发性出血，或非出血性疾病包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/不显性失水(例如烧伤、中暑)或胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤背景中的第三间隙体液丧失(在低血容量休克的情况下)，或
·所述患者可能已患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄(在阻塞性休克的情况下)，或
·所述患者可能患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克(在分布性休克的情况下)。
本发明的另一个实施方式涉及根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法用于治疗的启动和/或终止和/或分层和/或指引。
本发明的另一个实施方式涉及根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则治疗被启动和/或维持和/或暂停和/或终止。
本发明的主题内容是在将发生休克或已发生休克的对象中预防或治疗难治性休克的方法中使用的血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂和/或抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段，其中所述难治性休克的所述预测和/或诊断已通过根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法来确定。在上述方法的一个实施方式中，确定DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平并将其与预定阈值进行比较，其中所述DPP3水平通过将所述体液样品与特异性结合DPP3的捕获结合剂相接触来确定。
本发明的主题内容是在将发生休克或已发生休克的对象中预防或治疗难治性休克的方法中使用的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂，其中所述难治性休克的所述预测和/或诊断已通过根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法来确定，其中当所述样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
本发明的主题内容是在将发生休克或已发生休克的对象中预防或治疗难治性休克的方法中使用的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂，其中所述难治性休克的所述预测和/或诊断已通过根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法来确定，其中当所述样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
本发明的主题内容是在将发生休克或已发生休克的对象中预防或治疗难治性休克的方法中使用的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中所述难治性休克的所述预测和/或诊断已通过根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法来确定，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
本发明的主题内容是在将发生休克或已发生休克的对象中预防或治疗难治性休克的方法中使用的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段和/或DPP3活性抑制剂，其中所述难治性休克的所述预测和/或诊断已通过根据本发明所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法来确定，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
在本发明的特定实施方式中，对于血浆DPP3来说，所述阈值在20至200ng/ml之间、优选地25至150ng/ml之间、甚至更优选地30至100ng/ml之间、甚至更优选地35至75ng/ml之间的阈值范围内，最优选地使用50ng/mL的阈值。
具体来说，所述患者的难治性休克是血管加压药耐药性休克。
肾上腺髓质素(ADM)这种肽被描述为是一种从人类嗜铬细胞瘤分离的包含52个氨基酸的新型降压肽(Kitamura等，1993.Biochemical and Biophysical Research Communications 192(2):553-560)。从前肾上腺髓质素原(pre-proADM)切下21个氨基酸的N-端信号序列产生前体肽肾上腺髓质素原(proADM)(SEQ ID No.：31)。Pro-ADM被进一步切割成PAMP(SEQ ID No.32)、MR-proADM(SEQ ID No.33)、ADM-Gly(SEQ ID No.：35)和CT-proADM(SEQ ID No.36)。成熟的肾上腺髓质素肽是一种酰胺化肽(ADM-NH2)，其包含52个氨基酸(SEQ ID No：34)，并包含通过蛋白水解切割形成它的pre-proADM的第95至146位氨基酸。成熟ADM、bio-ADM和ADM-NH2在整个本申请中同义使用，并且是根据SEQ ID No.：34所述的分子。
在本发明的主题内容的一个实施方式中，所述肾上腺髓质素原的片段选自PAMP(SEQ ID No.32)、MR-proADM(SEQ ID No.33)、酰胺化ADM(SEQ ID No.34)、ADM-Gly(SEQ IDNo.：35)和CT-proADM(SEQ ID No.36)。
ADM可以被认为是一种多功能调节肽。它部分以被甘氨酸延长的无活性形式释放到循环中(Kitamura等，1998.Biochem.Biophys.Res.Commun.244(2):551-555)。还存在特异性针对ADM并可能同样调节ADM效应的结合蛋白(Pio等，2001.The Journal of Biological Chemistry 276(15):12292-12300)。
在迄今为止的研究中最为重要的ADM和PAMP的生理效应是影响血压的效应。因此，ADM是一种有效的血管扩张剂。已发现，可以在循环和其他生物体液中测量到的ADM浓度，在多种病理状态下明显高于在健康对照者中发现的浓度。因此，在充血性心力衰竭、心肌梗塞、肾病、高血压障碍、糖尿病、急性休克期以及脓毒症和脓毒性休克患者中ADM水平显著升高，尽管程度不同。在某些所述病理状态下PAMP浓度也提高，但血浆水平相对于ADM降低(Eto等，2001.Peptides22:1693-1711)。
此外，已知在脓毒症或脓毒性休克中观察到异常高的ADM浓度(Eto等， 2001.Peptides 22:1693-1711；Hirata等，1996.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism81(4):1449-1453；Ehlenz等，1997.Exp Clin Endocrinol Diabetes105:156-162；Tomoda等，2001.Peptides22:1783-1794；Ueda等，1999Am.J.Respir.Crit.Care Med.160:132-136；Wang等，2001.Peptides 22:1835-1840)。所述发现与已知是脓毒症和其他严重综合征例如SIRS患者中疾病过程的典型现象的典型血液动力学变化相关。肾上腺髓质素在脓毒症发生期间(Wang,Shock1998,10(5):383-384；Wang等，1998.Archivesof surgery 133(12):1298-1304)和大量急性和慢性疾病中(Parlapiano等，1999.European Review for Medical and Pharmacological Sciences3:53-61；Hinson等，2000Endocrine Reviews21(2):138-167)发挥关键作用。
MR-proADM已被确定为一种能够在具有不同器官衰竭程度的脓毒症患者中对死亡风险进行分层的预后标志物。它可能有助于脓毒症的早期鉴定和个体风险评估，也可能有助于脓毒症和脓毒性休克的后续临床管理(综述参见
Figure BDA0003520634770000151
等，2018.Healthcare 6:110)。
描述了几种测量ADM循环水平的方法：直接地或通过确定其同源前体肽的更稳定片段间接地测量ADM。最近发表了一种方法，描述了一种测量循环成熟ADM的测定法(Weber 等，2017.JALM 2:222-233)。
已描述了对源自于ADM前体的片段进行定量的其他方法，例如MR-proADM(Morgenthaler等，2005.Clin Chem 51(10):1823-9)、PAMP(Washimine等，1994.Biochem Biophys Res Commun202(2):1081-7)和CT-proADM(EP 2 111 552)的测量。一种用于在全自动系统上测量血浆中的MR-proADM的商业化均相时间分辨荧光免疫测定法是可用的(BRAHMS MR-proADM KRYPTOR；BRAHMS GmbH,Hennigsdorf,Germany)(Caruhel等， 2009.Clin Biochem 42(7-8):725-8)。由于这些肽从同一前体以化学计量比产生，因此它们的血浆水平在一定程度上是相关的。
抗ADM抗体的产生在本领域中是已知的(例如通过参考并入本文的WO2013072512和WO2019057992)。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中所述抗体或片段或支架结合到成熟ADM的N-端部分(aa 1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.37)。
在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段识别并结合到ADM的N-端末端(aa1)。N-端末端是指SEQ ID No.34和35的第1位氨基酸即“Y”对于抗体结合来说是强制性的。所述抗体或片段或非Ig支架既不结合N-端延长或N-端修饰的ADM也不结合N-端降解的ADM。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中所述抗体或片段是结合到成熟ADM的N-端区域(aa 1-21)(SEQ ID No.37)的人类单克隆抗体或其抗体片段，其中重链包含下述序列：
GYTFSRYW(CDR1：SEQ ID NO：38)、ILPGSGST(CDR2：SEQ ID NO：39)、TEGYEYDGFDY(CDR3：SEQ ID NO：40)，并且
其中轻链包含下述序列：
QSIVYSNGNTY(CDR1：SEQ ID NO：41)、RVS(CDR2)、FQGSHIPYT(CDR3：SEQ ID NO：42)。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体，其包含下述序列作为重链：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：43)
并且其中所述单克隆抗体包含下述序列作为轻链：
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID No.44)。
内皮功能障碍可由几种疾病过程引起和/或造成几种疾病过程，正如在休克、尤其是脓毒性休克中所发生的。从在脓毒症/脓毒性休克模型中的临床前实验可知，抗ADM抗体的给药诱导血浆bio-ADM浓度的提高，并且这与存活率提高相吻合(Struck等， 2013.Intensive Care Med Exp 1(1):22)。这种效应背后的机制已被描述在Geven等，2018中(Geven等，2018.SHOCK50(2):132–140)。简单来说，所述抗体在i.v.给药时，由于其尺寸而不能穿过内皮屏障进入间质，而是保留在血液循环中。相比之下，ADM作为一种小肽可以跨过内皮屏障自由扩散。因此，所述抗体当以超过内源性ADM的巨大摩尔过量给药时，作为达到结合平衡的简单结果几乎结合血浆中的所有ADM，导致ADM从间质易位到血液循环。位于间质的ADM可以与血管平滑肌细胞结合并诱导松弛，从而导致血管舒张。这通过所述抗体的给药来减少。另一方面，血浆中的ADM与内皮细胞结合，从而稳定或甚至恢复血管完整性。因此，当血浆ADM水平作为给药作为非中和性抗体的所述抗体的结果而提高时，这种功能被加强。最后，所述抗体与ADM的结合减少了ADM的蛋白水解衰减。合在一起，抗ADM抗体Adrecizumab可以在休克例如脓毒性休克中恢复内皮功能。
如果所述肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值水平，则给药所述与ADM结合的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段作为疗法。
这是指在本发明的主题内容的特定实施方式中将所述与ADM结合的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段用于疗法，其中从所述患者获取的体液样品表现出高于一定阈值的高水平的proADM和/或其具有至少5个氨基酸的片段。因此，使用所述proADM和/或片段的诊断方法可充当伴随诊断方法。
在本发明的特定实施方式中，对于血浆ADM-NH2来说，所述阈值在50至250pg/ml之间、优选地55至200pg/ml之间、甚至更优选地60至150pg/ml之间、甚至更优选地65至100pg/ml之间的阈值范围内，更优选地使用70pg/ml的阈值。
在本发明的特定实施方式中，对于血浆MR-proADM来说，所述阈值在0.5至3nmol/L之间、优选地0.6至2nmol/L之间、甚至更优选地0.7至1ng/mL之间的阈值范围内，更优选地使用0.8nmol/L的阈值。
在本发明的特定实施方式中，对于血浆CT-proADM来说，所述阈值在85至500pmol/L之间、优选地90至350pmol/L之间、甚至更优选地95至250pmol/L之间、甚至更优选地100至200pmol/L之间的阈值范围内，更优选地使用150pmol/L的阈值。
本发明的ADM-NH2水平或proADM或其片段的水平已分别使用如实施例中所概述的ADM-NH2测定法(或分别的proADM或其片段测定法)(Weber等，2017.JALM2(2):1-4)来确定。本发明的DPP3水平使用如实施例中所概述的DPP3测定法来测定。上面提到的阈值在其他测定法中可能不同，如果这些测定法的校准与本发明中使用的测定系统不同的话。因此，上述截止值应该将校准的差异考虑在内，相应地适用于此类不同校准的测定法。量化校准差异的一种可能性是通过使用两种方法测量样品中的相应生物标志物(例如bio-ADM、DPP3)，对所讨论的测定法与本发明中使用的相应生物标志物测定法进行方法比较分析(相关性)。另一种可能性是鉴于所讨论的测定法具有足够的分析灵敏度，用所述测定法确定代表性正常人群的中位数生物标志物水平，将结果与文献中描述的中位数生物标志物水平进行比较，并在通过该比较得到差异的基础上重新计算校准。使用在本发明中使用的校准测量了来自于正常(健康)对象的样品：中位数血浆bio-ADM(成熟ADM-NH2)为24.7pg/ml，最低值为11pg/ml，第99百分位数为43pg/ml(Marino等，2014.Critical Care18:R34)。使用在本发明中使用的校准测量了来自于5,400位正常(健康)对象(瑞典单中心前瞻性群体研究(swedish single-center prospective population-based Study)(MPP-RES))的样品：中位数(四分位距)血浆DPP3为14.5ng/ml(11.3ng/ml–19ng/ml)。
使用在Caruhel等(Caruhel等，2009.Clin Biochem 42:725-8)中描述的检测MR-proADM的自动化夹心荧光测定法，正常(健康)对象中的血浆中位数MR-proADM浓度为0.41(四分位距0.23-0.64)nmol/L(Smith等，2009.Clin Chem 55:1593-1595)。
正常健康对象(n＝200)中CT-proADM的血浆中位数浓度为77.6pmol/L(最小值46.6pmol/L，最大值136.2pmol/L)，95％百分位数为113.8pmol/L(EP 2 111 552 B1)。
在本发明的特定实施方式中，血浆ADM-NH2的阈值为正常健康人群的5倍中位数浓度，优选地4倍中位数浓度，更优选地3倍中位数浓度，最优选地2倍中位数浓度。
在本发明的特定实施方式中，血浆MR-proADM的阈值为正常健康人群的5倍中位数浓度，优选地4倍中位数浓度，更优选地3倍中位数浓度，最优选地2倍中位数浓度。
在本发明的特定实施方式中，血浆CT-proADM的阈值为正常健康人群的5倍中位数浓度，优选地4倍中位数浓度，更优选地3倍中位数浓度，最优选地2倍中位数浓度。
在本发明的实施方式中，所述用于治疗需要的患者的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段可以以至少0.5mg/Kg体重，特别是至少1.0mg/kg体重，更特别地1.0至20.0mg/kg体重，例如2.0至10mg/kg体重、2.0至8.0mg/kg体重或2.0至5.0mg/kg体重的剂量给药。
本发明的一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中当通过根据本发明所述的预测或诊断难治性休克的方法中的任一者确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中所述血管加压药选自多巴胺、去甲肾上腺素、去甲肾上腺素等效物、肾上腺素、苯肾上腺素和血管加压素。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中所述血管加压药在药物制剂中给药到所述对象。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中所述对象具有等于或低于65mm Hg的血压。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中当通过上述实施方式中描述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述DPP3活性抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
本发明的一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂对DPP3具有等于或低于10-7M的最低结合亲和性。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述DPP3活性抑制剂是抗体。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体，其中重链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：7、SEQ ID NO.：8和/或SEQ ID NO.：9，并且轻链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：10、KVS和/或SEQ ID NO.：11。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是人源化单克隆抗体或人源化单克隆抗体片段，其中所述重链包含序列SEQ ID NO.：12，并且其中所述轻链包含序列SEQ ID NO.：13。
所述DPP3活性抑制剂可以通过吸入给药。
本发明的一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体选自血管紧张肽I、血管紧张肽II、血管紧张肽III、血管紧张肽IV，特别是血管紧张肽II。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，并且其中确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
本发明的另一个实施方式涉及用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，并且其中确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
本发明的另一个特定实施方式涉及用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
在所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平被确定并且所述样品中的DPP3水平被确定的情况下，所述确定可以通过提供下述两者的床旁检测设备来进行：用于确定肾上腺髓质素原或其片段的水平的测试，和用于确定所述样品中的DPP3水平的测试。
当患者体液样品中的DPP3蛋白的量和/或DPP3活性高于预定阈值水平时，指示开始使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体的治疗。
本发明的一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当通过前述实施方式中描述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中所述血管加压药选自多巴胺、去甲肾上腺素、去甲肾上腺素等效物、肾上腺素、苯肾上腺素和血管加压素。
