CN116930478A - 一种甲状腺素荧光偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甲状腺素荧光偶联物及其制备方法和甲状腺素荧光偶联物在用于检测甲状腺素的试剂盒中的应用,还提供了一种用于检测甲状腺素的试剂盒及其制备方法。将本发明的甲状腺素荧光偶联物用于检测甲状腺素的试剂盒中,可以提高试剂盒的稳定性。本发明提出了在采用吖啶类衍生物对甲状腺素进行标记的过程中,在甲状腺素与吖啶类衍生物中间嵌入两端均为亚氨基的碳链结构作为连接臂,形成具有甲状腺素‑连接臂‑吖啶类衍生物的偶联结构的甲状腺素荧光偶联物,将该甲状腺素荧光偶联物作为用于检测甲状腺素的试剂盒的试剂成分,可以提高试剂盒的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域,具体是一种甲状腺素荧光偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
甲状腺素(3,5,3',5'-四碘甲状腺原氨酸,T4)是由甲状腺滤泡上皮细胞分泌产生的激素,分子量约为777KD。T4经甲状腺分泌释放进入血液循环后,以结合态和游离态两种形式存在。血清中的总的T4称为总T4(TT4),游离部分的T4称为游离T4(FT4)。T4进入血液循环后约99.7%T4与血液中甲状腺素结合蛋白结合,其中约60%与TBG结合,30%与TBPA结合,其余与白蛋白结合。仅约0.05%的T4呈游离状态(FT4)存在于血液中。正常情况下两种形态之间保持着动态平衡,只有FT4才能进入靶细胞与受体结合发挥其生理功能,FT4是循环血中甲状腺激素的活性部分,具有生物活性。甲状腺激素分泌量增加或减少均可导致甲状腺功能失调,内分泌代谢紊乱。因此,在甲状腺疾病的诊断和治疗过程中,经常通过检测血清中FT4和/或TT4的含量来反映甲状腺的功能状态。
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术;是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。常用作化学发光标记物的吖啶类化合物(acridinium ester,AE)包括:吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)和吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS),它们的结构中都有吖啶环。吖啶类化合物通过起动发光试剂(NaOH、H2O2)作用而发光,将其应用于化学发光检测具有许多优越性,如:①背景发光低,信噪比高;②发光反应干扰因素少;③光释放快速集中、发光效率高、发光强度大;④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少;⑤标记物稳定(在2-8℃下可保存数月之久)。
现有研究公开了将甲状腺素用化学发光标记物进行标记后采用化学发光免疫分析方法进行检测,例如以下列举的一篇中国专利申请文件及一篇期刊论文中记载的吖啶酯-FT4结合物的制备方法:
中国专利申请CN 110988368 A公开了一种游离甲状腺素发光免疫检测试剂盒,该试剂盒包括以下试剂:固相试剂R1:含有链霉亲和素磁颗粒的悬液;液相试剂R2:含有吖啶酯标记的T4抗体的悬液;生物素试剂R3:含有生物素标记的甲状腺素衍生物的悬液。其中,液相试剂R2的制备方法为:取T4抗体,用磷酸缓冲液稀释,加入吖啶酯,抗体与吖啶酯的标记摩尔比例为1:3,缓缓震荡,避光反应过夜;混合液经过葡聚糖凝胶G-25株纯化后得到的吖啶酯标记的T4抗体的悬液,将标记好的吖啶酯标记T4抗体悬液重悬于磷酸盐缓冲液中,得到液相试剂R2。
张建锋将吖啶酯作为信号物质与小分子甲状腺素进行标记,采用小分子竞争法原理,引入磁性微球作为固相载体,并结合链霉亲和素-生物素系统,开发出性能优良的FT4检测试剂,具有重要的临床应用价值,对相关科研也有一定的参考意义。其中,吖啶酯-T4结合物的制备方法:称取T4纯品适量,溶于DMSO中,配制浓度为0.1mmol/L的溶液A。再称取NSP–DMAE-NHS适量,溶于无水DMF中,配制浓度为10mmol/L的溶液B。取溶液B 5.0mL,加入三乙胺(TEA)2mg,再加入溶液B 5.0mL,最后用0.05mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至总体积10mL,室温搅拌反应16h,产物经制备色谱纯化,获得吖啶酯-T4结合物(磁微粒-吖啶酯化学发光游离甲状腺素检测试剂的研制及应用[J],张建锋,《国际检验医学杂志》2016年19期)。
