DE3853320T2 - Fluorophore für die Abkapselung in Liposome. - Google Patents
Fluorophore für die Abkapselung in Liposome.Info
- Publication number
- DE3853320T2 DE3853320T2 DE3853320T DE3853320T DE3853320T2 DE 3853320 T2 DE3853320 T2 DE 3853320T2 DE 3853320 T DE3853320 T DE 3853320T DE 3853320 T DE3853320 T DE 3853320T DE 3853320 T2 DE3853320 T2 DE 3853320T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- carboxyfluorescein
- bis
- fluorescein
- methylglucamide
- liposomes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title abstract description 87
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 title description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 38
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 17
- -1 fluorescein derivative compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical class OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 73
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 20
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 15
- MCGUHCAGEHVXTR-UHFFFAOYSA-N 2-(2-hydroxyethylamino)prop-2-en-1-ol Chemical compound OCCNC(=C)CO MCGUHCAGEHVXTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- LOAPQPIRTYQPTA-UHFFFAOYSA-N 2-(carboxymethylamino)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=C)C(O)=O LOAPQPIRTYQPTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 13
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- CUHFCSMYBZBTIT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethenylamino)acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC=C CUHFCSMYBZBTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KQJQICVXLJTWQD-UHFFFAOYSA-N N-Methylthiourea Chemical compound CNC(N)=S KQJQICVXLJTWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004682 aminothiocarbonyl group Chemical group NC(=S)* 0.000 claims description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 3
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 abstract description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 10
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 8
- YVTPVJDECOUTJW-UHFFFAOYSA-N 3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonyl-2-(3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)benzoic acid;4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonyl-2-(3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound C1=C(C2=C3C=CC(=O)C=C3OC3=CC(O)=CC=C32)C(C(=O)O)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O.C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(=O)C=CC2=C1C=1C(C(=O)O)=CC=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O YVTPVJDECOUTJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000010408 film Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 125000001834 xanthenyl group Chemical group C1=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3C(C12)* 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 125000005506 phthalide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 3
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N n-octyl beta-D-glucopyranoside Natural products CCCCCCCCOC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- CBOJBBMQJBVCMW-NQZVPSPJSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-amino-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal;hydrochloride Chemical compound Cl.O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO CBOJBBMQJBVCMW-NQZVPSPJSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOBLSBAZCVBABY-WPWUJOAOSA-N 1,6-diphenylhexatriene Chemical compound C=1C=CC=CC=1\C=C\C=C\C=C\C1=CC=CC=C1 BOBLSBAZCVBABY-WPWUJOAOSA-N 0.000 description 1
- GHPCICSQWQDZLM-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenyl)sulfonyl-1-methyl-3-propylurea Chemical compound CCCNC(=O)N(C)S(=O)(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 GHPCICSQWQDZLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKDVEBUNYUKMMN-UHFFFAOYSA-N 2-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=C1NC1=CC=CC=C1 HKDVEBUNYUKMMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RROGZKOUUYGSDS-UHFFFAOYSA-N 4-aminonaphthalene-1,2,3-trisulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C(S(O)(=O)=O)=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 RROGZKOUUYGSDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWKUXQNLWDTSLO-GWQJGLRPSA-N N-hexadecanoylsphingosine-1-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC RWKUXQNLWDTSLO-GWQJGLRPSA-N 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQCNTXNJFIZWIK-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol;propan-2-one Chemical compound OC.CC(C)=O.CC(O)=O RQCNTXNJFIZWIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IRTLGLYSFAKASM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propan-2-ol Chemical compound CC(C)O.CC(O)=O IRTLGLYSFAKASM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- TVMUHOAONWHJBV-UHFFFAOYSA-N dehydroglycine Chemical compound OC(=O)C=N TVMUHOAONWHJBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 125000003071 maltose group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- HNWCOANXZNKMLR-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O HNWCOANXZNKMLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/10—Spiro-condensed systems
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Fluoresceinderivate, sie betrifft Liposompräparate, die dieselben mit einbeziehen, und sie betrifft Immunoassaysysteme, die auf der Verwendung solcher Liposome beruhen.
- Liposome sind kugelförmige Bläschen der Größenordnung Mikron aus amphipathischen Molekülen, die einen wäßrigen Innenraum vom Hauptteil der äußeren wäßrigen Umgebung isolieren. Liposome können so hergestellt werden, daß sie hydrophobe Moleküle innerhalb ihrer Membran enthalten, oder daß sie hydrophile Markierungen innerhalb ihres wäßrigen Innenraumes enthalten, oder auch beides gleichzeitig. Diese Abwandelbarkeit macht die Liposome sowohl als potentielle Transportstoffe für die Abgabe von Arzneien in vivo als auch als Basis für homogene Immunoassaysysteme in vitro interessant.
- Es sind viele Immunoassaysysteme, die Liposome verwenden, beschrieben worden. Z.B. beschreibt O'Connell et al., Clin. Chem., 31:1424-1426 (1985) ein einfaches Konkurrenz- Bindungsimmunoassay zum Nachweis von Digoxin, das Liposome verwendet, wobei die Liposome Sulforhodamin B als Tracer einkapseln. Ein anderes Immunoassaysystem ist das empfindliche homogene Liposom-immunolytische Assay (LILA), das die Antikörper-ausgelöste komplementvermittelte Lyse von Liposomen mit einbezieht. Bei einem als Beispiel genannten Assayformat wird ein Liposom, das eine Markierung einkapselt, dadurch immunreaktiv gemacht, daß z.B. ein Antigen an die Liposomoberfläche gekoppelt wird, und das Liposom wird mit einer flüssigen Probe inkubiert, die auf die Gegenwart von Antikörpern, die gegen das Antigen immunreaktiv sind, analysiert werden soll. Die nachfolgende Bindung eines spezifischen Antikörpers an dieses Antigen bildet einen Liposomimmunkomplex. Bei Zugabe von Serum zu diesem Liposomkomplex wird Komplementaktivierung ausgelöst, die zur Lyse des Liposoms und zur Abgabe der inneren Markierungssubstanz führt.
- Der Nachweis dieses lytischen Ereignisses kann auf eine Vielzahl von Arten erbracht werden, die von der Natur der Markierung abhängen, die anfänglich in dem Liposom eingekapselt war. Z.B. beschreiben Kataoka et al., Eur. J. Biochem., 24:123 (1971) sensitivierte Liposomen, welche eingeschlossene Glukosemarkierungen abgeben, wenn sie mit einem geeigneten Antiserum und einer Komplementquelle inkubiert werden.
- Viele Fluroeszenzmarkierungen wurden erfolgreich mit Liposomen verbunden oder in diesen eingeschlossen, und zwar einschließlich sowohl fettlöslicher Verbindungen wie 1,6- Diphenylhexatrien, Diacyloxacarbocyanin, Diacylindocarbocyanin und 4-Nitrobenzol-2-oxadiazol; als auch wasserlöslicher Verbindungen wie Carboxyfluorescein, Lucifergelb, Aminonaphthalintrisulfonat und Anilinonaphthalinsulfonat, Barbet J., Fluorescent Tracers for Lipsomes. Inserm, 107:27-36 (1982).
- Es wurden verschiedene Methoden für den fluoreszenten Nachweis der Liposomlyse beschrieben, einschließlich der Einkapselung eines Fluorophors in selbstlöschenden Konzentrationen, gefolgt von der Lyse und der Wiederherstellung von Fluoreszenz, Weinstein et al., Science, 195:489-491 (1977); der Verdünnung eines Fluorophors und eines Löschers, Vanderwerf et al., Biochern. Biophys. Acta., 596:302-314 (1980); der Bildung fluoreszenter Komplexe, Wilschut et al., Biochemistry, 19:6011- 6021 (1980); der Löschung durch Komplexbildung, Kendall et al., Biol. Chem., 257:13892-5 (1982) und der Resonanzenergieübertragung unter Verwendung zweier Fluorophore, Struck et al., Biochemistry, 20:4093-4099 (1981).
- Wenn eine fluoreszente Verbindung in selbstlöschenden Konzentrationen innerhalb des inneren wäßrigen Raums eines Liposoms eingekapselt ist, tritt bei der Liposomlyse eine starke Verdünnung des Fluorophors ein. Eine selbstlöschende Konzentration ist als die Konzentration definiert, bei der die Fluoreszenz des Fluorophors im Vergleich zu der maximal erreichbaren Fluoreszenz unter extremen Verdünnungsbedingungen reduziert ist. Die nachfolgende Verdünnung stellt die Fluoreszenz wieder her, und der Anstieg der Fluoreszenz über das Hintergrundniveau hinaus ist im Idealfall zu der Konzentration an in der Assayprobe vorhandenem Analyt proportional.
