RU2771824C2 - Способы определения dpp3 и терапевтические способы - Google Patents
Способы определения dpp3 и терапевтические способы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2771824C2 RU2771824C2 RU2018140832A RU2018140832A RU2771824C2 RU 2771824 C2 RU2771824 C2 RU 2771824C2 RU 2018140832 A RU2018140832 A RU 2018140832A RU 2018140832 A RU2018140832 A RU 2018140832A RU 2771824 C2 RU2771824 C2 RU 2771824C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dpp3
- antibody
- activity
- arg
- disease
- Prior art date
Links
- 101700019464 DPP3 Proteins 0.000 title claims abstract description 417
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 7
- 102100014976 DPP3 Human genes 0.000 claims abstract description 421
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims abstract description 217
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 217
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 136
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 116
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 80
- 230000001338 necrotic Effects 0.000 claims abstract description 70
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 60
- 206010007556 Cardiac failure acute Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 101710006307 MVA110L Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 101710042748 UL80 Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 206010007554 Cardiac failure Diseases 0.000 claims abstract description 50
- 206010019280 Heart failure Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 206010038436 Renal failure acute Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 208000010125 Myocardial Infarction Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 208000007903 Liver Failure Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 claims abstract description 15
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 206010000565 Acquired immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000000813 microbial Effects 0.000 claims abstract description 10
- 206010051379 Systemic inflammatory response syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010003816 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 206010039911 Seizure Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 201000011528 vascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 117
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 117
- 210000001124 Body Fluids Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 48
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001218 Blood-Brain Barrier Anatomy 0.000 claims description 5
- 240000006225 Blighia sapida Species 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 abstract 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 86
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 86
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 68
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 57
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 55
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 41
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 38
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 23
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 22
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 21
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 19
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 14
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 14
- 102100002857 PDYN Human genes 0.000 description 13
- 102100008873 POMC Human genes 0.000 description 13
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 239000002609 media Substances 0.000 description 13
- -1 4-methoxy-β-naphthylamide (4-methoxy-2-naphthylamide) Chemical compound 0.000 description 12
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 12
- 206010024971 Lower respiratory tract infection Diseases 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 12
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 12
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 12
- 238000002761 liquid phase assay Methods 0.000 description 12
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 12
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 11
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 11
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 10
- 230000035693 Fab Effects 0.000 description 10
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 10
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 10
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 10
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 10
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 9
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 9
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 210000004534 Cecum Anatomy 0.000 description 8
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 8
- VDOUHVITQWKJCB-UHFFFAOYSA-N naphthalen-2-ylazanide Chemical compound C1=CC=CC2=CC([NH-])=CC=C21 VDOUHVITQWKJCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 8
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 8
- JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 2-Naphthylamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N)=CC=C21 JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000005862 Angiotensin II Human genes 0.000 description 7
- QMMRCKSBBNJCMR-KMZPNFOHSA-N Angiotensin III Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 QMMRCKSBBNJCMR-KMZPNFOHSA-N 0.000 description 7
- QSBGWDDCOJYQGY-KOQODJNWSA-N Angiotensin IV Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 QSBGWDDCOJYQGY-KOQODJNWSA-N 0.000 description 7
- 229950006323 Angiotensin ii Drugs 0.000 description 7
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 7
- 101800000738 Angiotensin-3 Proteins 0.000 description 7
- 102400000348 Angiotensin-3 Human genes 0.000 description 7
- 101800000737 Angiotensin-4 Proteins 0.000 description 7
- 102400000349 Angiotensin-4 Human genes 0.000 description 7
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 7
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 7
- ZEXLJFNSKAHNFH-SYKYGTKKSA-N Endomorphin-1 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZEXLJFNSKAHNFH-SYKYGTKKSA-N 0.000 description 7
- XIJHWXXXIMEHKW-LJWNLINESA-N Endomorphin-2 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 XIJHWXXXIMEHKW-LJWNLINESA-N 0.000 description 7
- 210000002216 Heart Anatomy 0.000 description 7
- CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N Ile(5)-angiotensin II dizwitterion Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=[NH2+])NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC([O-])=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N 0.000 description 7
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 7
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 7
- 108010022337 Leucine Enkephalin Proteins 0.000 description 7
- 102400000988 Met-enkephalin Human genes 0.000 description 7
- YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N Metenkefalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N 0.000 description 7
- 108010042237 Methionine Enkephalin Proteins 0.000 description 7
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 7
- 108060006375 POMC Proteins 0.000 description 7
- OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 7
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 7
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 7
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 7
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 108010015205 endomorphin 1 Proteins 0.000 description 7
- 108010015198 endomorphin 2 Proteins 0.000 description 7
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N leu-enkephalin Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1CC(N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 230000003071 parasitic Effects 0.000 description 7
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 7
- 229940035620 ACTH and synthetic analog preparations Drugs 0.000 description 6
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 6
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N Alanyl-Arginine Chemical compound CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 6
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 6
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 6
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 6
- 108010065372 Dynorphins Proteins 0.000 description 6
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 6
- HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N Leu-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 6
- 208000001725 Mucocutaneous Lymph Node Syndrome Diseases 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K Tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- VAEOIFAHJWMTKD-NMUVPRMFSA-N Valorphin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VAEOIFAHJWMTKD-NMUVPRMFSA-N 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 6
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 108010065875 beta-casomorphins Proteins 0.000 description 6
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 6
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N pro glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 206010000891 Acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 5
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 5
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 5
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 5
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 5
- 102100009178 RUNX1T1 Human genes 0.000 description 5
- 101710034060 RUNX1T1 Proteins 0.000 description 5
- 206010040070 Septic shock Diseases 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 5
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- QBLFFOHVDMBOPS-DYEKYZERSA-N (2S)-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-[2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound ONC(=O)C[C@@H](CCC)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QBLFFOHVDMBOPS-DYEKYZERSA-N 0.000 description 4
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N (2S)-2-acetamido-N-[(2S)-1-[[(2S)-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]-4-methylpentanamide Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- PYHRZPFZZDCOPH-QXGOIDDHSA-N (S)-amphetamine sulfate Chemical compound [H+].[H+].[O-]S([O-])(=O)=O.C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1.C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYHRZPFZZDCOPH-QXGOIDDHSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 210000001168 Carotid Artery, Common Anatomy 0.000 description 4
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 4
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 4
- 208000005333 Pulmonary Edema Diseases 0.000 description 4
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 4
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 4
- 206010038435 Renal failure Diseases 0.000 description 4
- VEKPWANJVWWTMM-DYDSHOKNSA-N Spinorphin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1[C]2C=CC=CC2=NC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VEKPWANJVWWTMM-DYDSHOKNSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 4
- XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 4
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 4
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 4
- 108010052590 amastatin Proteins 0.000 description 4
- QFAADIRHLBXJJS-ZAZJUGBXSA-N amastatin Chemical compound CC(C)C[C@@H](N)[C@H](O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QFAADIRHLBXJJS-ZAZJUGBXSA-N 0.000 description 4
- 229940058303 antinematodal Benzimidazole derivatives Drugs 0.000 description 4
- 229940019336 antithrombotic Enzymes Drugs 0.000 description 4
- 150000001556 benzimidazoles Chemical class 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 4
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 4
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 4
- 230000000004 hemodynamic Effects 0.000 description 4
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 4
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 4
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000021597 necroptosis Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 201000010874 syndrome Diseases 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 4
- QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- KKUPPLMEDQDAJX-UEHMALFGSA-N (2S,3R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=C(O)C=C1 KKUPPLMEDQDAJX-UEHMALFGSA-N 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000683 Abdominal Cavity Anatomy 0.000 description 3
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 3
- 206010007625 Cardiogenic shock Diseases 0.000 description 3
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 3
- 210000001715 Carotid Arteries Anatomy 0.000 description 3
- 108090000283 Dipeptidyl-peptidase III Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 3
- 206010016803 Fluid overload Diseases 0.000 description 3
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 3
- 210000001308 Heart Ventricles Anatomy 0.000 description 3
- CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004731 Jugular Veins Anatomy 0.000 description 3
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 3
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 3
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 208000002151 Pleural Effusion Diseases 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N Rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N Staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 3
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfizole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 3
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 3
- QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 3
- GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Threonine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 3
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 3
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 3
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 3
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 3
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010017421 proctolin Proteins 0.000 description 3
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019798 tripotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N α-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 3
- PYYCBPABFFOXLZ-IPYPFGDCSA-N (2S)-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-[2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound ONC(=O)C[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PYYCBPABFFOXLZ-IPYPFGDCSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 2-((2,6-Dichlorophenyl)imino)imidazolidine Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(1-carboxy-2-phenylethyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGHKSHCBDXNTHX-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(4-amino-1-carboxy-4-oxobutyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O MGHKSHCBDXNTHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-Carboxy-X-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 description 2
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 2
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 2
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 2
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 2
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N Arg-Gln Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 210000001367 Arteries Anatomy 0.000 description 2
- IQTUDDBANZYMAR-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Methionine Chemical compound CSCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O IQTUDDBANZYMAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 description 2
- 208000000409 Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N Carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 2
- 210000001723 Extracellular Space Anatomy 0.000 description 2
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N Glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 229960003180 Glutathione Drugs 0.000 description 2
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 2
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 229960004184 Ketamine Hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-hydroxy-Succinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N O-Phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 2
- 206010039073 Rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LZLREEUGSYITMX-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CO)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LZLREEUGSYITMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M Sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101800001235 Spinorphin Proteins 0.000 description 2
- 102400001227 Spinorphin Human genes 0.000 description 2
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 2
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 2
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 2
- 210000001186 Vagus Nerve Anatomy 0.000 description 2
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 Xylazine Drugs 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N Xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliferant Effects 0.000 description 2
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N ketamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=C(Cl)C=1C1([NH2+]C)CCCCC1=O VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive Effects 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 2
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108010071870 propioxatin A Proteins 0.000 description 2
- 108010071872 propioxatin B Proteins 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 230000005700 syncytium formation by plasma membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000010967 transthoracic echocardiography Methods 0.000 description 2
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N (2S)-1-[2-[[(2S)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2,5-diamino-5-oxopentanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VHGIWFGJIHTASW-FXQIFTODSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VHGIWFGJIHTASW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KHTIUAKJRUIEMA-HOUAVDHOSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 KHTIUAKJRUIEMA-HOUAVDHOSA-N 0.000 description 1
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N (2S)-5-amino-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N (2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 1
- BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-sulfanylpropanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 2-[[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[[1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino)butyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 239000000275 Adrenocorticotropic Hormone Substances 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 210000003423 Ankle Anatomy 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- DAQIJMOLTMGJLO-YUMQZZPRSA-N Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N DAQIJMOLTMGJLO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 206010003119 Arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N Asn-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N Asp-Gln Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- TWXZVVXRRRRSLT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Cysteine Chemical compound NC(=O)CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O TWXZVVXRRRRSLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Aspartyl-L-proline Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000036912 Bioavailability Effects 0.000 description 1
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 208000003170 Bronchiolo-Alveolar Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M CHEMBL593252 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100008895 CLEC3B Human genes 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Calypsol Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 206010007521 Cardiac arrhythmias Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 229920002301 Cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 210000004289 Cerebral Ventricles Anatomy 0.000 description 1
- 210000003483 Chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 206010070976 Craniocerebral injury Diseases 0.000 description 1
- RGTVXXNMOGHRAY-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Arginine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N RGTVXXNMOGHRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Phenylalanine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003067 Cystine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Enkephalin L Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100008658 FN1 Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010016807 Fluid retention Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000005017 Glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Histidine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CTCFZNBRZBNKAX-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Glutamine Chemical compound NC(=O)CCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 CTCFZNBRZBNKAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015434 Humanized Monoclonal Antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108010064750 Humanized Monoclonal Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 201000001971 Huntington's disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 210000003767 Ileocecal Valve Anatomy 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Threonine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007313 Kawasaki disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine zwitterion Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine zwitterion Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N L-tyrosyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N L-tyrosyl-L-tyrosine Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 229940067606 Lecithin Drugs 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalins Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalins Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Asparagine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 1
- 239000000637 Melanocyte-Stimulating Hormone Substances 0.000 description 1
- PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N Met-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 210000004115 Mitral Valve Anatomy 0.000 description 1
- 208000004221 Multiple Trauma Diseases 0.000 description 1
- 206010028224 Multiple injury Diseases 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000009025 Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 108009000578 Oxidative Stress Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006551 Parasitic Disease Diseases 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010034674 Peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N Phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N Phenylalanyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- RKCAIXNGYQCCAL-UHFFFAOYSA-N Porphin Chemical compound N1C(C=C2N=C(C=C3NC(=C4)C=C3)C=C2)=CC=C1C=C1C=CC4=N1 RKCAIXNGYQCCAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N Pro-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N Pro-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)[O-])C(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037175 Psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001147 Pulmonary Artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 1
- 210000000664 Rectum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 Semen Anatomy 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Arginine Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010070144 Single-Chain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000005632 Single-Chain Antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 229920001385 Spiegelmer Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N Texas Red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N Thr-Gln Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N Thr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003437 Trachea Anatomy 0.000 description 1
- 208000005765 Traumatic Brain Injury Diseases 0.000 description 1
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Aspartate Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N Xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700084638 YAP6 Proteins 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PUDCZUQFOPHIGU-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-4-[(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl]azanium;chloride Chemical compound Cl.C1=C(N)C(C)=CC(N=NC=2C(=CC=CC=2)C)=C1 PUDCZUQFOPHIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNDMXFUIXOEPRA-UHFFFAOYSA-M [4-[3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-3-oxopropyl]phenyl] 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate;trifluoromethanesulfinate Chemical compound [O-]S(=O)C(F)(F)F.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC(C=C1)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O GNDMXFUIXOEPRA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 108010084094 alanyl-alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002416 angiotensin derivative Substances 0.000 description 1
- 108010058865 angiotensinase Proteins 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 201000009596 autoimmune hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 230000018867 autolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000035514 bioavailability Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 1
- 201000011024 colonic benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated Effects 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003492 excitotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000063 excitotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002637 fluid replacement therapy Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 1
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010358 genetic engineering technique Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N gly pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010033719 glycyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010048994 glycyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 201000010238 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 101500007094 human Dentin phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010030617 leucyl-phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 108010044655 lysylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000090 phagocyte Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000005053 phenanthridines Chemical class 0.000 description 1
- 108010058453 phenylalanyl-glutamyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary Effects 0.000 description 1
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000037150 protein metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000029865 regulation of blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N rhodamine 110 Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N)=CC2=[O+]C2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013645 tetranectin Proteins 0.000 description 1
- 108010072986 threonyl-seryl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Arginine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к применению ингибитора активности дипептидилпептидазы-3 (DPP3) для лечения заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида. Ингибитор активности DPP3 представляет собой анти-DPP3 антитело, фрагмент анти-DPP3 антитела или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Заболевание выбрано из группы, включающей сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, микробную инфекцию, СПИД, малярию, ССВО, сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), судороги, нейродегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания и гипотензию. Изобретение обеспечивает лечение заболевания или состояния у индивида, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, с применением ингибитора активности DPP3. 4 з.п. ф-лы, 12 табл., 11 ил., 14 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способам определения активной DPP3 в образце жидкости организма, анализу или набору для определения активной DPP3 в образце жидкости организма, способу диагностики заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, и способам лечения указанного заболевания.
Уровень техники
Дипептидилпептидаза-3 также известна как дипептидиламинопептидаза III, дипептидилариламидаза III, дипептидилпептидаза III, энкефалиназа B или эритроцитарная ангиотензиназа; сокращенное название: DPP3, DPPIII - представляет собой металлопептидазу, которая катализирует отщепление дипептидов из физиологически активных пептидов, таких как энкефалины и ангиотензины.
DPP3 была впервые идентифицирована и ее активность была измерена в экстрактах очищенной передней доли гипофиза крупного рогатого скота Ellis & Nuenke, 1967. Фермент, который указан как EC 3.4.14.4, имеет молекулярную массу примерно 83 кДа и является высококонсервативым в прокариотах и эукариотах (Prajapati & Chauhan, 2011). Аминокислотная последовательность человеческого варианта показана в SEQ ID NO: 1. Дипептидилпептидаза III преимущественно является цитозольной пептидазой, которая экспрессируется повсеместно. Несмотря на отсутствие сигнальной последовательности, в нескольких исследованиях сообщалось о мембранной активности (Lee & Snyder, 1982).
DPP3 представляет цинк-зависимую экзопептидазу, относящуюся к семейству пептидаз M49. Она обладает широкой субстратной специфичностью для олигопептидов, включающих от трех/четырех до десяти аминокислот различных составов, и также способна катализировать расщепление после пролина. Известно, что DPP3 гидролизует дипептиды из N-конца ее субстратов, включая ангиотензин II, III и IV; лей- и мет-энкефалин; эндоморфин 1 и 2. Металлопептидаза DPP3 имеет оптимальную активность при рН 8,0-9,0, и может активироваться добавлением ионов двухвалентных металлов, таких как Co2+ и Mg2+. Структурный анализ DPP3 показал наличие каталитических мотивов HELLGH (hDPP3 450-455) и EECRAE (hDPP3 507-512), а также следующих аминокислот, которые важны для связывания субстрата и гидролиза: Glu316, Tyr318, Asp366, Asn391, Asn394, His568, Arg572, Arg577, Lys666 и Arg669 (Prajapati & Chauhan 2011, Kumar et al., 2016; нумерация относится к последовательности DPP3 человека, см. SEQ ID NO: 1). С учетом всех известных аминокислот или областей последовательности, которые участвуют в связывании субстрата и гидролизе, активный сайт DPP3 человека можно определить как область между аминокислотами 316 и 669.
Активность DPP3 может ингибироваться неспецифически различными общими ингибиторами протеаз (например, PMSF, TPCK), сульфгидрильными реагентами (например, pHMB, DTNB) и хелаторами металлов (ЭДТА, o-фенантролин, Abramić et al., 2000).
Активность DPP3 может ингибироваться специфически различными типами соединений: эндогенным ингибитором DPP3 является пептид спинорфин. Получено несколько синтетических производных спинорфина, например, тинорфин, и было показано, что они ингибируют активность DPP3 в разной степени (Yamamoto et al., 2000). Другими пептидными ингибиторами DPP3, о которых имеются сообщения, являются пропиоксатин А и В (патент США № 480676) и аналоги пропиоксатина А (Inaoka et al., 1988).
DPP3 также можно ингибировать небольшими молекулами, такими как флуостатины и производные бензимидазола. Флуостатины A и B представляют антибиотики, продуцируемые Streptomyces sp. TA-3391, которые нетоксичны и эффективно ингибируют активность DPP3. К настоящему времени было синтезировано и опубликовано 20 различных производных бензимидазола (Agić et al., 2007; Rastija et al., 2015), из которых два соединения 1' и 4' демонстрируют самый высокий ингибирующий эффект (Agić et al., 2007). Полный список ингибиторов DPP3 приведен в таблице 2.
Точная биологическая функция DPP3 в клеточной физиологии не понятна, но последние данные указывают на ее роль не только в метаболизме белков, но также в регуляции кровяного давления, модуляции боли и воспалительных процессах (Prajapati & Chauhan 2011).
В нескольких публикациях было показано, что DPP3 является перспективным биомаркером, все источники относятся к внутриклеточной DPP3. Было показано, что активность DPP3 повышается в гомогенатах опухолей яичников и эндометрия. Активность DPP3 даже увеличивается с увеличением тяжести/ злокачественности указанных опухолей (Šimaga et al., 1998 и 2003). Анализ иммуногистологией и вестерн-блоттингом клеточных линий глиобластомы также выявил повышенные уровни DPP3 (Singh et al., 2014).