然而,本申请人应用现有游离/总甲状腺素检测试剂盒进行甲状腺素检测时发现,现有的甲状腺素与吖啶酯的连接产物存在免疫反应效价低、易受胆红素干扰、结果不稳定等缺点。而在甲状腺素与吖啶类衍生物中间嵌入连接臂形成偶联物后,再用其替换现有的吖啶标记的甲状腺素制备用于检测甲状腺素的试剂盒,有利于提高试剂盒的稳定性。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种甲状腺素荧光偶联物及其制备方法和应用,本发明还提供了一种用于检测甲状腺素的试剂盒及其制备方法。将本发明的甲状腺素荧光偶联物替换现有甲状腺素检测试剂盒中的吖啶标记的甲状腺素制备用于检测甲状腺素的试剂盒,可以提高试剂盒的稳定性。
本发明的目的通过以下技术方案来实现:
第一方面,本发明提供了一种甲状腺素荧光偶联物,所述甲状腺素荧光偶联物具有如下式Ⅰ所示的偶联结构:
式Ⅰ中,AE表示吖啶类衍生物(优选吖啶类衍生物脱去琥珀酰亚胺基后形成的基团);L表示连接臂,所述连接臂是两端均为亚氨基的碳链结构;R为H或含有羰基的基团,优选含有羰基的基团。
当R为H时,L右边连接的结构表示甲状腺素;当R为含有羰基的基团时,L右边连接的结构为被含有羰基的基团取代的甲状腺素结构。
进一步优选,所述含有羰基的基团是R1-CO-或R1-COO-,其中R1选自C1-C10烷基、C3-C10烯基、C3-C10炔基、C6-C10芳基、C6-C10杂芳基、C4-C10硅烷基或C4-C10硅氧烷基等。
R1优选自甲基、乙基、叔丁基、烯丙基、苯甲基;更优选的,R1为甲基。
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物,所述吖啶类衍生物为吖啶磺酰胺或吖啶酯,优选吖啶磺酰胺。
当所述吖啶类衍生物为吖啶磺酰胺时,式Ⅰ中AE的结构优选为:
其中,TS是指对甲苯璜酰基。
当所述吖啶类衍生物为吖啶酯时,式Ⅰ中AE的结构优选为:
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物,所述连接臂的碳链结构中碳原子个数小于11。
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物,所述连接臂具有下式Ⅱ或Ⅲ所示的结构:
式Ⅱ中,n选自整数1-9;
式Ⅲ中,n选自整数1-7。
进一步优选,式Ⅱ中,n选自整数1、3或9。
进一步优选,式Ⅲ中,n选自整数1、3、6或7;更进一步优选,n选自整数1或7。
进一步优选,所述甲状腺素荧光偶联物具有下式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ或XIII所示的结构:
式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、XIII中的TS是指对甲苯璜酰基,式Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、XIII中的AC是指乙酰基。
其中,使用具有式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、XIII的结构的甲状腺素荧光偶联物制备得到的试剂盒具有较好的稳定性。另外,使用具有式Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、XIII的结构的甲状腺素荧光偶联物制备得到的试剂盒还具有抗胆红素干扰能力。
第二方面,本发明提供了一种甲状腺素荧光偶联物的制备方法,包括采用吖啶类衍生物对甲状腺素进行偶联,在偶联过程中在甲状腺素与吖啶类衍生物中间嵌入两端均为亚氨基的碳链结构作为连接臂,使形成具有甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构的化合物。所得到的化合物是第一方面所述的当R为H时的甲状腺素荧光偶联物。
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法,所述甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构中,甲状腺素与连接臂之间、连接臂与吖啶类衍生物之间均是通过酰胺键连接。
优选地,所述甲状腺素与连接臂之间的酰胺键是由甲状腺素结构上的羧基脱去羟基后与连接臂一端的亚氨基结合后形成的。吖啶类衍生物与连接臂之间的酰胺键是由吖啶类衍生物结构上的氮氧键发生断裂后与连接臂另一端的亚氨基结合后形成的。
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法,所述吖啶类衍生物为吖啶磺酰胺或吖啶酯。