- Als ein Beispiel beschreiben Ishimori et al., J. Tmmuno. Methods, 75:351-360 (1984) ein Immunoassayverfahren, das die Immunolyse von Liposomen zur Messung von Antikörpern gegen Proteinantigene wie Human-IgG verwendet. Die verwendete Abgabemarkierung ist Carboxyfluorescein und das Verfahren ist erwiesenermaßen zum Nachweis von Konzentrationen von 10&supmin;¹&sup5; Mol an anti-human-IgG-Antikörper, oder, in einem Inhibitionsassay, an Human-IgG, wirksam. Yasuda et al., J. Immun. Methods, 44:153-158 (1981) beschreiben die Verwendung von komplementvermittelter Immunolyse von Liposomen, die einen fluoreszenten Farbstoff einschließen, um Antiglykolipid-Antikörper zu messen. Es werden multilamellare Liposome, die Carboxyfluorescein in hohen selbstlöschenden Konzentrationen enthalten, hergestellt und bei Zugabe von Antiglykolipidserum plus aktivem Komplement tritt die Lyse der Liposome ein, und das gefangene Carboxyfluorescein wird abgegeben.
- Die Fluorophore, die in Liposomuntersuchungen am meisten gebräuchlich sind, Fluorescein, Carboxyfluorescein und Calcein, weisen alle eine deutliche Leckbildung innerhalb eines kurzen Zeitraums von Stunden bis Tagen auf. Weinstein et al., Science, 195:489-492 (1977) berichtet beim Studium der Liposomzell- Wechselwirkungen, daß die Halbwertszeit der Fluorescein- Leckbildung bei 5ºC ungefähr 5 Minuten beträgt, wohingegen diejenige von 6-Carboxyfluorescein, einem polareren Fluoresceinderivat, in der Größenordnung von Wochen liegt.
- Obwohl Carboxyfluorescein durch Liposommembranen hindurch weniger durchtrittsfähig ist als Fluorescein, ist die Fluoreszenzausbeute von Carboxyfluorescein hochgradig pH- abhängig, und nur die 3-fach anionische Form weist die maximale Fluoreszenz auf. Die Ionenstärke, die Calciumkonzentration und die Temperatur der Lösung haben einen Einfluß auf die Fluoreszenz. Darüberhinaus berichten Lelkes P. et al., Biochim. et Biophys. Acta., 716:410-419 (1982) bei der Untersuchung der Stabilität kleiner unilamellarer Liposomen in menschlichem Blut über die Notwendigkeit zur Korrektur aufgrund von Detergens- und Zentrifugationseffekten, wie auch aufgrund von passiver Assoziation zwischen Liposomen und Blutzellen. Die Verwendung gewisser Detergenzien führte zu einer starken Fluoreszenzlöschung und die Zentrifugation der Liposomen führte zu einer 7 bis 8,8%igen Abgabe des Carboxyfluoresceins aus den Liposomen. Die Zugabe von ungefähr 50 Mol% Cholesterol war notwendig, um die Liposomstabilität wesentlich zu steigern. Obwohl Carboxyfluorescein hochgradig fluoreszent ist und eine geringe Leckbildungsgeschwindigkeit aufweist, werden fluoreszente Verbindungen, die polarer oder stärker ionisch sind, oft bevorzugt, da sie pH-Schwankungen gegenüber unempfindlich sind. Unempfindlichkeit gegenüber pH-Schwankungen ist insbesondere bei den Assaysystemen vorteilhaft, die die Komplementlyse der Liposomen erfordern, weil der pH hier für die optimale Komplementaktivität und die optimale Assayempfindlichkeit leicht eingestellt werden kann, ohne die Fluorophor-Leckbildung oder das Signal zu beeinflussen.
- Die Fluoreszenz von Calcein, einem mehr elektronegativ geladenen Derivat von Fluorescein, ist über den pH-Bereich von 6,0 bis 8,5 weitgehend pH-unabhängig. Über die Leckbildung von Calcein in einer Vielzahl von Phospholipidvesikeln als Funktion der Temperatur und in Gegenwart und Abwesenheit von Humanserum wird in Allen T.M. et al., Biochim. et Biophys. Acta., 597:418- 426 (1980) berichtet. Die Gegenwart von Serum steigerte die Liposom-Leckbildung wesentlich, und der Einbau von wachsenden Molverhältnissen an Cholesterol in die Liposome war notwendig, um die Leckbildung durch Calcein in den Liposomen, die mit Puffer und mit Serum inkubiert worden waren, zu vermindern. Die Leckbildung war in Liposomen, die einen osmotischen Gradienten durch die Membran hindurch aufwiesen (im Inneren höher) wesentlich stärker als in äquiosmolaren Liposomen.
- Hinsichtlich der Leckbildung kann Calcein ein geeignetes Fluorophor für solche Anwendungen sein, wo die Experimente am gleichen Tage durchgeführt werden. Jedoch ist es häufig für andere Anwendungen unverträglich, aufgrund seiner ausgeprägten Leckbildung und aufgrund seiner durch Metallionen bedingten Löschungsanfälligkeit, d.h. die chelatisierenden Gruppen an dem Xanthenring binden eine große Anzahl verschiedener Metallionen, Kendall et al., Analvtical Biochemistry, 134:26-33 (1983). Die Calceinfluoreszenz wird durch die Bindung von Fe²&spplus;, Fe³&spplus;, Ni³&spplus;, Mn²&spplus;, Co²&spplus; und Tb³&spplus; gelöscht. Diese Metalle können allgemeine Verunreinigungen im Wasser und im Laborglas sein. Da die Lyse bei einem Liposomimmunoassay durch die Abgabe des Liposomeninhalts und die sich daraus ergebende Zunahme der Fluoreszenz nachgewiesen wird, kann jegliche Fluoreszenzlöschung zu einer ungenauen Messung der Lyse und infolgedessen zu einem ungenauen Assayergebnis führen.
- Es besteht daher nach wie vor in der Technik ein Bedarf an fluoreszenten Verbindungen, die zur Verwendung bei der Herstellung von Fluorophor-einkapselnden Liposomen für lytische Assays, einschließlich immunolytischen Assays geeignet sind, die die Abgabe von Fluorophoren, die in selbstlöschenden Konzentrationen innerhalb der Liposomen vorhabden sind, mit einbeziehen. Verbindungen dieser Art sollten chemisch stabil und schnell synthetisierbar und leicht zu reinigen sein.
- Idealerweise würden sie ein Fluoreszenzspektrum aufweisen, das demjenigen von Fluorescein ähnlich ist (wodurch die Verwendung existierender Fluoreszenz-Nachweisvorrichtungen möglich wäre, die auf den Spektraleigenschaften von Fluorescein beruhen) und sie würden Quantenausbeuten bei ungefähr neutralen pH-Werten liefern, die nicht geringer als ungefähr 80%, bezogen auf die maximale Fluoresceinfluoreszenz, sind. Die Verbindungen sollten Löslichkeitseigenschaften aufweisen, die die Einkapselung in selbstlöschenden Konzentrationen erlauben, und sie sollten dennoch wenige ionisierbare Gruppen enthalten, um osmotische Effekte zu minimieren. Sollten sie zur Verwendung in analytischen Systemen vorgesehen sein, in denen Metallionen Teil der Probenumgebung sind, so sollten die Fluoreszenzeigenschaften der Verbindungen nur minimal hinsichtlich solchen Ionen empfindlich sein. Die Verbindungen sollten nur minimal zur Leckbildung durch die Liposommembranschicht(en) hindurch neigen.
- Die vorliegende Erfindung stellt neue Fluorescein- Derivatverbindungen zur Verfügung, die ein Fluoreszenzspektrum und eine Quantenausbeutecharakteristik aufweisen, die denjenigen von Fluorescein ähnlich sind. Die Verbindungen sind schnell synthetisiert und gereinigt, und sie sind in Wasser gut in selbstlöschenden Konzentrationen löslich. Ausschlaggebenderweise neigen diese Fluoresceinderivate aufgrund der Anwesenheit polarer Polyhydroxygruppensubstituenten und aufgrund der Abwesenheit metallchelatisierender Gruppen nur minimal zur Leckbildung durch Liposomenmembranen hindurch, und sie besitzen Fluoreszenzeigenschaften, die minimal für die Anwesenheit von Metallionen empfindlich sind. Die Verbindungen der Erfindung sind daher außerordentlich zur Verwendung bei der Entwicklung von hochstabilen Liposompräparaten zum Einsatz bei immunolytischen Assays, die humane Körperflüssigkeitsproben verwenden, geeignet.