Также было предположено, чтобы внутриклеточная или мембранная DPP3 является потенциальным маркером артериального риска (US 2011008805) и маркером ревматоидного артроза (US 2006177886). В международной заявке на патент WO 2005106486 раскрывается экспрессия и активность DPP3 в качестве диагностического маркера и DPP3 в качестве терапевтической мишени при многих видах заболеваний за счет повсеместной экспрессии DPP3 в клетке или на поверхности клетки. В EP1498480 упоминается потенциальное диагностическое и терапевтическое применение гидролитических ферментов, включая DPP3.
DPP3 была предложена не только качестве потенциального биомаркера, но также и в качестве потенциальной терапевтический мишени за счет ее способности расщеплять несколько биологически активных пептидов. Сверхэкспрессия DPP3 защищает клетки нейробластомы от окислительного стресса (Liu et al., 2007). Вирус гриппа А изменяет уровни DPP3 хозяина для собственной репликации (исследования с клеточными культурами, Meliopoulos et al., 2012). В общем, ферменты, расщепляющие энкефалин и/или ангиотензин, включая DPP3, обладают терапевтическим потенциалом в качестве мишеней для лечения боли, сердечно-сосудистых заболеваний (CVD) и рака, и соответствующие ингибиторы в качестве потенциального лечения боли, психических заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний (Khaket et al. 2012, Patel et al., 1993, Igic et al., 2007).
Несмотря на то, что DPP3 известна как внутриклеточный белок, активность DPP3 была обнаружена в некоторых жидкостях организма: ретроплацентарной сыворотке (Shimamori et al., 1986), семенной плазме (Vanha-Perttula et al., 1988) и СМЖ (Aoyagi et al., 1993). В СМЖ наблюдали повышенные уровни активности DPP3, измеренные у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (AD, Aoyagi et al., 1993). Wattiaux et al. (2007) предложили высвобождение внутриклеточной DPP3 в качестве маркера погибших и/или умирающих клеток в клеточной культуральной системе. Также было высказано предположение, что высвобождение DPP3 из некротических клеток влияет на иммунный ответ на мышиной модели (Gamrekelashvili et al., 2013).
Целью настоящего изобретения является обеспечение способа специфического определения активной DPP3 в образце жидкости организма, т. е., определения активной DPP3, но не любой другой аминопептидазы, чем DPP3.
Целью изобретения является обеспечение соответствующих анализов и наборов.
Еще одной целью изобретения является обеспечение способа диагностики заболевания или состояния у индивида, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, и способов лечения указанного заболевания.
Предметом настоящего изобретения является способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3,
отделения DPP3, связанной с указанным с захватывающим-связывающим соединением,
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3,
количественного определения активности DPP3 измерением превращения субстрата DPP3.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ представляет анализ с захватом фермента (ECA, см., например, US 5612186A, US 5601986A).
Все определения и конкретные варианты осуществления, указанные в описании, следует применять ко всем аспектам и объектам изобретения. Следует понимать, что определения и конкретные варианты осуществления, которые подробно изложены в одном аспекте или объекте изобретения, будут представлять определения и конкретные варианты осуществления для других аспектов и объектов изобретения, например, определение захватывающего-связывающего соединения или специфического захвата применимо ко всем вариантам осуществления изобретения: например, способам определения DPP3, анализам и наборам, диагностическим методам, терапевтическим методам. Такие определения могут не повторяться по тексту описания.
Связывание специфически с полноразмерной DPP3 означает, что указанное захватывающее-связывающее соединение не связывается с каким-либо другим белком, отличным от DPP3. Связывание специфически с полноразмерной DPP3 означает, что указанное захватывающее-связывающее соединение не связывается с какой-либо другой аминопептидазой, отличной от DPP.
Связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3, представляет связывающее соединение, которое связывается с белком с последовательностью SEQ ID NO: 1. Связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3, представляет связывающее соединение, которое связывается с SEQ ID NO: 1.
В конкретном варианте осуществления указанное захватывающее-связывающее соединение ингибирует активность DPP3 в жидкофазном анализе менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30%. Жидкофазный анализ представляет собой анализ, в котором расщепление субстратов DPP3 имеет место в жидкой фазе.
Ингибирование активности DPP3 в жидкофазном анализе связывающим соединением можно определить согласно настоящему изобретению. Возможные захватывающие-связывающие соединения DPP3 инкубируют с рекомбинантной или очищенной нативной DPP3 и специфическими субстратами DPP3 в жидкофазном анализе. Предпочтительно, в качестве захватывающего-связывающего соединения для ECA выбирают такое, которое обладает, по меньшей мере, ингибирующей способностью. Захватывающее-связывающее соединение должно ингибировать активность DPP3 менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30%. Специфический жидкофазный анализ активности DPP3 для определения ингибирующей способности возможных захватывающих-связывающих соединений подробно описан в примере 1 и включает следующие стадии:
Инкубацию 25 нг/мл рекомбинантной GST-hDPP3 с 5 мкг/мл соответствующего захватывающего-связывающего соединения и контрольного буфера в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5 и 100 мкМ ZnCl2 в течение 1 ч при комнатной температуре.
Добавление флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ).
Инкубацию при 37°C и мониторинг образования свободного βNA на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH) в течение 1 ч. Флуоресценцию βNA детектируют при волне возбуждения 340 нм и волне эмиссии 410 нм.
Вычисляют наклоны (в RFU/мин) увеличения флуоресценции различных образцов. Наклон GST-hDPP3 с контрольным буфером определяется как 100% активность. Ингибирующая способность возможного захватывающего-связывающего соединения определяется как снижение активности GST-hDPP3 инкубацией с указанным захватывающим-связывающим соединением в процентах.
Напротив, твердофазный анализ представляет собой анализ, где соответствующие события связывания имеют место в твердой фазе (см. пример 4 и 5).
Для четкого понимания, способ определения активной DPP3 можно провести в виде жидкофазного анализа и в виде твердофазного анализа. Ингибирование активности DPP3 можно определить в жидкофазном анализе, тем не менее, согласно вышеописанной процедуре.
Таким образом, твердофазный анализ является вариантом осуществления настоящего изобретения. Контактирование указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3, может иметь место в жидкой фазе (жидкофазный анализ захвата), и затем стадия отделения может включать иммобилизацию указанного комплекса захватывающее-связывающее соединение-DPP3. В качестве альтернативы захватывающее-связывающее соединение может быть иммобилизовано на поверхности, и связующее событие - захватывающее-связывающее соединение с DPP3 - имеет место в твердой фазе (твердофазный анализ).
В одном конкретном варианте осуществления для предотвращения полного ингибирования DPP3 и для ингибирования активности DPP3 менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30% в вышеописанном жидкофазном анализе, захватывающее-связывающее соединение предпочтительно не связывается с DPP3 в области или около области аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1. Область аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1 включает активный центр DPP3 и область связывания субстрата (например, Prajapati & Chauhan 2011, Kumar et al., 2016).
Активность DPP3 можно измерить детектированием продуктов расщепления субстратов DPP3.
Известные субстраты, пептидные гормоны, включают ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, АКТГ (адренокортикотропный гормон) и MSH (меланоцитстимулирующий гормон, Abramić et al., 2000, Baršun et al., 2007, Dhanda et al., 2008). Расщепление указанных пептидных гормонов, а также других немеченых олигопептидов (например, Ala-Ala-Ala-Ala, Dhanda и др., 2008), можно контролировать детектированием соответствующих продуктов расщепления. Способы детектирования включают, не ограничиваясь этим, анализ ВЭЖХ (например, Lee & Snyder, 1982), масс-спектрометрию (например, Abramić et al., 2000), H1-ЯМР анализ (например, Vandenberg et al., 1985), капиллярный зональный электрофорез (CE; например, Baršun et al., 2007), тонкослойную хроматографию (например, Dhanda et al., 2008) или обращеннофазовую хроматографию (например, Mazocco et al., 2006).
Детектирование флуоресценции за счет гидролиза флуорогенных субстратов DPP3 является стандартной процедурой для контроля активности DPP3. Данные субстраты представляют собой специфические ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe), связанные с флуорофором. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramić et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление этих флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. В жидкофазном анализе субстрат ECA и DPP3 инкубируют, например, в 96-луночном планшете, и флуоресценцию измеряют с использованием флуоресцентного детектора (Ellis & Nuenke 1967). Кроме того, образцы, содержащие DPP3, можно иммобилизовать и разделить гель-электрофорезом, окрасить гели флуорогенным субстратом (например, Arg-Arg-βNA) и Fast Garnet GBC и полосы флуоресцентного белка, детектировать на ридере для измерения флуоресценции (Ohkubo et al., 1999).
Те же самые пептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) можно связать с хромофорами, такими как п-нитроанилида диацетат. Детектирование изменения окраски за счет гидролиза хромогенных субстратов можно использовать для контроля активности DPP3.
Другим вариантом детектирования активности DPP3 является анализ Protease-Glo™ (коммерчески доступный в Promega). В данном варианте осуществления указанного способа определения DPP3 специфические ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu -Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) связывают с аминолюциферином. При расщеплении под действием DPP3 аминолюциферин высвобождается и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряется добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и контролем флуоресценции в режиме реального времени.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения ингибирующего эффекта связывающих соединений DPP3 и/или активности DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
Антитело по настоящему изобретению представляет белок, включающий один или более полипептидов, по существу кодированных генами иммуноглобулина, которые специфически связываются с антигеном. Известные иммуноглобулиновые гены включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также многочисленные гены вариабельной области иммуноглобулинов. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина обычно имеют длину примерно 25 кД или 214 аминокислот. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулина обычно имеют длину примерно 50 кД или 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH2-конце (длиной примерно 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на COOH-конце. Тяжелые цепи аналогичным образом кодируются геном вариабельной области (длиной примерно 116 аминокислот) и одним из генов другой константной области.
Основная структурная единица антитела обычно представляет собой тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, где каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепи связываются с антигеном, а константные области опосредуют эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют в различных других формах, включая, например, Fv, Fab и (Fab')2, а также бифункциональные гибридные антитела и одиночные цепи (например, Lanzavecchia et al., 1987; Huston et al., 1988; Bird et al., 1988; Hood et al., 1984. Hunkapiller & Hood, 1986). Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR) (см. Kabat et al., 1983). Как отмечено выше, CDR в основном ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело или функциональный фрагмент антитела, специфически связанные с антигеном.
Химерные антитела представляют антитела, гены легкой и тяжелой цепи которых были сконструированы, как правило, методами генной инженерии из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулинов, относящихся к разным видам. Например, вариабельные сегменты генов из мышиного моноклонального антитела могут быть присоединены к человеческим константным сегментам, таким как каппа и гамма 1 или гамма 3. Таким образом, в одном примере терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена из мышиного антитела и константного или эффекторного домена из человеческого антитела, хотя можно использовать другие виды млекопитающих, или вариабельную область можно получить молекулярными методами. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, например, см. патент США № 5807715. «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет иммуноглобулин, включающий человеческую каркасную область и один или более CDR из иммуноглобулина, отличного от человеческого (например, мышиного, крысиного или синтетического). Иммуноглобулин, отличный от человеческого, обеспечивающий CDR, называется «донором», и иммуноглобулин человека, обеспечивающий каркасную область, называется «акцептором». В одном варианте осуществления в гуманизированном иммуноглобулине все CDR происходят из донорного иммуноглобулина. Константные области необязательно должны присутствовать, но если они имеются, то они должны быть в основном идентичны константным областям иммуноглобулина человека, т. е. идентичны, по меньшей мере, примерно на 85-90%, например, примерно на 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей природных человеческих иммуноглобулинов. «Гуманизированное антитело» представляет антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое обеспечивает CDR. Акцепторная каркасная область гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное число замен аминокислот, взятых из донорной каркасной области. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые по существу не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть сконструированы с помощью методов генной инженерии (например, см. патент США № 5585089). Человеческое антитело представляет антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепи имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела могут быть получены с использованием способов, известных в данной области. Человеческие антитела можно получить иммортализацией человеческой В-клетки, секретирующей представляющее интерес антитело. Иммортализация может быть осуществлена, например, посредством инфицирования EBV или слияния В-клетки человека с миеломной или гибридомной клеткой с получением клетки триомы. Человеческие антитела также можно получить с помощью способов фагового дисплея (см., например, публикацию PCT № WO 91/17271, публикацию PCT № WO 92/001047, публикацию PCT № WO 92/20791, которые включены здесь посредством ссылки) или отобраны из комбинаторной библиотеки человеческих моноклональных антител (см. веб-сайт Morphosys). Человеческие антитела также могут быть получены с использованием трансгенных животных, несущих ген человеческого иммуноглобулина (например, см. публикацию PCT № WO 93/12227, публикацию PCT № WO91/10741, которые включены здесь посредством ссылки).
Таким образом, антитело против DPP3 может иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела. В предпочтительном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению представляют рекомбинантно продуцированные антитела, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антитела, включающие, по меньшей мере, F-фрагмент вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, например, химически связанные антитела (антигенсвязывающий фрагмент), включая, не ограничиваясь этим, Fab-фрагменты, включая Fab-минитела, одноцепочечный Fab-фрагмент, антитело в виде моновалентного Fab-фрагмента с эпитопными метками, например, FAB-V5S×2; бивалентный Fab (миниантитело), димеризованный с доменом CH3; бивалентный Fab или поливалентный Fab, т.е. образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации доменов dHLX, например, FAB-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризированные мультивалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, бивалентные и/или биспецифические диатела, BITE® (биспецифический активатор Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из другого класса, отличного от класса G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов верблюдов или рыб, и многие другие.
В дополнение к анти-DPP3-антителам, другие биополимерные каркасы хорошо известны в области техники для связывания молекулы-мишени, и их использовали для получения высокоспецифичных биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины.
Каркасные белки, отличные от Ig, могут представлять каркасные белки и могут использоваться в качестве миметиков антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Каркасные белки, отличные от Ig, могут быть выбраны из группы, включающей каркасные белки, отличные от Ig, на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), каркасные белки на основе фибронектина (например, описанные в EP 1266025, каркасные белки на основе липокалина ((например, описанные в WO 2011/154420), каркасные белки на основе убиквитина (например, описанные в WO 2011/073214), каркасные белки для переноса (например, описанные в US 2004/0023334), каркасные белки на основе белка А (например, описанные в ЕР 2231860), каркасные белки на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748), каркасные белки на основе микропротеинов (предпочтительно микропротеинов, образующих цистиновый узел) (например, описанные в ЕР 2314308), каркасные белки на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685), каркасные белки на основе домена EGFR-A (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасные белки на основе домена Кунитца (например, описанные в EP 1941867). Каркасные белки, отличные от Ig, могут быть пептидными или олигонуклеотидными аптамерами. Аптамеры обычно получают выбором из большого пула случайных последовательностей, и они представляют собой короткие цепи олигонуклеотидов (ДНК, РНК или XNA; Xu et и др. 2010, Deng et al. 2014) или короткие вариабельные пептидные домены, присоединенные к белковому каркасу (Li et al., 2011).
В одном варианте осуществления изобретения анти-DPP3-антитела по настоящему изобретению могут быть получены следующим образом:
Мышей иммунизировали рекомбинантной DPP3 (например, GST-hDPP3 из USBio, Salem, США), пептидами, содержащими фрагменты аминокислотной последовательности DPP3, например, конъюгированные с BSA, или нативной очищенной DPP3 (например, из эритроцитов человека, Abramić et al., 1988).
Мышам Balb/c вводили внутрибрюшинно (в/б) 100 мкг рекомбинантной GST-hDPP3, нативной очищенной hDPP3 или конъюгаты DPP3-пептид-BSA на сутки 0 (эмульгированные в адъюванте TiterMax Gold), 100 мкг на 14 сутки (эмульгированные в полном адъюванте Фрейнда) и 50 мкг на 21 и 28 сутки (в неполном адъюванте Фрейнда). На сутки 49 животное получало внутривенную (в/в) инъекцию 50 мкг GST-hDPP3, нативной очищенной hDPP3 или конъюгаты DPP3-пептид-BSA, растворенные в физиологическом растворе. Через 3 суток мышей подвергали эвтаназии и проводили слияние иммунных клеток.
Спленоциты от иммунизированных мышей и клетки миеломной клеточной линии SP20 сливали с использованием 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывания клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны отбирали культивированием в среде HAT [среда для культивирования RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и добавки HAT]. Через одну неделю среду HAT заменяли средой НТ на три пассажа с последующим возвратом на обычную клеточную культуральную среду.
Супернатанты клеточной культуры сначала подвергали скринингу на IgG-антитела, связывающиеся с рекомбинантной DPP3, через две недели после слияния. Соответственно, рекомбинантную GST-меченную DPP3 (USBiologicals, Salem, США) иммобилизовали в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубировали с 50 мкл клеточного культурального супернатанта на лунку в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания планшета добавляли POD-кроличий антимышиный IgG из расчета 50 мкл/лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После следующей стадии промывания в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ о-фенилендиамин в цитратно-гидрофосфатном буфере, 0,012% Н2О2), инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре и хромогенную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 Н серной кислоты. Поглощение детектировали при 490 мм.
Тестированные положительные микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования выбранные культуры клонировали и реклонировали с использованием метода предельных разведений и определяли изотипы.
Антитела, полученные против GST-меченной человеческой DPP3 или пептидов DPP3, получали с помощью стандартных методов получения антител (Marx et al., 1997) и очищали на белке A. Чистота антител составляла ≥ 90% на основе данных анализа электрофорезом в SDS-геле.
Антитела можно получить с использованием фагового дисплея в соответствии со следующей процедурой:
Библиотеки генов человеческого интактного антитела HAL7/8 использовали для выделения рекомбинантной одиночной цепи F-вариабельных доменов (scFv) против пептида DPP3. Библиотеки генов антитела подвергали скринингу, используя стратегию пэннинга, которая включает использование пептидов, содержащих биотиновую метку, связанную через два различных спейсера с пептидной последовательностью DPP3. Смесь из раундов пэннинга, используя неспецифически связанный антиген и стрептавидин-связанный антиген, использовали, чтобы минимизировать фон неспецифических связывающих соединений. Элюированные фаги из третьего раунда пэннинга использовали для получения штаммов E. coli, экспрессирующих моноклональное scFv. Супернатант, полученный в результате культивирования этих клональных штаммов, непосредственно использовали для тестирования антигена ELISA (см. также Hust et al., 2011; Schütte et al., 2009)
Гуманизацию мышиных антител можно проводить в соответствии со следующей процедурой:
Для гуманизации антитела мышиного происхождения анализируют последовательность антитела на структурное взаимодействие каркасных областей (FR) с областями, определяющими комплементарность (CDR), и антигеном. На основе структурного моделирования отбирают подходящую FR человеческого происхождения и мышиные последовательности CDR пересаживают в FR человека. В аминокислотной последовательности CDR или FR могут быть введены изменения для восстановления структурных взаимодействий, которые были отменены в результате видового переключения последовательностей FR. Такое восстановление структурных взаимодействий может быть достигнуто посредством случайного подхода с использованием библиотек фагового дисплея или посредством направленного подхода с использованием молекулярного моделирования (Almagro & Fransson, 2008).
В альтернативном варианте осуществления выбирают формат антитела к DPP3 из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, F(ab)2-фрагмент и слитый белок scFv-Fc. В еще одном предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и их оптимизированные по биодоступности конъюгаты, такие как ПЭГилированные фрагменты.
В конкретном варианте осуществления указанного способа для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение представляет собой антитело.
В одном варианте осуществления можно провести анализ захвата или связывания для детектирования и/или количественного определения DPP3. Связывающее соединение, реагирующее с белком DPP3, но не оказывающее отрицательного влияния на активность пептидазы более чем на 50%, предпочтительно более чем на 40%, предпочтительно более чем на 30% в жидкофазном анализе, может быть иммобилизовано на твердой фазе. В одном варианте осуществления для предупреждения ингибирования DPP3 захватывающее-связывающее соединение предпочтительно не связывается с DPP3 в области аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1. Область аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1 включает активный центр DPP3 и область связывания субстрата (Prajapati & Chauhan 2011, Kumar et al., 2016).