本发明的特定实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中所述血管加压药在药物制剂中给药到所述对象。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中所述对象具有等于或低于65mmHg的血压。
本发明的一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中当通过前述实施方式中描述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中DPP3活性抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂对DPP3具有等于或低于10-7M的最低结合亲和性。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中DPP3活性抑制剂是抗体。
本发明的一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体。
本发明的一个特定实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体，其中所述重链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：7、SEQ ID NO.：8和/或SEQID NO.：9，并且所述轻链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：10、KVS和/或SEQ IDNO.：11。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是人源化单克隆抗体或人源化单克隆抗体片段，其中重链包含序列SEQ ID NO.：12，并且其中轻链包含序列SEQ ID NO.：13。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体选自血管紧张肽I、血管紧张肽II、血管紧张肽III、血管紧张肽IV，特别是血管紧张肽II。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
本发明的一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
本发明的一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗，并且其中确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
本发明的一个特定实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，并且其中确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
本发明的另一个实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，并且其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
本发明的另一个特定实施方式涉及一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
激动剂是指与受体结合并激活所述受体以产生生物学响应的化学物质。受体可以被内源激动剂(例如激素和神经递质)或外源激动剂(例如药物)激活，引起生物学响应。完全激动剂与受体结合并以激动剂可以在所述受体处引发的最大响应激活受体。部分激动剂是结合并激活给定受体，但相对于完全激动剂而言在所述受体处仅具有部分功效的药物。效价是引发所需响应所需的激动剂的量。激动剂的效价与其EC50值反相关。对于给定激动剂来说，可以通过确定引发所述激动剂的半最大生物学响应所需的激动剂浓度来测量EC50。所述EC50值可用于比较具有相似功效、产生相似生理效应的药物的效价。EC50值越小，激动剂的效价越高，引发最大生物学响应所需的药物浓度越低。
只要所述患者的体液样品中DPP3蛋白的量和/或DPP3活性高于预定阈值水平，所述使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体的治疗就可以继续进行。
所述DPP3蛋白的量和/或DPP3活性可以至少每24小时、优选地每12小时、更优选地每8小时、甚至更优选地每6小时、甚至更优选地每4小时、甚至更优选地每2小时、甚至更优选地每小时、最优选地每30分钟测量。
当所述患者的体液样品中DPP3蛋白的量和/或DPP3活性低于预定阈值水平时，所述使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体的治疗可以被中止。
血管紧张肽治疗剂：
血管紧张肽I，也被称为前血管紧张肽，通过肾素对血管紧张肽原的作用而形成。肾素切开血管紧张肽原上亮氨酸(Leu)与缬氨酸(Val)残基之间的肽键，产生十肽(10个氨基酸)(des-Asp)血管紧张肽I。通过血管紧张肽转化酶(ACE)、主要通过肺内的ACE(但也存在于内皮细胞、肾上皮细胞和脑中)移除两个C-端残基，将血管紧张肽I转变成血管紧张肽II。
血管紧张肽II、血管紧张肽III和血管紧张肽IV是由身体天然产生的肽类激素，其通过血管收缩和钠重吸收来调控血压。血管紧张肽II给药的血液动力学效应已成为大量临床研究的主题，证实了对全身和肾血流量具有显著影响(Harrison-Bernard,L.M.,肾的肾 素-血管紧张肽系统(The renalrenin-angiotensin system)，Adv Physiol Educ, 33(4): 270(2009))。
血管紧张肽II是由肾素-血管紧张肽-醛固酮系统(RAAS)产生的一种激素，通过调控血管平滑肌张力和细胞外液稳态来调节血压。血管紧张肽II通过诱导血管收缩和钠潴留来介导其对血管系统的作用，因此是许多高血压疗法的靶点。除了全身性作用外，血管紧张肽II对肾脏的出球小动脉具有显著作用，在血流量减少时维持肾小球滤过。血管紧张肽II还通过刺激近端小管中的Na+/H+交换器并诱导醛固酮和血管加压素的释放来调控肾脏中的钠重吸收(Harrison-Bernard 2009.肾的肾素-血管紧张肽系统(The renal renin- angiotensin system)，Adv Physiol Educ, 33(4):270)。
可以在本公开的组合物和方法中使用的血管紧张肽II治疗剂可以是Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(SEQ ID NO：13)，也被称为5-异亮氨酸血管紧张肽II。SEQ IDNO：13是在人类和其他物种例如马类、猪类等中天然存在的八肽。异亮氨酸可以被缬氨酸替换，以产生5-缬氨酸血管紧张肽II，即Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe(SEQ ID NO：14)。也可以使用其他血管紧张肽II类似物例如[Asn1-Phe4]-血管紧张肽II(SEQ ID NO：15)、六肽Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(SEQ ID NO：16)、九肽Asn-Arg-Val-Tyr-Tyr-Val-His-Pro-Phe(SEQ ID NO：17)、[Asn1 Ile5 Ile8]-血管紧张肽II(SEQ ID NO：18)、[Asn1-lle5-Ala8]-血管紧张肽II(SEQ ID NO：19)和[Asn1-二碘代Tyr4-Ile5-血管紧张肽II(SEQID NO：20)。血管紧张肽II可以例如通过固相肽合成来合成，以并入修饰例如C-端酰胺化。在没有进一步具体说明的情况下，术语“血管紧张肽II”旨在指这些各种不同形式中的任一者及其组合。
在某些情况下，包含血管紧张肽II的组合物可以选自5-缬氨酸血管紧张肽II、5-缬氨酸血管紧张肽II酰胺、5-L-异亮氨酸血管紧张肽II和5-L-异亮氨酸血管紧张肽II酰胺或其可药用盐，优选地在目前良好的生产条件(cGMP)下制造。在某些情况下，所述组合物可以以不同的百分率包含不同形式的血管紧张肽II，例如六肽和九肽血管紧张肽II的混合物。所述包含血管紧张肽II的组合物可能适合于肠胃外给药，例如注射或静脉内输注。
在本文公开的组合物和方法中使用的血管紧张肽II的序列可以与上文描述的血管紧张肽II的序列同源。在某些情况下，本发明包括分离的、合成的或重组的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19和/或20具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。可以使用任何此类变体序列代替在前文中描述的血管紧张肽II。
所有序列的序列同一性按照下述方法确定：同一性百分数通过将所述一对序列中的匹配数乘以100并除以包括间隙在内的比对区的长度来计算(同一性百分数＝[匹配数x100]/比对区的长度[含间隙])。
血管紧张肽III是血管紧张肽II的代谢物，具有血管紧张肽II的约40％的活性。可用于本公开的组合物和方法的血管紧张肽III治疗剂可以是Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(SEQ ID NO：21)。SEQ ID NO：21是在人类和其他物种例如马类、猪类等中天然存在的七肽。可以将异亮氨酸用缬氨酸替换，以产生Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe(SEQ ID NO：22)。也可以使用其他血管紧张肽III类似物例如[Phe3]-血管紧张肽III(SEQ ID NO：23)、[Ile4-Ala7]-血管紧张肽III(SEQ ID NO：24)和[二碘代Tyr3-Ile4]-血管紧张肽III(SEQID NO：25)。血管紧张肽III可以例如通过固相肽合成来合成，以并入修饰例如C-端酰胺化。在没有进一步具体说明的情况下，术语“血管紧张肽III”旨在指这些各种不同形式中的任一者及其组合。
在某些情况下，包含血管紧张肽III的组合物可以选自4-缬氨酸血管紧张肽III、4-缬氨酸血管紧张肽III酰胺、4-L-异亮氨酸血管紧张肽III和4-L-异亮氨酸血管紧张肽III酰胺或其可药用盐，优选地在目前良好的生产条件(cGMP)下制造。包含血管紧张肽III的组合物可能适合于肠胃外给药，例如注射或静脉内输注。
在本文公开的组合物和方法中使用的血管紧张肽III的序列可以与上文描述的血管紧张肽III的序列同源。在某些情况下，本发明包括分离的、合成的或重组的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：21、22、23、24和/或25具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。可以使用任何此类变体序列代替在前文中描述的血管紧张肽III。
血管紧张肽IV是血管紧张肽III的代谢物，具有比血管紧张肽II更低的活性。可用于本公开的组合物和方法的血管紧张肽IV治疗剂可以是Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(SEQID NO：26)。SEQ ID NO：26是在人类和其他物种中天然存在的六肽。可以将异亮氨酸用缬氨酸替换，以产生Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe(SEQ ID NO：27)。也可以使用其他血管紧张肽IV类似物例如[Phe2]-血管紧张肽III(SEQ ID NO：28)、[Ile3-AIa6]-血管紧张肽IV(SEQ IDNO：29)和[二碘代Tyr2-Ile3]-血管紧张肽IV(SEQ ID NO：30)。血管紧张肽IV可以例如通过固相肽合成来合成，以并入修饰例如C-端酰胺化。在没有进一步具体说明的情况下，术语“血管紧张肽IV”旨在指这些各种不同形式中的任一者及其组合。
在某些情况下，包含血管紧张肽IV的组合物可以选自3-缬氨酸血管紧张肽IV、3-缬氨酸血管紧张肽IV酰胺、3-L-异亮氨酸血管紧张肽IV和3-L-异亮氨酸血管紧张肽IV酰胺或其可药用盐，优选地在目前良好的生产条件(cGMP)下制造。包含血管紧张肽IV的组合物可能适合于肠胃外给药，例如注射或静脉内输注。
在本文公开的组合物和方法中使用的血管紧张肽IV的序列可以与上文描述的血管紧张肽IV的序列同源。在某些情况下，本发明包括分离的、合成的或重组的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：25、26、27、28、29和/或30具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。可以使用任何此类变体序列代替在前文中描述的血管紧张肽IV。
血管紧张肽II、血管紧张肽III或血管紧张肽IV治疗剂可以作为上面提到的肽的任何适合的盐(例如乙酸盐)、去保护的形式、乙酰化形式、脱乙酰化形式和/或前体药物形式，包括所述肽的聚乙二醇化形式或美国专利出版物2011/0081371(通过参考并入)中所公开的偶联物使用。术语“前体药物”是指能够在生理条件下产生或释放出上面提到的肽的任何前体化合物。此类前体药物或前体可以是更大的肽，其被选择性切开以便形成本发明的肽。例如，在某些情况下，所述前体药物或前体可以是血管紧张肽原、血管紧张肽I或其同源物，它们可以通过某些内源或外源酶的作用产生血管紧张肽II。其他前体药物或前体包括具有被保护的氨基酸，例如在一个或多个羧酸和/或氨基基团处具有保护基团的肽。适合用于氨基的保护基团包括苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基(BOC)、芴甲氧基羰基(FMOC)、甲酰基和乙酰基或酰基。适合于羧酸基团的保护基团包括酯类例如苯甲酯或叔丁酯。本发明还设想了使用具有氨基酸替换、缺失、添加的血管紧张肽II、血管紧张肽III、血管紧张肽IV和/或前体肽，所述替换和添加包括标准的D和L氨基酸和修饰的氨基酸例如酰胺化和乙酰化的氨基酸，其中所述基础肽序列的治疗活性被维持在药理学有用的水平上。
在优选实施方式中，所述血管紧张肽II是血管紧张肽II乙酸盐。血管紧张肽II乙酸盐是L-天冬氨酰基-L-精氨酰基-L-缬氨酰基-L-酪氨酰基-L-异亮氨酰基-L-组氨酰基-L-脯氨酰基-L-苯丙氨酸乙酸盐。平衡离子乙酸根以非化学计量比率存在。血管紧张肽II乙酸盐的分子式是C50H71N13O12·(C2H4O2)n；(n＝乙酸分子的数目；理论值n＝3)，平均分子量为1046.2(作为游离碱)。
本发明的一个实施方式是一种用于在对象中治疗疾病的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述对象的体液样品中DPP3蛋白的量和/或DPP3活性高于预定阈值，其中体液样品中所述DPP3蛋白的量和/或DPP3活性的确定被用作所述使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体的治疗的疗法指引和/或疗法监测。
在本发明的一个实施方式中，在用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体治疗所述对象之前确定体液样品中所述DPP3蛋白的量和/或DPP3活性。在本发明的一个实施方式中，在用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体治疗所述对象期间，体液样品中所述DPP3蛋白的量和/或DPP3活性在治疗期间被确定至少一次，优选地至少两次，或优选地在治疗期间每天至少一次。在本发明的一个实施方式中，在用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体治疗所述对象之后确定体液样品中所述DPP3蛋白的量和/或DPP3活性。在本发明的一个实施方式中，在用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体治疗所述对象之前和/或期间和/或之后确定体液样品中所述DPP3蛋白的量和/或DPP3活性。
本发明的一个实施方式是一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述对象在体液样品中具有高于预定阈值的DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，其中所述对象的所述体液样品选自全血、血浆和血清。
本发明的一个实施方式是一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体在药物制剂中给药到所述对象。
术语“药物制剂”是指与至少一种可药用赋形剂组合的药物(活性)成分。
本发明的一个实施方式是一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体是血管紧张肽II，并且所述药物制剂是溶液，优选为即用型溶液。在另一个实施方式中，本发明的另一个主题是根据本发明所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于干燥状态下，以在使用前重构。
本文公开的药物制剂还可以含有稀释剂、填充剂、盐类、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域中公知的其他材料。术语“可药用载体”是指可以与本发明的治疗有效物质(例如血管紧张肽II)一起给药到患者，并且不破坏所述治疗有效物质的药理活性的无毒性载体。术语“可药用的”是指不干扰所述活性成分的生物活性的有效性的无毒性材料。
所述载体的特征取决于给药途径。术语“赋形剂”是指制剂或组合物中不是药物活性成分的添加剂。
术语“药物(活性)成分”是指可以任选地与可药用载体组合以提供药物制剂或剂型的治疗性组合物。
本领域技术人员会认识到，任一赋形剂的选择可能影响任何其他赋形剂的选择。例如，特定赋形剂的选择可能排除了一种或多种另外赋形剂的使用，因为所述赋形剂的组合将产生不想要的效果。本发明的赋形剂可以包括但不限于共溶剂、增溶剂、缓冲剂、pH调节剂、增量剂、表面活性剂、包封剂、渗涨度调节剂、稳定剂、保护剂和黏度改进剂。
在某些情况下，在本文公开的组合物中包含可药用载体可能是有益的。
在某些情况下，在本发明的组合物中包含增溶剂可能是有益的。增溶剂可用于提高所述制剂或组合物的任何组分，包括治疗有效物质(例如血管紧张肽II、血管紧张肽III或血管紧张肽IV)或赋形剂的溶解性。本文中描述的增溶剂并非旨在构成详尽清单，而是仅仅被提供为可以在本发明的组合物中使用的示例性增溶剂。在某些情况下，增溶剂包括但不限于乙醇、叔丁醇、聚乙二醇、甘油、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮及其任何可药用盐和/或组合。
在某些情况下，通过在本发明的组合物中包含pH调节剂来调节所述组合物的pH，可能是有益的。修改制剂或组合物的pH可能对例如治疗有效物质的稳定性或溶解性具有有益效果，或者可能在制造适合于肠胃外给药的制剂或组合物中有用。pH调节剂在本领域中是公知的。因此，本文中描述的pH调节剂并非旨在构成详尽清单，而是仅仅被提供为可以在本发明的组合物中使用的示例性pH调节剂。pH调节剂可以包括但不限于酸和碱。在某些情况下，pH调节剂包括但不限于乙酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠及其组合。
本文公开的组合物的pH可以是为所述制剂或组合物提供所需性质的任何pH。所需性质可以包括例如治疗有效物质(例如血管紧张肽II、血管紧张肽III或血管紧张肽IV)的稳定性，与在其他pH下的组合物相比提高的治疗有效物质保留率，以及改进的过滤效率。在某些情况下，本发明的组合物的pH可以是约3.0至约9.0，例如约5.0至约7.0。在特定情况下，本发明的组合物的pH可以是5.5±0.1、5.6±0.1、5.7±0.1、5.8±0.1、5.9±0.1、6.0±0.1、6.1±0.1、6.2±0.1、6.3±0.1、6.4±0.1或6.5±0.1。
在某些情况下，通过在所述组合物中包含一种或多种缓冲剂来缓冲pH，可能是有益的。在某些情况下，缓冲剂可以具有例如约5.5、约6.0或约6.5的pKa。本领域技术人员会认识到，可以根据pKa和其他性质选择适合包含在本发明的组合物中的缓冲剂。
缓冲剂在本领域中是公知的。因此，本文中描述的缓冲剂并非旨在构成详尽清单，而是仅仅被提供为可以在本发明的组合物中使用的示例性缓冲剂。在某些情况下，缓冲剂可以包括下述一者或多者：Tris，Tris HC1，磷酸钾，磷酸钠，柠檬酸钠，抗坏血酸钠，磷酸钠和磷酸钾的组合，Tris/Tris HC1，碳酸氢钠，精氨酸磷酸盐，精氨酸盐酸盐，组氨酸盐酸盐，甲胂酸盐，琥珀酸盐，2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，马来酸盐，bis-tris，磷酸盐，碳酸盐及其任何可药用盐和/或组合。
在某些情况下，在本发明的组合物中包含表面活性剂可能是有益的。表面活性剂通常降低液体组合物的表面张力。这可能提供有益的性质例如过滤的容易性提高。表面活性剂也可以充当乳化剂和/或增溶剂。表面活性剂在本领域中是公知的。因此，本文中描述的表面活性剂并非旨在构成详尽清单，而是仅仅被提供为可以在本发明的组合物中使用的示例性表面活性剂。可以包含的表面活性剂包括但不限于失水山梨糖醇酯例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、脂多糖、聚乙二醇(例如PEG 400和PEG 3000)、泊洛沙姆(即普朗尼克)、氧化乙烯或聚氧化乙烯(例如曲拉通X-100)、皂苷、磷脂(例如卵磷脂)及其组合。