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法,所述连接臂的碳链结构中碳原子个数小于11。
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法,所述连接臂具有在第一方面中介绍的式Ⅱ或Ⅲ所示的结构。
根据本发明提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法,所述制备方法还包括对所形成的具有甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构的化合物进行氨基保护处理。经氨基保护处理后形成的甲状腺素荧光偶联物也就是第一方面所述的当R为含有羰基的基团时的甲状腺素荧光偶联物。
优选地,所述氨基保护处理是使用氨基保护剂对所形成的甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构进行酰胺化处理。也就是将甲状腺素结构上的活性氨基进行钝化处理形成-NH-CO-基团的过程。
进一步优选地,所述氨基保护剂可选自乙酸琥珀酰亚胺酯、苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺、烯丙基琥珀酰亚胺基碳酸酯、二碳酸二叔丁酯或N-[2-(三甲基硅基)乙氧羰氧基]琥珀酰亚胺等。
更进一步优选,所述氨基保护剂为乙酸琥珀酰亚胺酯。
第三方面,本发明提供了一种如第一方面所述的甲状腺素荧光偶联物或如第二方面所述的甲状腺素荧光偶联物的制备方法制备得到的甲状腺素荧光偶联物在用于检测甲状腺素的试剂盒中的应用,尤其是在游离甲状腺素检测试剂盒或总甲状腺素检测试剂盒中的应用。
第四方面,本发明提供了一种用于检测甲状腺素的试剂盒,在该试剂盒的试剂中含有第一方面所述的甲状腺素荧光偶联物或第二方面所述的甲状腺素荧光偶联物的制备方法制备得到的甲状腺素荧光偶联物。
优选的,所述用于检测甲状腺素的试剂盒包括游离甲状腺素检测试剂盒或总甲状腺素检测试剂盒。
进一步优选,本发明提到的用于检测甲状腺素的试剂盒、游离甲状腺素检测试剂盒或总甲状腺素检测试剂盒均是指基于化学发光免疫分析技术中磁微粒化学发光——竞争法对甲状腺素进行检测的试剂盒。
在本发明的一些实施例中,游离甲状腺素检测试剂盒包括以下试剂:
试剂R1:含包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒的悬液;
试剂R2:含定量甲状腺素荧光偶联物的悬液;
校准品:一系列含已知浓度梯度的甲状腺素抗原的悬液。
在本发明的一些实施例中,总甲状腺素检测试剂盒包括以下试剂:
试剂R1:含包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒的悬液;
试剂R2:含定量甲状腺素荧光偶联物的悬液;
试剂R3:含解离剂的悬液;
校准品:一系列含已知浓度梯度的甲状腺素抗原的悬液。
第五方面,本发明提供了一种用于检测甲状腺素的试剂盒的制备方法,是在采用吖啶类衍生物对甲状腺素进行标记制备吖啶标记的甲状腺素时,使用如第二方面所述的甲状腺素荧光偶联物的制备方法。
优选的,所述用于检测甲状腺素的试剂盒包括游离甲状腺素检测试剂盒或总甲状腺素检测试剂盒。
在本发明的一些实施例中,游离甲状腺素检测试剂盒的制备方法包括如下步骤:
采用本发明第二方面提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法制备甲状腺素荧光偶联物,使用该甲状腺素荧光偶联物配置试剂R2。再按常规方法配置试剂R1、校准品。
在本发明的一些实施例中,游离甲状腺素检测试剂盒的试剂R1、试剂R2、校准品可以选择如下表1所示的成分及用量:
表1游离甲状腺素检测试剂盒试剂成分及用量
按照表1的试剂成分及用量制备游离甲状腺素检测试剂盒的方法包括如下步骤:
(1)按照表1试剂R1的用量将包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒、缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、消泡剂加入纯化水中混合均匀,得到试剂R1。
(2)先采用本发明提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法制备甲状腺素荧光偶联物,再按照表1试剂R2的用量将甲状腺素荧光偶联物、缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂一起加入纯化水中混合均匀,得到试剂R2。