В конкретном варианте осуществления указанного способа для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагменты антитела, каркасные белки, отличные от Ig, или аптамеры.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное захватывающее-связывающее соединение, реагирующее с DPP3, иммобилизовано на твердой фазе.
Испытуемый образец пропускают над иммобилизованным связывающим соединением, и DPP3, если она присутствует, связывается со связывающим соединением и сама иммобилизуется для детектирования. Затем может быть добавлен субстрат и продукт реакции можно детектировать для определения присутствия или количества DPP3 в испытуемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» можно использовать для включения любого материала или резервуара, в котором или на котором можно проводить анализ, и она включает, не ограничиваясь этим: пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла, агарозовые смолы (например, Сефароза производства GE Healthcare Life Sciences), магнитные частицы (например, магнитные частицы Dynabeads™ или Pierce™ производства Thermo Fisher Scientific) и т. д.
Связывающие соединения белкового или пептидного происхождения (например, антитело, фрагменты антител, каркасные белки, отличные от IgG) иммобилизуют на твердой фазе способами, включающими физическую адсорбцию (например, электростатическое взаимодействие или гидрофобное взаимодействие), биоаффинную иммобилизацию (например, авидин-биотин, белок А/G/L, His-метку и Ni2+-NTA, GST-метку и глютатион, гибридизацию ДНК, аптамеры), ковалентную связь (например, посредством амина и N-гидроксисукцинимида) или комбинацию указанных методов иммобилизации (Kim & Herr 2013). Связывающие соединения олигонуклеотидного происхождения (например, аптамеры) могут быть иммобилизованы на твердой фазе с использованием системы (стрептококковый) авидин-биотин (Müller et al., 2012, Deng et al., 2014).
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3. Данная стадия отделения может быть любой другой стадией, которая отделяет DPP3, связанную с указанным захватывающим-связывающим соединением, от ингредиентов указанного образца жидкости организма.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида превращение указанного субстрата DPP3 иммобилизованной DPP3 измеряется (детектируется) способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или ди- и трипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™). Ди- или трипептиды, которые расщепляются под действием DPP3, включают, не ограничиваясь этим, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu -Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramic et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление данных флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. Хромофоры включают, не ограничиваясь этим, п-нитроанилида диацетат (pNA). Гидролиз связи пептид-pNK в хромогенных субстратах приводит к высвобождению pNA, который, в свою очередь, изменяет окраску. Таким образом, изменение оптической плотности (DA/мин) прямо пропорционально ферментативной активности. Используя анализ Protease-Glo™ от Promega, при расщеплении DPP3 высвобождается аминолюциферин и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряют добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и определением флуоресценции в режиме реального времени. В одном конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный образец выбирают из группы, включающей цельную кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, мокроту и плевральный выпот.
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный образец представляет образец крови, выбранный из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий:
связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3
субстрат DPP3.
Набор может дополнительно содержать калибратор:
калибратор может представлять образцы с известной концентрацией DPP3 (нативной, очищенной или рекомбинантной);
калибратор может представлять сами продукты расщепления, такие как свободные флуорофоры (например, 2-нафтиламин), свободные хромофоры (например, п-нитроанилид) или свободный люциферин.
Набор может дополнительно содержать реагенты для промывания:
реагент для промывания (может быть любым водным буферным раствором с или без детергента. В данном случае использовали 8 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 60 мМ NaCl, 0,02% Твин 20).
В конкретном варианте осуществления указанный анализ представляет анализ с захватом фермента (ECA, например, US 5612186A, US 5601986A).
В конкретном варианте осуществления указанное захватывающее-связывающее соединение, которое связывается с полноразмерной DPP3, специфически ингибирует активность DPP3 менее чем на 50% в жидкофазном анализе, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно менее чем на 30%. Определение термина «жидкофазный анализ» см. выше. В одном конкретном варианте осуществления для предупреждения ингибирования DPP3 захватывающее-связывающее соединение не должно связываться с DPP3 в области около активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID NO: 1).
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение представляет собой антитело.
Термин «антитело» обычно включает моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, в частности, Fc-фрагменты, а также так называемые «одноцепочечные антитела» (Bird et al., 1988), химерные, гуманизированные, в частности, CDR-привитые антитела, диатела или тетратела (Holliger et al., 1993). Также данный термин включает иммуноглобулиноподобные белки, которые выбирают с помощью методов, включая, например, фаговый дисплей, со специфическим связыванием с интересующей молекулой, содержащейся в образце. В этом контексте термин «специфическое связывание» относится к антителам, продуцированным против представляющей интерес молекулы, или его фрагментам. Антитело считается специфическим, если его аффинность к представляющей интерес молекуле, или вышеуказанного фрагмента, по меньшей мере, предпочтительно в 50 раз выше, более предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 1000 раз выше, чем в отношении других молекул, входящих в состав образца, содержащего интересующую молекулу. В данной области техники хорошо известно, как получить антитела и выбрать антитела с определенной специфичностью.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или ди- и трипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™). Ди- или трипептиды, которые расщепляются DPP3, включают, не ограничиваясь этим, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu -Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramic et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление данных флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. Хромофоры включают, не ограничиваясь этим, п-нитроанилида диацетат (pNA). Гидролиз связи пептид-pNK в хромогенных субстратах приводит к высвобождению pNA, который, в свою очередь, изменяет окраску. Таким образом, изменение оптической плотности (DA/мин) прямо пропорционально ферментативной активности. Используя анализ Protease-Glo™ от Promega, при расщеплении под действием DPP3 высвобождается аминолюциферин и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряется добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и контролем флуоресценции в режиме реального времени.
В конкретном варианте осуществления указанного анализа или набора для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанный калибратор выбирают из группы, включающей: A) рекомбинантную DPP3 (например, GST-hDPP3 от USBio), очищенную нативную DPP3 (например, из эритроцитов человека, Abramić et al., 1988) или фрагменты DPP3 (нативные, синтетические или рекомбинантные); B) сами продукты расщепления: свободные флуорофоры (например, 2-нафтиламин), свободные хромофоры (например, п-нитроанилид) или свободный люциферин, для количественного измерения флуоресценции, изменения окраски и сигналов биолюминесценции.
Один вариант осуществления настоящего изобретения с использованием DPP3 в качестве диагностического биомаркера включает иммуноанализы в различных форматах, такие как, например, радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), анализ на основе гранул Luminex, анализы на основе белковых микрочипов, и экспрессные аналитические форматы, например, такие как анализы на иммунохроматографических тест-полосках.
Анализы могут представлять гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные и неконкурентные анализы сэндвич-типа. В особенно предпочтительном варианте осуществления, в котором используется два антитела по настоящему изобретению, анализ проводят в формате сэндвич-анализа, который является неконкурентным иммуноанализом, где DPP3 или ее фрагмент, подлежащий детектированию и/или количественному определению, связаны с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, гранулой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или тест-полоской, и второе антитело представляет собой антитело, которое помечено, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособной или каталитически активной группой. Затем измеряют соответствующим методом количество меченого антитела, связанного с аналитом. Общий состав и процедуры, связанные с «сэндвич-анализами», хорошо разработаны и известны специалистам в данной области. (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, 2005; Hultschig et al., 2006).
В особенно предпочтительном варианте осуществления анализ включает жидкую реакционную смесь, в которой первый метящий компонент присоединен к первому антителу, где указанный первый метящий компонент является частью системы мечения на основе гашения или амплификации флуоресценции или хемилюминесценции, и второй метящий компонент указанной системы мечения присоединен ко второму антителу, так что при связывания обоих антител с аналитом генерируется измеримый сигнал, который позволяет детектировать образовавшиеся сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включают использование красителей, которые могут, например, быть выбраны из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеин изоотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, BODIPY-красители, такие как BODIPY TMR, орегоновый зеленый, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как техасский красный, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, бромистый этидий, акридиновые красители, карбазоловые красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и тому подобное.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают использование красителей на основе физических принципов, описанных для хемилюминесцентных материалов в монографии Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I Kroschwitz; редактор, М. Хоу-Грант, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562, включенной в настоящее описание посредством ссылки, включая цитаты на стр. 551-562. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются акридиновые эфиры.
Один вариант осуществления настоящего изобретения включает химический анализ DPP3. В анализе используют субстрат фермента, который реагирует с DPP3 с образованием детектируемого продукта реакции. Альтернативно, может контролироваться скорость реакции субстрата для определения присутствия или количества DPP3 в испытуемом образце. Подходящие субстраты фермента включают, не ограничиваясь этим, дипептидные субстраты, такие как Arg-Arg-β-NA или Arg-Arg-AMC.
Анализы, включающие такие реагенты и реакции, могут быть выполнены в любом подходящем реакционном резервуаре, например, в пробирке или лунке микротитрационного планшета. В качестве альтернативы, могут быть разработаны аналитические устройства в одноразовой форме, например, устройства в форматах индикаторной полоски или тест-полоски, которые хорошо известны специалистам в данной области и которые обеспечивают простоту изготовления и применения. Такие одноразовые аналитические устройства могут быть упакованы в виде наборов, содержащих все необходимые материалы, реагенты и инструкции по применению.
Аналитические устройства по настоящему изобретению предпочтительно могут находиться в формате индикаторных полосок или тест-полосок. Например, индикаторная полоска может быть изготовлена из кусочка гигроскопичного материала, содержащего хромогенный субстрат для DPP3. Альтернативно, индикаторная полоска может быть изготовлена из непористого материала, на который нанесен субстрат. При контактировании устройства с желательным испытуемым образцом субстрат и любая DPP3, присутствующие в образце, взаимодействуют, с образованием детектируемой реакции на устройстве.
В альтернативном варианте осуществления устройство может представлять тест-полоску, где находится субстрат в одной или более зонах вдоль длины полоски из гигроскопичного материала. При контактировании одного конца полоски с желаемым испытуемым образцом жидкий образец мигрирует вдоль гигроскопичного материала. Реакция субстрата и генерация детектируемого сигнала указывает на присутствие DPP3 в исследуемом образце. В мультизональном устройстве количество дискретных или изолированных зон вдоль длины полоски, которые генерируют детектируемый сигнал, также может указывать на количество DPP3, присутствующей в испытуемом образце. Альтернативно, большая часть тест-полоски может содержать субстрат. Длина цветной реакции, образованной на тест-полоске, имеющей такую единую вытянутую зону субстрата, может использоваться для указания на присутствие или количество DPP3 в испытуемом образце.
В альтернативном варианте осуществления анализа может детектироваться скорость, с которой протекает реакция, в качестве указания на количество DPP3, присутствующей в испытуемом образце. Например, скорость, с которой реагирует субстрат, можно использовать для указания на количество DPP3, присутствующей в испытуемом образце. Альтернативно, скорость, с которой образуется продукт реакции, можно использовать для указания на количество DPP3, присутствующей в образце.
В еще одном варианте осуществления может быть проведен анализ захвата или связывания для детектирования и/или количественного определения протеазы. Например, антитело, реагирующее с белком DPP3, но не оказывающее отрицательного влияния на активность пептидазы, может быть иммобилизовано на твердой фазе. Испытуемый образец пропускают над иммобилизованным антителом, и DPP3, если она присутствует, связывается с антителом и сама иммобилизуется для детектирования. Затем можно добавить субстрат, и продукт реакции может детектироваться с указанием на наличие или количество DPP3 в испытуемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» может использоваться для включения любого материала или резервуара, в котором или на котором может быть проведен анализ, и она включает, не ограничиваясь этим, пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла и т. д.
В еще одном конкретном варианте осуществления DPP3 ECA можно проводить в виде анализа с тест-полоской. В примерном устройстве с тест-полоской слой нанесения испытуемого образца необязательно присоединяется к одному концу пористой тест-полоски. Тест-полоска содержит иммобилизованное антитело, которое будет связываться с и тем самым иммобилизовать DPP3 на заранее определенном участке с последующим детектированием. Необязательно, устройство может включать конец индикатора анализа, который расположен на дистальном конце тест-полоски от места контакта испытуемого образца. Конец с индикатором анализа генерирует детектируемый сигнал при контакте с испытуемым образцом или аналитическим реагентом, тем самым указывая, что анализ завершен.
Слой нанесения испытуемого образца может быть частью самой пористой тест-полоски или материала в контакте жидкой среды с концом пористой тест-полоски, относящимся к проксимальному концу, так что испытуемый образец может проходить или мигрировать со слоя нанесения на пористую тест-полоску. Контактирование с жидкой средой может включать физический контакт слоя нанесения с пористой тест-полоской, а также отделение слоя нанесения от пористой тест-полоски промежуточным пространством или дополнительным материалом, которые все еще позволяют жидкой среде протекать между слоем нанесения и пористой тест-полоской. По существу, весь слой нанесения может перекрывать пористую тест-полоску так, чтобы испытуемый образец проходил через практически через любую часть слоя нанесения к проксимальному концу пористой тест-полоски. Альтернативно, только часть слоя нанесения может находиться в контакте жидкой среды с пористой тест-полоской. Слой нанесения может представлять собой любой материал, который может переносить испытуемый образец на пористую тест-полоску.
Пористая тест-полоска аналитического устройства может представлять любой подходящий абсорбирующий, пористый, гигроскопичный, хроматографический или капиллярный материал, через который испытуемый образец, содержащий аналит, может транспортироваться посредством капиллярного или продольного капиллярного эффекта. Природные, синтетические или встречающиеся в природе материалы, которые синтетически модифицированы, можно использовать в качестве пористой тест-полоски, включая, не ограничиваясь этим: целлюлозные материалы, такие как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы, такие как ацетилцеллюлоза и нитроцеллюлоза; стекловолокно; ткань, как из встречающегося в природе материала (например, хлопка), так и синтетическая (например, нейлон); пористые гели, такие как силикагель, агароза, декстран и желатин; пористые волокнистые матрицы; материалы на основе крахмала, такие как сшитые цепи декстрана; керамические материалы; пленки из поливинилхлорида и комбинации поливинилхлорида-диоксида кремния; и тому подобное. Пористая тест-полоска не должна мешать генерации детектируемого сигнала. Пористая тест-полоска должна иметь приемлемый внутренний запас прочности, или прочность может быть обеспечена с помощью дополнительной подложки.
Конкретные размеры пористой тест-полоски будут предметом удобства в зависимости от размера испытуемого образца, протокола анализа, средств детектирования и измерения сигнала и тому подобное. Например, размеры могут быть выбраны для регуляции скорости миграции жидкой среды, а также количества испытуемого образца, подлежащего поглощению пористой тест-полоской.
В одном возможном устройстве на основе тест-полосок по настоящему изобретению субстрат DPP3 и/или антитело, захватывающее DPP3, могут быть иммобилизованы на пористой тест-полоске с образованием, по меньшей мере, одного участка детектирования аналита, т. е. области пористой тест-полоски, содержащей один или более аналитических реагентов, недиффузно присоединенных к ней. В еще одном варианте осуществления изобретения область измерения или детектирования тест-полоски может включать множество участков, содержащих субстрат DPP3 и/или иммобилизованное антитело против DPP3. Необязательно, различные участки детектирования могут содержать различные количества субстрата и/или иммобилизованного антитела против DPP3, т. е. большее количество на первом участке детектирования и меньшие количества на других участках. Например, если 20 нанограмм антитела захватывают эквивалент 1 нмоль/мин/мл DPP3, то тогда первый участок детектирования аналитического устройства может содержать 50 нанограмм анти-DPP3-антитела, тогда как другие участки содержат 10, 20, 30 и т. д. нанограмм антител. При добавлении испытуемого образца количество участков, отображающих детектируемый сигнал, дает количественное указание на количество DPP3, присутствующее в образце. Участки детектирования могут быть сконфигурированы в любой приемлемо детектируемой форме и обычно имеют форму полосы, охватывающей ширину тест-полоски.
Необязательно, может быть получено устройство с множеством участков захвата так, что если пороговое количество DPP3 не присутствует в испытуемом образце, то по существу вся DPP3 будет связываться с антителом в первом участке захвата и, таким образом, иммобилизоваться в этом участке. Если в испытуемом образце присутствует количество DPP3 больше порогового значения, то оставшаяся DPP3 будет связываться с последующими зонами детектирования иммобилизованного антитела по длине тест-полоски. Чем больше количество DPP3 в испытуемом образце, тем больше количество участков захвата, которые будут отображать детектируемый сигнал за счет наличия DPP3. Как будет понятно специалистам в данной области техники, также можно получить устройства, содержащие много участков с субстратом DPP3, в которых количество субстрата в отдельных участках предназначено для получения результата количественного или полуколичественного анализа.
Другим важным вариантом осуществления изобретения является способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, включающий:
определение количества общей DPP3 или определение количества активной DPP3 в образце жидкости организма указанного индивида;
сравнение указанного определенного количества с заранее определенным пороговым значением;
где у указанного индивида диагностируется наличие заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, если указанное определенное количество выше указанного заранее определенного порогового значения.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное количество общей или активной DPP3 определяется в единицах концентрации.
Способы определения количества общей или активной DPP3 известны в данной области техники. В контексте способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по настоящему изобретению, можно использовать как способы и анализы современного уровня техники, так и вышеописанные способы и анализы для определения DPP3.
Пороговое значение заранее определяется измерением концентрации DPP3 и/или активности DPP3 у здоровых контрольных субъектов и вычислением, например, соответствующего 75-процентиля, более предпочтительно 90-процентиля, еще более предпочтительно 95-процентиля. Верхняя граница 75-процентиля, более предпочтительно 90-процентиля, еще более предпочтительно 95-процентиля, определяет пороговое значение для здоровых субъектов против больных пациентов. В отношении указанных процентилей, то пороговое значение, которой разделяет здоровых субъектов и больных пациентов, может составлять от 5 до 25 нг/мл, более предпочтительно от 7 до 20 нг/мл, более предпочтительно от 8 до 18 нг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 15 нг/мл в плазме с использованием иммуноанализа сэндвич-типа с анти-DPP3-антителом (см. пример 3). В анализе специфической активности DPP3 в плазме с захватом фермента пороговое значение, которое разделяет здоровых субъектов и больных пациентов, может составлять от 0,5 до 2 нмоль βNA мин-1 мл-1, более предпочтительно от 0,7 до 1,8 нмоль βNA мин-1 мл-1, более предпочтительно от 0,8 до 1,5 нмоль βNA мин-1 мл-1, наиболее предпочтительно от 1,0 до 1,3 нмоль βNA мин-1 мл-1 (см. пример 5).
Специалист в данной области знает, как определить пороговые значения по результатам ранее проведенных исследований. Специалист в данной области знает, что конкретное пороговое значение может зависеть от когорты субъектов, используемой для вычисления заранее определенного порогового значения, которое позднее может быть использовано на практике. Специалист в данной области знает, что конкретное пороговое значение может зависеть от калибровки, используемой в анализе. Специалист в данной области знает, что конкретное пороговое значение может зависеть от чувствительности и/или специфичности, которые для практика считаются приемлемыми.