- Die derzeitig bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind diejenigen nach Formel I,
- wobei: R&sub1; in der 5- oder 6-Stellung steht, und R&sub1; ist eine Pyridoxamidgruppe oder eine Carboxylgruppe, oder eine Gruppe nach Formel II,
- in der
- X Carbonyl, Aminothiocarbonyl oder Methylen ist
- Y ist Wasserstoff, Alkyl, das 1 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, Carboxyalkyl, das 2 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, oder Alkylol, das 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, und
- Z ist Carboxyalkyl, das 2 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, Alkylol, das 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, oder eine Monooder Disaccharidgruppe oder Pyridoxyl; und R&sub2; und R&sub3; sind gleich oder verschieden und können Wasserstoff oder eine Gruppe nach Formel II sein,
- unter der Voraussetzung, daß wenn R&sub1; eine Carboxylgruppe ist, dann R&sub2; und R&sub3; nicht gleichzeitig beide Wasserstoff sein können.
- Die Alkylolgruppe kann z.B. Ethylol oder Tris(methylol)methyl sein. Das Mono- oder Disaccharid kann z.B. ein Galaktose-, Glukose- oder ein Maltoserest sein.
- Die Verbindungen nach Formel I können als Isomerenmischungen zur Verfügung gestellt sein und als solche eingesetzt werden, wobei die Mischungen sowohl die 5- als auch die 6-substituierte Form enthalten, oder im wesentlichen eine isomere Form enthalten. Es ist zu verstehen, daß die Vorsilbe "5(6)-", die verwendet wird, um die Verbindungen der Erfindung zu bezeichnen, sowohl die Isomerenmischungen meint, die sowohl die 5- als auch die 6-substituierte Form enthalten, als auch diejenigen, die im wesentlichen eine der isomeren Formen enthalten.
- Derzeitig bevorzugte Verbindungen nach Formel I, in denen R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, umfassen: 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid (nachfolgend NMG); 5- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid; 6-Carboxyfluorescein-N- methylglukamid; 5(6)-Carboxyfluorescein- tris(methylol)methylamid; 5-Carboxyfluoresceindiethanolamid; 5(6)-Carboxyfluorescein-N-(β-hydroxyethyl)maltosamid; 5(6)- Carboxyfluoresceingalaktosamid; 5(6)-Carboxyfluoresceinpyridoxamid, Fluorescein-5(6)-N-(β-hydroxyethyl)maltosethioharnstoff und Fluorescein-5(6)-tris(methylol)methylthioharnstoff.
- Derzeitig bevorzugte Verbindungen nach Formel I, in denen R&sub2; und R&sub3; nicht Wasserstoff sind, umfassen: 5(6)- Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamid-4',5'- bis(methylendiethanolamin); 5(6)-Carboxyfluorescein-N- methylglukamid-4'5'-bis(methylendiethanolamin); 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4'5'-bis(N- methylglukaminomethyl); 5(6)-Carboxyfluorescein-N- methylglukamid-4',5'-bis(methyleniminodiessigsäure); 5(6)- Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methylensarkosin) und 5(6)- Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methyleniminodiessigsäure).
- Die derzeitig besonders bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid und 5(6)-Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamid.
- Es werden durch die Erfindung auch wäßrige Zusammensetzungen der Verbindungen nach Formel I in selbstlöschenden Konzentrationen zur Verfügung gestellt, wobei diese Zusammensetzungen in Liposomen eingekapselt werden können, um Reagenzien zu liefern, die zur Verwendung in lytischen Assays geeignet sind.
- Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden eingehenden Beschreibung derselben ersichtlich, die viele anschauliche Beispiele der Anwendung der Erfindung beinhaltet.
- Fig. 1 ist eine Auftragung des Signal/Rauschverhältnisses gegen die Zeit in Tagen; für fünf Fluorophore und
- Fig. 2 ist ein Balkendiagramm des Signal/Rauschverhältnisses, das für fünf verschiedene Fluorophore 103 Tage nach der Herstellung erhalten wurde.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung und die Synthese neuartiger Fluorophore, die in synthetischen Liposomen eingekapselt und für längere Zeiträume erhalten werden können, ohne daß wesentliche Leckbildung auftritt. Wenn die Fluorophore in hohen Konzentrationen in der Größenordnung von 50 bis 200 mM in Abhängigkeit von der erforderlichen Signalstärke eingekapselt werden, sind die Fluorophore selbst-löschend, und bei der Liposomlyse wird die Fluoreszenz wieder hergestellt und kann sofort gemessen werden.
- Die folgenden Beispiele zeigen die Durchführung der Erfindung. Beispiel 1 betrifft die Synthese der Fluorophore. Beispiel 2 betrifft die Herstellung der Liposome und die Einkapselung der Fluorophore und Beispiel 3 betrifft die Leckbildungsuntersuchungen.
- Die Beispiele, die folgen, dienen anschaulichen Zwecken und nicht der Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung.
- Die Fluorophore werden allgemein als Isomerenmischung aus sowohl der 5- als auch der 6-isomeren Form je nach den Ausgangsmaterialien, die zur Darstellung der Fluorophore eingesetzt werden, erhalten.
- Der N-Hydroxysuccinimidester von 5(6)-Carboxyfluorescein wird als Ausgangsmaterial für 5(6)-Carboxyfluorescein-N- methylglukamid; 5(6)-Carboxyfluorescein- tris(methylol)methylamid; 5-Carboxyfluoresceindiethanolamid, 5(6)-Carboxyfluorescein-N-(β-hydroxyethyl)maltosamid; 5(6)- Carboxyfluoresceingalaktosamid und 5(6)- Carboxyfluoresceinpyridoxamid verwendet.
- 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglucamid wird als Ausgangsmaterial für 5(6)-Carboxyfluoresceintris(methylol)methylamid-4',5'-bis(methylendiethanolamin); 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4',5'- bis(methylendiethanolamin); 5(6)-Carboxyfluorescein-N- methylglukamid-4',5'-bis(N-methylglukaminomethyl); 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4',5'- bis(methyleniminodiessigsäure) und 5(6)-Carboxyfluorescein- 4',5'-bis(methylensarkosin) verwendet.
- 5(6)-Carboxyfluorescein (Eastman Organic Chemicals; Rochester, New York) wird als das Ausgangsmaterial für 5(6)- Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methyleniminodiessigsäure) verwendet.
- Fluoresceinisothiocyanat (Eastman Organic Chemicals; Rochester, New York) wird als das Ausgangsmaterial für Fluorescein-5(6)-tris(methylol)methylthioharnstoff und für Fluorescein-5(6)-N-(β-hydroxyethyl)maltosethioharnstoff verwendet.
- 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester wurde wie folgt synthetisiert. Ein 250-ml-Rundkolben wurde mit 11,28g (0,03Mol) an 5(6)-Carboxyfluorescein, 3,45g (0,03Mol) N- Hydroxysuccinimid und 6,18g (0,03Mol) Dicyclohexylcarbodiimid beschickt. Der Inhalt wurde in 80ml trockenem Dimethylformamid gelöst und 16 Stunden unter Stickstoff gerührt. Am Ende dieses Zeitraums konnte mittels Dünnschichtchromatographie keinerlei Ausgangsmaterial mehr beobachtet werden. Der Inhalt des Kolbens wurde auf 25ml aufkonzentriert und eine Aceton:Toluol-(1:3)- Lösung wurde hinzugegeben, um den rohen aktivierten Ester wieder aufzulösen. Das Material wurde auf einer präparativen HPLC- Vorrichtung unter Verwendung von Silicagelsäulen und einem Eluenten aus Essigsäure:2-Propanol:Ethylacetat (2:50:48) gereinigt. Die erzielte Ausbeute betrug 10,0g (70%). Die gewünschte Struktur wurde durch ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) bestätigt, die die folgenden chemischen Verschiebungen aufwies:
- δ = 10,2 (phenolische OH, 2H)
- δ = 8,6 - 7,5 (Phthalidring, 3H)
- δ = 6,8 - 6,5 (Xanthenring, 6H)
- δ = 2,95 (Succinimid, 4H)
- Zusätzlich ergab die Massenspektralanalyse ein Molekularion von MS(M+H)&spplus; = 474. Die Struktur des erhaltenen Produktes ist unten angegeben. 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester
- Ein 1000-ml-Rundkolben wurde mit 95g (0,20Mol) 5(6)- Carboxyfuorescein-N-hydroxysuccinimidester und 39g (0,20Mol) N- Methyl-D-glukamin und 24 g (0,24Mol) Triethylamin beschickt. Der Inhalt des Kolbens wurde in 750ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Nach 12 Stunden Rühren bei Raumtemperatur unter Stickstoff war die Reaktion fast vervollständigt, wie mittels Dünnschichtchromatographie ermittelt wurde. Die Lösung wurde auf ca. 200ml aufkonzentriert und durch praparatlve HPLC unter Verwendung von Silicagelsäulen und Aceton:Essigsäure (50:1) mit einem Methanolgradienten von 2% bis 10% gereinigt. Die erzielte Ausbeute betrug 47,6g (43%). Die gewünschte Struktur wurde mittels ¹H-NMR (CD&sub3;OD, D&sub2;O) bestätigt, die die folgenden chemischen Verschiebungen ergab.