(3)设置4个以上甲状腺素抗原的梯度浓度,按照设置的浓度将甲状腺素抗原与缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂混合均匀,通过pH调节剂控制pH,得到校准品。例如,校准品中甲状腺素抗原的浓度可以设置为0、2.50、8.00、25.00、124.00pmol/mL。
总甲状腺素检测试剂盒的制备方法包括如下步骤:
采用本发明第二方面提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法制备甲状腺素荧光偶联物,使用该甲状腺素荧光偶联物配置试剂R2。再按常规方法配置试剂R1、试剂R3、校准品。
在本发明的一些实施例中,总甲状腺素检测试剂盒的试剂R1、试剂R2、试剂R3、校准品可以选择如下表2所示的成分及用量:
表2总甲状腺素检测试剂盒试剂成分及用量
总甲状腺素检测试剂盒的制备方法包括如下步骤:
(1)按照表2试剂R1的用量将包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒、缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、消泡剂加入纯化水中混合均匀,得到试剂R1。
(2)采用本发明提供的甲状腺素荧光偶联物的制备方法制备甲状腺素荧光偶联物,再按照表2试剂R2的用量将甲状腺素荧光偶联物、缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂加入纯化水中混合均匀,得到试剂R2。
(3)按照表2试剂R3的用量将缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、解离剂、防腐剂加入纯化水中搅拌均匀,得到试剂R3。
(4)设置4个以上甲状腺素抗原的梯度浓度,按照设置的浓度将甲状腺素抗原与缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂混合均匀,通过pH调节剂控制pH,得到校准品。例如,校准品中甲状腺素抗原的浓度可以设置为0、14、37、112、283nmol/mL。
以上表1和表2提到的甲状腺素荧光偶联物在本发明中指的是第一方面的甲状腺素荧光偶联物或第二方面制备得到的甲状腺素荧光偶联物。另外,本发明提供的游离甲状腺素检测试剂盒并不局限于表1所示的成分及用量,同理,总甲状腺素检测试剂盒并不局限于表2所示的成分及用量,试剂盒中常规试剂(如缓冲剂、无机盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、消泡剂、pH调节剂)的成分选择及用量范围可以是符合甲状腺素检测试剂盒的其他任意选择。
本发明的有益效果如下:
本发明提供了一种甲状腺素荧光偶联物,该甲状腺素荧光偶联剂的连接键及连接臂的结构相对较为稳定,偶联结构能在一段时间内保持偶联关系。将该甲状腺素荧光偶联物替换现有甲状腺素检测试剂盒中的吖啶标记的甲状腺素,可以提高试剂盒的稳定性;部分甲状腺素荧光偶联物制备得到的试剂盒还具有较强的抗干扰能力。
另外,本发明还提供了一种甲状腺素荧光偶联物的制备方法,提出采用吖啶类衍生物对甲状腺素进行偶联,在偶联过程中在甲状腺素与吖啶类衍生物中间嵌入两端均为亚氨基的碳链结构作为连接臂,形成具有甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物偶联结构的化合物。采用该制备方法制备的化合物来配置用于检测甲状腺素的试剂盒的检测试剂,得到的试剂具有较好的稳定性,能有效提高试剂盒检测结果的准确性。本发明甲状腺素荧光偶联物的制备方法还对甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物偶联结构进一步进行氨基保护处理,通过氨基保护剂使偶联结构上的活性氨基钝化形成更加稳定的-NH-CO-基团,从而进一步提高了偶联结构的稳定性以及试剂盒的抗干扰能力。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的技术。这些实施例是本发明的阐释和举例,并不以任何形式限制本发明的范围。
本发明实施例2-5采用的甲状腺素荧光偶联物的偶联过程具体包括以下步骤:
(1)将甲状腺素以及9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯,溶解于溶剂中,室温避光反应20-30h,除去溶剂,柱层析分离,得到化合物1。
(2)将吖啶类衍生物以及提供连接臂结构的偶联剂溶解于溶剂中,室温置于滚轴混匀仪上混匀,避光反应得到反应液。
(3)将步骤(1)得到的化合物1与二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺溶解于溶剂中,室温避光反应20-30h后,加入步骤(2)得到的反应液,继续避光反应20-30h,除去溶剂,柱层析分离,得到化合物2。