在某些情况下，在本发明的组合物中包含渗涨度调节剂可能是有益的。液体组合物的渗涨度是在例如通过肠胃外给药将所述组合物给药到患者时的重要考虑因素。因此，渗涨度调节剂可用于帮助制造适合于给药的制剂或组合物。渗涨度调节剂在本领域中是公知的。因此，本文中描述的渗涨度调节剂并非旨在构成详尽清单，而是仅仅被提供为可以在本发明的组合物中使用的示例性渗涨度调节剂。渗涨度调节剂可以是离子型或非离子型的，并且包括但不限于无机盐、氨基酸、碳水化合物、糖类、糖醇和碳水化合物。示例性的无机盐可以包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾。示例性的氨基酸是甘氨酸。示例性的糖类可以包括糖醇例如甘油、丙二醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘露糖醇。
在某些情况下，在本发明的组合物中包含稳定剂可能是有益的。稳定剂帮助提高治疗有效物质在本发明的组合物中的稳定性。这可能通过例如减少治疗有效物质的降解或阻止其聚集而发生。不希望受到理论限制，增强稳定性的机制可能包括从溶剂封存所述治疗有效物质或抑制蒽环类化合物的自由基氧化。稳定剂在本领域中是公知的。因此，本文中描述的稳定剂并非旨在构成详尽清单，而是仅仅被提供为可以在本发明的组合物中使用的示例性稳定剂。稳定剂可以包括但不限于乳化剂和表面活性剂。
本文公开的组合物可以以各种不同的常规方式给药。在某些情况下，本发明的组合物适合于肠胃外给药。这些组合物可以例如腹膜内、静脉内、肾内、鞘内或通过吸入给药。在某些情况下，本发明的组合物被静脉内注射。本领域技术人员会认识到，给药本发明的治疗有效物质制剂或组合物的方法取决于多种因素，例如待治疗患者的年龄、体重和身体状况，以及待治疗的疾病或病症。因此，专业技术人员能够视情况而定为患者选择最适的给药方法。
血管紧张肽受体激动剂和/或其前体可以以任何适合的方式给药，但通常通过连续输注来给药。因此，通过改变静脉滴注的流速、改变静脉滴注中药剂的浓度等，可以实现给药速率的提高或降低。然而，改变给药速率的方式取决于所述治疗剂的给药方式。在所述治疗剂透黏膜或透皮给药的情况下，可以通过例如改变成释放速率更高的贴片或透皮组合物来提高速率。在所述治疗剂口服给药的情况下，可以例如通过切换到更高剂量的形式、给药另外的剂量或给药具有更高释放速率的受控释放制剂来提高速率。
在所述治疗剂通过吸入给药的情况下，可以通过例如给药另外的药团、更浓的药团或释放更快的药团来提高速率。其他给药方式(通过皮下注射泵、栓剂等)可以以类似的方式调节，并且降低给药速率可以通过做出与提高治疗剂的给药速率的行动相反的行动来实现。
本发明的一个实施方式是一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体是血管紧张肽II，其以0.1至200ng/kg/min之间、优选地1至100ng/kg/min之间、更优选地2至80ng/kg/min之间、甚至更优选地5至60ng/kg/min之间、甚至更优选地10至50ng/kg/min之间、甚至更优选地15至40ng/kg/min之间的速率，最优选地以20ng/kg/min的速率给药。
在本公开的特定实施方式中，通过连续静脉内输注，血管紧张肽II的起始剂量(初始速率)为80ng/kg/min，更优选地40ng/kg/min，最优选地20ng/kg/min。
在本发明的另一个特定实施方式中，为了滴定血管紧张肽II，对血压响应(例如平均动脉压；MAP)进行监测。血管紧张肽II的滴定可以每60分钟,更优选地每45分钟、甚至更优选地每30分钟、甚至更优选地每15分钟、甚至更优选地每10分钟、最优选地每5分钟进行。血管紧张肽II滴定可以根据需要以高达40ng/kg/min、更优选地高达20ng/kg/min、最优选地高达15ng/kg/min的增量进行，以达到或维持目标血压。在另一个优选实施方式中，在治疗的前3小时期间，剂量应该不超过80ng/kg/min的血管紧张肽II。最优选地，维持剂量应该不超过40ng/kg/min，并且可以使用低至1.25ng/kg/min的剂量。
在某些实施方式中，在给药所述组合物之前，所述患者具有不超过约40mm Hg、约45mm Hg、约50mm Hg、55mm Hg、约60mm Hg、约65mm Hg、约70mm Hg或约75mm Hg的初始平均动脉压(MAP)。所述方法可以包括测量所述患者的平均动脉压，并且如果所述平均动脉压低于约40mm Hg、约45mm Hg、约50mm Hg、55mm Hg、约60mm Hg、约65mm Hg、约70mm Hg或约75mmHg，则提高血管紧张肽II的给药速率。
在一个实施方式中，所述患者可以接受血管加压药(例如儿茶酚胺类，诸如去甲肾上腺素、去甲肾上腺素等效物、肾上腺素、多巴胺、苯肾上腺素)或其组合。在某些实施方式中，所述血管加压药是血管加压素(例如特利加压素、精氨加压素、去氨加压素、苯赖加压素、赖氨加压素或鸟氨加压素)。
本发明的一个实施方式是一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、特别是血管紧张肽II，与DPP3的抑制剂联合给药。
本发明的一个实施方式是一种与DPP3的抑制剂联合用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述DPP3的抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
根据本发明，所述“抗DPP3抗体”是与DPP3特异性结合的抗体，“抗DPP3抗体片段”是所述抗DPP3抗体的片段，其中所述片段与DPP3特异性结合。“抗DPP3非Ig支架”是与DPP3特异性结合的非Ig支架。
本发明的一个实施方式是一种与DPP3的抑制剂联合用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述DPP3的抑制剂是与SEQ ID NO.1结合、特别是与SEQ ID NO.2结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
本发明的一个实施方式是一种与DPP3的抑制剂联合用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述DPP3的抑制剂是对DPP3表现出等于或低于10-7M的最低结合亲和性的抗体或片段或支架。
根据本发明，本领域技术人员会充分认识到，本文公开的DPP3结合剂与DPP3的结合亲和性可以通过本领域中已知的各种适合的测定法来测量。相应的实例在下文给出，但它们不应被解释为限制测量本文公开的DPP3结合剂与DPP3的结合亲和性的可能性。
例如，可以确定所述DPP3结合剂与表位的结合亲和性。可以进行结合测定法以检测和/或定量与例如相应结合剂的免疫肽结合的抗体。例如，可以将这种免疫肽固定化在固相上。将测试样品(例如抗体溶液)通过所述固定的免疫肽，并且可以检测结合的抗体。出于本说明书的目的，术语“固相”可用于涵盖可以在其中或其上进行所述测定法的任何材料或容器，并且包括但不限于多孔材料、无孔材料、试管、孔、载片、磁珠等。
示例性的检测方法：
-对抗体进行标记，然后与固相接触并检测相应的标记物(荧光、化学发光、酶等)。
-使用针对样品-抗体的特定Fc部分的标记的第二抗体。将固相结合的抗体与第二抗体(例如抗人类IgG抗体、抗鼠类IgG抗体)温育并检测相应的标记物(荧光、化学发光、酶等)。
-使用作为固相结合的竞争物的标记的抗体(例如标记的AK1967)。
-通过信号的降低来定量结合亲和性。
作为确定抗体对DPP3的亲和性的另一种方法，可以使用Biacore2000系统(GEHealthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振来确定DPP3与固定化抗体的结合的动力学。抗体的可逆固定化可以使用以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)来进行(Lorenz等， 2011.Antimicrob Agents Chemother.55(1):165–173)。
本发明的一个实施方式是一种与DPP3的抑制剂联合用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述DPP3的抑制剂是单特异性的抗体或片段或支架，在一个实施方式中，所述DPP3的抑制剂是单克隆的抗体或片段或支架。
根据本发明所述的单特异性抗体或片段或非Ig支架是全都对同一抗原具有亲和性的抗体或片段或非Ig支架。单克隆抗体是单特异性的，但单特异性抗体也可以通过从共同胚细胞生产之外的其他手段来生产。
在特定实施方式中，所述与全长DPP3结合的捕获结合物在液相测定法中特异性抑制少于50％、优选地少于40％、更优选地少于30％的DPP3活性。液相测定法的定义参见上文。在一个特定实施方式中，为了阻止DPP3的抑制，所述捕获结合物不应在活性中心和底物结合区(SEQ ID No.1的第316–669位氨基酸)附近的区域中结合DPP3。
本发明的一个实施方式是一种与DPP3的抑制剂联合用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体，其中所述DPP3的抑制剂是与全长DPP3结合的抗体或片段或支架，并将DPP3的活性抑制至少10％或至少50％，更优选地至少60％，甚至更优选地超过70％，甚至更优选地超过80％，甚至更优选地超过90％，甚至更优选地超过95％。
在液相测定法中DPP3活性被结合剂的抑制可以如下所述来确定：将可能的DPP3捕获结合物与重组或纯化的本源DPP3和特异性DPP3底物在液相测定法中温育。优选地，作为用于ECA的捕获结合物，选择具有最低抑制能力的捕获结合物。所述捕获结合物应该抑制DPP3活性少于50％，优选地少于40％，优选地少于30％。用于确定可能的捕获结合物的抑制能力的具体液相DPP3活性测定法包括以下步骤：
·将25ng/ml本源人类DPP3与5μg/ml相应的捕获结合物和缓冲液对照在50mMTris-HCl，pH 7,5和100μM ZnCl2中，在室温温育1小时。
·添加产荧光底物Arg-Arg-βNA(20μl，2mM)。
·在37℃温育并在Twinkle LB 970微孔板荧光计(Berthold TechnologiesGmbH)中监测游离βNA的产生超过1小时。βNA的荧光通过在340nm处激发并在410nm处测量发射来检测。
·计算不同样品的增加的荧光的斜率(单位为RFU/min)。含有缓冲液对照的本源人类DPP3的斜率被指定为100％活性。可能的捕获结合物的抑制能力被定义为通过与所述捕获结合物温育，本源人类DPP3活性降低的百分数。
在液相测定法中，体液样品直接暴露于产荧光底物(例如Arg-Arg-β-NA)。由于在血浆中存在许多不同氨基肽酶(Sanderink等，1988)，因此所使用的底物有可能被DPP3之外的肽酶降解。为了避免这一问题，检测特异性DPP3活性的一种优选方法是使用酶捕获活性测定法。
在一个特定实施方式中，在酶捕获测定法中有活性DPP3的确定包括以下步骤：
·将所述样品与捕获结合物相接触，所述捕获结合物与全长DPP3结合，但优选地在液相测定法中抑制DPP3活性少于50％、优选地少于40％、更优选地30％。为了防止DPP3的抑制，所述捕获结合物不应在活性中心和底物结合区(SEQ ID No.1的第316–669位氨基酸)附近的区域中结合DPP3。
·从体液样品分离与所述捕获结合物结合的DPP3，
·向所述分离的DPP3添加DPP3的底物，
·通过测量DPP3的底物的转变来定量DPP3活性。
根据本发明所述的“抗体”是包括基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽的蛋白质，其特异性结合抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链通常为约25kDa或214个氨基酸长。
全长免疫球蛋白重链通常为约50kDa或446个氨基酸长。轻链在NH2-端由可变区基因编码(约110个氨基酸长)，并且在COOH-端由κ或λ恒定区基因编码。重链类似地由可变区基因(约116个氨基酸长)和其他恒定区基因之一编码。
抗体的基本结构单元通常是由相同的两对免疫球蛋白链构成的四聚体，每对具有一条轻链和一条重链。在每一对中，轻链和重链可变区与抗原结合，并且恒定区介导效应物功能。免疫球蛋白也以各种不同的其他形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab')2以及双功能杂合抗体和单链(例如Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17:105,1987；Huston等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 85:5879-5883, 1988；Bird等，Science242:423-426,1988； Hood等，Immunology,Benjamin,N.Y.,2nded.,1984；Hunkapiller and Hood,Nature323: 15-16,1986)。
免疫球蛋白轻链或重链可变区包括被三个也被称为互补决定区(CDR)的高变区打断的构架区(参见《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，E.Kabat等，U.S.Department of Health and HumanServices,1983)。正如上文提到的，所述CDR主要负责与抗原的表位结合。免疫复合体是特异性结合到抗原的抗体例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体或有功能的抗体片段。
“嵌合抗体”是其轻链和重链基因通常通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因构建的抗体。例如，可以将来自于小鼠单克隆抗体的可变基因区段联结到人类恒定区段例如κ和γ1或γ3。因此在一个实例中，治疗性嵌合抗体是由来自于小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自于人类抗体的恒定或效应物结构域组成的杂合蛋白，尽管也可以使用其他哺乳动物物种，或者可变区可以通过分子技术来产生。制造嵌合抗体的方法在本领域中是公知的，例如参见美国专利号5,807,715。“人源化”免疫球蛋白是包括人类构架区和来自于非人类(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。所述提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，并且所述提供构架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。
在本发明的一个实施方式中，人源化免疫球蛋白中的所有CDR均来自于供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但如果它们存在的话，它们必须与人类免疫球蛋白恒定区基本上同一，即具有至少约85-90％例如约95％以上的同一性。因此，可能除了CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分均与天然人类免疫球蛋白序列的对应部分基本上同一。
根据本发明所述的“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与所述提供CDR的供体抗体结合到相同抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体构架可以具有从供体构架获取的有限数目的氨基酸替换。人源化或其他单克隆抗体可以具有另外的保守氨基酸替换，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。示例性的保守替换是例如gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr。人源化免疫球蛋白可以利用遗传工程来构建(例如参见美国专利号5,585,089)。人类抗体是其中轻链和重链基因是人类起源的抗体。人类抗体可以使用本领域已知的方法来产生。人类抗体可以通过将分泌感兴趣的抗体的人类B细胞永生化来生产。永生化可以例如通过EBV感染或通过将人类B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三源杂交瘤细胞来实现。人类抗体也可以通过噬菌体展示方法来产生(参见例如Dower等，PCT出版号WO 91/17271；McCafferty等，PCT出版号WO 92/001047；和Winter，PCT出版号WO 92/20791)，或从人类组合单克隆抗体文库选择(参见Morphosys网站)。人类抗体也可以使用带有人类免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如参见Lonberg等，PCT出版号WO 93/12227；和Kucherlapati，PCT出版号WO 91/10741)。
因此，根据本发明所述的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段可以具有本领域中已知的形式。实例是人类抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体或其抗体片段，但不限于此。
在本发明的特定实施方式中，所述抗DPP3抗体是单克隆抗体或其片段。在本发明的一个实施方式中，所述抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段是人类或人源化抗体或从其衍生。在一个特定实施方式中，将一个或多个(鼠类)CDR嫁接到人类抗体或抗体片段中。
在优选实施方式中，根据本发明所述的抗体是重组生产的抗体例如典型的全长免疫球蛋白IgG或至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段例如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于：Fab片段，包括Fab微抗体、单链Fab抗体、带有表位标签的单价Fab抗体例如Fab-V5Sx2；使用CH3结构域二聚化的二价Fab(微型抗体)；二价Fab或多价Fab，例如通过在异源结构域的帮助下多聚化，例如通过dHLX结构域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab‘)2片段，scFv片段，多聚化的多价和/或多特异性scFv片段，二价和/或双特异性双体抗体，
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(双特异性T-细胞衔接物)，三功能抗体，来自于例如G之外的不同类别的多价抗体；单域抗体，例如源自于骆驼科或鱼类免疫球蛋白的纳米抗体，以及大量其他抗体片段。
除了抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段之外，本领域中公知其他生物聚合物支架、即所谓的非Ig支架与靶分子形成复合物，并且已被用于产生高度靶特异性生物聚合物。实例是适体、spiegelmer、anticalin和芋螺毒素。
在本发明的情形中，非Ig支架可以是蛋白质支架，并且可以用作抗体模拟物，因为它们能够与配体或抗原结合。非Ig支架可以选自基于四连接素的非Ig支架(例如在US2010/0028995中描述的)、纤连蛋白支架(例如在EP 1266 025中描述的)、基于载脂蛋白的支架(例如在WO 2011/154420中描述的)、遍在蛋白支架(例如在WO 2011/073214中描述的)、转移支架(例如在US 2004/0023334中描述的)、蛋白A支架(例如在EP 2231860中描述的)、基于锚蛋白重复序列的支架(例如在WO 2010/060748中描述的)、微蛋白(优选为形成胱氨酸结的微蛋白)支架(例如在EP 2314308中描述的)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如在WO 2011/023685中描述的)、基于EGFR-A结构域的支架(例如在WO 2005/040229中描述的)和基于Kunitz结构域的支架(例如在EP 1941867中描述的)。非Ig支架可以是肽或寡核苷酸适体。适体通常通过从大的随机序列库中选择来产生，并且是短链寡核苷酸(DNA、RNA或XNA；Xu等，2010，Deng等，2014)或附连到蛋白质支架的短的可变肽结构域(Li等，2011)。
在可选实施方式中，所述抗DPP3抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，所述抗体形式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及其生物可利用性优化的偶联物例如PEG化的片段。
在本发明的情形中，术语“抗体”通常包含单克隆和多克隆抗体及其结合片段、特别是Fc-片段，以及所谓的“单链抗体”(Bird等，1988)、嵌合、人源化特别是CDR嫁接抗体和双体或四体抗体(Holliger等，1993)。还包括通过包括例如噬菌体展示在内的技术选择的与样品中包含的感兴趣的分子特异性结合的免疫球蛋白样蛋白。在这种情形中，术语“特异性结合”是指针对感兴趣的分子或其片段产生的抗体。如果抗体对感兴趣的分子或其上述片段的亲和性比对含有所述感兴趣的分子的样品中包含的其他分子的亲和性至少高优选地50倍、更优选地100倍、最优选地至少1000倍，则所述抗体被认为是特异性的。如何制造抗体和选择具有给定特异性的抗体，在本领域中是公知的。
在本发明的特定实施方式中，所述与根据SEQ ID NO.：2所述的表位结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段是单克隆抗体或其单克隆抗体片段，其中所述表位被包含在DPP3蛋白或其功能性衍生物中。在本发明的一个实施方式中，所述与根据SEQ ID NO.：2所述的表位结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段是人类或人源化抗体或从其衍生或人源化抗体片段或从其衍生，其中所述表位被包含在DPP3蛋白或其功能性衍生物中。