Чувствительность и специфичность диагностического теста зависят не только от аналитического «качества» теста, но и зависят от определения того, что представляет собой аномальный результат. На практике характеристические кривые (ROC-кривые) обычно вычисляют построением графика зависимости значения переменной от ее относительной частоты в «нормальных» (т. е., явно здоровых) и «больных» популяциях (т. е. пациентов, страдающих инфекцией). В зависимости от конкретного диагностического вопроса, который исследуется, референсная группа не обязательно должна быть «нормальной», а это может быть группа пациентов, страдающих другим заболеванием или патологическим состоянием, от которых дифференцируется интересующая группа больных пациентов. Для любого конкретного маркера распределение уровней маркера для субъектов с или без заболевания, вероятно, будет перекрываться. В таких условиях тест не различает абсолютно норму от болезни со 100% точностью, и область перекрывания указывает на то, где тест не может различить норму от заболевания. Выбирают пороговое значение, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, как изменяется маркер при заболеваниях), результаты теста считаются аномальными и ниже которого результаты теста считаются нормальными. Площадь под ROC-кривой является показателем вероятности того, что различаемое измерение позволяет правильно идентифицировать патологическое состояние. ROC-кривые можно использовать, даже если результаты испытаний не обязательно дают точное число. При условии того, что можно ранжировать результаты, можно построить ROC-кривую. Например, результаты теста образцов на наличие «заболевания» можно ранжировать в соответствии со степенью (например, 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Такое ранжирование можно соотнести с результатами для «нормальной» популяции, и построить ROC-кривую. Эти способы хорошо известны в данной области (см., например, Hartley et al, 1982). Предпочтительно, пороговое значение выбирают таким образом, чтобы обеспечить область ROC-кривой выше примерно 0,5, более предпочтительно выше примерно 0,7. Термин «примерно» в этом контексте относится к±5% от данного измерения.
Если пороговое значение определяется с использованием когорты предыдущего исследования и с учетом всех вышеуказанных пунктов, то практикующий врач будет использовать заранее определенное пороговое значение для способов диагностики заболевания по изобретению и определит, имеет ли субъект показатель выше или ниже указанного заранее определенного порогового значения, чтобы поставить соответствующий диагноз.
Концентрации DPP3 в тканевых гомогенатах и жидкостях организма можно измерить, используя несколько коммерчески доступных наборов для постановки ELISA для определения DPP3 (например, производства LifeSpan BioSciences). Все эти анализы основаны на принципе анализа сэндвич-типа и применяются только для исследовательских целей.
Стандартная процедура измерения концентрации DPP3 заключается в определении активности DPP3 с использованием флуорогенного субстрата (например, Arg-Arg-β-нафтиламида) в жидкофазном анализе (Ellis & Nuenke 1967). Коммерчески доступные наборы (например, производства BPS Bioscience) обычно включают черные микротитрационные планшеты с низким связыванием, рекомбинантную DPP3, флуорогенный субстрат и соответствующие буферы. Данные наборы регулярно используются для скринингового анализа для субстратов и ингибиторов DPP3.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный образец выбирают из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму. Жидкость организма в контексте способа по настоящему изобретению также может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, мокроту и плевральный выпот.
В данном случае некротические процессы определяются всеми процессами в организме, которые приводят к гибели клеток и высвобождению DPP3 из цитоплазмы клеток во внеклеточное пространство и/или жидкости организма. Такие процессы включают, не ограничиваясь этим, некроз, апоптоз, некроптоз, эриптоз.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное заболевание выбрано из группы, включающей: сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию. В таблице 1 перечислены клинические симптомы/заболевания, которые сопровождаются или связаны с некротическими процессами и соответствующим некротическим событием.
В еще одном варианте указанное заболевание выбрано из группы, включающей острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, ожоговые травмы, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак и острую почечную недостаточность (AKI).
В одном варианте осуществления указанное заболевание представляет собой гипотензию.
Таблица 1 Заболевания, сопровождаемые или связанные с некротическими процессами |
||
клинический симптом/ заболевание | некротическое/апоптическое событие | ссылка |
острая сердечная недостаточность | внезапная гибель клеток/участков тканей/органов | Fischer et al., 2005, Zong et al., 2006 |
инфаркт миокарда | ||
инсульт | ||
печеночная недостаточность/повреждение печени | ||
почечная недостаточность/повреждение почек | ||
ожоговые травмы | Lanier et al., 2011 | |
травматические повреждения (например, травматическое повреждение головного мозга); политравма | Raghupathi, 2004 | |
вирусные+микробные+паразитарные инфекции | гибель макрофагов, лизис клеток хозяина | Zong et al., 2006; Fink et al., 2005 |
СПИД | прогрессирующая гибель иммунных клеток | Fischer et al., 2005 |
сепсис | некроз в результате иммунного ответа/апоптоз иммунных клеток | Pinheiro da Silva et al., 2009 |
малярия | лизис эритроцитов хозяина (эриптоз) | Lang et al., 2015 |
нейродегенеративные заболевания (например, AD, болезнь Гентингтона) | медленно прогрессирующая гибель нейрональных клеток | Fischer et al., 2005 |
другие расстройства ЦНС (например, судороги) | гибель клеток в результате эксайтотоксичности | Zong et al., 2006 |
рак | сильное воспаление | Wallach et al., 2014 |
аутоиммунное заболевание | ||
болезнь Кавасаки | сильное воспаление и некроз кровеносных сосудов | Dimitrades et al., 2014 |
Апоптоз представляет процесс запрограммированной гибели клеток (PCD), который может возникать в многоклеточных организмах. Биохимические события приводят к характерным изменениям клеток (морфологии) и их гибели. Эти изменения включают пузырение, сморщивание клеток, фрагментацию ядра, конденсацию хроматина и фрагментацию хромосомной ДНК. См. обзор в публикации Elmore 2007, Toxicol. Pathol., 35 (4): 495-516.
Некроз представляет форму повреждения клеток, которая приводит к преждевременной гибели клеток в живой ткани в результате аутолизиса (Vanlangenakker et al., 2008. Current Molecular Medicine, 8 (3): 207-220). Некроз вызван факторами, внешними по отношению к клетке или ткани, такими как инфекция, токсины или травма, которые приводят к неконтролируемому перевариванию клеточных компонентов.
Несмотря на то, что апоптоз часто оказывает положительные эффекты на организм, некроз почти всегда вреден и может привести к фатальному исходу.
Клеточная смерть за счет некроза не следует пути передачи сигнала апоптоза, а в большей степени имеет место активирование различных рецепторов, что приводит к потере целостности клеточной мембраны и неконтролируемому высвобождению продуктов гибели клеток во внеклеточное пространство. Это событие инициирует в окружающих тканях воспалительный ответ, который препятствует притоку находящихся рядом фагоцитов и устранению мертвых клеток фагоцитозом. По этой причине часто бывает необходимым удалять некротическую ткань хирургическим путем, процедурой, известной как санация раны. В отсутствии лечения некроз приводит к нарастанию разложения мертвой ткани и клеточного дебриса в или рядом с местом гибели клеток.
Форма запрограммированного некроза, называемая некроптозом, считается альтернативной формой запрограммированной гибели клеток. Некроптоз может служить в качестве резервной для апоптоза гибели клеток, когда сигнальный путь апоптоза блокируется эндогенными или экзогенными факторами, такими как вирусы или мутации (Linkermann et al., 2014. NEJM, 370 (5): 455-465). Позднее были обнаружены другие типы регулируемого некроза, которые разделяют несколько сигнальных событий с некроптозом и апоптозом (Vanden Berghe et al., 2014).
Сердечная недостаточность (HF) представляет заболевание сердца, которое возникает, когда проблема со структурой или функцией сердца ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма. Такое патологическое состояние может вызвать большое разнообразие симптомов, в частности, одышку (SOB) в состоянии покоя или во время физических нагрузок, симптомы задержки жидкости, такие как отек легких или отеки в области лодыжки, и объективное свидетельство нарушения структуры или функции сердца в состоянии покоя.
Сердечная недостаточность представляет клинический синдром, характеризующийся рядом симптомов и признаков, вызванных сердечной дисфункцией. Сердечная недостаточность является одной из основных причин заболеваемости и смертности в развитых странах с частотой распространения на уровне 1-2%. Сердечную недостаточность можно разделить на хроническую HF и острую HF. Пациентов с хронической HF можно разделить на пациентов со стабильной хронической HF, ухудшением признаков и симптомов хронической HF, и с острой декомпенсацией хронической HF. Острая сердечная недостаточность (AHF) определяется как быстрое начало развития признаков и симптомов сердечной недостаточности, которая приводит к необходимости в неотложной терапии или госпитализации. AHF может представлять вновь возникшую острую HF (вновь возникшая AHF у пациента без предшествующей сердечной дисфункции) или острую декомпенсацию хронической HF. AHF является основной причиной госпитализации взрослых людей в возрасте старше 65 лет. Несмотря на заметный прогресс в улучшении прогноза у пациентов с хронической сердечной недостаточностью, что в основном связано с терапевтическими достижениями за последние несколько десятилетий, как краткосрочные, так и долгосрочные исходы остаются очень неблагоприятными, как только пациенты госпитализируются по поводу декомпенсированной сердечной недостаточности. Почти 25% пациентов, госпитализированных по поводу AHF, нуждаются в повторной госпитализации в течение 30 дней после выписки из больницы, а <50% выживают в течение менее 5 лет после госпитализации. В дополнение к значительному снижению выживаемости и качества жизни у больных пациентов, денежная нагрузка за счет AHF на системы здравоохранения огромна. По оценкам, общая стоимость лечения сердечной недостаточности составляла 31 млр. долл. США только в 2012 году, и большая часть этих расходов связана с внутрибольничной помощью. По прогнозам, эти расходы увеличатся до беспрецедентного уровня 70 млрд. долл. США в 2030 году за счет старения населения.
Сердечная недостаточность затрагивает широкий круг пациентов, у которых нормальная фракция выброса левого желудочка (LVEF) обычно составляет ≥50%, также известная как HF с сохраненным EF (HFpEF), по сравнению с пациентами с пониженным LVEF, обычно равным <40%, также известным как HF с пониженным EF (HFrEF). Пациенты с LVEF в диапазоне 40-49% представляют «серую зону», которая определяется как HF со средним EF (HFmrEF) (Ponikowski et al., 2016. European Heart Journal 18 (8): 891-975).
Сердечная недостаточность может проявляться в виде острой или хронической сердечной недостаточности.
Термин «острая» используется для обозначения стремительного начала и для описания осложненной или декомпенсированной сердечной недостаточности, относящейся к эпизодам, когда пациента можно охарактеризовать как имеющего изменение признаков и симптомов сердечной недостаточности, приводящих к необходимости в срочной терапии или госпитализации.
Термин «хроническая» относится к длительной продолжительности течения заболевания. Хроническая сердечная недостаточность является долговременным состоянием, обычно сохраняющимся стабильным при лечении симптомов (стабильная хроническая HF).
Стабильная хроническая HF характеризуется:
(i) наличием структурной или функциональной недостаточности сердца, которая ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма;
(ii) отсутствием объемной перегрузки (проявляющейся отеком легких и/или системным отеком) и/или выраженным снижением сердечного выброса (проявляющимся в гипотензии, почечной недостаточности и/или шоковом синдроме);
и когда пациент не нуждается в неотложной терапии или корректировке терапии, и не требуется госпитализация.
Хроническая HF с ухудшающимися признаками и симптомами характеризуется:
(i) наличием структурной или функциональной недостаточности сердца, которая ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма;
(ii) объемной перегрузкой (проявляющейся отеком легких и/или системным отеком) и/или выраженным снижением сердечного выброса (проявляющимся в гипотензии, почечной недостаточности и/или шоковом синдроме);
и когда пациент не нуждается в неотложной терапии, или не требуется госпитализация, но нуждается в корректировке терапии.
Хроническая сердечная недостаточность также может декомпенсироваться (относится к острой декомпенсированной сердечной недостаточности или острой декомпенсированной хронической сердечной недостаточности), что чаще всего является результатом интеркуррентного заболевания (например, пневмонии), инфаркта миокарда, аритмий, неконтролируемой гипертензии или неспособности пациента поддерживать ограничения в жидкости, соблюдать диету или лечение. После лечения пациенты с острой декомпенсированной хронической HF могут вернуться к стабильному хроническому компенсированному статусу (стабильной хронической HF).
Вновь возникшая острая HF и острая декомпенсированная хроническая HF характеризуются:
(i) наличием структурной или функциональной сердечной недостаточности, которая ухудшает его способность обеспечивать достаточный приток крови для удовлетворения потребностей организма;
(ii) объемной перегрузкой (проявляющейся отеком легких и/или системным отеком) и/или выраженным снижением сердечного выброса (проявляющимся в гипотензии, почечной недостаточности и/или шоковом синдроме);
и когда пациент нуждается в неотложной терапии или в корректировке терапии, и не требуется госпитализация.
Острая HF | Хроническая HF | |||
Вновь возникшая AHF | Острая декомпенсированная HF=острая декопенсированная хроническая HF | Ухудшение признаков/симптомов хронической HF | Стабильная хроническая HF |
Вышеприведенные определения острой сердечной недостаточности, вновь возникшей AHF, острой декомпенсированной HF, острой декомпенсированной хронической HF или ухудшение симптомов хронической сердечной недостаточности, соответствуют приведенным в публикации Voors et al., European Journal of Heart Failure (2016), 18, 716-726.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, активность DPP3 можно определить с использованием жидкофазного анализа активности или с использованием анализа активности с захватом фермента.
В жидкофазном анализе образцы жидкостей организма непосредственно подвергаются контактированию с флуорогенным субстратами (например, Arg-Arg-β-NA). Поскольку в плазме много других аминопептидаз (Sanderink et al., 1988), то возможно, что использованный субстрат расщепляется пептидазами, отличными от DPP3. Для того, чтобы обойти эту проблему, одним из предпочтительных способов определения специфической активности DPP3 является использование анализа активности с захватом фермента.
В одном конкретном варианте осуществления определение активной DPP3 в анализе с захватом фермента включает стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое связывается с полноразмерной DPP3, но предпочтительно ингибирует активность DPP3 в жидкофазном анализе менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно менее чем на 30%. Для предупреждения ингибирования DPP3 захватывающее-связывающее соединение не должно связываться с DPP3 в области около активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID NO: 1);
отделения DPP3, связанной с указанным захватывающим-связывающим соединением, от образца жидкости организма;
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3;
количественного определения активности DPP3 измерением превращения субстрата DPP3;
оценки измеренных сигналов в сравнении с контрольными индивидами, не страдающими заболеваниями. Пороговое значение может быть заранее определено, например, измерением концентрации DPP3 и активности DPP3 у здоровых контрольных субъектов и вычислением соответствующего 75-процентиля. Верхняя граница 75-процентиля определяет пороговое значение для здоровых субъектов против больных пациентов.
В одном конкретном варианте осуществления определение активной DPP3 проводят согласно вышеописанному способу по настоящему изобретению.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от Ig.
В конкретном варианте осуществления указанный способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, представляет анализ с захватом фермента (ECA, патент США № 5612186A, патент США № 5601986A). Связывающее DPP3 соединение в этом анализе представляет собой антитело.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное захватывающее-связывающее соединение иммобилизуют на поверхности. Связывающее соединение, реагирующее с белком DPP3, но не оказывающее отрицательного влияния на активность пептидазы более чем на 50%, предпочтительно более чем на 40%, предпочтительно более чем на 30%, может быть иммобилизовано на твердой фазе. Для предупреждения ингибирования DPP3, захватывающее-связывающее соединение не должно связываться с DPP3 в области около активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID NO: 1).
В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида указанное связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела, каркасный белок, отличный от Ig, или аптамеры.
Испытуемый образец пропускают над иммобилизованным связывающим соединением, и DPP3, если она присутствует, связывается со связывающим соединением и сама иммобилизуется для детектирования. Затем может быть добавлен субстрат и продукт реакции можно детектировать для определения присутствия или количества DPP3 в испытуемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» можно использовать для включения любого материала или резервуара, в котором или на котором можно проводить анализ, и она включает, не ограничиваясь этим: пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла, агарозовые смолы (например, Сефароза производства GE Healthcare Life Sciences), магнитные частицы (например, магнитные частицы Dynabeads™ или Pierce™ производства Thermo Fisher Scientific) и т. д.
Связывающие соединения белкового или пептидного происхождения (например, антитело, фрагменты антител, каркасные белки, отличные от IgG) иммобилизуют на твердой фазе способами, включающими физическую адсорбцию (например, электростатическое взаимодействие или гидрофобное взаимодействие), биоаффинную иммобилизацию (например, авидин-биотин, белок А/G/L, His-метку и Ni2+-NTA, GST-метку и глютатион, гибридизацию ДНК, аптамеры), ковалентную связь (например, посредством амина и N-гидроксисукцинимида) или комбинацию указанных методов иммобилизации (Kim & Herr 2013). Связывающие соединения олигонуклеотидного происхождения (например, аптамеры) могут быть иммобилизованы на твердой фазе с использованием системы (стрептококковый) авидин-биотин (Müller et al., 2012, Deng et al., 2014).
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3.
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, превращение указанного субстрата DPP3 иммобилизованной DPP3 измеряется (детектируется) способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
В конкретном варианте осуществления указанного способа диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или ди- и трипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™). Ди- или трипептиды, которые расщепляются под действием DPP3, включают, не ограничиваясь этим, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu -Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Флуорофоры включают, не ограничиваясь этим, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA, Abramic et al., 2000, Ohkubo et al., 1999). Расщепление данных флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина соответственно. Хромофоры включают, не ограничиваясь этим, п-нитроанилида диацетат (pNA). Гидролиз связи пептид-pNK в хромогенных субстратах приводит к высвобождению pNA, который, в свою очередь, изменяет окраску. Таким образом, изменение оптической плотности (DA/мин) прямо пропорционально ферментативной активности. Используя анализ Protease-Glo™ от Promega, при расщеплении DPP3 высвобождается аминолюциферин и служит в качестве субстрата для связанной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.
В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряется добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и определением флуоресценции в режиме реального времени.
Еще одним важным вариантом осуществления настоящего изобретения является ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
Ингибиторы представляют собой молекулы, которые предпочтительно достоверно ингибируют активность DPP3. Данные молекулы могут представлять пептиды и небольшие молекулы (см. таблицу 2) или антитела (см. таблицу 3). Достоверное ингибирование означает ингибирование более чем на 80% в жидкофазном анализе, как описано выше, предпочтительно более чем на 90%, более предпочтительно почти или фактически 100% ингибирование.
Пептидные ингибиторы DPP3 включают, не ограничиваясь этим, спинорфин, синтетические производные спинорфина (тинорфин и другие пептиды, см. таблицу 2, Yamamoto et al., 2000), пропиоксатин А и В (патент США № 4808076) и синтетические аналоги пропиоксатина А (Inaoka et 1988).
Низкомолекулярные ингибиторы DPP3 включают, не ограничиваясь этим, флуостатины и производные бензимидазола. Флуостатины A и B являются антибиотиками, продуцируемыми Streptomyces sp. TA-3391, которые нетоксичны и эффективно ингибируют активность DPP3. К настоящему времени синтезировано, и имеются сообщения о 20 различных производных бензимидазола (Agic et al., 2007; Rastija et al., 2015), из которых два производных 1' и 4' демонстрируют самый высокий ингибирующий эффект (Agic et al., 2007).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения выбранный ингибитор является фармацевтически приемлемым, селективным и/или специфичным для DPP3 и не проходит через клеточную мембрану и/или гематоэнцефалический барьер. Селективные и специфические ингибиторы DPP3 не связываются с другими белками/ферментами или связаны другими белками/ферментами, и не ингибируют какой-либо другой фермент/протеазу/пептидазу, отличную от DPP3. Низкомолекулярные пептиды могут связываться и расщепляться неспецифическими аминопептидазами, и низкомолекулярные ингибиторы легко проходят через клеточную мембрану и гематоэнцефалический барьер. Антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 или каркасные белки, отличные от Ig, против DPP3, специфически и селективно связываются с DPP3 и не проходят через клеточную мембрану или гематоэнцефалический барьер. Следовательно, предпочтительными ингибиторами активности DPP3 являются специфические антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 или каркасные белки, отличные от Ig, против DPP3.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется для профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор выбран из группы, включающей антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяют для профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей: сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
В еще одном варианте осуществления указанное заболевание выбрано из группы, включающей острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, ожоговые травмы, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак и острую почечную недостаточность (AKI).