- δ = 8,2 - 7,25 (Phthalidring; 3H)
- δ = 6,8 - 6,55 (Xanthenring, 6H)
- δ = 4,3 - 3,25 (Glukamin, 8H)
- δ = 3,25 - 3,05 (N-Methyle, 3H, vier Peaks; entsprechend den syn- und anti-Formen der 5- und 6- Carboxamidgruppen)
- Die Massenspektralanalyse ergab ein Molekularion von MS(M+H)&spplus; = 554. 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid
- Die 5- und 6-Isomeren von Carboxyfluorescein-N- methylglukamid wurden wie folgt getrennt. Rohes 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglucamid, 4,2g (07 0076Mol) wurde in 8ml 1:1 Dimethylformamid und Methanol gelöst und an einer 500- ml-Silicagelsäule einer Waters Associates Pre LC/System 500A HPLC-Vorrichtung chromatographiert, unter Verwendung von Aceton:Methanol:Essigsäure (70:2:2) als Elutionsmittel bei einer Flußgeschwindigkeit von 0,11/min. Die Fraktion, welche nach 3,5 Minuten eluiert wurde, war das reine Isomer 5- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid (0,447g). Spätere Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und auf ein Volumen von 15ml eingeengt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Leuchtend gelbe Kristalle fielen aus und ergaben 0,368g des Isomers 6-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid. Der Überstand wurde erneut chromatographiert und ergab zusätzliche 1,013g des Isomeren 5-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid. Daher wurden 1,460g des 5-Isomeren und 0,368g des 6-Isomeren erhalten.
- Ein 1000-ml-Rundkolben wurde mit 63,4 g (0,134Mol) 5(6)- Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester und 16,2 g (0,134Mol) Tris(hydroxymethyl)aminomethan und 33,8g (0,335Mol) Triethylamin beschickt. Der Inhalt des Kolbens wurde in 200ml trockenem Dimethylformamid gelöst und unter Stickstoff 24 Stunden gerührt. Eine Spur 4-Dimethylaminopyridin wurde hinzugegeben, und die Reaktion wurde eine weitere Stunde bei 70ºC unter Stickstoff erhitzt. Am Ende dieses Zeitraums schien die Reaktion gemäß der Kontrolle durch Dünnschichtchromatographie abgeschlossen. Das Lösungsmittel wurde auf ein Gesamtvolumen von 200ml einer dunkelroten öligen Lösung eingeengt. Dieses Material wurde auf einer präparativen HPLC-Vorrichtung unter Verwendung einer Silicagelsäule und eines Laufmittels aus Essigsäure:2- Propanol:Ethylacetat (2:8:70) gereinigt. Die erhaltene Ausbeute betrug 20,5g (32%). Die gewünschte Struktur wurde durch ¹H-NMR (CD&sub3;OD) bestätigt, die die folgenden chemischen Verschiebungen ergab:
- δ = 8,5 - 7,25 (Phthalidring, 3H)
- δ = 6,8 - 6,5 (Xanthenring, 6H)
- δ = 3,9 (Methylene, 6H)
- Die Massenspektralanalyse ergab ein Molekularion von MS(M+H)&spplus;=480. 5(6)-Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamid
- 948mg (2mMol) 5-Carboxyfluorescein-N- hydroxysuccinimidester wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und es wurden 202mg Triethylamin gefolgt von 234mg Diethanolamin hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 50ºC 4 Stunden lang gerührt. Die Dünnschichtchrornatographie zeigte die Bildung eines neuen Produktes und den völligen Verbrauch des 5- Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidesters (Silicagel; Elutionsmittel: Methylenchlorid, Methanol, Essigsäure, 73:5:2). Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und das Rohmaterial wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 300 g Silicagel und Methylenchlorid, Methanol, Essigsäure 73:5:2 als Elutionsmittel gereinigt. Die erzielte Ausbeute betrug 300mg.
- Die Struktur von 5-Carboxyfluoresceindiethanolamid ist unten angegeben. 5(6)-Carboxyfluoresceindiethanolamid
- 5(6)-Carboxyfluorescein-N-(β-hydroxyethyl)maltosamid wurde aus 0,473 g (0,001Mol) 5(6)-Carboxyfluorescein-N- hydroxysuccinimidester und 0,405g (0, 001Mol) N-(β- Hydroxyethyl)maltosamin synthetisiert. Die Aufarbeitung und die Reinigung waren derjenigen von 5(6)-Carboxyfluorescein-N- methylglukamid ähnlich, wobei sich 0,226 g (30 %) Produkt ergaben. Die Struktur ist unten gezeigt. 5(6)-Carboxyfluorescein-N-(β-hydroxyethyl)maltosamid
- 5(6)-Carboxyfluoresceingalakotsamid wurde aus 1,00g (0,0046 Mol) Galaktosaminhydrochlorid und 2,19g (0,0046Mol) (5)6-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester synthetisiert. Aufarbeitung und Reinigung ähnelten derjenigen von 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid und ergaben 0,120g (5%) Produkt. Die Struktur ist unten gezeigt. 5(6)-Carboxyfluoresceingalaktosamid
- 5(6)-Carboxyfluoresceinpyridoxamid wurde aus 1,183 g (0 0025Mol) 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester und 0,603g (0,0025Mol) Pyridoxamindihydrochlorid in Gegenwart von 1,01g (0,01 Mol) Triethylamin synthetisiert. Aufarbeitung und Reinigung ähnelten derjenigen von 5(6)-Carboxyfluorescein-N- methylglukamid und ergaben 0,879g (67%) Produkt. Die Struktur ist unten gezeigt. 5(6)-Carboxyfluoresceinpyridoxamid
- Ein Rundkolben wurde mit 0,54 g (1,1x10&supmin;³ Mol) 5(6)- Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamid, gelöst in 4ml Essigsäure, und 0,25g (2,4x10&supmin;³ Mol) Diethanolamin beschickt. Unter Rühren wurde langsam 2ml 37%iges wäßriges Formaldehyd hinzugegeben, und die Reaktionslösung wurde unter Rückfluß 4 Stunden lang auf 80ºC erhitzt. Am Ende dieses Zeitraums wurden 30ml Toluol hinzugegeben und die Essigsäure wurde durch azeotrope Destillation entfernt. Der ölige Rückstand wurde mit Aceton gewaschen und der Halbfeststoff wurde aus 6ml Ethanol/Wasser umkristallisiert. Die Kristalle, die nach dem Stehenlassen über Nacht bei 4ºC erhalten wurden, ergaben 0,127g (16%ige Ausbeute) des reinen Produkts. 5(6)-Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamid-4',5'- bis (methylendiethanolamin)
- Ein Rundkolben wurde mit 0,50 g (9,9x10&supmin;&sup4; Mol) 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid, 15ml Essigsäure und 0,21g (2,0x10&supmin;³ Mol) Diethanolamin beschickt gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von 37%igem wäßrigem Formaldehyd. Die Reaktion wurde unter Rückfluß bei 80ºC gerührt. Nach 2 Stunden war die Hauptmenge der Essigsäure verdampft, gefolgt von der azeotropen Verdampfung zusammen mit dem Toluol. Das rohe Reaktionsprodukt wurde an einer XAD-4-Chromatographiesäule unter Verwendung von Wasser und Methanol als Laufmittel gereinigt. Es wurden 0,55g (42%ige Ausbeute) an Produkt erhalten. 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4',5'- bis(methylendiethanolamin)
- 100mg 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid (0,18mMol), wie oben beschrieben hergestellt, und 84mg (0,43mMo1) N-Methyl-D-glukamin wurden in 2ml Eisessig gelöst. 145,9mg einer 37%igen Formaldehydlösung wurden zu der Reaktion hinzugegeben und es wurde bei 65-70ºC 24 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum auf 0,5ml eingeengt. Das Produkt wurde aus der Lösung auskristallisieren lassen und wurde durch einen Büchner-Trichter filtriert. Die erreichte Ausbeute betrug 48 %. 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4',5'-bis(N- methylglukaminomethyl)