在一个特定实施方式中，将一个或多个(鼠类)CDR嫁接到人类抗体或抗体片段中。
在本发明的另一方面，提供的主题内容是一种针对并结合到根据SEQ ID NO.：2所述的表位的人类CDR嫁接的抗DPP3抗体或其抗DPP3抗体片段，其中所述表位被包含在DPP3蛋白或其功能性衍生物中，并且其中所述人类CDR嫁接的抗DPP3抗体或其抗DPP3抗体片段包含含有SEQ ID NO.：4的抗体重链可变区(H链)，和/或还包含含有SEQ ID NO.：5的抗体轻链可变区(L链)。
另一方面，本发明的另一个主题内容是一种针对并结合到根据SEQ ID NO.：2所述的表位的人类CDR嫁接的抗DPP3抗体或其抗DPP3抗体片段，所述表位被包含在DPP3蛋白或其功能性衍生物中，并且其中所述人类CDR嫁接的抗DPP3抗体或其抗DPP3抗体片段包含含有SEQ ID NO.：11的抗体重链可变区(H链)，和/或还包含含有SEQ ID NO.：12的抗体轻链可变区(L链)。
在本发明的一个特定实施方式中，本发明的主题内容是一种针对并结合到根据SEQ ID NO.：2所述的表位的人类单克隆抗DPP3抗体或其单克隆抗DPP3抗体片段，其中所述表位被包含在DPP3蛋白或其功能性衍生物中，并且其中重链包含SEQ ID NO.：6、SEQ IDNO.：7或SEQ ID NO.：8中的至少一个CDR，并且其中轻链包含SEQ ID NO.：9、KVS或SEQ IDNO.：10中的至少一个CDR。
所述对象的体液样品中DPP3蛋白的量和/或DPP3活性可以通过不同方法来确定，例如免疫测定法、活性测定法、质谱法等。
所述对象的体液样品中DPP3蛋白的量和/或DPP3活性可以例如通过下述方法之一来确定：
1.用于定量DPP3蛋白浓度的发光免疫测定法(LIA)(Rehfeld等，2019 JALM3(6): 943-953)
所述LIA是一步化学发光夹心免疫测定法，使用白色高结合性聚苯乙烯微量滴定板作为固相。这些板用单克隆抗DPP3抗体AK2555(捕获抗体)包被。示踪剂抗DPP3抗体AK2553用MA70-吖啶-NHS-酯标记，并以每孔20ng的浓度使用。将20微升样品(例如源自于患者血液的血清、肝素血浆、柠檬酸盐血浆或EDTA血浆)和校准物吸取到包被的白色微量滴定板中。在添加示踪剂抗体AK2553后，将所述微量滴定板在室温和600rpm下温育3h。然后通过4个清洗步骤(每孔350μL)除去未结合的示踪剂。使用微量滴定板发光计测量每个孔的剩余化学发光1s。DPP3的浓度使用6点校准曲线来确定。校准物和样品优选地运行两份平行样。
2.用于定量DPP3活性的酶捕获活性测定法(ECA)(Rehfeld等，2019 JALM3(6): 943-953)
所述ECA是一种DPP3特异性活性测定法，使用黑色高结合性聚苯乙烯微量滴定板作为固相。这些板用单克隆抗DPP3抗体AK2555(捕获抗体)包被。将20微升样品(例如血清、肝素血浆、柠檬酸盐血浆、脑脊液和尿液)和校准物吸取到包被的黑色微量滴定板中。在添加测定法缓冲液(200μL)后，将所述微量滴定板在22℃和600rpm下温育2h。样品中存在的DPP3通过结合到所述捕获抗体而被固定化。通过4个清洗步骤(每孔350μL)除去未结合的样品组分。固定化的DPP3的比活性通过在反应缓冲液中添加产荧光底物Arg-Arg-β-萘基酰胺(Arg2-βNA)然后在37℃温育1h来测量。DPP3将Arg2-βNA特异性裂解成Arg-Arg二肽和发荧光的β-萘基胺。荧光使用荧光计来测量，使用340nm的激发波长，并在410nm处检测发射。DPP3的活性使用6点校准曲线来确定。校准物和样品优选地运行两份平行样。
3.用于定量DPP3活性的液相测定法(LAA)(从Jones等，Analytical Biochemistry,1982修改)
所述LAA是一种液相测定法，其使用黑色非结合性聚苯乙烯微量滴定板来测量DPP3活性。将20微升样品(例如血清、肝素血浆、柠檬酸盐血浆)和校准物吸取到非结合性黑色微量滴定板中。在添加测定法缓冲液(200μL)中的产荧光底物Arg2-βNA后，在荧光计中使用340nm的激发波长并在410nm处检测发射测量初始βNA荧光(T＝0)。然后将板在37℃温育1小时。测量(T＝60)的最终荧光。计算最终和初始荧光之间的差。DPP3的活性使用6点校准曲线来确定。校准物和样品优选地运行两份平行样。
各种不同的免疫测定法是已知的，并且可用于本发明的测定法和方法，它们包括：放射免疫测定法(“RIA”)，均相酶放大免疫测定法(“EMIT”)，酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)，酶蛋白再激活免疫测定法(“ARIS”)，化学发光和荧光免疫测定法，基于Luminex的珠子阵列，蛋白质微阵列测定法，以及快速测试形式例如免疫层析试条测试(“试纸条免疫测定法”)和免疫层析测定法。
在本发明的一个实施方式中，这种测定法是使用任何种类的检测技术包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物的夹心测定法，优选为全自动测定法。在本发明的一个实施方式中，这种测定法是酶标记的夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于下述系统之一的测定法：Roche
Figure BDA0003520634770000501
Abbott
Figure BDA0003520634770000502
Siemens
Figure BDA0003520634770000503
Brahms
Figure BDA0003520634770000504
Biomerieux
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Alere
Figure BDA0003520634770000506
在本发明的一个实施方式中，它可以是所谓的POC测试(护理点)，即不需全自动测定法系统，允许在患者附近在不到1小时内进行测试的测试技术。这种技术的一个实例是免疫层析测试技术。
在本发明的特定实施方式中，所述POC测试合并了超过一种分析物的同时测量。在本发明的另一个特定实施方式中，所述分析物选自DPP3和肾上腺髓质素原或其片段。在本发明的非常特定实施方式中，所述POC测试合并了DPP3和成熟ADM的测量。
在本发明的一个实施方式中，至少一种结合剂被标记以便进行检测。
在优选实施方式中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。
所述测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争测定法。在一个实施方式中，所述测定法采取夹心测定法的形式，这是一种非竞争免疫测定法，其中所述待检测和/或定量的分子被结合到第一抗体和第二抗体。所述第一抗体可以被结合到固相例如珠子、孔或其他容器、芯片或试条的表面，并且所述第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性组成部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与被分析物结合的标记抗体的量。与“夹心测定法”有关的通用组合物和程序是已确立的并且为专业技术人员所知(《免 疫测定法手册》(TheImmunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD,Oxford；第3 版(2005年5月), ISBN-13:978-0080445267；Hultschig C等，Curr OpinChem Biol.2006年 2月；10(1):4-10.PMID:16376134)。
在另一个实施方式中，所述测定法包含两种捕获分子，优选为均作为分散系存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一标记组分被附连到所述第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光-或化学发光-淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分被附连到第二捕获分子，使得在两种捕获分子与被分析物结合后产生可测量的信号，允许在包含所述样品的溶液中检测形成的夹心复合物。
在另一个实施方式中，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花菁类染料的组合。
在本发明的情形中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花菁染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、呫吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯甲酰亚胺类例如Hoechst 33258、菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。
在本发明的情形中，基于化学发光的测定法包括使用基于在下述文献中为化学发光材料描述的物理原理的染料(Kirk-Othmer，《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)，第4版，执行主编J.I.Kroschwitz，主编M.Howe-Grant,John Wiley&Sons,1993,第15卷,第518-562页，通过参考并入本文，包括第551-562页上的引文)。优选的化学发光染料是吖啶酯。
正如本文中提到的，“测定法”或“诊断测定法”可以是在诊断学领域中使用的任何类型的测定法。这种测定法可以基于待检测的被分析物与一种或多种捕获探针以一定亲和性的结合。就捕获分子与靶分子或感兴趣的分子之间的相互作用而言，亲和常数优选地大于108M-1。
DPP3活性可以通过检测DPP3特异性底物的裂解产物来测量。
已知的肽激素底物包括Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽、内吗啡肽1和2、valorphin、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH(促肾上腺皮质激素)和MSH(黑素细胞刺激激素；
Figure BDA0003520634770000531
等， 2000,
Figure BDA0003520634770000532
等，2007,Dhanda等，2008)。上述肽激素以及其他不带标签的寡肽(例如Ala-Ala-Ala-Ala，Dhanda等，2008)的裂解，可以通过检测相应的裂解产物来监测。检测方法包括但不限于HPLC分析(例如Lee&Snyder1982)、质谱(例如
Figure BDA0003520634770000533
等，2000)、H1-NMR分析(例如Vandenberg等，1985)、毛细管区带电泳(CE；例如
Figure BDA0003520634770000534
等，2007)、薄层层析(例如Dhanda等，2008)或反相层析(例如Mazocco等，2006)。
由于产荧光底物被DPP3水解而产生的荧光的检测是监测DPP3活性的标准程序。那些底物是偶联到荧光团的特定的二肽或三肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)。荧光团包括但不限于β-萘基酰胺(2-萘基酰胺、βNA、2NA)、4-甲氧基-β-萘基酰胺(4-甲氧基-2-萘基酰胺)和7-酰氨基-4-甲基香豆素(AMC，MCA；
Figure BDA0003520634770000535
等，2000,Ohkubo等， 1999)。这些产荧光底物的裂解分别导致发荧光β-萘基胺或7-氨基-4-甲基香豆素的释放。在液相测定法或ECA中，将底物和DPP3在例如96孔板形式中温育，并使用荧光检测器测量荧光(Ellis&Nuenke 1967)。此外，可以将带有DPP3的样品通过电泳在凝胶上固定化并分开，将凝胶用产荧光底物(例如Arg-Arg-βNA)和Fast Garnet GBC染色，并通过荧光读取器检测荧光蛋白条带(Ohkubo等，1999)。同样的肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)可以被偶联到生色团例如对硝基苯胺二乙酸。由生色底物的水解造成的颜色变化的检测可用于监测DPP3活性。
用于检测DPP3活性的另一个选项是Protease-GloTM测定法(可以从Promega商购)。在所述方法的这个实施方式中，DPP3特异性二肽或三肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)被偶联到氨基萤光素。在被DPP3裂解后氨基萤光素被释放出来，并充当发出可检测发光的偶联萤光素酶反应的底物。
在优选实施方式中，DPP3活性通过添加产荧光底物Arg-Arg-βNA并实时监测荧光来测量。
在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的方法的特定实施方式中，与DPP3具有反应性的所述捕获结合物被固定化在固相上。
将测试样品通过固定的结合剂，并且DPP3如果存在的话与所述结合剂结合并且本身被固定化，以备检测。然后可以添加底物，并且可以检测反应产物以指示所述测试样品中DPP3的存在或量。出于本说明书的目的，术语“固相”可用于包括可以在其中或其上进行测定法的任何材料或容器，并包括但不限于多孔材料、无孔材料、试管、孔、载片、琼脂糖树脂(例如来自于GE Healthcare Life Sciences的Sepharose)、磁性粒子(例如来自于ThermoFisher Scientific的DynabeadsTM或PierceTM磁珠)等。
蛋白质或肽起源的结合剂(例如抗体、抗体片段、非Ig支架)通过下述方法固定化在固相上：物理吸附(例如通过静电相互作用或疏水相互作用)，生物亲和固定化(例如亲和素-生物素、蛋白A/G/L、His标签和Ni2+-NTA、GST标签和谷胱甘肽、DNA杂交、适体)，共价键(例如胺和N-羟基琥珀酰亚胺)或所述固定化方法的组合(Kim&Herr 2013)。寡核苷酸起源的结合剂(例如适体)可以利用(链)亲和素-生物素系统固定化在固相上(Müller等，2012, Deng等，2014)。
在所述用于确定对象体液样品中的DPP3活性的方法的特定实施方式中，所述分离步骤是从所述捕获的DPP3除去所述样品的未结合到所述捕获结合物的成分的清洗步骤。该分离步骤可以是将与所述捕获结合物结合的DPP3与所述体液样品的成分分离开的任何其他步骤。
在所述用于确定对象体液样品中的DPP3活性的方法的特定实施方式中，所述DPP3底物被固定化的DPP3的转变通过选自以下的方法来测量(检测)：产荧光底物的荧光(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)，生色底物的颜色变化，偶联到氨基萤光素的底物的发光(Promega Protease-GloTM测定法)，质谱，HPLC/FPLC(反相层析、孔径排阻层析)，薄层层析，毛细管区带电泳，凝胶电泳后进行活性染色(固定化的有活性DPP3)或western印迹(裂解产物)。
在所述用于确定对象体液样品中的DPP3活性的方法的特定实施方式中，所述底物可以选自：Leu-脑啡肽，Met-脑啡肽，内吗啡肽1和2，valorphin，β-酪啡肽，强啡肽，原肠肽，ACTH和MSH，或偶联到荧光团、生色团或氨基萤光素的二肽和三肽(Promega Protease-GloTM测定法)。被DPP3裂解的二肽或三肽包括但不限于Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe。荧光团包括但不限于β-萘基酰胺(2-萘基酰胺、βNA、2NA)、4-甲氧基-β-萘基酰胺(4-甲氧基-2-萘基酰胺)和7-酰氨基-4-甲基香豆素(AMC，MCA；Abramic等，2000；Ohkubo等，1999)。这些产荧光底物的裂解分别导致发荧光β-萘基胺或7-氨基-4-甲基香豆素的释放。生色团包括但不限于对硝基苯胺二乙酸(pNA)。所述生色底物中肽-pNA键的水解导致pNA的释放，进而改变颜色。因此，吸光度的变化(DA/min)与酶活性成正比。使用所述来自于Promega的Protease-GloTM测定法，在被DPP3裂解后，氨基萤光素被释放，并充当可检测发光的偶联萤光素酶反应的底物。
本发明的主题内容还是一种用于在已发生难治性休克的对象中预后结果和/或不良事件风险的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较，
·将所述对象中的所述DPP3水平与所述不良事件风险相关联，其中高于一定阈值的高水平预测了所述不良事件的风险提高，或
·将所述对象中的所述DPP3水平与疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了疗法或干预的成功。
在本发明的情形中，术语“预后”表示对患者的医疗状况将如何进展的预测。这可能包括对所述患者的康复机会或不良事件机会的估计。不良事件被定义为器官功能障碍或死亡。器官功能障碍被定义为肾功能减退、心脏功能障碍或肝功能障碍。
本发明的其他实施方式是：
1.一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较，
其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则所述对象被预测为将发生难治性休克或被诊断为患有难治性休克。
2.根据实施方式1所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述休克选自由低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。
3.根据实施方式1和2所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中
·在心源性休克的情况下，所述对象可能已患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或其中所述对象患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者
·在低血容量休克的情况下，所述对象可能已患有出血性疾病包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂背景中的自发性出血，或非出血性疾病包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/不显性失水(例如烧伤、中暑)或胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤背景中的第三间隙体液丧失，或者
·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者
·在分布性休克的情况下，所述患者可能已患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。
4.根据实施方式1至3所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法用于治疗的启动和/或终止和/或分层和/或指引。
5.根据实施方式1至4中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则治疗被启动和/或维持和/或暂停和/或终止。
6.根据实施方式5所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述治疗选自血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂和抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段。
7.根据实施方式1至6中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平被确定，并与预定阈值进行比较。
8.根据实施方式1至7中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中DPP3水平通过将所述体液样品与特异性结合DPP3的捕获结合剂相接触来确定。
9.根据实施方式8所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述用于确定DPP3水平的捕获结合剂可以选自抗体、抗体片段或非IgG支架。
10.根据实施方式8至9所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述捕获结合剂是抗体。
11.根据实施方式8至10中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述捕获结合剂是单克隆抗体。
12.根据实施方式1至11中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述体液样品选自全血、血浆和血清。
13.根据实施方式1至12中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述诊断或预测方法进行至少两次。
14.根据实施方式1至13中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
15.根据实施方式1至13中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
16.根据实施方式14至15所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