В одном конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется для профилактики заболевания или патологического состояния у индивида, где заболевание или патологическое состояние представляет острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, рак и острую почечную недостаточность (AKI) и гипотензию.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется в лечении заболевания или патологического состояния у индивида, где заболевание или патологическое состояние представляет острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), печеночную недостаточность, рак и острую почечную недостаточность (AKI) и гипотензию.
В одном конкретном варианте осуществления для всех вариантов осуществления изобретения указанное заболевание не является болезнью Альцгеймера. В одном конкретном варианте осуществления для всех вариантов осуществления изобретения указанное заболевание не является раком. В одном конкретном варианте осуществления для всех вариантов осуществления изобретения указанное заболевание не является ревматоидным артритом.
В одном конкретном варианте осуществления указанное заболевание или патологическое состояние представляет гипотензию.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор активности DPP3 применяется для профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор представляет антитело, которое является моносвязывающим или, по меньшей мере, двусвязывающим.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор или эффектор представляет антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1, в конкретном варианте осуществления антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 2.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые проявляют минимальную аффинность связывания с DPP3 ниже 10-7 М.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые связываются с полноразмерной DPP3 и ингибируют активность DPP3, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%. Активность может быть определена в жидкофазном анализе, как описано выше.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые являются моноспецифическими.
Моноспецифическое антитело против DPP3 или моноспецифический фрагмент антитела против DPP3, или моноспецифический каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, означает, что указанное антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, связываются с одной определенной областью, охватывающей, по меньшей мере, 5 аминокислот в целевой DPP3. Моноспецифическое антитело против DPP3 или моноспецифический фрагмент антитела против DPP3 или моноспецифический каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, представляют антитела против DPP3 или фрагменты антител против DPP3, или каркасные белки, отличные от Ig, против DPP3, которые имеют аффинность к одному и тому же антигену.
В еще одном конкретном и предпочтительном варианте осуществления антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, связывающиеся с DPP3, представляют моноспецифические антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от Ig соответственно, где моноспецифические означает, что указанное антитело или фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от Ig, связываются с одной определенной областью, охватывающей, по меньшей мере, 4 аминокислоты в целевой DPP3. Моноспецифические антитела или фрагменты или каркасные белки, отличные от Ig, по изобретению представляют антитела или фрагменты, или каркасные белки, отличные от Ig, которые имеют аффинность к одному и тому же антигену. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, но моноспецифические антитела также могут быть получены другими способами, чем их получение из общей зародышевой клетки.
В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор или эффектор активности DPP3 применяется в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где указанный субъект имеет повышенный уровень DPP3. Повышенный уровень представляет уровень выше заранее определенного порогового значения.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор активности DPP3, как описано выше, для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, которому вводят ингибитор активности DPP3.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанное заболевание выбрано из группы, включающей: сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор представляет антитело, которое является моносвязывающим или, по меньшей мере, двусвязывающим.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор представляет антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1, в конкретном варианте осуществления антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 2.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые проявляют минимальную аффинность связывания с DPP3 ниже 10-7 М.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые являются моноспецифическими.
В конкретном варианте осуществления способа профилактики или лечения заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный ингибитор или эффектор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые связываются с полноразмерной DPP3 и ингибируют активность DPP3, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%.
В конкретном варианте осуществления изобретения способа профилактики или лечения заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, указанный субъект имеет повышенный уровень DPP3. Повышенный уровень представляет уровень выше заранее определенного порогового значения. Пороговые значения имеют определение, приведенное выше.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является удаление DPP3 из крови пациента. Удаление может быть достигнуто несколькими методами афереза и/или стадиями аффинной хроматографии (Balogun et al., 2010). Данные способы включают, не ограничиваясь этим, фильтрацию плазмы пациента через адсорбент, содержащий специфическое и высокоаффинное антитело к DPP3, связанное с агарозовыми смолами, см. в примере 12 анализ связывания DPP3 с возможным материалом адсорбента.
Фармацевтическая композиция по изобретению формулирована таким образом, чтобы она была совместимой с предполагаемым путем ее введения. Пути введения обычно классифицируются по месту, где применяется соединение. Наиболее распространенные примеры включают пероральное, эпикутанное, подкожное, внутрикожное, сублингвальное, внутримышечное, внутриартериальное, внутривенное и внутрибрюшинное введение.
Фармацевтические композиции также можно вводить через центральную нервную систему (ЦНС), например, эпидуральной (синоним: перидуральной) инъекцией или инфузией в эпидуральное пространство, интрацеребральной (в головной мозг) прямой инъекцией в мозг, интрацеребровентрикулярной (введение в желудочковую систему головного мозга) или интратекальной (в канал спинного мозга) инъекцией.
В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения приведены основные положения:
1. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, включающий:
определение количества общей DPP3 и/или определение количества активной DPP3 в образце жидкости организма указанного индивида;
сравнение указанного определенного количества общей DPP3 или активной DPP3 с заранее определенным пороговым значением;
где у индивида диагностируется наличие заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, если указанное определенное количество выше указанного заранее определенного порогового значения.
2. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по п.1, где количество общей или активной DPP3 определяется в единицах концентрации.
3. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, по пп.1 или 2, где указанный образец выбран из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму.
4. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.1-3, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
5. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.1-4, где количество общей DPP3 и/или количество активной DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного индивида, и включает стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3;
отделения DPP3, связанной с указанным захватывающим-связывающим соединением;
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3;
количественного определения указанной активной DPP3 измерением и количественным определением превращения субстрата DPP3.
6. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по п.5, где указанное захватывающее-связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
7. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по пп.5 или 6, где указанное захватывающее-связывающее соединение представляет антитело.
8. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-7, где захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
9. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-8, где указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3.
10. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-9, где превращение субстрата DPP3 детектируется способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
11. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-10, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или дипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
12. Способ диагностики заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.5-11, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
13. Способ контроля заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида, где способ диагностики по любому из пп.1-12 проводится, по меньшей мере, дважды.
14. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
15. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по п.14, где указанный ингибитор выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3.
16. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по пп.14 или 15, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, тяжелую инфекцию (микробную, вирусную (например, СПИД), паразитарную (например, малярию)) или ССВО или сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), расстройства центральной нервной системы (ЦНС) (например, судороги, нейродегенеративные заболевания), аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания (например, синдром Кавасаки) и гипотензию.
17. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-16, где указанный ингибитор представляет антитело, которое является моносвязывающим или, по меньшей мере, двусвязывающим.
18. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-17, где указанный ингибитор представляет антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1, в частности, которые связываются с SEQ ID NO: 2.
19. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-18, где указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент или каркасный белок, которые проявляют минимальную аффинность связывания с DPP3, равную или ниже 10-7 М.
20. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-19, где указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые являются моноспецифическими.
21. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-20, где указанный ингибитор представляет антитело или фрагмент, или каркасный белок, которые связываются с DPP3 и ингибируют активность DPP3, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%.
22. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.14-21, где указанный ингибитор является селективным и специфичным к DPP3, и не проходит через клеточные мембраны и/или гематоэнцефалический барьер.
23. Ингибитор активности DPP3 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп. 14-22, где указанный субъект имеет количество общей DPP3 и/или количество активной DPP3 в образце жидкости организма указанного индивида, которое выше заранее определенного порогового значения.
24. Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор активности DPP3 по любому из пп.14-23 для применения в профилактике или лечении заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида.
25. Применение ингибитора активности DPP3 по любому из пп.14-23 в способе экстракорпорального удаления DPP3 из плазмы, включающем аферез и аффинную хроматографию.
26. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий стадии:
контактирования указанного образца с захватывающим-связывающим соединением, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3;
отделения DPP3, связанной с указанным захватывающим-связывающим соединением;
добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3;
количественного определения указанной активной DPP3 измерением и количественным определением превращения субстрата DPP3.
27. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по п.26, где указанное захватывающее-связывающее соединение может быть выбрано из группы антитела, фрагмента антитела или каркасного белка, отличного от IgG.
28. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по пп.26 или 27, где указанное захватывающее-связывающее соединение является антителом.
29. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-28, где захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
30. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-29, где указанная стадия отделения представляет стадию промывания, на которой удаляются ингредиенты образца, которые не связаны с указанным захватывающим-связывающим соединением, от захваченной DPP3.
31. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-30, где превращение субстрата DPP3 детектируется способом, выбранным из группы, включающей флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение окраски хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращеннофазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, капиллярный зональный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).
32. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, по любому из пп.26-31, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
33. Способ определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-32, где указанный образец представляет образец крови, выбранный из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму.
34. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида, включающий:
захватывающее-связывающее соединение, которое специфически связывается с полноразмерной DPP3;
субстрат DPP3.
35. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по п.34, где указанное захватывающее-связывающее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG.
36. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по пп.34 или 35, где указанное захватывающее-связывающее соединение ингибирует активность DPP3 менее чем на 50% в жидкофазном анализе, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно менее чем на 30%.
37. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-36, где область связывания DPP3 для захватывающего-связывающего соединения не находится в области аминокислот 316-669 SEQ ID NO: 1.
38. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-37, где указанное захватывающее-связывающее соединение представляет антитело.
39. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-38, где указанное захватывающее-связывающее соединение иммобилизовано на поверхности.
40. Анализ или набор для определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.34-39, где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH, или дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет Arg-Arg.
41. Применение способа определения активной DPP3 в образце жидкости организма индивида по любому из пп.26-33 или применение анализа или набора по любому из пп.34-40 в способе диагностики или контроля заболевания или патологического состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида по любому из пп.1-13.
Примеры
1. Пример 1
Активность DPP3 в плазме пациентов с различными заболеваниями (пациентов с острым инфарктом миокарда (AMI), кардиогенным шоком, септическим шоком и печеночной недостаточностью) определяли с использованием анализа специфической активности DPP3 с захватом и сравнивали с активностью DPP3 в плазме здоровых контрольных субъектов.
1.1. Когорта исследуемых пациентов:
Образцы плазмы были получены от 388 пациентов, поступивших в отделение неотложной помощи непосредственно при их первом представлении. Согласно окончательному диагнозу эти пациенты можно разделить на 4 подгруппы: пациенты, страдающие острым инфарктом миокарда (AMI), кардиогенным шоком, септическим шоком и печеночной недостаточностью. Контрольная группа представляла собой коллекцию образцов плазмы от 93 здоровых контрольных субъектов.
1.2. Анализ активности hDPP3 с захватом:
DPP3 образцов плазмы (10 мкл) сначала обогащали на стадии аффинной очистки, и затем ее активность измеряли добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (подробное описание см. в примере 4). Высчитанные наклоны (в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин-1 мл-1]) увеличения флуоресценции различных образцов относятся к объему образца, равному 10 мкл.
1.3. Результаты:
Сравнение образцов плазмы пациентов и здоровых контрольных субъектов показало достоверно более высокие значения активности DPP3 для всех пациентов с тяжелыми заболеваниями или органной недостаточностью (фиг.10).
2. Пример 2
В данном эксперименте исследовали эффект инъекционного введения рекомбинантной hDPP3 у здоровых крыс по контролю артериального давления.
2.1. Метод:
Для данного исследования использовали крыс самцов Вистар в возрасте 2-3 месяцев (питомник Charles River Laboratories, Германия). Для измерения и регистрации артериального давления (BP) катетер (Introcan-W; 22 G/1''; B.Braun) вводили в артерию carotis communis dextra (правую общую сонную артерию). Человеческую рекомбинантную дипептидилпептидазу-3 с N-концевой GST-меткой (recGST-hDPP3) вводили в хвостовую вену.
Сначала животных анестезировали изофлураном для проведения взвешивания (в целых г) и внутрибрюшинной (в/б) инъекции уретана в дозе 1,2 г/кг массы тела (c=0,4 г/мл) для продолжительной анестезии. Затем с вентральной области шеи выстригали шерстный покров и участок протирали этиловым спиртом. Сосуды препарировали и вводили катетеры. В концы обоих катетеров вводили гепаринизированный изотонический раствор хлорида натрия. Затем датчики давления (medex logical, Medex Medical Ltd.) соединяли с системой мониторинга животного (Datex-Ohmeda, GE). Портативный компьютер через программное обеспечение сбора данных S/5, подключенный к монитору АД, отдельно записывал данные АД.
Крыс обрабатывали recGST-hDPP3 в дозе 0,2 мг/кг в PBS инъекцией в хвостовую вену. Кровяное давление постоянно контролировали до и после инъекции DPP3.
2.2. Результаты:
Инъекция рекомбинантной GST-hDPP3 здоровым крысам приводит к мгновенному снижению артериального давления (фиг.11).
3. Пример 3
Продукция антител и определение способности связываться с DPP3: получали несколько мышиных антител и подвергали скринингу на их способность связываться с DPP3 человека в сэндвич-анализе или анализе активности (см. таблицу 3).
3.1. Методы:
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Синтезировали пептиды DPP3 для иммунизации, см. таблицу 3 (JPT Technologies, Берлин, Германия) с дополнительным N-концевым цистеином (если цистеин отсутствовал в выбранной последовательности DPP3) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA с использованием геля для связывания Sulfolink (Perbio-science, Bonn, Германия). Процедуру связывания проводили в соответствии с инструкцией Perbio. Рекомбинантную GST-hDPP3 получали от USBio.
Иммунизация мышей, слияние и скрининг иммунных клеток:
Мышам Balb/c внутрибрюшинно (в/б) вводили 84 мкг GST-hDPP3 или 100 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA на сутки 0 (эмульгированных в адъюванте TiterMax Gold), 84 мкг или 100 мкг на сутки 14 (эмульгированных в полном адъюванте Фрейнда) и 42 мкг или 50 мкг на сутки 21 и 28 (в неполном адъюванте Фрейнда). На сутки 49 животным вводили внутривенно 42 мкг GST-hDPP3 или 50 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA, растворенных в физиологическом растворе. Через 3 суток мышей подвергали эвтаназии и проводили слияние иммунных клеток.
Спленоциты от иммунизированных мышей и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 сливали с использованием 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывания клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны отбирали культивированием в среде HAT [среда для культивирования RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и добавкой HAT]. Через одну неделю среду HAT заменяли средой НТ на три пассажа с последующим возвратом на обычную клеточную культуральную среду.
Супернатанты клеточной культуры первоначально подвергали скринингу на IgG-антитела, связывающиеся с рекомбинантной DPP3, через две недели после слияния. Соответственно, рекомбинантную GST-меченную DPP3 (USBiologicals, Salem, США) иммобилизовали в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубировали с 50 мкл клеточного культурального супернатанта на лунку в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания планшета добавляли 50 мкл/лунку POD-кроличий антимышиный IgG и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После следующей стадии промывания добавляли 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ o-фенилендиамин в цитратно-гидрофосфатном буфере, 0,012% H2O2) в каждую лунку, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре и хромогенную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 Н серной кислоты. Оптическую плотность определяли при 490 нм.
Тестированные положительные микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и реклонировали с использованием метода предельных разведений и определяли изотипы.
Продукция мышиных моноклональных антител:
Антитела, продуцированные против GST-меченной человеческой DPP3 или пептидов DPP3, получали с помощью стандартных методов получения антител (Marx et al., 1997) и очищали на белке A. Чистота антител составляла ≥ 90% на основе анализа электрофореза в SDS-геле.
Характеристика антител - анализ ингибирования hDPP3
Для анализа способности ингибирования DPP3 различными антителами и клонами антител проводили анализ определения активности DPP3 с использованием известной процедуры (Jones et al., 1982). Рекомбинантную GST-меченную hDPP3 разводили в аналитическом буфере (25 нг/мл GST-DPP3 в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5 и 100 мкМ ZnCl2) и 200 мкл этого раствора инкубировали с 10 мкг соответствующего антитела при комнатной температуре. Через 1 ч предварительной инкубации к раствору добавляли флуорогенный субстрат Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ), и образование свободного βNA во времени контролировали с использованием микропланшетного флуорометра Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°C. Флуоресценцию βNA определяли при волне возбуждения 340 нм и волне эмиссии 410 нм. Вычисляли наклоны (в ОЕФ/мин) увеличения флуоресценции различных образцов. Наклон GST-hDPP3 с контрольным буфером принимали за 100% активность. Ингибирующую способность возможного захватывающего-связывающего соединения определяли по снижению активности GST-hDPP3 инкубацией с указанным захватывающим-связывающим соединением в процентах. Полученные значения снижения активности DPP3 показаны на фиг. 1a и в таблице 3.
3.2. Результаты:
В следующей таблице представлен отбор полученных антител и их максимальная скорость ингибирования (таблица 3). Моноклональные антитела, продуцированные против указанных ниже областей DPP3, отбирали по их способности связываться с нативной DPP3 (mAb-FL-DPP3_2555 в виде твердой фазы и _2553 в качестве индикатора для иммуноанализа, подробности см. в примере 4).
Для анализа активности иммобилизованной DPP3 (см. примеры 6 и 7) необходимо было выбрать антитело на твердой фазе, которое не слишком сильно ингибирует активность DPP3. В качестве порога отсечения для скрининга антител антитела на твердой фазе не должны ингибировать активность DPP3 более чем на 50%. Антитело mAbDPP3_2555 показало наименьшую степень ингибирования (таблица 3, фиг. 1A).
Для получения сильного ингибитора DPP3, который можно было бы использовать в терапевтических целях (см. примеры 6-11), необходимо было выбрать связывающее DPP3 соединение, которое проявляет самую высокую скорость ингибирования. Моноклональное антитело mAbDPP3_1967, обладающее способностью ингибировать активность DPP3 на 70%, было выбрано как возможное терапевтическое антитело (см. фиг. 1A и таблицу 3), и весь дальнейший анализ проводили с использованием этого антитела. На фиг. 1В показана кривая ингибирования mAbDPP3_1967, которое имеет IC50 0,2041 мкг/мл.
Таблица 3 Последовательность иммуногена, обозначение и характеристики продуцированных анти-DPP3-антител |
|||||
Номер последовательности | Антиген/иммуноген | Область hDPP3 | Обозначение | Клон | Максимальное ингибирование DPP3 |
SEQ ID: 1 | GST-меченная рекомбинантная FL-DPP3 | 1-737 | mAb-FL-DPP3 | 2552 | 65% |
2553 | 35% | ||||
2554 | 30% | ||||
2555 | 25% | ||||
SEQ ID: 2 | CETVINPETGEQIQSWYRSGE | 474-493 | mAb-pep1-DPP3 | 1963 | 60% |
1964 | 60% | ||||
1965 | 70% | ||||
1966 | 65% | ||||
1967 | 70% | ||||
1968 | 65% | ||||
1969 | 70% |
4. Пример 4
Определение комбинации антител, которая дает высокие отношения сигнал/шум в иммуноанализе hDPP3.
4.1. Методы:
Получение моноклональных антител
Получали моноклональные антитела к GST-меченной человеческой DPP3, стандартными методами получения антител (Marx et al., 1997) и очищали на белке A. Чистота антител составляла ≥ 90% на основании анализа электрофореза в SDS-геле. Различные клоны анализировали по способности связываться с DPP3. Полученные положительные клоны использовали в виде антител на твердой фазе или индикаторных антител.
Твердая фаза
96-луночные полистироловые микропланшеты (Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывали (1 ч при комнатной температуре) одним клоном анти-DPP3-антитела (захватывающее антитело, 1,5 мкг антитела/0,25 мл 100 ммоль/л, NaCl, 50 ммоль/л Трис/HCl, pH 7,8). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином микропланшеты высушивали в вакууме.