- Ein 200-ml-Dreihalskolben, bestückt mit einem Magnetrührer, Thermometer und Rückflußkühler wurde mit 1,50g (2,7x10&supmin;³ Mol) 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid, gelöst in 15ml Eisessig, und mit 0,76 g (5,7 x 10&supmin;³ Mol) Iminodiessigsäure beschickt. Die Mischung wurde gerührt und auf 50ºC erhitzt und 4,43g 37%iges Formaldehyd wurden tropfenweise hinzugegeben. Das Erhitzen wurde 1 Stunde bei 65-70ºC fortgeführt, und das Ausgangsmaterials war nach dieser Zeitspanne vollständig verbraucht, wie durch Dünnschichtchromatographie (70:25:2 Aceton-Methanol-Essigsäure) bestätigt wurde. Die Essigsäure wurde durch Azeotropdestillation mit Toluol entfernt und das Rohprodukt wurde aus einem Minimalvolumen an Wasser umkristallisiert und ergab 0,28 g (12,3%) an reinem Produkt. 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4',5'- bis(methyleniminodiessigsäure)
- Ein 100-ml-Rundkolben wurde mit 3,76g (0,01Mol) 5(6)- Carboxyfluorescein und 25ml 1:1 2-propanol-Essigsäure beschickt und erhitzt bis sich das 5(6)-Carboxyfluorescein auflöste. Dann wurden 1,78g (0,02Mol) Sarkosin hinzugefügt, gefolgt von 8,11g 37%iger Formaldehydlösung, und die Reaktionsmischung wurde 75 Minuten lang auf 80ºC erhitzt. Nach dieser Zeitspanne konnte kein Ausgangsmaterial mehr mittels Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden. Die Reaktionslösung wurde heiß abfiltriert, und beim Kühlen kristallisierte das Produkt aus. Dieses Material wurde aus 1:1 Ethanol-Wasser umkristallisiert und ergab 0,60 g (10%ige Ausbeute) an reinem Material. 5(6)-Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methylensarkosin)
- 553mg 5(6)-Carboxyfluorescein und 266mg (2mMol) Iminoessigsäure wurden in einen Kolben eingetragen und 25ml Eisessig-Methanol (15:10) wurden hinzugegeben, gefolgt von 1,6g an 37%igem Formaldehyd. Die Reaktionsmischung wurde bei 70ºC 16 Stunden gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde in 15ml 5%igem Natriumhydroxid gelöst und durch Säulenchromatographie an Dowex 50X-2-200 Ionenaustauscherharz gereinigt. Die erzielte Ausbeute betrug 35%. Die Struktur von 5(6)-Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methyleniminodiessigsäure) ist unten angegeben. 5(6)-Carboxyfluorescein- 4',5'-bis(methyleniminodiessigsäure)
- Ein 50-ml-Rundkolben wurde mit 0,405g (0,001Mol) N-(β- Hydroxyethyl)maltosamin und 0,389g (0,001Mol) Fluoresceinisothiocyanat in 5ml wasserfreiem Dimethylformamid beschickt. Die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff 56 Stunden lang gerührt. Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Methanol (4:1) zeigte die fast vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials in das Produkt an. Nach Zugabe von 20ml Aceton und 25ml Chloroform bildete sich ein gelber kristalliner Niederschlag. Die Kristalle wurden durch einen gesinterten Glastrichter filtriert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur getrocknet. Das resultierende Produkt ergab einen einzelnen Fleck auf einer Dünnschichtchromatographieplatte mit einem Rf-Wert von 0,49 unter Verwendung von 2- Propanol:Aceton:Wasser:Essigsäure (50:40:8:2). Die erzielte Ausbeute betrug 0,546g (70%). Die Massenspektralanalyse ergab ein Basispeakion von: MS FAB (M+H)&spplus;=777. Die Struktur der Verbindung ist unten angegeben. Fluorescein-5(6)-N-(β-hydroxyethyl)maltosethioharnstoff
- Fluorescein-5(6)-tris(methylol)methylthioharnstoff wurde gemäß den Verfahren, wie sie für die Synthese von Fluorescein-5(6)-N-(β-hydroxyethyl)maltosethioharnstoff beschrieben sind, synthetisiert, mit der Ausnahme, daß 0,130g (0,0003Mol) Fluoresceinisothiocyanat und 0,040g (0,0003Mol) Tris(hydroxymethyl)aminomethan verwendet wurden, was 0,120g (73%) Produkt ergab. 5(6)-Tris (methylol)methylthioharnstoff
- Dieses Beispiel betrifft die Herstellung der Liposome, die Einkapselung der Fluorophore, und die anfängliche Untersuchung der Fluorophore bezüglich ihrer Verträglichkeit.
- Multilamellare Vesikel (MLV), die ein zu bewertendes Fluorophor enthielten, wurden wie folgt hergestellt. Eine 1:1 (Molverhältnis) Ei-Sphingomyelin:Cholesterollösung wurde aus 10mg/ml Stammlösungen in Chloroform:Methanol 9:1 (Volumenverhältnis) bereitet. ¹&sup4;C-sphingomyelin wurde als Tracer für die nachfolgende Lipidmengenbestimmung zugegeben. Eine Lösung, die 5uMol Gesamtlipid enthielt, wurde in einem birnenförmigen 10-ml-Kolben an einem Rotavapor unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Lipid wurde einmal durch die Zugabe von 1,0ml von 9:1 Chloroform:Methanol wieder aufgelöst. Ein 10-ul- Anteil wurde für die Lipidszintillationszählung entnommen. Die Lösung wurde erneut zur Trockne eingedampft und hinterließ einen dünnen Lipidfilm auf der inneren Oberfläche des Kolbens. Verbleibendes Lösungsmittel wurde über Nacht durch Gefriertrocknung entfernt.
- Jedes zu bewertende Fluorophor wurde in destilliertem, deionisiertem Wasser aufgelöst und mit Natriumhydroxid auf pH 7,4 eingestellt. Die Konzentration eines jeden Fluorophors betrug 100mM. Allgemein schwankt eine selbstlöschende Konzentration eines Fluorophors für jedes besondere Fluorophor und reicht von ungefähr 1mM bis zur oberen Löslichkeitsgrenze des Fluorophors. Die osmotisch wirksamen Molalitäten der Lösungen wurden mit einem Gefrierpunkt-Osmometer gemessen. Es wurde eine Stammpufferlösung, enthaltend 50mM HEPES (N-2- Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) und 150mM Natriumchlorid bereitet und mit Natriumhydroxid auf pH 7,4 eingestellt. Diese Stammpufferlösung wurde dann mit destilliertem, deionisiertem Wasser verdünnt, um eine Reihe von Puffern, die zu jeder der Fluorophorlösungen isotonisch waren, herzustellen. Ein Teil der Pufferlösung wurde dann zu 9 Teilen einer jeden korrespondierenden Fluorophorlösung hinzugegeben.
- Um die Liposome herzustellen, wurden 450ul Fluorophorlösung zu dem trockenen Lipidfilm hinzugegeben. Der Film wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur hydratisieren lassen. Die Liposome bildeten sich während dieses Zeitraums spontan. Die Lipiddispersion wurde 45 Minuten mit einem Reagenzglasmischer verwirbelt und wurde dann zusätzliche 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lipiddoppelschichten wurden durch Erhitzen auf 45ºC gehärtet und dann wurde die Temperatur langsam mit einer Geschwindigkeit von 2ºC/h auf 6ºC abgesenkt.
- Nicht eingekapseltes Fluorophor wurden mittels Zentrifugation wie folgt entfernt. Das Liposompräparat wurde in ein 50-ml-Zentrifugenglas überführt. 30ml an isotonischem Puffer wurden hinzugegeben. Die das Fluorophor enthaltenden Liposome wurden durch Zentrifugation bei 39000xg 30 Minuten lang niedergeschlagen. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt und die Liposome wurden in 30ml isotonischem Puffer resuspendiert. Dies wurde insgesamt viermal wiederholt. Die Liposome wurden in 30ml isotonischem Puffer resuspendiert. Ein 300-ul-Anteil wurde für die Szintillationszählung zur Bestimmung des Lipids entfernt. Danach wurden die Liposome mit isotonischem Puffer auf 33 nanomol/ml verdünnt und bei 2-8ºC aufbewahrt.
- Um die relative Menge an Fluorophor im Inneren der Liposome zu bestimmen, wurde die Fluoreszenz vor und nach der Detergenslyse gemessen. Kurz vor der Messung wurden die Liposome 1:50 mit dem geeigneten isotonischen Puffer verdünnt. 50ul dieser verdünnten Liposomensuspension wurden dann zu 950ul isotonischem Puffer hinzugegeben, was eine Endlipidkonzentration von 33Mol/ml ergab. Die Hintergrund-Fluoreszenzintensität der Suspension wurde unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 490nm und einer Emissionswellenlänge von 520nm gemessen. Die Liposome wurden dann durch die Zugabe von 50ul einer 18%igen (Gew./Vol.) Lösung von Octyl-β-D-glukopyranosid lysiert, wonach die Gesamtfluoreszenz gemessen wurde.