17.根据实施方式14所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
18.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中当通过根据实施方式1-17中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
19.根据实施方式18所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中所述血管加压药选自多巴胺、去甲肾上腺素、去甲肾上腺素等效物、肾上腺素、苯肾上腺素和血管加压素。
20.根据实施方式18或19所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中所述血管加压药在药物制剂中给药到所述对象。
21.根据实施方式18至20中的任一项所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中所述对象具有等于或低于65mm Hg的血压。
22.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中当通过根据实施方式1-17中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平。
23.根据实施方式22所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中DPP3活性抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
24.根据实施方式22和23所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂对DPP3具有等于或低于10-7M的最低结合亲和性。
25.根据实施方式22至24中的任一项所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中DPP3活性抑制剂是抗体。
26.根据实施方式22至25中的任一项所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体。
27.根据实施方式22至26中的任一项所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体，其中重链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：7、SEQ ID NO.：8和/或SEQ ID NO.：9，并且轻链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：10、KVS和/或SEQ ID NO.：11。
28.根据实施方式22至27中的任一项所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是人源化单克隆抗体或人源化单克隆抗体片段，其中重链包含序列SEQ ID NO.：12，并且其中轻链包含序列SEQ ID NO.：13。
29.根据实施方式22至28中的任一项所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
30.根据实施方式29所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体选自血管紧张肽I、血管紧张肽II、血管紧张肽III、血管紧张肽IV，特别是血管紧张肽II。
31.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
32.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
33.根据实施方式32所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
34.根据实施方式31所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
35.根据实施方式33-34所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
36.一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当通过根据实施方式1-17中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
37.根据实施方式35所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向给所述对象药血管加压药，其中所述血管加压药选自多巴胺、去甲肾上腺素、去甲肾上腺素等效物、肾上腺素、苯肾上腺素和血管加压素。
38.根据实施方式35-36所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中所述血管加压药在药物制剂中给药到所述对象。
39.根据实施方式35-37所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中所述对象具有等于或低于65mm Hg的血压。
40.一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中当通过根据实施方式1-17中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平。
41.根据实施方式39所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述DPP3活性抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
42.根据实施方式39-40所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂对DPP3具有等于或低于10-7M的最低结合亲和性。
43.根据实施方式39-41所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述DPP3活性抑制剂是抗体。
44.根据实施方式39-42所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体。
45.根据实施方式39-43所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单克隆抗体，其中重链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：7、SEQ ID NO.：8和/或SEQ ID NO.：9，并且轻链中的互补决定区(CDR)包含序列SEQ ID NO.：10、KVS和/或SEQ ID NO.：11。
46.根据实施方式39-44所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是人源化单克隆抗体或人源化单克隆抗体片段，其中重链包含序列SEQ ID NO.：12，并且其中轻链包含序列SEQ ID NO.：13。
47.根据实施方式39-45所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
48.根据实施方式39-46所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体选自血管紧张肽I、血管紧张肽II、血管紧张肽III、血管紧张肽IV，特别是血管紧张肽II。
49.根据实施方式39-47所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管紧张肽受体激动剂和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
50.根据实施方式35-38所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
51.根据实施方式49所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，并且其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
52.根据实施方式50所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，并且其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
53.根据实施方式51和52所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
54.根据实施方式51至53所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
根据上述情形，以下连续编号的实施方式提供了本发明的其他特定方面：
1.一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较，
其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则所述对象被预测为将发生难治性休克或被诊断为患有难治性休克。
2.根据实施方式1所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述休克选自由低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。
3.根据实施方式1和2所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中
·在心源性休克的情况下，所述对象可能已患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或其中所述对象患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者
·在低血容量休克的情况下，所述对象可能已患有出血性疾病包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂背景中的自发性出血，或非出血性疾病包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/不显性失水(例如烧伤、中暑)或胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤背景中的第三间隙体液丧失，或者
·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者
·在分布性休克的情况下，所述患者可能患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。
4.根据实施方式1至3所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法用于治疗的启动和/或终止和/或分层和/或指引。
5.根据实施方式1至4中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则治疗被启动和/或维持和/或暂停和/或终止。
6.根据实施方式5所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述治疗选自血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂和抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段。
7.根据实施方式1至6中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平被确定并与预定阈值进行比较，其中所述DPP3水平通过将所述体液样品与特异性结合DPP3的捕获结合剂相接触来确定。
8.根据实施方式1至7中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
9.根据实施方式1至7中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
10.根据实施方式8所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
11.根据实施方式8所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
12.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中当通过根据实施方式1-10中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
13.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中当通过根据实施方式1-10中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平，其中所述DPP3活性抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
14.根据实施方式13所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
15.根据实施方式14所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体选自血管紧张肽I、血管紧张肽II、血管紧张肽III、血管紧张肽IV，特别是血管紧张肽II。
16.一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当通过根据实施方式1-10中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
17.一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中当通过根据实施方式1-10中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平。
18.根据实施方式17所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
19.根据实施方式16-17所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管紧张肽受体激动剂和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
20.根据实施方式16-17所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
21.根据实施方式18所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
22.根据实施方式19所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
23.根据实施方式20和21所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
24.一种在已发生难治性休克的对象中预后结果和/或不良事件风险的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较；
·将所述对象中的所述DPP3水平与所述不良事件风险相关联，其中高于一定阈值的高水平预测了所述不良事件的风险提高，或
·将所述对象中的所述DPP3水平与疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了疗法或干预的成功。
实施例
实施例1–用于测量DPP 3蛋白和DPP3活性的方法
抗体的产生和DPP3结合能力的确定：产生了几种鼠类抗体，并在特异性结合测定法中筛选它们结合人类DPP3的能力(参见表1)。
用于免疫的肽/偶联物：
参见表1，合成了用于免疫的DPP3肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)，它们带有额外的N-端半胱氨酸残基(如果在所选的DPP3序列中不存在半胱氨酸的话)，用于将所述肽偶联到牛血清白蛋白(BSA)。使用Sulfolink偶联凝胶(Perbio-science,Bonn,Germany)将所述肽共价连接到BSA。偶联程序按照Perbio的手册进行。重组GST-hDPP3由USBio(United States Biological,Salem,MA,USA)生产。
小鼠的免疫、免疫细胞融合和筛选：
将Balb/c小鼠在第0天用84μg GST-hDPP3或100μg DPP3肽-BSA-偶联物(乳化在TiterMax Gold佐剂中)，在第14天用84μg或100μg(乳化在弗氏完全佐剂中)，并在第21和28天用42μg或50μg(在弗氏不完全佐剂中)腹膜内(i.p.)注射。在第49天，所述动物接受溶解在盐水中的42μg GST-hDPP3或50μg DPP3肽-BSA-偶联物的静脉内(i.v.)注射。三天后将小鼠处死并进行免疫细胞融合。
将来自于所述免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞用1ml 50％聚乙二醇在37℃融合30秒。在清洗后，将细胞接种在96孔培养板中。通过在HAT培养基[增补有20％胎牛血清和HAT增补剂的RPMI 1640培养基]中生长来选择杂交克隆。一周后，将所述HAT培养基用HT培养基代替，传代三次，然后返回到正常细胞培养基。
在融合后2周，首先筛选细胞培养上清液中重组的、结合DPP3的IgG抗体。因此，将重组的带有GST标签的hDPP3(USBiologicals,Salem,USA)固定化在96孔板中(100ng/孔)，并与每孔50μl细胞培养上清液在室温温育2小时。在洗板后，添加50μl/孔POD-兔抗小鼠IgG抗体，并在RT温育1h。在下一个清洗步骤后，向每个孔添加50μl发色团溶液(柠檬酸盐/磷酸氢盐缓冲液中的3.7mM邻苯二胺，0.012％H2O2)，在RT温育15分钟，并通过添加50μl 4N硫酸来终止生色反应。在490mm处检测吸光值。
将测试阳性的微量培养物转移到24孔板中用于繁殖。在重新测试后，使用有限稀释技术对所选的培养物进行克隆和再克隆，并确定亚型。
小鼠单克隆抗体生产
针对带有GST标签的人类DPP3或DPP3肽生成的抗体通过标准的抗体产生方法来产生(Marx等，1997)，并通过蛋白A纯化。根据SDS凝胶电泳分析，抗体纯度≥90％。
抗体的表征–与hDPP3和/或免疫肽的结合
为了分析不同抗体和抗体克隆对DPP3/免疫肽的结合能力，进行了结合测定法：
a)固相
将重组的带有GST标签的hDPP3(SEQ ID NO.1)或DPP3肽(免疫肽，SEQ ID NO.2)固定化在高结合性微量滴定板表面(96孔聚苯乙烯微孔板，Greiner Bio-One internationalAG,Austria，1μg/孔，在偶联缓冲液[50mM Tris，100mM NaCl，pH7,8]中，在RT下1h)。在用5％牛血清白蛋白阻断后，将微孔板真空干燥。
b)标记程序(示踪剂)
将100μg(100μl)不同的抗DPP3抗体(检测抗体，1mg/ml，在PBS中，pH 7.4)与10μl吖啶NHS酯(1mg/ml，在乙腈中；InVent GmbH,Germany；EP 0 353 971)混合，并在室温温育30min。标记的抗DPP3抗体在Shodex Protein 5μm KW-803(Showa Denko,Japan)上通过凝胶过滤HPLC进行纯化。将纯化的标记的抗体在测定缓冲液(50mmol/l磷酸钾，100mmol/lNaCl，10mmol/l Na2-EDTA，5g/l牛血清白蛋白，1g/l鼠类IgG，1g/l牛IgG，50μmol/l氨肽酶抑制剂，100μmol/l亮抑酶酞，pH 7.4)中稀释。终浓度为每200μl大约5-7*106相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。吖啶酯化学发光使用Centro LB 960发光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)测量。
c)hDPP3结合测定法
在板中装入200μl标记且稀释的检测抗体(示踪剂)，并在2-8℃温育2-4h。通过用350μl清洗液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗4次，除去未结合的示踪剂。孔结合的化学发光使用Centro LB 960发光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量。
抗体的表征–hDPP3抑制分析
为了分析不同抗体和抗体克隆的DPP3抑制能力，使用已知程序进行了DPP3活性测定法(Jones等，1982)。将重组的带有GST标签的hDPP3在测定缓冲液(25ng/ml GST-DPP3在50mM pH7,5的Tris-HCl中，和100μM ZnCl2)中稀释，并将200μl该溶液与10μg相应抗体在室温下温育。在预温育1小时后，向所述溶液添加产荧光底物Arg-Arg-βNA(20μl，2mM)，并使用Twinkle LB 970微孔板荧光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)在37℃监测游离βNA随时间的产生。βNA的荧光通过在340nm激发并在410nm测量发射来检测。计算不同样品的荧光增加的斜率(以RFU/min为单位)。将使用缓冲液对照的GST-hDPP3的斜率指定为100％活性。可能的捕获结合物的抑制能力被定义为通过与所述捕获结合物温育引起的GST-hDPP3活性的降低，以百分率为单位。