Процедура мечения (индикатор)
100 мкг (100 мкл) другого анти-DPP3-антитела (детектирующее антитело, 1 мг/мл в PBS, pH 7,4) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия, EP 0353971) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Меченное анти-DPP3-антитело очищали гель-фильтрацией ВЭЖХ на Shodex Protein 5 мкм KW-803 (Showa Denko, Япония). Очищенное меченное антитело разбавляли в аналитическом буфере (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na2-EDTA, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычьего IgG, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина, рН 7,4). Конечная концентрация составляла примерно 7×106 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию эфира акридиния измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Калибраторы
Стоковый раствор (в PBS, pH 7,4) рекомбинантной человеческой GST-DPP3 (USBiological, США) линейно разводили, используя (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-ЭДТА, 5 г/л сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычьего IgG, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина, рН 7,4). Стоковый раствор хранили при -80°С. Калибраторы готовили перед использованием.
Иммуноанализ hDPP3
10 мкл образца (или калибратора) пипетировали в покрытые 96-луночные микропланшеты после добавления меченого и разведенного детектирующего антитела (200 мкл), планшеты инкубировали в течение 18-24 ч при 2-8°С. Несвязанный индикатор удаляли промыванием 4 раза по 350 мкл раствора для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Тритон X-100). Связанную с лунками хемилюминесценцию измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
4.2. Результаты:
Все антитела использовали в иммуноанализе сэндвич-типа, в виде покрытого микропланшета и меченого антитела, объединенных в следующих вариантах (таблицы 4 и 5). Инкубацию проводили, как описано в hDPP3-Immunoassay. Результаты приведены в виде соотношения специфического сигнала/фонового сигнала для рекомбинантной человеческой GST-DPP3 (при 100; 10 и 1 нг/мл) и нативной hDPP3 в образцах плазмы.
Все комбинации имели хорошие отношения сигнал/шум для рекомбинантной GST-hDPP3. Кроме того, все комбинации, за исключением 2552 и 2554, давали хорошие отношения сигнал/шум для нативных образцов. Следовательно, все остальные комбинации можно использовать для дальнейших исследований. В отношении самого высокого абсолютного сигнала RLU, то использовали комбинацию 2555 в качестве антитела на твердой фазе и 2553 в качестве меченого антитела.
5. Пример 5
Концентрацию DPP3 в плазме пациентов с различными заболеваниями (пациентов с острой сердечной недостаточностью (AHF), инфарктом миокарда (MI), сепсисом, раком, острой почечной недостаточностью (AKI) и инфекцией нижних дыхательных путей (LRTI)) определяли с использованием иммуноанализа hDPP3 и сравнивали с концентрациями DPP3 в плазме крови здоровых контрольных субъектов.
5.1. Когорта исследуемых пациентов:
Образцы плазмы были получены у 214 пациентов, поступивших в отделение неотложной помощи непосредственно при их первом представлении. Согласно окончательному диагнозу этих пациентов можно разделить на 6 подгрупп: пациенты, страдающие острой сердечной недостаточностью (AHF), инфарктом миокарда (MI), сепсисом, раком, острой почечной недостаточностью (AKI) и инфекцией нижних дыхательных путей (LRTI). Контрольная группа представляла собой коллекцию образцов плазмы от 93 здоровых контрольных субъектов.
5.2. Иммуноанализ hDPP3:
mAbDPP3_2555 использовали в качестве антитела на твердой фазе и mAbDPP3_2553 в качестве меченого индикаторного антитела. Иммобилизацию, мечение и инкубацию антител проводили, как описано в примере 2.
5.3. Результаты:
Вместе с соответствующей подробной информацией, касающейся диагноза, полученные данные были обработаны статистически (фиг.2А). Все пациенты показали достоверно повышенную концентрацию DPP3 в плазме по сравнению со здоровыми контрольными индивидами (нормой). В таблице 6 показан процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы и их соответствующий диагноз. Результаты анализа концентрации DPP3 в плазме указывают на статус заболевания пациента. Данное изобретение можно использовать в областях диагностики, а также для создания основы для терапевтического лечения, например, посредством ингибирования DPP3.
Таблица 6 Сравнение концентраций DPP3 у пациентов с различными заболеваниями и здоровых контрольных субъектов в иммуноанализе сэндвич-типа |
||||||
Процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы | ||||||
Заболевание | AHF | MI | сепсис | рак | AKI | LRTI |
Анализ сэндвич-типа | 48,7 | 64,3 | 85,5 | 91,7 | 51,4 | 53,3 |
Ту же когорту исследуемых пациентов анализировали по показателю смертности. Пациенты, которые умерли после поступления в отделение неотложной помощи, имели значительно более высокую концентрацию DPP3 в плазме, чем пациенты с неотложной ситуацией, но которые выжили в больнице. Таким образом, повышенная концентрация DPP3 указывает на плохой прогноз относительно смертности (фиг.2 B).
6. Пример 6
Количество DPP3 в плазме человека можно определить не только концентрациями DPP3, но также анализом активности. Одной стандартной процедурой является анализ растворимой активности с использованием Arg-Arg-βNA в качестве флуорогенного субстрата:
Активность нативной человеческой DPP III определяли гидролизом Arg-Arg-β-нафтиламида (Bachem Holdig AG, Швейцария) с образованием флуоресцентного бета-нафтиламина. 200 мкл буфера (50 мМ Трис/HCl, pH 8,8, 0,04% NaN3, 50 мкМ амастатина, 100 мкМ лейпептина) и 10 мкл образца (плазмы человека) пипетировали в черные 96-луночные микропланшеты (Greiner Bio-One International GmbH, Австрия)), предварительно нагретые при 37°С в течение 10 мин. После добавления субстрата (20 мкл, 2 мМ) увеличение флуоресценции контролировали в течение 1 ч при 37°С на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) с использованием длины волны возбуждения 340 нм и длины волны эмиссии 410 нм. Наклоны увеличивающейся флуоресценции различных образцов рассчитывали в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин-1 мл-1], по отношению к калибратору свободному βNA.
С описанным стандартом невозможно провести анализ активности растворимой DPP3, поскольку неясно измеряется активность DPP3 или активность других аминопептидаз в плазме. Для получения сигналов, специфичных для DPP3, проводили анализ с захватом фермента, где на первой стадии DPP3 иммобилизовали на поверхности посредством связывания с моноклональным антителом, и после стадии промывания можно измерить только специфическую активность DPP3:
Твердую фазу готовили, как описано в примере 3, с использованием черных 96-луночных микропланшетов (Greiner Bio-One International GmbH, Австрия). 10 мкл образца (плазмы или стандарта) и 200 мкл буфера (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычьего IgG, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина, рН 7,4) пипетировали в указанные покрытые микропланшеты и инкубировали (18-24 ч, 2, 600 об/мин). Несвязанный аналит удаляли промыванием (3 × 350 мкл) раствором для промывания. После добавления субстрата (200 мкл, 100 мкМ, в 50 мМ Трис/HCl, pH (25°C) 8,8, 0,04% NaN3), увеличение флуоресценции контролировали в течение 1 ч при 37°C на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) с использованием длины волны возбуждения 340 нм и с длины волны эмиссии 410 нм. Наклоны увеличивающейся флуоресценции различных образцов рассчитывали в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин-1 мл-1], по отношению к калибратору свободному βNA.
В каждом анализе активности использовали свободный βNA в качестве калибратора. Таким образом, увеличение концентрации βNA (в 200 мкл, в 50 мМ Трис/HCl, pH (25°C) 8,8, 0,04% NaN3, 0; 4; 8; 16; 32; 64; 125; 250 мкМ βNA) измеряли на микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°C с использованием длины волны возбуждения 340 нм и с длины волны эмиссии 410 нм. Все измерения образцов были откалиброваны по этому стандарту βNA.
7. Пример 7
Активность DPP3 в плазме пациентов с различными заболеваниями (пациентов с острой сердечной недостаточностью (AHF), сепсисом, острой почечной недостаточностью (AKI) и инфекциями нижних дыхательных путей (LRTI)) определяли с использованием специфического анализа активности DPP3 с захватом фермента и сравнивали с активностью DPP3 в плазме здоровых контрольных субъектов.
7.1. Методы:
Части когорты, которые анализировали в примере 3, были подвергнуты анализу специфической активности DPP3 с захватом фермента. В данном анализе DPP3 образцы плазмы (10 мкл) сначала обогащали стадией аффинной очистки, и затем измеряли ее активность добавлением флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (подробное описание см. в примере 4). Высчитанные наклоны (в нмоль βNA/мин на мл образца [нмоль βNA мин-1 мл-1]) увеличения флуоресценции в различных образцах относятся к объему, равному 10 мкл.
7.2. Результаты:
Сравнение образцов пациентов и здоровых контрольных субъектов показало достоверно более высокие значения активности DPP3 для всех пациентов (AHF, сепсис, AKI и LTRI, фиг.3).
В таблице 7 показан процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы и их соответствующие диагнозы. Активность показывает лучшее отличие здоровых контрольных субъектов от пациентов с различными заболеваниями.
Таблица 7 Сравнение концентрации DPP3 у пациентов с различными заболеваниями и здоровых контрольных субъектов в иммуноанализе сэндвич-типа и в анализе активности фермента с захватом |
||||||
Процент пациентов с концентрацией DPP3 выше 75-процентиля контрольной группы | ||||||
Заболевание | AHF | MI | сепсис | рак | AKI | LRTI |
Анализ сэндвич-типа | 48,7 | 64,3 | 85,5 | 91,7 | 51,4 | 53,3 |
Анализ активности | 77,8 | данные отсутствуют | 87,0 | данные отсутствуют | 70,0 | 85,7 |
Для еще лучшего сравнения анализа активности DPP3 с анализом определения концентрации, проводили ROC-анализ (характеристическая кривая) для отделения здоровых контрольных субъектов от пациентов с AHF (фиг.4 A) или пациентов с сепсисом (фиг.4 B). Значения площади под кривой (AUC) и доверительного интервала (CI) показаны в таблице 8. Анализ данных показал более высокую специфичность для анализа определения активности по сравнению с иммуноанализом сэндвич-типа.
Таблица 8 Данные ROC-анализа (AUC - площадь под кривой, CI - доверительный интервал) |
|||
Значение | Анализ сэндвич-типа | Анализ активности | |
Норма против AHF | AUC | 0,6747 | 0,8506 |
95% CI | 0,5638-0,7853 | 0,7482-0,9530 | |
p-значение | < 0,005 | < 0,0001 | |
Норма против сепсиса | AUC | 0,8875 | 0,9384 |
96% CI | 0,8270-0,9479 | 0,8865-0,9479 | |
p-значение | < 0,0001 | < 0,0001 |
8. Пример 8
В данном эксперименте оценивали общую безопасность повышающихся доз mAbDPP3 на здоровых мышах.
8.1. Метод:
Мышей самок BALB/c nude (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) (питомник Charles River GmbH, Sulzfeld, Германия) в возрасте 4-5 недель при доставке и массой тела примерно 15-18 г содержали в оптимальных гигиенических условиях, с кондиционированием воздуха с 10-15-кратным обменом воздуха в ч и постоянно контролируемой средой с целевыми диапазонами температуры 22±3°C и относительной влажности 30-70%, искусственным флуоресцентным освещением 12 ч свет/12 ч темнота. Максимально 4 животных содержали в индивидуально вентилируемой клетке (IVC) и скармливали рацион, состоящий из M-Zucht (ssniff Spezialdiäten GmbH), и давали автоклавированную водопроводную воду.
После периода адаптации в течение 4 суток начинали применение mAbDPP3: mAbDPP3 в трех разных концентрациях (0,65 мг/кг; 1,9 мг/кг и 5,75 мг/кг) в PBS вводили 4 мышам на группу. MAbDPP3 вводили внутрибрюшинно (в/б) на сутки 1; 3; 5 и 7, и проводили наблюдение за мышами в течение 14 суток.
8.2. Результаты:
Все мыши выживали в течение 14-суточного периода обработки без проявления побочных эффектов, даже в максимальной дозировке. MAbDPP3 безопасно для применения в других экспериментах на животных, которые всегда будут выполняться с дозой 1,9 мг/кг.
9. Пример 9
В данном эксперименте оценивали общую безопасность обработки mAbDPP3 на здоровых крысах по мониторингу среднего кровяного давления.
9.1. Метод:
Для данного исследования использовали крыс самцов Вистар в возрасте 2-3 месяцев (питомник Charles River Laboratories, Германия). Для измерения и регистрации артериального давления (BP) катетер (Introcan-W; 22 G/1''; B.Braun) вводили в артерию carotis communis dextra (правую общую сонную артерию). Катетер для введения и отбора проб вводили в вену jugularis sinista (левую яремную вену).
Сначала животных анестезировали изофлураном для проведения взвешивания (в целых г) и внутрибрюшинной (в/б) инъекции уретана в дозе 1,2 г/кг массы тела (c=0,4 г/мл) для продолжительной анестезии. Затем с вентральной области шеи выстригали шерстный покров и участок протирали этиловым спиртом. Сосуды препарировали и вводили катетеры. В концы обоих катетеров вводили гепаринизированный изотонический раствор хлорида натрия. Затем датчики давления (medex logical, Medex Medical Ltd.) соединяли с системой мониторинга животного (Datex-Ohmeda, GE). Портативный компьютер через программное обеспечение сбора данных S/5, подключенный к монитору АД, отдельно записывал данные АД.
Крыс обрабатывали PBS, mAbDPP3 в дозе 1,9 мг/кг и 5,75 мг/кг в PBS (n=3 на группу). Соединения вводили через венозный катетер. Кровяное давление контролировали в течение 1 ч перед введением соединений и в течение 6 ч после введения соединений.
9.2. Результаты:
Крысы хорошо переносили обработку mAbDPP3. У крыс, получавших высокую дозу mAbDPP3, имело место небольшое повышение среднего кровяного давления (фиг.5). В общем, mAbDPP3 также безопасно для применения на крысиной модели даже в более высоких дозировках.
10. Пример 10
В данном исследовании оценивали, как обработка mAbDPP3 может повлиять на гибель в результате сепсиса на мышиной модели CLP.
10.1. Методы:
Для исследования использовали мышей самцов в возрасте 12-15 недель C57Bl/6 (питомник Charles River Laboratories, Германия). Перитонит воспроизводили хирургически при легкой анестезии изофлураном. Разрезы делали в левом верхнем квадрате брюшной полости (нормальное расположение слепой кишки). Обнажали слепую кишку и накладывали тугую лигатуру вокруг слепой кишки со швами, дистальнее разреза в тонком кишечнике. Одним проколом иглой 24 размера делали рану в слепой кишке, и небольшое количество содержимого слепой кишки вытекало через рану. Слепую кишку возвращали в брюшную полость, и закрывали участок лапаротомии. Наконец, животных возвращали в клетки со свободным доступом к корму и воде. 500 мкл физиологического раствора вводили п/к для замещения жидкости.
MAbDPP3 (1,9 мг/кг в PBS) тестировали в сравнении с растворителем (PBS). В/в инъекцию соединения и растворителя проводили за 5 мин до CLP (профилактическая обработка) и после полного развития сепсиса через 2 ч после CLP (терапевтическая обработка). Каждая группа включала 10 мышей, и наблюдение за животными проводили в течение 7 суток.
10.2. Результаты:
По данным фиг. 6 следует, что антитело mAbDPP3 достоверно снижало гибель по сравнению с введением PBS. Через 4 суток 75% мышей выживали при обработке mAbDPP3. В отличие от этого почти все мыши пали через 4 суток при обработке растворителем.
11. Пример 11
Модель септического шока использовали для индукции сердечной недостаточности у крыс, и затем для определения влияния mAbDPP3 на функцию сердца.
11.1. Методы:
Дизайн исследования
Схема исследования приведена на фиг. 7A ниже. После CLP или ложной операции животных оставляли на 20 ч восстановиться со свободным доступом к воде и корму. Затем их анестезировали, проводили трахеотомию и прокладывали артериальную и венозную линию. Через 24 ч после операции CLP вводили mAbDPP3 в дозе 2 мг/кг или растворитель (физиологический раствор). Показатели гемодинамики контролировали инвазивно и непрерывно от t=0 до 3 ч. Эхокардиографию сердца проводили сразу после операции, и через 15 мин; 1 ч; 2 ч и 3 ч после введения mAbDPP3 или физиологического раствора.
Модель сепсиса CLP
Крыс самцов Вистар (в возрасте 2-3 месяцев, с массой тела от 300 до 400 г, выборка группы приведена в таблице 1) из Centre d'élevage Janvier (Франция) рандомизировали в одну из трех групп. Всех животные подвергали анестезии с использованием кетамина гидрохлорида (90 мг/кг) и ксилазина (9 мг/кг) внутрибрюшинно (в/б). Для индукции полимикробного сепсиса проводили лигирование и пункцию слепой кишки (CLP) с использованием протокола Rittirsch с незначительной модификацией. Делали вентральный срединный разрез (1,5 см) для обеспечения экстериоризации слепой кишки. Затем слепую кишку лигировали чуть ниже илеоцекального клапана и пунктировали один раз иглой 18 размера. Затем брюшную полость закрывали в двух слоях с последующим восстановлением жидкости (вводили 3 мл/100 г массы тела физиологического раствора подкожно) и животное возвращали в клетку. Контрольных животных подвергали хирургическому вмешательству, без проведения пункции слепой кишки.
Инвазивное измерение кровяного давления
Показатели гемодинамики определяли с использованием системы AcqKnowledge (BIOPAC Systems, Inc., США). Она обеспечивает полностью автоматизированную систему анализа артериального давления. Катетер подключается к системе BIOPAC через датчик давления.
Для проведения данной процедуры крыс анестезировали (кетамин и ксилазин). Животных помещали на нагревательную подушку для поддержания необходимой температуры тела при 37-37,5°C. Датчик температуры с обратной связью вводили в прямую кишку. Крыс помещали на операционный стол в положении лежа на спине. Обнажали трахею, и вводили катетер (16G) для внешнего вентилятора без повреждения сонных артерий и блуждающих нервов. Артериальный катетер вводили в правую сонную артерию. Перед лигированием сонную артерию отделяли от блуждающего нерва.
Через левую яремную вену вводили центральный венозный катетер, позволяющий вводить лекарственное средство.
После операции животным давали время восстановиться до стабильного состояния до проведения гемодинамических измерений. Затем регистрировали исходное кровяное давление (BP). Во время сбора данных инфузию физиологического раствора через артериальную линию останавливали.
Эхокардиография
Животных анестезировали с использованием кетамина гидрохлорида. С области грудной клетки выстригали шерстный покров, и крыс помещали в лежачее положение.
Для исследования трансторакальной эхокардиографией (ТТЭ) использовали коммерчески доступную ультразвуковая систему GE Healthcare Vivid 7, оснащенную высокочастотным линейным датчиком (14 МГц) и 10-МГц датчиком сердечного ритма. Все данные записывались в цифровой форме и сохранялись для последующего оффлайн анализа.
Полутоновые изображения были записаны на глубине 2 см. Двумерное исследование начинали в виде парастернальной проекции по длинной оси для измерения диаметра кольца аорты и диаметра легочной артерии. Также использовали M-режим для измерения размеров левого желудочка (LV) и оценки фракции укорочения (FS%). LVFS рассчитывали как конечно-диастолический диаметр левого желудочка/конечно-систолический диаметр левого желудочка/конечно-диастолический диаметр левого желудочка и выражали в%. Соответственно, конечно-диастолический объем определяли при максимальном диаметре левого желудочка. Соответственно, конечно-систолический объем определяли как минимальный диаметр в одном сердечном цикле. Все параметры измеряли вручную. Для каждого измерения по трем сердечным циклам определяли среднее значение.
Из той же парастернальной проекции по длинной оси регистрировали легочной кровоток с использованием импульсно-волнового допплера. Измеряли интеграл скорости легочного оттока.
Из апикального пятикамерного обзора регистрировали митральный поток с использованием импульсного допплера на уровне кончика митральных клапанов.
Временные точки эксперимента и группы животных
Регистрировали исходный уровень АД и проводили эхокардиографию после операции. Затем вводили mAbDPP3 (2 мг/кг) или растворитель (физиологический раствор) (в течение 5 мин после операции) и начинали инфузию физиологического раствора. Показатели гемодинамики (АД и эхокардиография) регистрировали через 15 мин после введения mAbDPP3 или инъекции растворителя и через 1; 2 и 3 ч после. В опыте была 1 контрольная группа и 2 группы с CLP, которые приведены в таблице ниже (таблица 9). В конце эксперимента животное было подвергнуто эвтаназии, отбирали кровь для получения ЭДТА-плазмы, и собирали органы для последующего анализа.
Таблица 9 Экспериментальные группы |
|||
Группа | Выборка группы | CLP | Обработка |
1 - ложный контроль | 7 | нет | физиологический раствор |
2 - CLP-физиологический раствор | 7 | да | физиологический раствор |
3 - CLP-mAbDPP3 | 10 | да | mAbDPP3 |
11.2. Результаты:
По сравнению с животными в ложном контроле крысы с сепсисом имеют очень низкое кровяное давление и пониженную фракцию укорочения сердца. Применение mAbDPP3 достоверно увеличивало фракцию укорочения (фиг.7B), повышало среднее кровяное давление (фиг.7C) и существенно улучшало состояние крыс с сепсисом.
12. Пример 12
Цель описанного в данном примере исследования заключалась в оценке потенциального антипролиферативного эффекта mAbDPP3 в клеточной культуральной системе in vitro с использованием нескольких линий опухолевых клеток.
12.1. Метод:
Стоковый раствор mAbDPP3 (1 мг/мл в PBS) разбавляли с охватом диапазона конечных концентраций от 0 до 100 мкг/мл. PBS использовали в качестве стандартного соединения. Опухолевые клетки, происходящие из стабильных линий опухолевых клеток (A549, HCT116, MDA-MB231), культивировали в DMEM, содержащей 10% FCS и пенициллин/стрептомицин.
Клетки A549 представляют собой клетки базальной эпителиальной альвеолярной аденокарциномы человека. Эта клеточная линия была впервые была стабильно получена при удалении и культивировании опухолевой легочной ткани эксплантированной опухоли 58-летнего мужчины. В естественных условиях эти клетки плоские и ответственны за диффузию некоторых веществ, таких как вода и электролиты, через альвеолы легких. В случае, если указанные клетки A549 культивируют in vitro, то они растут в виде монослойных клеток, адгезированных к культуральному флакону. Еще одна характеристика заключается в том, что эти клетки способны синтезировать лецитин и содержат высокий уровень ненасыщенных жирных кислот. Линия клеток A549 широко используется в качестве модели in vitro легочных эпителиальных клеток типа II для исследования метаболизма лекарственных средств и в качестве хозяина для трансфекции.
Клеточная линия HCT116 представляет клетки опухоли ободочной кишки человека. Данные эпителиальные клетки обладают адгезивными культуральными свойствами и происходят от взрослого мужчины. Эта клеточная линия является подходящим хозяином для трансфекции. Данная линия имеет мутацию в кодоне 13 протоонкогена ras и может использоваться в качестве положительного контроля для ПЦР-анализов мутации в этом кодоне.
Клеточная линия MDA-MB231 представляет клетки аденокарциномы молочной железы человека, имеющую эпителиальную морфологию. Данные клетки были выделены из плеврального выпота пациентки с раком молочной железы кавказской национальности.
Для каждой клеточной линии готовили 96-луночные планшеты с суспензионной культурой клеток. 100 мкл нижнего слоя мягкого агара (конечная концентрация 0,6% в полной среде) выливали и оставляли для отверждения. Затем поверх добавляли 50 мкл верхнего слоя мягкого агара (конечная концентрация 0,4%), содержащего соответствующие клетки и поверх добавляли количество клеток, отверждали и такие 96-луночные планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, в 10% атмосфере СО2.
На следующий день во внутренние лунки планшета добавляли испытуемые соединения. Затем планшеты инкубировали в термостате для культивирования клеток. Наконец, реакции развивали с использованием Alamar Blue и через 3-5 ч инкубации при 37°C определяли интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения: 560 нм, длины волны эмиссии: 590 нм). В качестве низкого контроля клетки обрабатывали 10-5 М стауроспорином (6-кратные значения). В качестве высокого контроля клетки обрабатывали 0,1% ДМСО (контроль растворителя, 6-кратные значения).
Необработанные данные преобразовывали в показатели роста в процентах на мягком агаре по сравнению с высоким контролем (растворитель 0,1% ДМСО) и низким контролем (10-5 М стауроспорина), которые были установлены на 100% и 0% соответственно. Вычисление IC50 проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 с моделью сигмоидального отклика с переменным наклоном с использованием 0% роста на мягком агаре в качестве нижнего ограничения и без нижнего ограничения и 100% роста на мягком агаре в качестве верхнего ограничения.
12.2. Результаты:
В клеточной культуральной системе оценивали рост трех линий опухолевых клеток (A549, HCT116, MDA-MB231) в зависимости от различных концентраций mAbDPP3 (фиг. 8). Значения IC50 определяли с использованием стандартных параметров на основе сигнала контрольного растворителя в качестве верхнего ограничения (100% рост на мягком агаре) и сигнала контрольного стауроспорина в качестве нижнего ограничения (0% рост на мягком агаре). Соответствующие значения IC50 приведены в таблице 10.
Обработка MAbDPP3 оказывала антипролиферативный эффект на трех тестированных клеточных линиях.
Таблица 10 Значения IC50 для обработки mAbDPP3 |
|||
Клеточная линия | Источник ткани | Время инкубации | IC 50 |
A549 | Легкие | 8 суток | 6,3 мкг/мл |
HCT116 | Ободочная кишка | 8 суток | 2,0 мкг/мл |
MDA-MB231 | Молочная железа | 11 суток | 8,7 мкг/мл |
13. Пример 13
Цель исследования, описанного в данном примере, заключалась в том, чтобы оценить способность mAbDPP3 предупреждать образование опухоли на моделях ксенотрансплантатов злокачественной опухоли молочной железы и злокачественной опухоли ободочной кишки (исследование ингибирования роста опухоли).
13.1. Методы:
Монослойные клетки MDA-MB-231 (рак молочной железы) и клетки HCT-116 (рак ободочной кишки) соответственно, культивировали в DMEM+10% FCS. Клетки культивировали во влажной атмосфере с 90% воздуха и 10% диоксида углерода при 37°С. Среду регулярно заменяли каждые 3 суток. Конфлуентные культуры разделяли 1:3 к 1:3 каждые 3-4 суток с использованием трипсина/ЭДТА и высевали при плотности примерно 3-4 × 106 клеток/15 см2+25 мл среды.
Мышей самок BALB/c nude (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) (питомник Charles River GmbH, Sulzfeld, Германия) в возрасте 4-5 недель при доставке и массой тела примерно 15-18 г содержали в оптимальных гигиенических условиях, с кондиционированием воздуха с 10-15-кратным обменом воздуха в ч и постоянно контролируемой средой с целевыми диапазонами температуры 22±3°C и относительной влажности 30-70%, искусственным флуоресцентным освещением 12 ч свет/12 ч темнота. Максимально 4 животных содержали в индивидуально вентилируемой клетке (IVC) и скармливали рацион, состоящий из M-Zucht (ssniff Spezialdiäten GmbH), и давали автоклавированную водопроводную воду.
В данном исследовании использовали клетки злокачественной молочной железы человека MDA-MB-231 и клетки злокачественной ободочной кишки HCT-116, предоставленные ATCC. Проводили субкультивирование клеток в течение 5 пассажей перед инокуляцией мышам из расчета 3 × 106 клеток/0,1 мкл подкожно в правый бок мыши. Когда объем опухоли достигал примерно 100-200 мм3, 20 мышей, имеющих подходящий размер опухолей, рандомизировали в группы в соответствии с объемом опухоли и массой тела (10 мышей на группу). Испытуемые соединения вводили животным в соответствии с объемом опухоли и массой тела, и начинали введение. Группы указаны в таблице ниже (таблица 11).
Таблица 11 Общее представление стратегии обработки |
||||||||
Группа | Концентрация | Путь введения | Схема | Растворитель | Клеточная линия | Время наблюдений | Количество животных | |
mAbDPP3 - злокачественная опухоль молочной железы | 1,9 мг/кг | в/в | сутки 1, 3, 5, 7, 9 | PBS | MDA-MB231 | 24 суток | 10 | |
mAbDPP3 - злокачественная опухоль ободочной кишки | HCT116 | 28 суток | 10 | |||||
PBS - злокачественная опухоль молочной железы | - | в/в | сутки 1, 3, 5, 7, 9 | PBS | MDA-MB231 | 24 суток | 10 | |
PBS - злокачественная опухоль ободочной кишки | HCT116 | 28 суток | 10 |
Ежедневно наблюдали за поведением и состоянием животных, и каждые 2 суток оценивали рост опухолей измерением штангенциркулем в течение 24 или 28 суток. Размеры первичных опухолей измеряли с помощью штангенциркуля (ручной штангенциркуль, OMC Fontana). Размеры опухолей рассчитывали по формуле V=W2 × L/2 (L=длина и W=перпендикулярная ширина опухоли, L > W). Индивидуальный относительный объем опухолей (RTV) рассчитывали следующим образом: RTV=Vt/V0, где Vt представляет объем на каждый день, и V0 представляет объем в начале обработки.
13.2. Результаты:
На моделях опухолевых ксенотрансплантатов применение mAbDPP3 уменьшало образование всех исследованных опухолей (фиг.9A-D). При обработке mAbDPP3 для увеличения опухоли молочной железы до 20-кратного размера потребовалось на 2 суток дольше (фиг.9 B), и для опухоли ободочной кишки до 10-кратного размера на 2 суток дольше (фиг.9D). На данных моделях опухоли, индуцированные клеточной линией рака ободочной кишки, росли намного медленнее, чем опухоли, индуцированные клеточной линией рака молочной железы.
14. Пример 14
Для оценки возможности применения DPP3-адсорбента для очистки плазмы от избытка DPP3, необходимо было определить, будет ли DPP3 достаточно связываться с колонкой с анти-DPP3-антителом. Колонки для аффинной хроматографии готовили иммобилизацией антител, связывающихся с DPP3, на колонках GlycoLink (Thermo Fisher). Связывание DPP3 с этими колонками анализировали измерением концентрации DPP3 до и после элюирования через эти колонки.
14.1. Методы:
На первой стадии все антитела, связывающиеся с DPP3 (mAbDPP3_2552, 2553, 2554, 2555) окисляли и иммобилизовали на одной колонке GlycoLink каждое в соответствии с инструкцией по применению. Затем на колонку загружали образцы рекомбинантной GST-hDPP3 (USBio) или плазмы пациента, и также определяли связывание DPP3.
Окисление антител
Соответственно, 300 мкл соответствующего раствора анти-DPP3-антитела с концентрацией 3 мг/мл разводили в 700 мкл буфера для связывания GlycoLink до конечного объема 1 мл и рН <6. Для окисления углеводных групп антител 2,1 мг метапериодата натрия добавляли к раствору и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Окисляющий агент удаляли из раствора антитела с использованием обессоливающих колонок.
Подготовка колонок GlycoLink
Для каталитической реакции связывания к окисленному антителу добавляли 0,1 М анилин. Затем раствор наносили на уравновешенную колонку GlycoLink и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Несвязанному материалу давали возможность вытекать с колонки. Затем колонку промывали, уравновешивали и хранили до дальнейшего использования.
Аффинная очистка DPP3
В каждом случае рекомбинантную GST-hDPP3 или плазму пациента разбавляли в буфере для связывания (конечная концентрация recDPP3=100 нг/мл, 1 мл; 1 мл плазмы+1 мл буфера для связывания), наносили mAbDPP3 на уравновешенную колонку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Весь элюент сохраняли для оценки эффективности и способности связывания. Колонку промывали, связанный белок элюировали с использованием буфера для элюирования GlycoLink и колонку уравновешивали перед хранением.
Анализ содержания DPP3
Концентрацию DPP3 в образцах и рекомбинантной GST-hDPP3 перед аффинной очисткой и прохождением измеряли с использованием люминесцентного иммуноанализа сэндвич-типа (подробности см. в примере 4). 20 мкл образца (или калибратора) пипетировали в покрытые 96-луночные микропланшеты, после добавления меченого и разведенного детектирующего антитела (200 мкл), планшеты инкубировали в течение 18-24 ч при 2-8°С. Несвязанный индикатор удаляли промыванием 4 раза по 350 мкл раствора для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Тритон X-100). Связанную с лунками хемилюминесценцию измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
14.2. Результаты:
Почти вся DPP3 в плазме и растворах рекомбинантной DPP3 удалялась из образцов аффинной хроматографией (см. таблицу 12). Различные антитела mAbDPP3 проявляли различную аффинность к DPP3. Поскольку mAbDPP3_2555 показывало самый высокий уровень связывания recDPP3, то это антитело было выбрано для применения в хроматографии образцов плазмы. В таблице 12 показано, что концентрации DPP3 в плазме могут эффективно снижаться с помощью аффинной хроматографии. Полученные результаты показывают, что DPP3-адсорбент можно использовать в аферезе для очистки плазмы от избыточной DPP3.
Таблица 12 Концентрации нативной или рекомбинантной DPP3 в образцах до и после аффинной хроматографии с показанными анти-DPP3-антителами |
|||
Образец | Иммобилизованное антитело | c DPP3 [нг/ мл] | |
до колонки GlycoLink | после колонки GlycoLink | ||
рекомбинантная GST-hDPP3 | 2552 | 100 | 16,3 |
2553 | 100 | 21,6 | |
2554 | 100 | 14,1 | |
2555 | 100 | 8,5 | |
плазма_1 | 2555 | 18 | 1,2 |
плазма_2 | 26,1 | 4,3 | |
плазма_3 | 37,5 | 3,7 |
Ссылки
Abramić M. et al., 2000. Human and rat dipeptidyl peptidase III: Biochemical and mass spectrometric arguments for similarities and differences. Biological Chemistry, 381(December), pp.1233-1243.
Abramić M., Zubanović M. & Vitale L., 1988. Dipeptidyl peptidase III from human erythrocytes. Biol. Chem. Hoppe Seyler, pp.29-38.
Agić D. et al., 2007. Novel amidino-substituted benzimidazoles: Synthesis of compounds and inhibition of dipeptidyl peptidase III. Bioorganic Chemistry, 35(2), pp.153-169.
Almagro J.C., Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci., 2008 Jan. 1;13:1619-33.
Aoyagi T. et al., 1993. Enzymatic Changes in Cerebrospinal Fluid of Patients with Alzheimer-Type Dementia. J. Clin. Biochem. Nutr., 14, pp.133-139.
Balogun R.A. et al., 2010. Clinical applications of therapeutic apheresis. Journal of clinical apheresis, 25(5), pp.250-64.
Baršun M. et al., 2007. Human dipeptidyl peptidase III acts as a post-proline-cleaving enzyme on endomorphins. Biological Chemistry, 388(3), pp.343-348.
Bird et al., 1988. Single-chain antigen-binding proteins. Science, 242:423-426.
Chiba T. et al., 2003. Inhibition of recombinant dipeptidyl peptidase III by synthetic hemorphin-like peptides. Peptides, 24(5), pp.773-778.
Couston R.G. et al., Adsorption behavior of a human monoclonal antibody at hydrophilic and hydrophobic surfaces. mAbs, 5(1), pp.126-39.
Deng B. et al., 2014. Aptamer binding assays for proteins: The thrombin example-A review. Analytica Chimica Acta, 837, pp.1-15.
Dhanda S., Singh J. & Singh H., 2008. Hydrolysis of various bioactive peptides by goat brain dipeptidylpeptidase-III homologue. Cell biochemistry and function, 26(3), pp.339-45.
Ellis S. & Nuenke J.M., 1967. Dipeptidyl Arylamidase III of the Pituitary: Purification and Characterization. Journal of Biological Chemistry, 242(20), pp.4623-4629.
Gamrekelashvili J. et al., 2013. Peptidases released by necrotic cells control CD8+T cell cross-priming. Journal of clinical investigation, 123(11), pp.4755-4768.
Hartley et al, 1982. Radiology 143: 29-36
Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6444-8
Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984
Hultschig C. et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006 February; 10(1):4-10. PMID: 16376134)
Hunkapiller & Hood, 1986. The growing immunoglobulin gene superfamily. Nature, 323:15-16.
Hust M., Meyer T., Voedisch B., Rülker T., Thie H., El-Ghezal A., Kirsch M.I., Schütte M., Helmsing S., Meier D., Schirrmann T., Dübel S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology, 152, 159-170
Huston et al., 1988. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883.
Igic R. & Behnia R., 2007. Pharmacological, immunological, and gene targeting of the renin-angiotensin system for treatment of cardiovascular disease. Current pharmaceutical design, 13(12), pp.1199-214.
Inaoka Y. & Naruto S., 1988. Propioxatins A and B, New Enkephalinase B Inhibitors, IV. Characterization of the Active Site of the Enzyme Using Synthetic Propioxatin Analogues. J. Biochem., 104(5), pp.706-711.
Jones T.H. & Kapralou A, 1982. A rapid assay for dipeptidyl aminopeptidase III in human erythrocytes. Analytical biochemistry, 119(2), pp.418-23.
Kabat et al., 1983. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services.
Khaket T.P. et al., 2012. Enkephalin degrading enzymes: metalloproteases with high potential for drug development. Current pharmaceutical design, 18(2), pp.220-30.
Kim D. & Herr, A.E., 2013. Protein immobilization techniques for microfluidic assays. Biomicrofluidics, 7(4), p.41501.Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562
Kumar P. et al., 2016. Substrate complexes of human dipeptidyl peptidase III reveal the mechanism of enzyme inhibition. Scientific Reports, 6(March), p.23787.
Lanzavecchia A. & Scheidegger D., 1987. The use of hybrid hybridomas to target human cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol., 17:105.
Lee C.M. & Snyder S.H., 1982. Dipeptidyl-aminopeptidase III of rat brain. Selective affinity for enkephalin and angiotensin. The Journal of biological chemistry, 257(20), pp.12043-50.
Li J. et al., 2011. Peptide aptamers with biological and therapeutic applications. Current medicinal chemistry, 18(27), pp.4215-22.
Liu Y. et al., 2007. A genomic screen for activators of the antioxidant response element. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(12), pp.5205-10.
Marx et al., 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121.
Mazzocco C. et al., 2006. Identification and characterization of two dipeptidyl-peptidase III isoforms in Drosophila melanogaster. FEBS Journal, 273(5), pp.1056-1064.
Meliopoulos V.A. et al., 2012. MicroRNA regulation of human protease genes essential for influenza virus replication. PloS one, 7(5), p.e37169.
Müller J. et al., 2016. Aptamer-Based Enzyme Capture Assay for Measurement of Plasma Thrombin Levels. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1380, pp.179-89.
Müller J. et al., 2012. Monitoring of plasma levels of activated protein C using a clinically applicable oligonucleotide-based enzyme capture assay. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 10(3), pp.390-398.
Ohkubo I. et al., 1999. Dipeptidyl peptidase III from rat liver cytosol: purification, molecular cloning and immunohistochemical localization. Biological chemistry, 380(12), pp.1421-1430.
Patel A., Smith H.J. & Sewell R.D., 1993. Inhibitors of enkephalin-degrading enzymes as potential therapeutic agents. Progress in medicinal chemistry, 30, pp.327-78.
Pinheiro Da Silva F. & Nizet V., 2009. Cell death during sepsis: Integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection. Apoptosis, 14(4), pp.509-521.