- Das Signal/Rauschverhältnis (S/N) wurde als (Gesamtfluoreszenz - Hintergrundfluoreszenz)/Hintergrundfluoreszenz berechnet. Dieses ist ein empfindlicheres Maß für die Leckbildung als das Einkapselungsverhältnis (ER), welches durch folgende Formel gegeben ist: Gesamtfluoreszenz Hintergrundfluoreszenz
- Von den vielen Derivaten, die synthetisiert und die auf die Leckbildung überprüft wurden, und deren Quantenausbeute, deren allgemeine spektralen Eigenschaften, deren Einfachheit der Darstellung oder deren Reinigung bewertet worden waren, zeigt Tabelle 1 diejenigen Verbindungen, die für die Verwendung in einem Liposomassay am geeignetesten befunden wurden. Für einige der aufgeführten Verbindungen ist die Fluoreszenz- Quantenausbeute relativ zum Fluorescein, der RQY-Faktor, ebenfalls angegeben. RQY-Faktor wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen gemessen, und der Fachmann weiß, daß Veränderungen in der Anregungs- und Emissionswellenlänge dazu verwendet werden können, um den beobachteten RQY-Faktor zu maximieren und um das gewählte Fluorophor für eine besondere Anwendung geeignet anzupassen.
- Ein vorläufiges Screening der Verbindungen, die unter den Schutzbereich der Erfindung fallen, d.h. ein Screening von Fluorescein-4',5'-bis(methylendiethanolamin); 5(6)- Carboxyfluoresceinpyridoxamid-4',5'-bis(methylendiethanolamin) und 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4',5'- bis(methylensarkosin) zeigte, daß diese für die Verwendung in Liposomassays weniger geeignet sind, da sie unzureichende Fluoreszenz und/oder unzureichende Latenz aufweisen. TABELLE A VERBINDUNG 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglutamid 5-Carboxyfluorescein-N-methylglutamid 6-Carboxyfluorescein-N-methylglutamid 5(6)-Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylglutamid 5-Carboxyfluorescein-diethanolamid 5(6)-Carboxyfluorescein-N-(β-hydroxyethyl)maltosamide 5(6)-Carboxyfluorescein-galactosamid 5(6)-Carboxyfluorescein-pyridoxamid *RQY - FLUORESZENZ QUANTEN AUSBEUTE BEZOGEN AUF FLUORESCEIN ND - NICHT BESTIMMT TABELLE 1 FORTSETZUNG VERBINDUNG 5(6)-Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamide-4',5'-bis(methylen diethanolamin ) 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglucamide-4',5'-bis(methylen diethanolamin ) 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglucamide-4',5'-bis(N-methylenglucaminomethyl) 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglucamide-4',5'-bis(methylen iminodiessigsäure 5(6)-Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methylen - sarcosin ) 5(6)-Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methylen iminodiessigsäure Fluorescein-5(6)-N-(β-hydroxtethyl)maltose-thioharnstoff Fluorescein-5(6)-tris(methylol)methyl-thioharnstoff *RQY - Fluoreszenzquantenausbeure bezogen auf Fluorescein ND - nicht bestimmt
- Dieses Beispiel betrifft einen gegenüberstellenden Vergleich einer bevorzugten Verbindung der Erfindung, NMG, mit zwei im Handel erhältlichen Fluorophoren.
- Es wurden multilamellare Vesikel einheitlicher Größe, die die zu vergleichenden Fluorophore enthielten, wie folgt hergestellt. Eine 45:50:5 (Molverhältnis) Lösung von Sphingomyelin:Cholesterol:Stearinsäure wurde aus Stammlösungen in 9:1 Chloroform:Methanol hergestellt. Die Sphingomyelin- und die Cholesterolstammlösung wiesen einen Gehalt von 10mg/ml auf, die Stearinsäurestammlösung einen von 5mg/ml. Eine Lösung, die 5uMol Gesamtlipid enthielt, wurde im Vakuum an einem Rotavapor in einem birnenförmigen 5-ml-Kolben zur Trockne eingedampft. Das Lipid wurde einmal durch die Zugabe von 500ul 9:1 Chloroform:Methanol wieder aufgelöst. Die Lösung wurde erneut zur Trockne eingedampft, was einen dünnen Lipidfilm auf der inneren Oberfläche des Kolbens hinterließ. Verbleibendes Lösungsmittel wurde durch Gefriertrocknung über Nacht entfernt.
- Fluorescein (Eastman Organic Chemicals; Rochester, New York), Carboxyfluorescein (Molekular Probes; Junction City, Orgeon) und NMG, dargestellt entsprechend dem Beispiel 1, wurden in destilliertem, deionisiertem Wasser gelöst und mit 6N Natriumhydroxidlösung (Carboxyfluorescein, NMG) auf pH 7,2 eingestellt, oder mit 6N HCl (Fluorescein). Die Konzentration eines jeden Fluorophors betrug 100mM. Fünf (5) ul von 1M HEPES- Puffer, pH 7,2, wurden zu 1ml eines jeden Fluorophors hinzugegeben. Die osmotisch wirksamen Molalitäten der Lösungen wurden durch die Zugabe von Natriumchlorid auf ungefähr 340 mOsm eingestellt.
- Um die Liposome herzustellen, wurden 500ul Fluorophorlösung auf 37ºC erhitzt und zu dem getrockneten Lipidfilm hinzugegeben. Der Film wurde 15 Minuten bei 37ºC hydratisieren lassen. Der Kolben, der die Fluorophorlösung und das Lipid enthielt, wurde 1 Stunden lang bei 2300Upm auf einen Glas-Col-"Big-Vortexer" verwirbelt, was zu einer Liposomsuspension mit einem ungefähren Durchmesser von 600nm führte. Der Kolbeninhalt wurde auf 50ºC erhitzt und die Temperatur wurde dann langsam um 2ºC pro Stunde abgesenkt bis auf 4ºC hin, um die Liposome zu härten. Nach 5 Tagen Lagerung bei 5ºC wurde das Liposompräparat in 10ml isotonischem Puffer (50mM HEPES, 150mM NaCl, 0,02% Natriumazid, mit Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt, osmotisch wirksame Molalität 350 mOsm) verdünnt. Die Liposome, die das Fluorophor enthielten, wurden durch Zentrifugation bei 43000x g 30 Minuten lang niedergeschlagen. Der Überstand wurde abgesaugt und die Liposome wurden in 10ml isotonischem Puffer resuspendiert. Dies wurde insgesamt viermal wiederholt. Nach dem letzten Durchgang wurden die Liposome in 2ml isotonischem Puffer resuspendiert und bei 2-8ºC gelagert.
- Es wurden gegenüberstellende Untersuchungen durchgeführt durch Vergleich zweier im Handel erhältlicher Fluorophore - Fluorescein und Carboxyfluorescein- mit NMG, einer beispielhaften Verbindung der in Tabelle 1 aufgeführten Derivate.
- Um die relative Menge von Fluorophor innerhalb und außerhalb der Liposomen zu bestimmen, wurde die Fluoreszenz vor und nach der Detergenslyse gemessen. Kurz vor der Messung wurden die Liposome 1:500 mit isotonischem Puffer (50mM HEPES, 150mM Natriumchlorid, 0,02% Natriumazid, mit Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt, osmotisch wirksame Molalität: 350 mOsm) verdünnt. Fünfzig ul dieser verdünnten Liposomsuspension wurden dann zu 950ul isotonischem Puffer in einer Glasküvette gegeben. Die Hintergrund-Fluoreszenzintensität der Suspension wurde dann unter Verwendung der Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge von 490 und 520nm gemessen. Die Liposome wurden dann durch die Zugabe von 50ul einer 18%igen Lösung von Octyl-β-D- glukopyranosid lysiert, wonach die Gesamtfluoreszenz gemessen wurde. Die Retention an Fluorophor wurde als Signal/Rauschverhälntis (S/N) ausgedrückt das aus (Gesamtfluoreszenz-Hintergrundfluoreszenz)/Hintergrundfluoreszenz berechnet wurde. TABELLE 2 GEGENÜBERSTELLENDE LECKBILDUNGSUNTERSUCHUNG VON 5(6)-CARBOXYFLUORESCEIN-N- METHYLGLUKAMID MIT ZWEI HANDELSÜBLICHEN FLUOROPHOREN FLUORESCEIN 5(6)-CARBOXYFLUORESCEIN 5(6)-CARBOXYFLUORESCEIN-N-METHYLGLUKAMID TAG PROZENT ENKAPSELUNG
- Tabelle 2 zeigt an, daß das NMG anfänglich zu 99,0% eingekapselt war, d.h. 1% der Markierung befand sich außerhalb des Liposoms, und nach 20 Tagen verblieben noch 98,4% innerhalb des Liposoms eingekapselt. Im Gegensatz dazu trat das Fluorescein so schnell aus dem Liposom aus, daß bei der anfänglichen Messung nur 96,2% eingekapselt waren. Nach 20 Tagen waren 21,7% der Markierung aus dem Liposom ausgetreten. Das 5(6)-Carboxyfluorescein war anfänglich zu 97,5% eingekapselt. Nach 20 Tagen betrug die Einkapselung 96,8%. Als Prozentzahl der Einkapselung ausgedrückt, scheint dies nur eine geringe Verlustmenge zu sein. Das S/N-Verhältnis beträgt jedoch nach nur einem Tag weniger als die Hälfte des S/N-Verhältnis von NMG.