(4)将步骤(3)得到的化合物2和哌啶溶解于溶剂中,室温避光反应2-4h后,除去溶剂,柱层析分离,得到甲状腺素荧光偶联物。
其中,步骤(1)和步骤(2)可调换顺序进行、可同时进行。
步骤(2)中提到的偶联剂可以是一种或者多种,能给甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构提供如式Ⅱ或Ⅲ所示的结构的化合物均可,如乙二胺、丁二胺、丁二酸二酰肼等。
进一步优选地,对所形成的甲状腺素荧光偶联物进行酰胺化处理的方法为:将乙酸琥珀酰亚胺酯以及以上得到的甲状腺素荧光偶联物,溶解于溶剂中,室温避光反应20-30h后,除去溶剂,柱层析分离,得到酰胺化的甲状腺素荧光偶联物。
以上溶剂优选二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
甲状腺素有DL、L、D型,以下本申请人使用L型甲状腺素与NSP-SA-NHS为原料合成甲状腺素荧光偶联物并对其稳定性和抗干扰性进行考察。
实施例1
T4-AE偶联物的结构式:
T4-AE偶联物的合成路线:
T4-AE偶联物的合成方法:
将50mg NSP-SA-NHS以及84.7mg L-甲状腺素溶解于含有5mL DMF溶液的10mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温置于滚轴混匀仪上混匀,避光反应24h。减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=5:1)分离,得到59mg T4-AE偶联物,反应收率为60%。HRMS(ESI)结果显示C43H37I4N3O11S2 m/z 1343.8108(M+H)。
实施例2
T4-L-AE偶联物a的结构式:
T4-L-AE偶联物a的合成路线:
T4-L-AE偶联物a的合成方法:
(1)将100mg L-甲状腺素以及52.3mg 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯,溶解于含有15mL DMF溶液的厚壁茄形瓶中,室温避光反应24h。减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离,得到109.6mg化合物1,反应收率为85%。HRMS(ESI)显示C30H21I4NO6m/z 999.7620(M+H)。
(2)将61.3mg NSP-SA-NHS以及6.6mg丁二胺溶解于含有3mL DMF溶液的10mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温置于滚轴混匀仪上混匀,避光反应24h得反应液A。
(3)将72.9mg化合物1、30.1mg二环己基碳二亚胺以及16.8mg N-羟基琥珀酰亚胺,溶解于含有3mL DMF溶液的10mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温避光反应24h后,加入上述反应液A,继续避光反应24h。减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离,得到54mg化合物2,反应收率为45%。HRMS(ESI)结果显示C62H57I4N5O12S2 m/z 1635.9750(M+H)。
(4)将50mg化合物2、0.6mL哌啶,溶解于含有3mL DMF溶液的7mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温避光反应3h后,减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=3:1)分离,得到32.9mgT4-L-AE偶联物a,反应收率为75%。HRMS(ESI)结果显示C47H48I4N5O10S2 m/z 1413.9213(M+H)。
实施例3
T4-L-AE偶联物a’的结构式:
通过T4-L-AE偶联物a得到T4-L-AE偶联物a’的路线:
通过T4-L-AE偶联物a得到T4-L-AE偶联物a’的方法:
将20mgT4-L-AE偶联物a、2.7mg乙酸琥珀酰亚胺酯,溶解于含有2mL DMF溶液的7mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温避光反应24h后,减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=4:1)分离,得到14mg T4-L-AE偶联物a’,反应收率为69%。HRMS(ESI)结果显示C49H49I4N5O12S2 m/z 1471.8987(M+H)。
实施例4
T4-L-AE偶联物b的结构式:
T4-L-AE偶联物b的合成路线:
T4-L-AE偶联物b的合成方法:
(1)将100mg L-甲状腺素以及52.3mg 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯,溶解于含有15mL DMF的厚壁茄形瓶中,室温避光反应24h。减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离,得到109.6mg化合物1,反应收率为85%。HRMS(ESI)结果显示C30H21I4NO6 m/z 999.7620(M+H)。
(2)将61.3mg NSP-SA-NHS以及11.0mg丁二酸二酰肼溶解于含有3mL DMF溶液的10mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温置于滚轴混匀仪上混匀,避光反应24h得反应液B。
(3)将72.9mg化合物1、30.1mg二环己基碳二亚胺以及16.8mg N-羟基琥珀酰亚胺,溶解于含有3mL DMF溶液的10mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温避光反应24h后,加入上述反应液B,继续避光反应24h。减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=8:1)分离,得到54mg化合物3,反应收率为44%。HRMS(ESI)结果显示C62H55I4N7O14S2 m/z 1693.9439(M+H)。
(4)将40mg化合物3、0.6mL哌啶,溶解于含有3mL DMF溶液的7mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温避光反应3h后,减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=3:1)分离,得到27.5mgT4-L-AE偶联物b,反应收率为78%。HRMS(ESI)结果显示C47H45I4N7O12S2 m/z 1471.8917(M+H)。
实施例5
T4-L-AE偶联物b’的结构式:
通过T4-L-AE偶联物b得到T4-L-AE偶联物b’的路线:
通过T4-L-AE偶联物b得到T4-L-AE偶联物b’的方法:
将18mg T4-L-AE偶联物b、2.2mg乙酸琥珀酰亚胺酯,溶解于含有2mL DMF溶液的7mL棕色硼硅玻璃瓶中,室温避光反应24h后,减压除去DMF,经过柱层析(二氯甲烷:甲醇=4:1)分离,得到13.2mg T4-L-AE偶联物b’,反应收率为72%。HRMS(ESI)结果显示C49H47I4N7O14S2 m/z 1529.9001(M+H)。
偶联物性能考察
为了验证本申请介绍的T4-L-AE偶联物的性能,本申请人以T4-AE偶联物作为对照,进行了以下反应性考察、稳定性考察、不同浓度胆红素干扰考察:
(一)反应性考察
参照游离甲状腺素检测试剂盒的试剂成分及用量配置了以下试剂R1、试剂R2、校准品:
试剂R1:包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒0.4mg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂10g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。
试剂R2:吖啶标记的甲状腺素0.1μg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂20g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。吖啶标记的甲状腺素分别选用实施例1的T4-AE偶联物、实施例2的T4-L-AE偶联物a和实施例3的T4-L-AE偶联物a’。
校准品:甲状腺素抗原(CalA:0pmol/mL、CalB:2.56pmol/mL、CalC:
8.01pmol/mL、CalD:25.27pmol/mL、CalE:123.89pmol/mL)、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂50g/L、防腐剂3mL/L。
使用迈克生物股份有限公司的i3000全自动化学发光免疫分析仪,进行检测,读取相对发光值如下表3所示:
表3反应性考察结果
从反应性考察结果可以看出,使用实施例2或3的T4-L-AE偶联物制备得到的试剂盒与使用实施例1的T4-AE偶联物制备得到的试剂盒均具有较好的反应性;即采用本发明提供的甲状腺素荧光偶联物配置试剂R2,并不会影响试剂盒的反应性。
(二)稳定性考察
(1)7天发光信号稳定性考察:
参照游离甲状腺素检测试剂盒的试剂成分及用量配置了以下试剂R1、试剂R2、校准品:
试剂R1:包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒0.4mg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂10g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。
试剂R2:吖啶标记的甲状腺素0.1μg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂20g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。吖啶标记的甲状腺素分别选用实施例1的T4-AE偶联物、实施例2的T4-L-AE偶联物a和实施例3的T4-L-AE偶联物a’、实施例4的T4-L-AE偶联物b和实施例5的T4-L-AE偶联物b’。
校准品:磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂50g/L、防腐剂3mL/L。
将试剂盒在37℃环境下放置7天,放置前后均使用迈克生物股份有限公司的i3000全自动化学发光免疫分析仪进行相对发光值检测,得到第一相对发光值和第二相对发光值,然后依据公式:信号保留率=第二次相对发光值/第一次相对发光值*100%,计算各试剂R2放置7天后的信号保留率见下表4:
表4 7天发光信号稳定性考察结果
从表4可以看出:使用T4-L-AE偶联物制备得到的试剂盒的7天信号保留率明显比使用T4-AE偶联物制备得到的试剂盒高;其中,使用T4-L-AE偶联物a’或b’制备得到的试剂盒的7天信号保留率又明显高于使用T4-L-AE偶联物a或b制备得到的试剂盒。说明使用本发明的甲状腺素荧光偶联物替换现有甲状腺素检测试剂盒中的吖啶标记的甲状腺素,可以提高试剂盒的热稳定性。
(2)不同环境温度下发光信号稳定性考察:
参照游离甲状腺素检测试剂盒的试剂成分及用量配置了以下试剂R1、试剂R2、校准品:
试剂R1:包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒0.4mg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂10g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。
试剂R2:吖啶标记的甲状腺素0.1μg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂20g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。吖啶标记的甲状腺素分别选用实施例3的T4-L-AE偶联物a’和实施例5的T4-L-AE偶联物b’。
校准品:磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂50g/L、防腐剂3mL/L。
使用迈克生物股份有限公司的i3000全自动化学发光免疫分析仪,分别在环境温度20℃、25℃、30℃下,读取检测试剂的相对发光值,以20℃的相对发光值为100%,计算25℃、30℃下的相对发光值相对于20℃的相对发光值的百分比,具体如下表5所示:
表5不同环境温度下发光信号稳定性考察结果
从表5可以看出,使用实施例5的T4-L-AE偶联物b’制备得到的试剂盒相对于使用实施例3的T4-L-AE偶联物a’制备得到的试剂盒具有更好的环境温度稳定性。
(三)胆红素干扰考察
参照游离甲状腺素检测试剂盒的试剂成分及用量配置了以下试剂R1、试剂R2、校准品:
试剂R1:包被鼠抗甲状腺素单克隆抗体的免疫磁微粒0.4mg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂10g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。
试剂R2:吖啶标记的甲状腺素0.1μg/mL、磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂20g/L、防腐剂3mL/L、溶剂为纯化水。吖啶标记的甲状腺素分别选用实施例3的T4-L-AE偶联物a’、实施例4的T4-L-AE偶联物b和实施例5的T4-L-AE偶联物b’。
校准品:磷酸盐3g/L、无机盐离子9g/L、表面活性剂1mL/L、稳定剂50g/L、防腐剂3mL/L。
往校准品溶液中分别添加不同浓度胆红素(1000μmol/L、100μmol/L、10μmol/L),添加胆红素前后均使用迈克生物股份有限公司的i3000全自动化学发光免疫分析仪进行相对发光值检测,计算添加不同浓度胆红素后的相对发光值与添加胆红素前的相对发光值的偏差,结果见下表6所示:
表6胆红素干扰考察结果
当测值干扰(即1/2Tea)<12.5%,满足甲状腺素检测的要求。
从表6的结果可以看出,使用实施例4的T4-L-AE偶联物b制备得到的试剂盒在胆红素浓度小于100μmol/L时,满足相对发光值偏差的要求;使用实施例3的T4-L-AE偶联物a’制备得到的试剂盒和使用实施例5的T4-L-AE偶联物b’制备得到的试剂盒在胆红素浓度为1000μmol/L时,仍然满足相对发光值偏差的要求。使用实施例3的T4-L-AE偶联物a’制备得到的试剂盒和使用实施例5的T4-L-AE偶联物b’制备得到的试剂盒较使用实施例4的T4-L-AE偶联物b制备得到的试剂盒抗胆红素干扰能力更强。
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的任何限制。实施例对本发明进行了描述,应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种甲状腺素荧光偶联物,其特征在于,所述甲状腺素荧光偶联物具有如下式Ⅰ所示的偶联结构:
式Ⅰ中,AE表示吖啶类衍生物;L表示连接臂,所述连接臂是两端均为亚氨基的碳链结构;R为H或含有羰基的基团。
2.根据权利要求1所述的甲状腺素荧光偶联物,其特征在于,所述吖啶类衍生物为吖啶磺酰胺或吖啶酯,优选为吖啶磺酰胺;和/或,所述连接臂的碳链结构中碳原子个数小于11。
3.根据权利要求1或2所述的甲状腺素荧光偶联物,其特征在于,所述含有羰基的基团是R1-CO-或R1-COO-,其中R1选自C1-C10烷基、C3-C10烯基、C3-C10炔基、C6-C10芳基、C6-C10杂芳基、C4-C10硅烷基或C4-C10硅氧烷基。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的甲状腺素荧光偶联物,其特征在于,所述连接臂具有下式Ⅱ或Ⅲ所示的结构:
式Ⅱ中,n选自整数1-9,优选自整数1、3或9;
式Ⅲ中,n选自整数1-7,优选自整数1、3、6或7,更优选自整数1或7。
5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的甲状腺素荧光偶联物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括采用吖啶类衍生物对甲状腺素进行偶联,在偶联过程中在甲状腺素与吖啶类衍生物中间嵌入两端均为亚氨基的碳链结构作为连接臂,使形成具有甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构的化合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括对所形成的具有甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构的化合物进行氨基保护处理。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述氨基保护处理是使用氨基保护剂对所形成的甲状腺素-连接臂-吖啶类衍生物的偶联结构进行酰胺化处理;优选的,所述氨基保护剂选自乙酸琥珀酰亚胺酯、苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺、烯丙基琥珀酰亚胺基碳酸酯、二碳酸二叔丁酯或N-[2-(三甲基硅基)乙氧羰氧基]琥珀酰亚胺。
8.一种如权利要求1-4中任意一项所述的甲状腺素荧光偶联物或如权利要求5-7中任意一项所述的甲状腺素荧光偶联物的制备方法制备得到的甲状腺素荧光偶联物在用于检测甲状腺素的试剂盒中的应用,尤其是在游离甲状腺素检测试剂盒或总甲状腺素检测试剂盒中的应用。
9.一种用于检测甲状腺素的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的试剂中含有权利要求1-4中任意一项所述的甲状腺素荧光偶联物或如权利要求5-7中任意一项所述的制备方法制备得到的甲状腺素荧光偶联物。
10.一种用于检测甲状腺素的试剂盒的制备方法,其特征在于,所述制备方法是在采用吖啶类衍生物对甲状腺素进行标记制备吖啶标记的甲状腺素时,使用如权利要求5-7中任意一项所述的甲状腺素荧光偶联物的制备方法。
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