下面的表代表了一部分得到的抗体和它们的以相对光单位(RLU)表示的结合率以及它们的相对抑制能力(％；表1)。针对下述DPP3区生成的单克隆抗体，凭借它们结合重组DPP3和/或免疫肽的能力以及它们的抑制潜力进行选择。
针对带有GST标签的全长形式的重组hDPP3生成的所有抗体与固定化的带有GST标签的hDPP3均显示出强烈结合。针对SEQ ID NO.：2肽生成的抗体也与GST-hDPP3结合。所述SEQ ID NO.：2抗体也与免疫肽强烈结合。
Figure BDA0003520634770000751
表1：针对全长hDPP3或其序列生成的抗体、用RLU表示的它们结合hDPP3(SEQ IDNO.：1)或免疫肽(SEQ ID NO.：2)的能力以及重组GST-hDPP3的最大抑制的列表。
用于定量DPP3蛋白浓度的发光免疫测定法(DPP3-LIA)以及用于定量DPP3活性的酶捕获活性测定法(DPP3-ECA)的开发最近已被描述(Rehfeld等，2018.JALM.，付印中)，其整体通过参考并入本文。
实施例2-DPP3用于短期死亡率的预后
确定了脓毒症/脓毒性休克和心源性休克患者的血浆中的DPP3浓度，并将它们与所述患者的短期死亡率相关联。
研究组群–脓毒症/脓毒性休克
在来自于严重脓毒症和脓毒性休克中的肾上腺髓质素和结果(AdrenOSS)研究的患者的574个血浆样品中，测量了DPP3。AdrenOSS是一项前瞻性观察性多国研究，包括了583位因脓毒症或脓毒性休克而入住重症监护室的患者(Hollinger等，2018)。292位患者被诊断为脓毒性休克。
研究组群–心源性休克
对来自于108位被诊断为心源性休克的患者的血浆样品的DPP3进行筛查。血液在检测到心源性休克后6h内抽取。死亡率被跟踪7天。
hDPP3免疫测定法：
分别检测人类DPP3的量(LIA)或人类DPP3的活性(ECA)的免疫测定法(LIA)或活性测定法(ECA)被用于确定患者血浆中的DPP3水平。抗体固定化、标记和温育如Rehfeld等(Rehfeld等，2018)中所述来进行。
结果
脓毒症患者中的短期患者存活率与入院时的DPP3血浆浓度相关。DPP3血浆浓度高于40.5ng/mL(四分之三位数)的患者与DPP3血浆浓度低于该阈值的患者相比具有提高的死亡风险(图1A)。将该截止值应用于脓毒性休克患者的子组群，揭示出甚至更显著的与高DPP3血浆浓度相关的短期死亡风险(图1B)。当将相同的截止值用于心源性休克患者时，在具有高DPP3的患者中也观察到7天内短期死亡风险的提高(图1C)。
实施例3-人类本源DPP3的纯化
将人类红细胞裂解物施加在总共100ml Sepahrose 4B树脂(Sigma-Aldrich)上并收集穿流液。将树脂用总共370mL pH 7.4的PBS缓冲液清洗，并将洗出级分与收集的穿流液合并，得到2370mL的总体积。
对于免疫亲和纯化步骤来说，按照制造商的方案(GlycoLink固定化试剂盒，Thermo Fisher Scientific)将110mg单克隆抗hDPP3 mAb AK2552偶联到25.5mLUltraLink酰肼树脂(Thermo Fisher Scientific)。通过用Bradford技术对未偶联的抗体定量，确定偶联效率为98％。将所述树脂-抗体偶联物用10倍床体积的清洗-结合缓冲液(PBS，0.1％TritonX-100，pH 7.4)平衡，与2370mL澄清的红细胞裂解物合并，并在4℃和连续搅拌下温育2h。随后，将100mL温育混合物铺展在10个15mL聚丙烯柱上，并通过以1000xg离心30秒收集穿流液。将这个步骤重复几次，每个柱产生2.5mL装载有DPP3的树脂。使用重力流方法将每个柱用10mL清洗-结合缓冲液清洗5次。通过将每个柱放置在含有2mL中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 8.0)的15-mL falcon管中，然后每个柱添加10mL洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-HCl，0.1％TritonX-100，pH 3.5)并立即以1000xg离心30秒，将DPP3洗脱。所述洗脱步骤重复3次，总共得到360mL合并的洗脱液。所述中和的洗脱液的pH为8.0。
使用
Figure BDA0003520634770000772
Start系统(GE Healthcare)的样品泵将所述合并的洗脱液装载在用IEX缓冲液A1(100mM甘氨酸，150mM Tris，pH 8.0)平衡的5mL HiTrap Q-sephare HP柱(GEHealthcare)上。在载样后，将所述柱用5倍柱体积的IEX缓冲液A2(12mM NaH2PO4，pH 7.4)清洗，以除去未结合的蛋白质。通过使用IEX缓冲液B(12mM NaH2PO4，1M NaCl，pH 7.4)，在10个柱体积(50mL)内施加0–1M NaCl范围内的氯化钠梯度，实现DPP3的洗脱。以2mL的级分收集洗脱液。用于离子交换层析的缓冲液使用0.22μM瓶盖过滤器进行除菌过滤。
纯化表和每个步骤的相应得率和活性提供在表2中。图2示出了从人类红细胞裂解物纯化的本源hDPP3在梯度凝胶(4-20％)上的SDS-PAGE。
表2：从人类红细胞纯化DPP 3
Figure BDA0003520634770000771
a)所有级分中的相对DPP3量使用DPP3-LIA测定法来确定。起始原料中DPP3的量被设定为100％，并将纯化级分中剩余的DPP3量关联到所述起始原料。
b)总蛋白量使用Peterson改良的Lowry方法来确定(Peterson 1977.Analytical Biochemistry356:346-356)。
c)以每分钟转化的底物的μmol数为单位的总Arg2-βNA水解活性使用DPP3-ECA来确定，通过β-萘基胺(0,05-100μM)进行校准。
d)纯化得率从总Arg2-βNA水解活性计算。将起始原料中的Arg2-βNA水解活性设定为100％。
e)比活性被定义为每分钟每mg总蛋白转化的底物的μmol数。
f)纯化因子是每个纯化步骤之后和之前的比活性的商。
实施例4-本源DPP3在动物模型中的效应
通过监测缩短分数和肾阻力指数研究了本源hDPP3注射在健康小鼠中的效应。
将野生型Black 6小鼠(8-12周龄，组规模参考表3)驯化2周，并进行基线超声波心动描记术。将小鼠随机指派到两个组之一，随后对于DPP3蛋白来说使用600μg/kg的剂量通过眶后注射静脉内注射本源DPP3蛋白或PBS。
在DPP3或PBS注射后，在15、60和120分钟时通过超声波心动描记术评估心脏功能(Gao等，2011)，并通过肾阻力指数评估肾功能(Lubas等，2014,Dewitte等，2012)(图3)。
组 动物数目 治疗
WT+PBS 3 PBS
WT+DPP3 4 本源DPP3
表3：实验组列表
结果
用本源DPP3蛋白治疗的小鼠与注射PBS的对照组相比显示出显著减小的缩短分数(图4A)。WT+DPP3组还表现出恶化的肾功能，正如通过肾阻力指数提高所观察到的(图4B)。
实施例5–Procizumab的开发
对针对SEQ ID NO.2生成的抗体进行了更详细的表征(表位作图、结合亲和性、特异性、抑制潜力)。在这里，示出了SEQ ID NO.：2的克隆1967(AK1967；“Procizumab”)的结果作为实例。
AK1967在DPP3上的表位的确定：
为了对AK1967进行表位作图，合成了多个N-或C-端生物素化的肽(PE GmbH,Hennigsdorf,Germany)。这些肽包括完整免疫肽的序列(SEQ ID No.2)或其从C-或N-端逐步移除一个氨基酸的片段(肽的完整名单参见表5)。
将高结合性96孔板的每个孔用偶联缓冲液(500mM Tris-HCl，pH 7.8，100mMNaCl)中的2μg亲和素(Greiner Bio-One international AG,Austria)包被。然后将板清洗，并装入生物素化的肽的特定溶液(10ng/孔；缓冲液–含有0.5％BSA的1xPBS)。按照实施例1将抗DPP3抗体AK1967用化学发光标记物标记。
在板中装入200μl标记且稀释的检测抗体(示踪剂)，并在室温温育4h。通过用350μl清洗液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗4次，除去未结合的示踪剂。孔结合的化学发光使用Centro LB 960发光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量。AK1967与相应肽的结合通过评估相对光单位(RLU)来确定。显示出比AK1967的非特异性结合明显更高的RLU信号的任何肽，被定义为AK1967结合剂。结合性和非结合性肽的组合分析揭示出AK1967的特异性DPP3表位。
使用Octet确定结合亲和性：
所述实验使用Octet Red96(ForteBio)来进行。将AK1967捕获在动力学等级的抗人类Fc抗体(AHC)生物传感器上。然后将所述载样的生物传感器浸泡在重组的带有GST标签的人类DPP3的连续稀释液(100、33.3、11.1、3.7nM)中。观察120秒的结合，然后观察180秒的解离。用于所述实验的缓冲液描述在表4中。动力学分析使用1:1结合模型和全局拟合来进行。
缓冲液 组成
测定缓冲液 含有0.1％BSA、0.02％Tween-21的PBS
再生缓冲液 10mM甘氨酸缓冲液(pH 1.7)
中和缓冲液 含有0.1％BSA、0.02％Tween-21的PBS
表4：用于Octet测量的缓冲液
AK1967的结合特异性的Western印迹分析：
将来自于人类EDTA血液的血细胞清洗(3x，在PBS中)，在PBS中稀释，并通过重复的冻融循环裂解。所述血细胞裂解物具有250μg/ml的总蛋白浓度和10μg/ml的DPP3浓度。对血细胞裂解物的稀释液(1:40、1:80、1:160和1:320)和纯化的重组人类His-DPP3的稀释液(31.25-500ng/ml)进行SDS-PAGE和Western印迹。将所述印迹在1.)阻断缓冲液(含有5％脱脂奶粉的1xPBS-T)、2.)第一抗体溶液(在阻断缓冲液中1:2,000稀释的AK1967)和3.)HRP标记的第二抗体(山羊抗小鼠IgG抗体，在阻断缓冲液中1:1,000稀释)中温育。结合的第二抗体使用Amersham ECL Western印迹检测试剂和Amersham成像仪600UV(两者均来自于GEHealthcare)来检测。
DPP3抑制测定法：
为了分析AK1967的DPP3抑制能力，如实施例1中所述进行程序已知的DPP3活性测定法(Jones等，1982)。AK1967的抑制能力被定义为通过与所述抗体温育引起的GST-hDPP3活性的降低，以百分数为单位。得到的降低的DPP3活性示出在图1C中的抑制曲线中。
表位作图：
AK1967结合和不结合的肽的分析揭示出DPP3序列INPETG(SEQ ID No.：3)是AK1967结合所必需的表位(参见表5)。
Figure BDA0003520634770000811
表5：用于AK1967的表位作图的肽
结合亲和性：
AK1967以2.2*10-9M的亲和性与重组GST-hDPP3结合(动力学曲线参见图5)。
特异性和抑制潜力：
在血细胞裂解物中使用AK1967作为第一抗体检测到的唯一蛋白是80kDa处的DPP3(图6)。所述裂解物的总蛋白浓度为250μg/ml，而估算的DPP3浓度为约10μg/ml。尽管在裂解物中存在多25倍的非特异性蛋白，但AK1967特异性结合并检测DPP3，并且没有其他非特异性结合发生。
在特异性DPP3活性测定法中AK1967以约15ng/ml的IC50抑制15ng/ml DPP3(图7)。
嵌合化/人源化：
选择对DPP3活性具有70％抑制能力的单克隆抗体AK1967(“Procizumab”)作为可能的治疗性抗体，并且也用作嵌合化和人源化的模板。
鼠类抗体的人源化可以按照下述程序进行：
为了将鼠类起源的抗体人源化，分析抗体序列的构架区(FR)与互补决定区(CDR)和抗原的结构相互作用。在结构建模的基础上选择适合的人类起源的FR，并将鼠类CDR序列移植到所述人类FR中。可以在CDR或FR的氨基酸序列中引入变异以重新获得被所述FR序列的物种切换所废除的结构相互作用。这种结构相互作用的恢复可以使用噬菌体展示文库通过随机方法或通过由分子建模指导的定向方法来实现(Almagro和Fransson，2008，“抗体的 人源化”(Humanization of antibodies)，Front Biosci.13:1619-33)。
在上述情形中，可以将可变区连接到任何亚类的恒定区(IgG、IgM、IgE、IgA)或仅仅连接到支架、Fab片段、Fv、Fab和F(ab)2。在下面的实施例6和7中，使用具有IgG2a骨架的鼠类抗体变体。对于嵌合化和人源化来说，使用人类IgG1κ骨架。
对于表位结合来说，只有CDR是重要的。鼠类抗DPP3抗体(AK1967)的重链和轻链的CDR，对于重链来说分别示出在SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8中，对于轻链来说分别示出在SEQ ID No.9、序列KVS和SEQ ID No.10中。所述抗DPP3抗体(AK1967)的测序揭示出符合SEQ ID No.：11的抗体重链可变区(H链)和符合SEQ ID No.：12的抗体轻链可变区(L链)。
实施例6–Procizumab在脓毒性休克诱导的心力衰竭中的效应
在本实验中，通过监测缩短分数研究了在脓毒症诱导的心力衰竭大鼠(Rittirsch等，2009)中Procizumab注射的效应。
脓毒性休克的盲肠结扎穿刺(CLP)模型：
将来自于Centre d'élevage Janvier(法国)的雄性Wistar大鼠(2-3月龄，300至400g，组规模参考表6)随即指派到三个组之一。将所有动物使用盐酸氯胺酮(90mg/kg)和甲苯噻嗪(9mg/kg)腹膜内(i.p.)麻醉。为了诱导多微生物脓毒症，使用作出少量修改的Rittirsch方案进行CLP。制造腹部中线切口(1.5cm)以使盲肠外露。然后就在回盲瓣下方结扎盲肠，并用18号针头穿刺一次。然后将腹腔分两层封闭，然后进行液体复苏(皮下注射3毫升/100克体重的盐水)，并将动物放回笼子。假手术组动物经历手术而没有穿刺盲肠。将CLP动物在安慰剂和治疗性抗体组之间随机分配。
研究设计：
研究流程如图8中所描绘。在CLP或假手术后，允许动物休息20小时并自由取用水和食物。然后将它们麻醉，进行气管切开术，并进行动脉和静脉管线铺放。在CLP手术后24小时，将AK1967或介质(盐水)以5mg/kg的剂量作为快速浓注给药，然后以7.5mg/kg的剂量进行3h输注。作为安全措施，从t＝0直至3h，对血液动力学进行有创且连续的监测。
在t＝0(基线)时，所有CLP动物处于脓毒性休克中，并发生心脏功能降低(低血压、低缩短分数)。在这个时间点注射(i.v.)Procizumab或介质(PBS)并开始盐水输注。存在1个对照组和2个CLP组，它们被概述在下面的表(表6)中。在实验结束时，将动物安乐死并收获器官用于后续分析。
组 动物数目 CLP 治疗
假手术 7 否 PBS
CLP-PBS 6 是 PBS
CLP-PCZ 4 是 PCZ
表6：实验组列表
有创血压：
血液动力学变量使用AcqKnowledge系统(BIOPAC Systems,Inc.,USA)获得。它提供了全自动血压分析系统。导管通过压力传感器连接到BIOPAC系统。
对于所述程序来说，将大鼠麻醉(氯胺酮和甲苯噻嗪)。将动物移动到加热垫上，以获得37–37.5℃的所需体温。将温度反馈探头插入到直肠中。将大鼠以仰卧位放置在手术台上。在不损伤颈动脉和迷走神经的情况下，将气管打开并插入用于外部呼吸机的导管(16G)。将动脉导管插入右颈动脉中。在结扎前将颈动脉与迷走神经分开。通过左颈静脉插入中央静脉导管，以允许PCZ或PBS的给药。
在手术后，在血流动力学测量之前允许动物休息以达到稳定条件。然后记录基线血压(BP)。在数据收集期间，停止通过动脉管线的盐水输注。
超声波心动描记术：
使用盐酸氯胺酮麻醉动物。将胸部剃毛，并将大鼠以卧位放置。对于经胸超声波心动描记(TTE)检查来说，使用装备有高频(14-MHz)线性探头和10-MHz心脏探头的商用GEHealthcare Vivid 7超声波系统。所有检查均以数字方式记录并存储，用于后续的离线分析。
在2厘米的深度记录灰度图像。在胸骨旁长轴视图中开始二维检查，以测量主动脉瓣环直径和肺动脉直径。也使用M-模式测量左心室(LV)维度并评估缩短分数(FS％)。LVFS被计算为LV舒张末期直径-LV收缩末期直径/LV舒张末期直径，并以％表示。因此，LV直径最大之时被定义为舒张末期的时间。因此，收缩末期被定义为在同一心脏周期中的最小直径。所有参数均手动测量。每个测量值是三个心脏周期的平均值。
从相同的胸骨旁长轴视图，使用脉冲波多普勒记录肺动脉血流。测量肺动脉流出的速度时间积分。
从心尖五腔视图，在二尖瓣尖端高度处使用脉冲多普勒记录二尖瓣血流。
结果：
用PBS治疗的脓毒性休克诱导的心力衰竭大鼠(CLP+PBS)与假手术组动物相比显示出减小的缩短分数(图9A)。CLP+PBS组也显示出高死亡率(图9B)。相反，向脓毒性休克诱导的心力衰竭大鼠施用Procizumab改善了缩短分数(图9A)，并急剧降低死亡率(图9B)。
实施例7-Procizumab对心脏和肾功能的效应
通过监测缩短分数和肾阻力指数，在小鼠中研究了Procizumab在异丙肾上腺素诱导的心力衰竭中的效应。
小鼠中异丙肾上腺素诱导的心脏应激：
在3月龄雄性小鼠中，通过每日皮下注射300mg/kg异丙肾上腺素这种非特异性β-肾上腺素能激动剂(DL-异丙肾上腺素盐酸盐，Sigma Chemical Co)(ISO)共两日，诱导了急性心力衰竭(Vergaro等，2016)。ISO稀释在NaCl 0.9％中进行。将ISO处理的小鼠随机指派到两个组(表7)，在基线超声波心动描记术后静脉内注射PBS或Procizumab(10mg/kg)(Gao 等，2011)，并在第3天进行肾阻力指数测量(Lubas等，2014；Dewitte等，2012)(图10A和B)。
在1小时、6小时和24小时，通过超声波心动描记术(Gao等，2011)并通过肾阻力指数(Lubas等，2014；Dewitte等，2012)评估心脏功能(图10A和B)。注射介质(PBS)代替异丙肾上腺素的小鼠组不进行进一步药理学处理，并充当对照组(表7)。
组 动物数目 治疗
假手术+PBS 27 PBS
心力衰竭+PBS 15 PBS
心力衰竭+PCZ 20 Procizumab(PCZ)
表7：实验组列表
结果：
向异丙肾上腺素诱导的心力衰竭小鼠施用Procizumab，在给药后第一个小时内恢复了心脏功能(图11A)。在Procizumab注射后6小时患病小鼠的肾功能显示出显著改善，并且在24小时时与假手术动物的肾功能相当(图11B)。
实施例8-DPP3指示对血管加压药的需要和对血管加压药疗法的反应
使用hDPP3免疫测定法确定脓毒性休克患者的血浆中的DPP3浓度，并将它们与对血管加压药疗法的需要相关联。
研究组群–脓毒性休克
对来自于AdrenOSS(参见实施例2)研究的292位被诊断为脓毒性休克的患者的血浆样品的DPP3进行筛查。人类DPP3如实施例1中所述来测量。
结果
对超过5天的血管加压药给药的需求提高的患者具有高的血浆DPP3浓度(图12A)。相比之下，对血管加压药给药做出响应并且其中血管加压药给药可以在前5天内中断的患者具有显著降低的血浆DPP3浓度(图12B)。这表明难治性休克的发生以及因此由于对这种疗法的响应降低而对血管加压药给药的需求提高，与脓毒性休克患者中的高DPP3血浆浓度相关。
血管加压药耐药性难治性脓毒性休克(去甲肾上腺素>0.5μg/kg/min)患者与需要剂量<0.5μg/kg/min的去甲肾上腺素的患者相比显示出明显更高的血浆DPP3浓度(p<0.001)(图16A)。此外，在血管加压药耐药性难治性脓毒性休克患者中，DPP3血浆浓度与死亡率强相关(图16B)。
实施例9–DPP3与难治性休克相关
使用hDPP3免疫测定法确定心源性休克患者的血浆中的DPP3浓度，并将它们与难治性休克的发生相关联。
研究组群–心源性休克
对来自于57位被诊断为急性心肌梗塞后心源性休克的患者的血浆样品的DPP3进行筛查。人类DPP3如实施例1中所述来测量。
结果
在入院时DPP3血浆浓度高于一定阈值(59.1ng/ml；四分之三位数)的患者与DPP3血浆浓度低于59.1ng/ml的患者(12％)相比以更高的程度(47％)发生难治性休克(图13)。
实施例10–DPP3和bio-ADM指示休克中的短期死亡率
使用hDPP3和bio-ADM免疫测定法确定脓毒性休克患者的血浆中的DPP3和bio-ADM浓度，并将它们与所述患者的短期死亡率相关联。
研究组群–脓毒性休克
对来自于AdrenOSS研究的292位被诊断为脓毒性休克的患者的血浆样品的DPP3和bio-ADM进行筛查。人类DPP3如实施例1中所述来测量。Bio-ADM如Weber等(Weber等， 2017.JALM 2(2):1-4)中所述来测量。
结果
测量了脓毒性休克患者中bio-ADM和DPP3的血浆浓度。将患者根据被确定为是相应标志物的所有实测血浆浓度的四分之三位数(表8)的特定截止值进行分组。数量相等的患者仅具有高DPP3或仅具有高bio-ADM(15.4％)，而程度更低的患者显示出bio-ADM和DPP3两者的升高的血浆浓度(9.6％)。
低DPP3(<48.4ng/ml) 高DPP3(>48.4ng/ml)
低bio-ADM(<213pg/mL) 174(59.6％) 45(15.4％)
高bio-ADM(>213pg/mL) 45(15.4％) 28(9.6％)
表8：具有低/高DPP3和低/高bio-ADM的患者的数目。两者的截止值在Q3(最高的25％)的基础上指定。
将入院后前4周内的死亡率与入院时的bio-ADM和DPP3浓度相关联。仅具有高bio-ADM血浆浓度或仅具有高DPP3血浆浓度的患者与具有低于一定阈值(四分之三位数)的bio-ADM(图14A)或DPP3(图14B)血浆浓度的患者相比具有显著提高的在前4周内死亡的风险。具有高bio-ADM的患者的存活率好于具有高DPP3的患者的存活率。