- Fign. 1 und 2 zeigen einen gegenüberstellenden Vergleich der zeitabhängigen Leckbildung von Calcein und von vier Kandidatverbindungen unter den in Beispiel 2B beschriebenen Bedingungen. 5(6)-Carboxyfluoresceindiethanolamid- und 5(6)- Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamid-Markierungen verblieben nach 103 Tagen zu 95% eingekapselt, und die beiden Isomeren von NMG verblieben zu 96 % eingekapselt. Das Einkapselungsverhältnis von Calcein betrug 96,8%. Daher zeigten die sechs Kandidatverbindungen ein Einkapselungsniveau das fast gleich demjenigen von Calcein ist, aber ohne die Löschungsprobleme, die beim Calcein auftreten.
- Die vorangegangenen anschaulichen Beispiele betreffen neuartige Fluorophore, die in synthetischen Liposomen eingekapselt und aufbewahrt werden können, ohne daß über längere Zeiträume hinweg wesentliche Leckbildung auftritt. Wenn sie in hohen Konzentrationen eingekapselt werden, sind die Fluorophore selbstlöschend, und bei der Lyse des Liposoms wird die Fluoreszenz wieder hergestellt und kann sofort gemessen werden. Es ist offensichtlich, daß eine Vielzahl von Verfahren alternativ angewendet werden kann, um verschiedene Verbindungen mit Eigenschaften bereitzustellen, die auf die gleiche Art und Weise verwendet werden können. Zusätzlich ist offensichtlich, daß verschiedene Abwandlungen der vorgestellten Verfahren zur Anwendung gelangen können.
- Obwohl die vorliegende Erfindung mittels spezifischer Verbindungen, Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben wurde, ist offensichtlich, daß vom Fachmann nach Kenntnisnahme der vorliegenden Erfindung Abwandlungen und Veränderungen eingebracht werden können. Z.B. ist in Betracht zu ziehen, daß verschiedene fluoreszente Verbindungen als Fluorophore gemäß der vorliegenden Erfindung wirksam sind. Obwohl 5(6)- Carboxyfluorescein-N-methylglukamid und 5(6)-Carboxyfluoresceintris(methylol)methylamid bevorzugte Verbindungen sind, ist nicht beabsichtigt, andere nicht spezifisch aufgeführte oder jegliche anderen wirksamen Verbindungen aus dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung auszuschließen.
- Auch fallen andere Liposompräparate und dergl. unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, und zwar in dem Ausmaß, als daß diese anderen als die spezifisch beschriebenen Liposome ebenfalls erfolgreich verwendet werden können, und diese daher wahrscheinlich ähnlich wirksam sind.
- Vielfältige Abwandlungen und Veränderungen der oben mittels anschaulichen Beispielen beschriebenen Erfindung können durch den Fachmann eingebracht werden, und infolgedessen sollten nur solche Beschränkungen gültig sein, die in den beigefügten Ansprüchen erscheinen.
- Demgemäß sollen die beigefügten Ansprüche alle äquivalenten Veränderungen abdecken, welche unter den Schutzumfang der Erfindung fallen, wie sie beansprucht ist.
Claims (6)
1. Verbindung nach der Formel I:
wobei R&sub1; sich in der 5- oder 6- Position befindet, und R&sub1;
eine Pyridoxamid- oder eine Carboxylgruppe oder eine Gruppe nach
Formel II ist,
wobei
X Carbonyl, Aminothiocarbonyl oder Methylen ist, und
Y Wasserstoff, Alkyl mit einem bis sieben
Kohlenstoffatomen, Carboxyalkyl mit zwei bis sieben
Kohlenstoffatomen oder Alkylol mit einem bis sechs
Kohlenstoffatomen ist, und
Z Carboxyalkyl mit zwei bis sieben Kohlenstoffatomen,
Alkylol mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen oder eine
Monooder Disaccharidgruppe oder Pyridoxyl ist, und R&sub2; und R&sub3; sind
gleich oder verschieden und können Wasserstoff oder eine Gruppe
nach Formel II sein,
unter dem Vorbehalt, daß, wenn R&sub1; eine Carboxylgruppe
ist, dann R&sub2; und R&sub3; nicht beide Wasserstoff sein können.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff
sind.
3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y ein Glied ist, das
aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethylol und
Tris(methylol)methyl gewählt ist.
4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Z ein Glied ist, das
aus der Gruppe, bestehend aus Galaktose, Glukose, Maltose,
Ethylol, Pyridoxyl und Carboxyalkyl mit zwei bis sieben
Kohlenstoffatomen, gewählt ist.
5. Verbindung nach Anspruch 1, gewählt aus der Gruppe, die
aus folgendem besteht: 5(6)-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid;
5-Carboxyfluorescein-N-methylglukamid; 6-Carboxyfluorescein-N-
methylglukamid; 5(6)-Carboxyfluorescein-
tris(methylol)methylamid; 5-Carboxyfluorescein-diethanolamid;
5(6)-Carboxyfluorescein-N-(β-hydroxyethyl)-maltosamid; 5(6)-
Carboxyfluorescein-galaktosamid; 5(6)-Carboxyfluorescein-
pyridoxamid; 5(6)-Carboxyfluorescein-tris(methylol)methylamid-
4',5-bis(methylendiethanolamin); 5(6)-Carboxyfluorescein-N-
methylglukamid-4',5'-bis(methylendiethanolamin); 5(6)-
Carboxyfluorescein-N-methylglukamid-4',5'-bis(N-
methylglukaminomethyl); 5(6)-Carboxyfluorescein-N-
methylglukamid-4',5'-bis(methyleniminodiessigsäure); 5(6)-
Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methylensarkosin); 5(6)-
Carboxyfluorescein-4',5'-bis(methyleniminodiessigsäure);
Fluorescein-5(6)-N-(β-hydroxyethyl)maltosethioharnstoff; und
Fluorescein-5(6)-tris(methylol)methylthioharnstoff.