Prajapati S.C. & Chauhan S.S., 2011. Dipeptidyl peptidase III: a multifaceted oligopeptide N-end cutter. FEBS Journal, 278(18), pp.3256-3276.
Raghupathi R., 2004. Cell death mechanisms following traumatic brain injury. Brain pathology (Zurich, Switzerland), 14(2), pp.215-22.
Rastija V. et al., 2015. Synthesis, QSAR, and Molecular Dynamics Simulation of Amidino-substituted Benzimidazoles as Dipeptidyl Peptidase III Inhibitors. Acta Chimica Slovenica, 62, pp.867-878.
Rittirsch D., Huber-Lang M., Flierl M. Ward P.: Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols 4, - 31-36 (2009)
Sanderink G.J., Artur Y. & Siest G., 1988. Human aminopeptidases: a review of the literature. Journal of clinical chemistry and clinical biochemistry. Zeitschrift für klinische Chemie und klinische Biochemie, 26(12), pp.795-807.
Schütte M., Thullier P., Pelat T., Wezler X., Rosenstock P., Hinz D., Kirsch M.I., Hasenberg M., Frank R., Schirrmann T., Gunzer M., Hust M., Dübel S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625.
Shimamori Y., Watanabe Y. & Fujimoto Y., 1986. Purification and Characterization of Dipeptidyl Aminopeptidase III from Human Placenta. Chem. Pharm. Bull., 34(8), pp.3333-3340.
Šimaga Š. et al., 1998. Dipeptidyl peptidase III in malignant and non-malignant gynaecological tissue. European Journal of Cancer, 34(3), pp.399-405.
Šimaga Š. et al., 2003. Tumor cytosol dipeptidyl peptidase III activity is increased with histological aggressiveness of ovarian primary carcinomas. Gynecologic Oncology, 91(1), pp.194-200.
Singh R. et al., 2014. Transcription factor C/EBP-beta mediates downregulation of dipeptidyl-peptidase III expression by interleukin-6 in human glioblastoma cells. FEBS Journal, 281, pp.1629-1641.
Vandenberg I., King F. & Kuchel P., 1985. Enkephalin Degradation by Human Erythrocytes and Hemolysates Studied Using 1H NMR Spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics, 242(2), pp.515-522.
Vanha-Perttula T., 1988. Dipeptidyl peptidase III and alanyl aminopeptidase in the human seminal plasma: origin and biochemical properties. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 177(2), pp.179-95.
Wattiaux R. et al., 2007. Lysosomes and Fas-mediated liver cell death. The Biochemical journal, 403(1), pp.89-95.
Wild David (2005). The Immunoassay Handbook, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed., ISBN-13: 978-0080445267
Xu Y., Yang X. & Wang E., 2010. Review: Aptamers in microfluidic chips. Analytica chimica acta, 683(1), pp.12-20.
Yamamoto Y. et al., 2000. Characterization of tynorphin, a potent endogenous inhibitor of dipeptidyl peptidaseIII. Peptides, 21(4), pp.503-8.
Yamamoto Y. et al., 1998. Inhibitory action of spinorphin, an endogenous regulator of enkephalin-degrading enzymes, on carrageenan-induced polymorphonuclear neutrophil accumulation in mouse air-pouches. Life sciences, 62(19), pp.1767-73.
Zong W.-X. & Thompson C.B., 2006. Necrotic Cell Death as a Cell Fate. Genes & Development, 20, pp.1-5.
Zuk et al., Enzyme Immunochromatography--A Quantitative Immunoassay Requiring No Instrumentation, Clinical Chemistry, 31 (7): 1144-1150 (1985).
Последовательности
SEQ ID NO: 1
hDPP3 AS 1-737
MADTQYILPNDIGVSSLDCREAFRLLSPTERLYAYHLSRAAWYGGLAVLLQTSPEAPYIYALLSRLFRAQDPDQLRQHALAEGLTEEEYQAFLVYAAGVYSNMGNYKSFGDTKFVPNLPKEKLERVILGSEAAQQHPEEVRGLWQTCGELMFSLEPRLRHLGLGKEGITTYFSGNCTMEDAKLAQDFLDSQNLSAYNTRLFKEVDGEGKPYYEVRLASVLGSEPSLDSEVTSKLKSYEFRGSPFQVTRGDYAPILQKVVEQLEKAKAYAANSHQGQMLAQYIESFTQGSIEAHKRGSRFWIQDKGPIVESYIGFIESYRDPFGSRGEFEGFVAVVNKAMSAKFERLVASAEQLLKELPWPPTFEKDKFLTPDFTSLDVLTFAGSGIPAGINIPNYDDLRQTEGFKNVSLGNVLAVAYATQREKLTFLEEDDKDLYILWKGPSFDVQVGLHELLGHGSGKLFVQDEKGAFNFDQETVINPETGEQIQSWYRSGETWDSKFSTIASSYEECRAESVGLYLCLHPQVLEIFGFEGADAEDVIYVNWLNMVRAGLLALEFYTPEAFNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGLVTITPTTGSDGRPDARVRLDRSKIRSVGKPALERFLRRLQVLKSTGDVAGGRALYEGYATVTDAPPECFLTLRDTVLLRKESRKLIVQPNTRLEGSDVQLLEYEASAAGLIRSFSERFPEDGPELEEILTQLATADARFWKGPSEAPSGQA
SEQ ID NO: 2
hDPP3 AS 474-493 (N-Cys)
CETVINPETGEQIQSWYRSGE
Описание фигур
Фиг.1: ингибирование активности DPP3
(A) Активность рекомбинантной GST-hDPP3 измеряли в присутствии нескольких различных анти-DPP3-антител. DPP3-связывающие антитела, которые были получены против пептидов и/или полноразмерной (FL) нативной DPP3, проявляют сильный ингибирующий эффект на уровне до 70%.
(B) Кривая ингибирования рекомбинантной GST-hDPP3 ингибирующим mAbDPP3. Ингибирование DPP3 специфическим антителом зависит от концентрации, со значением IC50 примерно 0,2 мкг/мл.
Фиг 2: концентрация DPP3 в качестве диагностического маркера
A) концентрация DPP3 в ЭДТА-плазме здоровых контрольных субъектов и пациентов с различными заболеваниями (AHF - острая сердечная недостаточность, MI - инфаркт миокарда, сепсис, рак, AKI - острая почечная недостаточность, LRTI - инфекция нижних дыхательных путей). Медианы групп пациентов достоверно отличаются от здоровых контрольных субъектов (тест Манна-Уитни p <0,005).
(B) Сравнение концентраций DPP3 в плазме пациентов, которые умерли вскоре после поступления в отделение неотложной помощи, и выживших пациентов. У выживших пациентов достоверно более низкие уровни DPP3 (тест Манна-Уитни p <0,05).
Фиг. 3: Активность DPP3 в качестве диагностического маркера
Активность DPP3 в ЭДТА-плазме здоровых контрольных субъектов и пациентов с различными заболеваниями (AHF - острая сердечная недостаточность, сепсис, AKI - острая почечная недостаточность, LRTI - инфекция нижних дыхательных путей). Медианы групп пациентов достоверно отличаются от здоровых контрольных субъектов (тест Манна-Уитни p <0,0001).
Фиг. 4: Анализ с ROC-кривой для определения активности и концентрации DPP3.
(A) ROC-анализ здоровых контрольных субъектов и пациентов, страдающих AHF.
(B) ROC-анализ здоровых контрольных субъектов и пациентов, страдающих сепсисом.
Фиг. 5: Безопасность обработки mAbDPP3 (кровяное давление)
Здоровых крыс обрабатывали PBS или mAbDPP3 (5,75 мг/кг). Кровяное давление (BP) измеряли и регистрировали через катетер, введенный в правую общую сонную артерию. Катетер для введения и отбора проб вводили в левую яремную вену. Обработка приводит к незначительному повышению относительного кровяного давления по сравнению с крысами, обработанными PBS (n=3 на группу).
Фиг. 6: Влияние mAbDPP3 на гибель мышей от сепсиса
Мышей с сепсисом (модель CLP) обрабатывали PBS или mAbDPP3 (1,9 мг/кг) за 5 мин до и через 2 ч после CLP. Наблюдение за гибелью животных проводили в течение 7 суток. График по методу Каплана-Майера показывает повышенную выживаемость мышей с сепсисом после обработки mAbDPP3.
Фиг. 7: Влияние mAbDPP3 на сердечную недостаточность у крыс с сепсисом
(A) Схема исследования сердечной недостаточности у крыс при септическом шоке.
(В) CLP вызывает сердечную недостаточность у крыс, о чем свидетельствует уменьшение фракции укорочения по сравнению с контрольными животными. Данная фракция укорочения достоверно повышается при обработке mAbDPP3 (2 мг/кг, n ≥ 7 на группу, тест Манна-Уитни p <0,0001).
(C) Среднее кровяное давление у обработанных растворителем крыс с сепсисом снижается во времени, тогда как обработка mAbDPP3 приводит к достоверному увеличению mBP (2 мг/кг, n ≥ 7 на группу, тест Манна-Уитни p <0,005).
Фиг. 8: Влияние mAbDPP3 на рост опухоли in vitro
Анализ на мягком агаре с линиями опухолевых клеток (злокачественные опухоли легких, ободочной кишки и молочной железы). Добавление анти-DPP3-антитела снижает рост опухолевых клеток.
Фиг. 9: Влияние mAbDPP3 на рост опухоли in vivo
(A) Мышей с ксенотрансплантатом клеток злокачественной опухоли молочной железы (n=10 на группу) обрабатывали PBS или mAbDPP3. Кривая роста относительного объема опухолей в течение 24 суток показывает снижение роста опухоли у мышей, обработанных mAbDPP3.
(B) Сравнение времени, в течение которого объем опухоли молочной железы должен увеличиваться в 20 раз с и без обработки mAbDPP3. Рост занимает значительно больше времени при обработке mAbDPP3 (тест Манна-Уитни, p <0,05).
(C) Мышей с ксенотрансплантатом клеток злокачественной опухоли ободочной кишки (n=10 на группу) обрабатывали PBS или mAbDPP3. Кривая роста относительного объема опухоли в течение 30 суток показывает снижение роста опухоли у мышей, обработанных mAbDPP3.
(D) Сравнение времени, в течение которого объем опухоли ободочной должен увеличиваться в 10 раз с и без лечения mAbDPP3. Рост занимает больше времени при обработке mAbDPP3.
Фиг. 10: Активность DPP3 в качестве диагностического маркера (II)
Активность DPP3 в ЭДТА-плазме здоровых контрольных субъектов и пациентов с различными заболеваниями (острый инфаркт миокарда (MI), кардиогенный шок, септический шок и печеночная недостаточность). Медианы групп пациентов достоверно отличаются от здоровых контрольных субъектов (тест Манна-Уитни p <0,05).
Фиг. 11: Влияние DPP3 на кровяное давление у здоровых крыс
Здоровым самцам крыс Вистар вводили 0,2 мг/кг рекомбинантной GST-hDPP3. Кровяное давление (BP) измеряли и регистрировали через катетер, введенный в правую общую сонную артерию. DPP3 вводили в/в в хвостовую вену. Инъекция DPP3 приводит к снижению АД.
--->
Список последовательностей
<110> СФИНГОТЕК ТЕРАПЬЮТИКС ГМБХ
<120> Способы определения DPP3 и терапевтические способы
<130> S75076WO
<150> 16166476.8
<151> 2016-04-21
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 737
<212> БЕЛОК
<213> человек
<400> 1
Met Ala Asp Thr Gln Tyr Ile Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Ser Ser
1 5 10 15
Leu Asp Cys Arg Glu Ala Phe Arg Leu Leu Ser Pro Thr Glu Arg Leu
20 25 30
Tyr Ala Tyr His Leu Ser Arg Ala Ala Trp Tyr Gly Gly Leu Ala Val
35 40 45
Leu Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ala Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Ser
50 55 60
Arg Leu Phe Arg Ala Gln Asp Pro Asp Gln Leu Arg Gln His Ala Leu
65 70 75 80
Ala Glu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Phe Leu Val Tyr Ala
85 90 95
Ala Gly Val Tyr Ser Asn Met Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Gly Asp Thr
100 105 110
Lys Phe Val Pro Asn Leu Pro Lys Glu Lys Leu Glu Arg Val Ile Leu
115 120 125
Gly Ser Glu Ala Ala Gln Gln His Pro Glu Glu Val Arg Gly Leu Trp
130 135 140
Gln Thr Cys Gly Glu Leu Met Phe Ser Leu Glu Pro Arg Leu Arg His
145 150 155 160
Leu Gly Leu Gly Lys Glu Gly Ile Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Cys
165 170 175
Thr Met Glu Asp Ala Lys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Asp Ser Gln Asn
180 185 190
Leu Ser Ala Tyr Asn Thr Arg Leu Phe Lys Glu Val Asp Gly Glu Gly
195 200 205
Lys Pro Tyr Tyr Glu Val Arg Leu Ala Ser Val Leu Gly Ser Glu Pro
210 215 220
Ser Leu Asp Ser Glu Val Thr Ser Lys Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Arg
225 230 235 240
Gly Ser Pro Phe Gln Val Thr Arg Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Leu Gln
245 250 255
Lys Val Val Glu Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser
260 265 270
His Gln Gly Gln Met Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Gln Gly
275 280 285
Ser Ile Glu Ala His Lys Arg Gly Ser Arg Phe Trp Ile Gln Asp Lys
290 295 300
Gly Pro Ile Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe Ile Glu Ser Tyr Arg Asp
305 310 315 320
Pro Phe Gly Ser Arg Gly Glu Phe Glu Gly Phe Val Ala Val Val Asn
325 330 335
Lys Ala Met Ser Ala Lys Phe Glu Arg Leu Val Ala Ser Ala Glu Gln
340 345 350
Leu Leu Lys Glu Leu Pro Trp Pro Pro Thr Phe Glu Lys Asp Lys Phe
355 360 365
Leu Thr Pro Asp Phe Thr Ser Leu Asp Val Leu Thr Phe Ala Gly Ser
370 375 380
Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Gln
385 390 395 400
Thr Glu Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Gly Asn Val Leu Ala Val Ala
405 410 415
Tyr Ala Thr Gln Arg Glu Lys Leu Thr Phe Leu Glu Glu Asp Asp Lys
420 425 430
Asp Leu Tyr Ile Leu Trp Lys Gly Pro Ser Phe Asp Val Gln Val Gly
435 440 445
Leu His Glu Leu Leu Gly His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Val Gln Asp
450 455 460
Glu Lys Gly Ala Phe Asn Phe Asp Gln Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu
465 470 475 480
Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp Tyr Arg Ser Gly Glu Thr Trp Asp
485 490 495
Ser Lys Phe Ser Thr Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Glu Cys Arg Ala Glu
500 505 510
Ser Val Gly Leu Tyr Leu Cys Leu His Pro Gln Val Leu Glu Ile Phe
515 520 525
Gly Phe Glu Gly Ala Asp Ala Glu Asp Val Ile Tyr Val Asn Trp Leu
530 535 540
Asn Met Val Arg Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Phe Tyr Thr Pro Glu
545 550 555 560
Ala Phe Asn Trp Arg Gln Ala His Met Gln Ala Arg Phe Val Ile Leu
565 570 575
Arg Val Leu Leu Glu Ala Gly Glu Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Thr
580 585 590
Thr Gly Ser Asp Gly Arg Pro Asp Ala Arg Val Arg Leu Asp Arg Ser
595 600 605
Lys Ile Arg Ser Val Gly Lys Pro Ala Leu Glu Arg Phe Leu Arg Arg
610 615 620
Leu Gln Val Leu Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Gly Gly Arg Ala Leu
625 630 635 640
Tyr Glu Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Pro Pro Glu Cys Phe Leu
645 650 655
Thr Leu Arg Asp Thr Val Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Lys Leu Ile
660 665 670
Val Gln Pro Asn Thr Arg Leu Glu Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu
675 680 685
Tyr Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ile Arg Ser Phe Ser Glu Arg Phe
690 695 700
Pro Glu Asp Gly Pro Glu Leu Glu Glu Ile Leu Thr Gln Leu Ala Thr
705 710 715 720
Ala Asp Ala Arg Phe Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ala Pro Ser Gly Gln
725 730 735
Ala
<210> 2
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> человек
<400> 2
Cys Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp
1 5 10 15
Tyr Arg Ser Gly Glu
20
<---
Claims (6)
1. Применение ингибитора активности DPP3, который представляет собой анти-DPP3 антитело, фрагмент анти-DPP3 антитела или каркасный белок, отличный от Ig, против DPP3, которые связываются с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, для лечения заболевания или состояния, сопровождаемого или связанного с некротическими процессами, у индивида,
где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сердечную недостаточность, хроническую сердечную недостаточность, острую сердечную недостаточность (AHF), инфаркт миокарда (MI), инсульт, печеночную недостаточность, ожоговые травмы, травматические повреждения, микробную инфекцию, СПИД, малярию, ССВО, сепсис, рак, острую почечную недостаточность (AKI), судороги, нейродегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания, сосудистые заболевания и гипотензию.
2. Применение по п.1, где антитело, или фрагмент, или каркас проявляет минимальную аффинность связывания с DPP3, равную или ниже 10-7 М.
3. Применение по п.1 или 2, где антитело, или фрагмент, или каркасный белок связывается с DPP3 и ингибирует активность DPP3 по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%.
4. Применение по любому из пп.1-3, где антитело, или фрагмент, или каркасный белок не проходит через клеточные мембраны и/или гематоэнцефалический барьер.
5. Применение по любому из пп.1-4, где указанный индивид имеет количество общей DPP3 и/или количество активной DPP3 в образце жидкости организма указанного индивида, которое выше заранее определенного порогового значения.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16166476 | 2016-04-21 | ||
EP16166476.8 | 2016-04-21 | ||
PCT/EP2017/059377 WO2017182561A1 (en) | 2016-04-21 | 2017-04-20 | Methods for determining dpp3 and therapeutic methods |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022112015A Division RU2022112015A (ru) | 2016-04-21 | 2017-04-20 | Способы определения ddp3 и терапевтические способы |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018140832A RU2018140832A (ru) | 2020-05-21 |
RU2018140832A3 RU2018140832A3 (ru) | 2020-08-14 |
RU2771824C2 true RU2771824C2 (ru) | 2022-05-12 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005106486A2 (en) * | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostic and therapeutics for diseases associated with dipeptidyl-peptidase 3(dpp3) |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005106486A2 (en) * | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostic and therapeutics for diseases associated with dipeptidyl-peptidase 3(dpp3) |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
AGIC D. et al. Novel amidino-substituted benzimidazoles: Synthesis of compounds and inhibition of dipeptidyl peptidase III// Bioorganic Chemistry. - 2007. - V.35. - N.2. - P.153-169. * |
SIMAGA S. et al. Dipeptidyl Peptidase III in Malignant and Non-malignant Gynaecological Tissue// European Journal of Cancer. - 1998. - V. 34. - N. 3. - P. 399-405. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7219737B2 (ja) | Dpp3の定量方法および治療方法 | |
US20220307065A1 (en) | Therapy guidance and/or therapy monitoring for treatment of shock | |
US20230104578A1 (en) | Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for use in therapy or prevention of shock | |
CN115244401A (zh) | 用于在休克患者中进行nt-adm抗体的治疗指导、监测和分层的dpp3 | |
RU2771824C2 (ru) | Способы определения dpp3 и терапевтические способы | |
US20220211798A1 (en) | Therapy guidance and/or therapy monitoring for a treatment with angiotensin-receptor-agonist and/or a precursor thereof | |
CA3207969A1 (en) | Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for use in therapy or prevention of shock and prediction of an increase of dpp3 in a critically ill patient | |
WO2024023368A1 (en) | Prediction of an increase of dpp3 in a patient with septic shock | |
WO2024023369A1 (en) | Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for use in therapy or prevention of shock | |
CN115769076A (zh) | 感染冠状病毒的患者中的dpp3 |