当将两种标志物bio-ADM和DPP3组合时，与两种标志物中的仅仅一者的提高相关的死亡率相比，鉴定到甚至更高的短期死亡风险(图14C)。仅仅28.6％的具有高bio-ADM和高DPP3血浆浓度的患者在入院后前4周存活。
实施例11–DPP3和bio-ADM DPP3指示对血管加压药的需要和对血管加压药疗法的 反应
使用hDPP3和bio-ADM免疫测定法确定脓毒性休克患者的血浆中的DPP3和bio-ADM浓度，并将它们与对血管加压药的需求相关联。
研究组群–脓毒性休克
在来自于AdrenOSS研究的292位被诊断为脓毒性休克的患者的血浆样品中，测量了DPP3和bio-ADM浓度。人类DPP3如实施例1中所述来测量。Bio-ADM如Weber等(Weber等， 2017.JALM2(2):1-4)中所述来测量。
结果
测量了脓毒性休克患者中bio-ADM和DPP3的血浆浓度。将患者根据被确定为是脓毒性休克组群中相应标志物的所有实测血浆浓度的四分之三位数的特定截止值进行分组(低DPP3<48.4ng/mL，低bio-ADM<213pg/mL；高bio-ADM≥213pg/mL；高DPP3≥48.4ng/mL)。
具有高DPP3但低bio-ADM血浆浓度的患者与具有低DPP3+低bio-ADM或低DPP3+高bio-ADM的患者相比对连续血管加压药给药具有更高的需求(图15；表9)。相比之下，在入院时具有低DPP3和低bio-ADM血浆浓度的患者或具有低DPP3但高bio-ADM血浆浓度的患者与入院时具有高DPP3血浆浓度的患者相比可以更早地中断血管加压药给药(图15；表9)。这表明与具有高DPP3的脓毒性休克患者相比，在具有高bio-ADM的脓毒性休克患者中血管加压药疗法由于更好的治疗反应可以被更早地中断。这些患者(高DPP3)由于不应性而需要更长的使用血管加压药的治疗。
Figure BDA0003520634770000901
表9：将需要血管加压药的患者根据他们入院时的DPP3和bio-ADM血浆浓度进行分组。两者的截止值在Q3(测定值的最高的25％)的基础上指定；低DPP3<48.4ng/mL，低bio-ADM<213pg/mL；高bio-ADM≥213pg/mL；高DPP3≥48.4ng/mL；7：使用血管加压药≥7天或在7天内死亡。
序列实例
SEQ ID No.1–hDPP3 aa 1-737
MADTQYILPNDIGVSSLDCREAFRLLSPTERLYAYHLSRAAWYGGLAVLLQTSPEAPYIYALLSRLFRAQDPDQLRQHALAEGLTEEEYQAFLVYAAGVYSNMGNYKSFGDTKFVPNLPKEKLERVILGSEAAQQHPEEVRGLWQTCGELMFSLEPRLRHLGLGKEGITTYFSGNCTMEDAKLAQDFLDSQNLSAYNTRLFKEVDGEGKPYYEVRLASVLGSEPSLDSEVTSKLKSYEFRGSPFQVTRGDYAPILQKVVEQLEKAKAYAANSHQGQMLAQYIESFTQGSIEAHKRGSRFWIQDKGPIVESYIGFIESYRDPFGSRGEFEGFVAVVNKAMSAKFERLVASAEQLLKELPWPPTFEKDKFLTPDFTSLDVLTFAGSGIPAGINIPNYDDLRQTEGFKNVSLGNVLAVAYATQREKLTFLEEDDKDLYILWKGPSFDVQVGLHELLGHGSGKLFVQDEKGAFNFDQETVINPETGEQIQSWYRSGETWDSKFSTIASSYEECRAESVGLYLCLHPQVLEIFGFEGADAEDVIYVNWLNMVRAGLLALEFYTPEAFNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGLVTITPTTGSDGRPDARVRLDRSKIRSVGKPALERFLRRLQVLKSTGDVAGGRALYEGYATVTDAPPECFLTLRDTVLLRKESRKLIVQPNTRLEGSDVQLLEYEASAAGLIRSFSERFPEDGPELEEILTQLATADARFWKGPSEAPSGQA
SEQ ID No.2–hDPP3 aa 474-493(N-Cys)–具有额外的N-端半胱氨酸的免疫肽
CETVINPETGEQIQSWYRSGE
SEQ ID No.3–hDPP3 aa 477-482–AK1967的表位
INPETG
SEQ ID No.4–鼠类AK1967重链可变区
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTISRDTSNNQVFLKIASVVTADTGTYFCARNYSYDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID No.5–鼠类AK1967轻链可变区
DVVVTQTPLSLSVSLGDPASISCRSSRSLVHSIGSTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID No.6–鼠类AK1967重链的CDR1
GFSLSTSGMS
SEQ ID No.7–鼠类AK1967重链的CDR2
IWWNDNK
SEQ ID No.8–鼠类AK1967重链的CDR 3
ARNYSYDY
SEQ ID No.9–鼠类AK1967轻链的CDR1
RSLVHSIGSTY
鼠类AK1967轻链的CDR2
KVS
SEQ ID No.10-鼠类AK1967轻链的CDR3
SQSTHVPWT
SEQ ID No.11–人源化AK1967–重链序列(IgG1κ骨架)
MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTGTYYCARNYSYDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID No.12–人源化AK1967–轻链序列(IgG1κ骨架)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSRSLVHSIGSTYLYWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No.13–血管紧张肽II(同义语：5-异亮氨酸-血管紧张肽II)
DRVYIHPF
SEQ ID No.14–血管紧张肽II类似物(5-缬氨酸-血管紧张肽II)
DRVYVHPF
SEQ ID No.15–血管紧张肽II类似物(Asn1-Phe4)
NRVFIHPF
SEQ ID No.16–血管紧张肽II六肽
VYIHPF
SEQ ID No.17–血管紧张肽II九肽
NRVYYVHPF
SEQ ID No.18–血管紧张肽II类似物([Asn1-Ile5-Ile8]-血管紧张肽II)
NRVYIHPI
SEQ ID No.19–血管紧张肽II类似物([Asn1-Ile5-Ala8]-血管紧张肽II)
NRVYIHPA
SEQ ID No.20–血管紧张肽II类似物([Asn1-二碘代Tyr4-Ile5]-血管紧张肽II
NRVYIHPF
SEQ ID No.21–血管紧张肽III
RVYIHPF
SEQ ID No.22–血管紧张肽III类似物(Val4-血管紧张肽III)
RVYVHPF
SEQ ID No.23-血管紧张肽III类似物(Phe3-血管紧张肽III)
RVFIHPF
SEQ ID No.24–血管紧张肽III类似物([Ile4-Ala7]-血管紧张肽III)
RVYIHPA
SEQ ID No.25–血管紧张肽III类似物(二碘代Tyr3-Ile4]-血管紧张肽III)
RVYIHPF
SEQ ID No.26–血管紧张肽IV
VYIHPF
SEQ ID No.27–血管紧张肽IV类似物(Val3-血管紧张肽IV)
VYVHPF
SEQ ID No.28–血管紧张肽IV类似物(Phe2-血管紧张肽IV)
VFIHPF
SEQ ID No.29-血管紧张肽IV类似物([Ile3-Ala6]-血管紧张肽IV)
VYIHPA
SEQ ID No.30-血管紧张肽IV类似物([二碘代Tyr2-Ile3-血管紧张肽IV)
VYIHPF
SEQ ID No.31(proADM)：164个氨基酸(前肾上腺髓质素原的第22–185位)
ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSPEDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID No.32(肾上腺髓质素原N-20末端肽，PAMP)：前肾上腺髓质素原的第22–41位氨基酸
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID No.33(中段肾上腺髓质素原，MR-proADM)：前肾上腺髓质素原的第45–92位氨基酸
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID No.34(成熟肾上腺髓质素(成熟ADM)；酰胺化ADM；bio-ADM；hADM)：第95–146位氨基酸-CONH2
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY-CONH2
SEQ ID No.35(肾上腺髓质素1-52-Gly(ADM 1-52-Gly))：前肾上腺髓质素原的第95–147位氨基酸
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
SEQ ID No.36(C-端肾上腺髓质素原，CT-proADM)：前肾上腺髓质素原的第148–185位氨基酸
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID No.37(成熟ADM的N-端部分)：成熟ADM的第1-21位氨基酸
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
SEQ ID No.38(抗ADM抗体的重链CDR1)
GYTFSRYW
SEQ ID No.39(抗ADM抗体的重链CDR2)
ILPGSGST
SEQ ID No.40(抗ADM抗体的重链CDR3)
TEGYEYDGFDY
SEQ ID No.41(抗ADM抗体的轻链CDR1)
QSIVYSNGNTY
SEQ ID No.42(抗ADM抗体的轻链CDR3)
FQGSHIPYT
SEQ ID No.43(抗ADM抗体(Adrecizumab)重链)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：44(抗ADM抗体(Adrecizumab)轻链)
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
附图说明
图1：与低(<40.5ng/mL)和高(≥40.5ng/mL)DPP3浓度相关的Kaplan-Meyer存活率图。(A)与DPP3血浆浓度相关的脓毒症患者的7天存活率；(B)与DPP3血浆浓度相关的心源性休克患者的7天存活率；(C)与DPP3血浆浓度相关的脓毒性休克患者的7天存活率。
图2：从人类红细胞裂解物纯化的本源hDPP3在梯度凝胶(4-20％)上的SDS-PAGE。分子量标志物用箭头指示。
图3：实验设计-本源DPP3在动物模型中的效应。
图4：(A)DPP3注射引起缩短分数降低，并因此导致心脏功能恶化。(B)通过肾阻力指数提高也观察到肾功能降低。
图5：使用Octet的AK1967-DPP3结合分析的结合和解离曲线。将装载有AK1967的生物传感器浸泡在重组的带有GST标签的人类DPP3的连续稀释液(100、33.3、11.1、3.7nM)中，并监测结合和解离。
图6：使用AK1967作为第一抗体的血细胞裂解物稀释液的Western印迹和DPP3的检测。
图7：来自于血细胞的本源DPP3的使用抑制性抗体AK1967的抑制曲线。DPP被特异性抗体的抑制是浓度依赖性的，当针对15ng/ml DPP3进行分析时IC50为～15ng/ml。
图8：实验设置–Procizumab在脓毒症诱导的心力衰竭中的效应。
图9：在脓毒症诱导的心力衰竭大鼠中Procizumab急剧改善缩短分数(A)和死亡率(B)。
图10：实验设计–小鼠中异丙肾上腺素诱导的心脏应激和随后的Procizumab治疗(B)和对照(A)。
图11：在异丙肾上腺素诱导的心力衰竭小鼠中，在给药后1小时和6小时内Procizumab分别改善缩短分数(A)和降低肾阻力指数(B)。
图12：(A)在脓毒性休克患者中需要血管加压药疗法的天数与DPP3血浆浓度的关联。使用血管加压药≥7天或在7天内死亡；*p<0.05，在相对于第1-4组的事后比较中。(B)在脓毒性休克患者中对血管加压药疗法的需求与DPP3血浆浓度的关联。将使用血管加压药疗法最多5天(≤5)的患者和使用血管加压药疗法长于5天或在7天内死亡的患者一起(>5)分组。
图13：DPP3与难治性休克的关联。与DPP3血浆浓度低于一定阈值的患者相比，心源性休克患者的血浆中的高DPP3浓度与发生难治性心源性休克的较高风险相关。
图14：Kaplan-Meier存活率图(A)脓毒性休克患者的4周存活率与bio-ADM血浆浓度的关联；值按照四分位数分组；(B)脓毒性休克患者的4周存活率与DPP3血浆浓度的关联；值按照四分位数分组；(C)脓毒性休克患者的4周存活率与bio-ADM和DPP3血浆浓度的关联；截止值在相应标志物的所有实测血浆浓度的四分之三位数的基础上确定：低DPP3<48.4ng/mL，低bio-ADM<213pg/mL；高bio-ADM≥213pg/mL；高DPP3≥48.4ng/mL。
图15：需要血管加压药的患者根据他们在入院时的DPP3和bio-ADM血浆浓度进行分组。接受血管加压药1-7天的患者的比例用灰度示出——更浅的颜色代表更长的治疗持续时间。两者的截止值在Q3(测定值的最高25％)的基础上指定；低DPP3<48.4ng/mL，低bio-ADM<213pg/mL；高bio-ADM≥213pg/mL；高DPP3≥48.4ng/mL；7：使用血管加压药≥7天或在7天内死亡。
图16：(A)需要低于(n＝186)和高于(n＝95)0.5μg/kg/min的血管加压药去甲肾上腺素的脓毒性难治性休克患者中的血浆DPP3浓度(p<0.001)。(B)Kaplan-Meier存活率图(A)脓毒性难治性休克患者的4周存活率与DPP3血浆浓度的关联；值按照四分位数分组。
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序列表
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<120> 用于治疗休克的疗法指引和/或疗法监测
<130> T75093WO
<150> EP19194729.0
<151> 2019-08-30
<150> EP19201098.1
<151> 2019-10-02
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 737
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Ala Asp Thr Gln Tyr Ile Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Ser Ser
1 5 10 15
Leu Asp Cys Arg Glu Ala Phe Arg Leu Leu Ser Pro Thr Glu Arg Leu
20 25 30
Tyr Ala Tyr His Leu Ser Arg Ala Ala Trp Tyr Gly Gly Leu Ala Val
35 40 45
Leu Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ala Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Ser
50 55 60
Arg Leu Phe Arg Ala Gln Asp Pro Asp Gln Leu Arg Gln His Ala Leu
65 70 75 80
Ala Glu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Phe Leu Val Tyr Ala
85 90 95
Ala Gly Val Tyr Ser Asn Met Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Gly Asp Thr
100 105 110
Lys Phe Val Pro Asn Leu Pro Lys Glu Lys Leu Glu Arg Val Ile Leu
115 120 125
Gly Ser Glu Ala Ala Gln Gln His Pro Glu Glu Val Arg Gly Leu Trp
130 135 140
Gln Thr Cys Gly Glu Leu Met Phe Ser Leu Glu Pro Arg Leu Arg His
145 150 155 160
Leu Gly Leu Gly Lys Glu Gly Ile Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Cys
165 170 175
Thr Met Glu Asp Ala Lys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Asp Ser Gln Asn
180 185 190
Leu Ser Ala Tyr Asn Thr Arg Leu Phe Lys Glu Val Asp Gly Glu Gly
195 200 205
Lys Pro Tyr Tyr Glu Val Arg Leu Ala Ser Val Leu Gly Ser Glu Pro
210 215 220
Ser Leu Asp Ser Glu Val Thr Ser Lys Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Arg
225 230 235 240
Gly Ser Pro Phe Gln Val Thr Arg Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Leu Gln
245 250 255
Lys Val Val Glu Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser
260 265 270
His Gln Gly Gln Met Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Gln Gly
275 280 285
Ser Ile Glu Ala His Lys Arg Gly Ser Arg Phe Trp Ile Gln Asp Lys
290 295 300
Gly Pro Ile Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe Ile Glu Ser Tyr Arg Asp
305 310 315 320
Pro Phe Gly Ser Arg Gly Glu Phe Glu Gly Phe Val Ala Val Val Asn
325 330 335
Lys Ala Met Ser Ala Lys Phe Glu Arg Leu Val Ala Ser Ala Glu Gln
340 345 350
Leu Leu Lys Glu Leu Pro Trp Pro Pro Thr Phe Glu Lys Asp Lys Phe
355 360 365
Leu Thr Pro Asp Phe Thr Ser Leu Asp Val Leu Thr Phe Ala Gly Ser
370 375 380
Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Gln
385 390 395 400
Thr Glu Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Gly Asn Val Leu Ala Val Ala
405 410 415
Tyr Ala Thr Gln Arg Glu Lys Leu Thr Phe Leu Glu Glu Asp Asp Lys
420 425 430
Asp Leu Tyr Ile Leu Trp Lys Gly Pro Ser Phe Asp Val Gln Val Gly
435 440 445
Leu His Glu Leu Leu Gly His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Val Gln Asp
450 455 460
Glu Lys Gly Ala Phe Asn Phe Asp Gln Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu
465 470 475 480
Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp Tyr Arg Ser Gly Glu Thr Trp Asp
485 490 495
Ser Lys Phe Ser Thr Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Glu Cys Arg Ala Glu
500 505 510
Ser Val Gly Leu Tyr Leu Cys Leu His Pro Gln Val Leu Glu Ile Phe
515 520 525
Gly Phe Glu Gly Ala Asp Ala Glu Asp Val Ile Tyr Val Asn Trp Leu
530 535 540
Asn Met Val Arg Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Phe Tyr Thr Pro Glu
545 550 555 560
Ala Phe Asn Trp Arg Gln Ala His Met Gln Ala Arg Phe Val Ile Leu
565 570 575
Arg Val Leu Leu Glu Ala Gly Glu Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Thr
580 585 590
Thr Gly Ser Asp Gly Arg Pro Asp Ala Arg Val Arg Leu Asp Arg Ser
595 600 605
Lys Ile Arg Ser Val Gly Lys Pro Ala Leu Glu Arg Phe Leu Arg Arg
610 615 620
Leu Gln Val Leu Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Gly Gly Arg Ala Leu
625 630 635 640
Tyr Glu Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Pro Pro Glu Cys Phe Leu
645 650 655
Thr Leu Arg Asp Thr Val Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Lys Leu Ile
660 665 670
Val Gln Pro Asn Thr Arg Leu Glu Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu
675 680 685
Tyr Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ile Arg Ser Phe Ser Glu Arg Phe
690 695 700
Pro Glu Asp Gly Pro Glu Leu Glu Glu Ile Leu Thr Gln Leu Ala Thr
705 710 715 720
Ala Asp Ala Arg Phe Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ala Pro Ser Gly Gln
725 730 735
Ala
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Cys Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp
1 5 10 15
Tyr Arg Ser Gly Glu
20
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Ile Asn Pro Glu Thr Gly
1 5
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 4
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 5
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Ile Gly Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 6
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 7
Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 8
Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 9
Arg Ser Leu Val His Ser Ile Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 10
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 11
<211> 469
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg
50 55 60
Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn
65 70 75 80
Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr
85 90 95
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp
100 105 110
Pro Val Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly
465
<210> 12
<211> 239
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser
20 25 30
Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Arg Ser
35 40 45
Leu Val His Ser Ile Gly Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
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130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
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Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
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Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽II变体
<400> 14
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1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽II变体
<400> 15
Asn Arg Val Phe Ile His Pro Phe
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Val Tyr Ile His Pro Phe
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Asn Arg Val Tyr Tyr Val His Pro Phe
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽II类似物
<400> 18
Asn Arg Val Tyr Ile His Pro Ile
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽II类似物
<400> 19
Asn Arg Val Tyr Ile His Pro Ala
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽II类似物
<400> 20
Asn Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽III类似物
<400> 22
Arg Val Tyr Val His Pro Phe
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽III类似物
<400> 23
Arg Val Phe Ile His Pro Phe
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽III类似物
<400> 24
Arg Val Tyr Ile His Pro Ala
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽III类似物
<400> 25
Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Val Tyr Ile His Pro Phe
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽IV类似物
<400> 27
Val Tyr Val His Pro Phe
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽IV类似物
<400> 28
Val Phe Ile His Pro Phe
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽IV类似物
<400> 29
Val Tyr Ile His Pro Ala
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 血管紧张肽IV类似物
<400> 30
Val Tyr Ile His Pro Phe
1 5
<210> 31
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro
20 25 30
Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg
35 40 45
Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro
50 55 60
Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn
65 70 75 80
Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val
85 90 95
Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp
100 105 110
Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg
115 120 125
Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser
130 135 140
Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala
145 150 155 160
Pro His Phe Leu
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg
20
<210> 33
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20 25 30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35 40 45
<210> 34
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-端酰胺(CONH2)
<400> 34
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 35
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-端处带有甘氨酸
<400> 35
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Tyr Gly
50
<210> 36
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro His Phe Leu
35
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 43
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 44
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 44
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (25)

1.一种在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较，
其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则所述对象被预测为将发生难治性休克或被诊断为患有难治性休克。
2.根据权利要求1所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述休克选自由低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。
3.根据权利要求1或2所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述休克是血管加压药耐药性休克。
4.根据权利要求1至3所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中
·在心源性休克的情况下，所述对象可能已患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或其中所述对象患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者
·在低血容量休克的情况下，所述对象可能已患有出血性疾病包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂背景中的自发性出血，或非出血性疾病包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/不显性失水(例如烧伤、中暑)或胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤背景中的第三间隙体液丧失，或者
·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者
·在分布性休克的情况下，所述患者可能已患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。
5.根据权利要求1至4所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述方法用于治疗的启动和/或终止和/或分层和/或指引。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则治疗被启动和/或维持和/或暂停和/或终止。
7.根据权利要求6所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中所述治疗选自血管加压药、血管紧张肽受体激动剂和/或其前体、DPP3活性抑制剂和抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平被确定并与预定阈值进行比较，其中所述DPP3水平通过将所述体液样品与特异性结合DPP3的捕获结合剂相接触来确定。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中当所述样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
11.根据权利要求9所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
12.根据权利要求9所述的在将发生休克或已发生休克的对象中预测或诊断难治性休克的方法，其中如果所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值并且所述确定的DPP3水平高于DPP3的所述预定阈值，则启动和/或继续使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段和/或血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
13.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的血管加压药，其中当通过根据权利要求1-11中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
14.一种用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中当通过根据权利要求1-11中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平，其中所述DPP3活性抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。
15.根据权利要求14所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
16.根据权利要求15所述的用于在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的DPP3活性抑制剂，其中所述血管紧张肽受体激动剂和/或其前体选自血管紧张肽I、血管紧张肽II、血管紧张肽III、血管紧张肽IV，特别是血管紧张肽II。
17.一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当通过根据权利要求1-11中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有低于预定阈值的DPP3水平。
18.一种在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中当通过根据权利要求1-11中的任一项所述的方法确定时，所述对象在所述对象的体液样品中具有高于预定阈值的DPP3水平。
19.根据权利要求18所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂与血管紧张肽受体激动剂和/或其前体联合给药。
20.根据权利要求17-18所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中当所述对象的样品中的DPP3水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管紧张肽受体激动剂和/或DPP3活性抑制剂的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平高于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管加压药的治疗。
21.根据权利要求17-18所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中当所述对象的体液样品中的DPP3水平低于一定阈值时，启动和/或继续使用所述血管加压药的治疗，和/或其中如果所述确定的DPP3水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂的治疗。
22.根据权利要求19所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管紧张肽受体激动剂和/或其前体和/或DPP3活性抑制剂，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
23.根据权利要求20所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药血管加压药，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
24.根据权利要求21和22所述的在将发生休克或已发生休克的对象中治疗休克的方法，所述方法包括向所述对象给药抗ADM抗体或抗ADM抗体片段，其中另外还确定肾上腺髓质素原或其片段的水平，并且其中当所述样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平高于一定阈值时，启动和/或继续使用所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗，和/或其中如果所述确定的肾上腺髓质素原或其片段的水平低于所述预定阈值，则暂停和/或终止使用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段的治疗。
25.一种在已发生难治性休克的对象中预后结果和/或不良事件风险的方法，其中所述方法包括下述步骤：
·确定所述对象的体液样品中的DPP3水平；
·将所述确定的DPP3水平与预定阈值进行比较；
·将所述对象中的所述DPP3水平与所述不良事件风险相关联，其中高于一定阈值的高水平预测了所述不良事件的风险提高，或
·将所述对象中的所述DPP3水平与疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了疗法或干预的成功。
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