6. Lipidvesikel, das in einer selbstlöschenden Konzentration
eine fluoreszente Verbindung nach Formel I einschließt:
,wobei R&sub1; sich in der 5- oder 6- Position befindet, und
R&sub1; eine Pyridoxamid- oder eine Carboxylgruppe oder eine Gruppe
nach Formel II ist, und wobei R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden
sind, und wobei sie Wasserstoff oder eine Gruppe nach Formel II
sind,
wobei
X Carbonyl, Aminothiocarbonyl oder Methylen ist, und
Y Wasserstoff, Alkyl mit einem bis sieben
Kohlenstoffatomen, Carboxyalkyl mit zwei bis sieben
Kohlenstoffatomen oder Alkylol mit einem bis sechs
Kohlenstoffatomen ist, und
Z Carboxyalkyl mit zwei bis sieben Kohlenstoffatomen,
Alkylol mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen oder eine
Mono- oder Disaccharidgruppe oder Pyridoxyl ist,
unter dem Vorbehalt, daß wenn R&sub1; eine Carboxylgruppe
ist, dann R&sub2; und R&sub3; nicht beide Wasserstoff sein können.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/067,833 US4912208A (en) | 1987-06-29 | 1987-06-29 | Fluorophores for encapsulation into liposomes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3853320D1 DE3853320D1 (de) | 1995-04-20 |
DE3853320T2 true DE3853320T2 (de) | 1995-10-19 |
Family
ID=22078712
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3853320T Expired - Fee Related DE3853320T2 (de) | 1987-06-29 | 1988-06-01 | Fluorophore für die Abkapselung in Liposome. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4912208A (de) |
EP (1) | EP0297303B1 (de) |
JP (1) | JPS6422878A (de) |
AT (1) | ATE119904T1 (de) |
AU (1) | AU598385B2 (de) |
CA (1) | CA1295999C (de) |
DE (1) | DE3853320T2 (de) |
ES (1) | ES2072253T3 (de) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5130446A (en) * | 1985-06-25 | 1992-07-14 | Siska Diagnostics, Inc. | Fluorescent compounds for tagging nucleic acid probes |
FI884721A (fi) * | 1987-10-15 | 1989-04-16 | Univ Moskovsk | Anvaendning av fluorderivat som kontrastmedel. |
US5375606A (en) * | 1990-02-28 | 1994-12-27 | Zynaxis, Inc. | Bio-analytical separation method |
ES2106040T3 (es) * | 1990-05-16 | 1997-11-01 | Abbott Lab | Ensayo para barbituratos, trazadores, inmunogenos, anticuerpos y kit. |
US5272260A (en) * | 1992-01-29 | 1993-12-21 | Abbott Laboratories | Reagents and methods for the determination of glycohydrolytic enzymes |
US5352803A (en) * | 1992-03-30 | 1994-10-04 | Abbott Laboratories | 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives |
EP0649533B1 (de) * | 1992-03-30 | 2000-05-10 | Abbott Laboratories | Reagenzien und verfahren zum nachweis und zur quantifizierung von thyroxin in flüssigen proben |
DE69435240D1 (de) | 1993-06-30 | 2009-10-29 | Abbott Lab | Interkalatoren mit DNA-Affinität und Anwendungsverfahren |
IT1298693B1 (it) * | 1996-04-24 | 2000-01-12 | Hoffmann La Roche | Derivati della fluoresceina 4'-metil sostituiti |
TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US7160732B2 (en) * | 2000-07-07 | 2007-01-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Fluorescein-based metal sensors, and methods of making and using the same |
US20040110828A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-06-10 | Chowdhury Dipak K. | Tetrahydrocannabinol compositions and methods of manufacture and use thereof |
US7399639B2 (en) | 2003-05-04 | 2008-07-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Sensors, and methods of making and using the same |
US7615377B2 (en) | 2003-09-05 | 2009-11-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Fluorescein-based metal sensors |
US20080113014A1 (en) * | 2004-01-28 | 2008-05-15 | Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. | Method for Screening for Compounds Safe for Gastric Mucosa |
GB0811385D0 (en) * | 2008-06-20 | 2008-07-30 | Artemis Intelligent Power Ltd | Fluid working machines and method |
KR101933622B1 (ko) * | 2012-10-09 | 2018-12-28 | 삼성전자주식회사 | 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4130634A (en) * | 1974-03-15 | 1978-12-19 | University Of Illinois Foundation | Method for detecting and quantifying antigens |
US4318846A (en) * | 1979-09-07 | 1982-03-09 | Syva Company | Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers |
US4342826A (en) * | 1980-02-04 | 1982-08-03 | Collaborative Research, Inc. | Immunoassay products and methods |
US4304720A (en) * | 1980-04-30 | 1981-12-08 | Merck & Co., Inc. | Fluorescein esters and ethers and the preparation thereof |
US4439356A (en) * | 1981-03-03 | 1984-03-27 | Syva Company | Unsymmetrical fluorescein derivatives |
US4350676A (en) * | 1981-05-21 | 1982-09-21 | Laties Alan M | Ophthalmic use of carboxyfluorescein |
US4668640A (en) * | 1981-12-11 | 1987-05-26 | Abbott Laboratories | Fluorescence polarization immunoassay utilizing substituted carboxyfluoresceins |
US4517303A (en) * | 1982-10-20 | 1985-05-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Specific binding assays utilizing analyte-cytolysin conjugates |
US4614823A (en) * | 1982-11-08 | 1986-09-30 | Abbott Laboratories | Aminomethylfluorescein derivatives |
US4476229A (en) * | 1982-11-08 | 1984-10-09 | Abbott Laboratories | Substituted carboxyfluoresceins |
US4510251A (en) * | 1982-11-08 | 1985-04-09 | Abbott Laboratories | Fluorescent polarization assay for ligands using aminomethylfluorescein derivatives as tracers |
EP0201633A3 (de) * | 1984-12-20 | 1989-02-22 | Abbott Laboratories | Substituierte Anilid-Verbindungen und ihre Verwendung |
EP0200960A1 (de) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Abbott Laboratories | Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay auf Gesamtöstriol |
EP0218010A3 (de) * | 1985-07-10 | 1988-01-07 | Abbott Laboratories | Verfahren zur Bestimmung von Liganden und substituierte Carboxyfluoreszein-Markers zur Durchführung desselben |
DE3689688T2 (de) * | 1985-10-15 | 1994-08-25 | Abbott Lab | Verbindungen und Immunoassay für tricyclische Antidepressiva. |
EP0232736A1 (de) * | 1986-02-06 | 1987-08-19 | Abbott Laboratories | Herstellung von 4'-Aminomethylfluoreszeinderivaten für Fluoreszenzpolarisations-Immunassays |
-
1987
- 1987-06-29 US US07/067,833 patent/US4912208A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-06-01 AT AT88108778T patent/ATE119904T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-06-01 DE DE3853320T patent/DE3853320T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-06-01 ES ES88108778T patent/ES2072253T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-01 EP EP88108778A patent/EP0297303B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-22 CA CA000570160A patent/CA1295999C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-06-28 AU AU18482/88A patent/AU598385B2/en not_active Ceased
- 1988-06-28 JP JP63162374A patent/JPS6422878A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA1295999C (en) | 1992-02-18 |
EP0297303A3 (en) | 1989-09-20 |
EP0297303B1 (de) | 1995-03-15 |
EP0297303A2 (de) | 1989-01-04 |
ATE119904T1 (de) | 1995-04-15 |
US4912208A (en) | 1990-03-27 |
AU1848288A (en) | 1989-01-05 |
DE3853320D1 (de) | 1995-04-20 |
AU598385B2 (en) | 1990-06-21 |
ES2072253T3 (es) | 1995-07-16 |
JPS6422878A (en) | 1989-01-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3853320T2 (de) | Fluorophore für die Abkapselung in Liposome. | |
DE3750503T2 (de) | Chemilumineszierende Acridinium- und Phenantridiniumsalze. | |
EP0371262B1 (de) | Neue Digoxigenin-Derivate und ihre Verwendung | |
DE69233146T2 (de) | Partikel, die eine Zusammensetzung beinhalten, die eine chemilumineszierende Verbindung umfassen | |
DE3686429T2 (de) | Fluoreszierende indikatoren und kennsatz-spezies und ihre verwendung in analytischen elementen und bestimmungen. | |
DE69720809T2 (de) | Durch gruppen erweiterte fluorophore polymere, die eine hydrophobe und konformativ eingeschrankte mikroumgebung schaffen | |
DE3033691A1 (de) | An ein substrat gebundene diamintriessigsaeuren und ihre chelate | |
DE3856358T3 (de) | Für Tests verwendbare chemilumineszierende Ester, Thioester und Amide | |
EP0597333B1 (de) | Verbindungen für Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays und Verwendung derselben in Immunoassays | |
EP0209875A1 (de) | Resorufin-Derivate sowie Verfahren zu deren Herstellung | |
EP3461815B1 (de) | Neue poly-sulfonierte fluoreszenz-farbstoffe | |
EP0632810B1 (de) | Neues biotinylierungsreagenz | |
DE69737298T2 (de) | Konjugate von polysacchariden und biomolekülen | |
DE60226151T2 (de) | Verbessertes verfahren zur membranpotentialmessung | |
DE2914842C2 (de) | N-(ω-Diphenylhydantoinyl-alkyl)-7-β-D-galactosyl-cumarin-3-carboxamide | |
DE68906279T2 (de) | Fluorkohlenstoffkette enthaltende antigene konjugate. | |
DE3877032T2 (de) | Diagnostischer immunoassay fuer digoxin mit festphasetrennung. | |
DE3205506A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von liganden in einer probe und verbindungen zur durchfuehrung des verfahrens | |
DE3245854C2 (de) | Aminofluorescein-Derivate und ihre Verwendung als Tracer zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten mittels einer Fluoreszenzpolarisationstechnik | |
CH628737A5 (de) | Immunologisches testsystem. | |
DE68917387T2 (de) | Dioxetane zur verwendung bei immuntests. | |
DE69822446T2 (de) | Cyclosporin derivate und deren verwendung | |
DE19930177A1 (de) | Intermolekular assoziierende Verbindungen und diese umfassende Aggregate | |
DE2411884A1 (de) | Verfahren und stoffzusammensetzung zur analyse von biologisch aktiven molekuelen | |
US4970074A (en) | Fluorophores for encapsulation into liposomes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |