JPH0637513B2 - ジゴキシゲニン誘導体、その製法、標識結合体の製法、核酸検出法及びジゴキシゲニン結合体 - Google Patents

ジゴキシゲニン誘導体、その製法、標識結合体の製法、核酸検出法及びジゴキシゲニン結合体

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JPH0637513B2
JPH0637513B2 JP1278799A JP27879989A JPH0637513B2 JP H0637513 B2 JPH0637513 B2 JP H0637513B2 JP 1278799 A JP1278799 A JP 1278799A JP 27879989 A JP27879989 A JP 27879989A JP H0637513 B2 JPH0637513 B2 JP H0637513B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規ジゴキシゲニン誘導体、その製法及びこれ
を使用した種種の方法に関する。
従来の技術 ジゴキシゲニンの基本骨格が他の分子又は巨大分子担体
に共有結合して存在するジゴキシゲニン誘導体は多数の
生物学的分析目的に使用される。特に、そのようなジゴ
キシゲニン誘導体は免疫学的テスト（イムノアツセイ）
において、臨床学的観点において重要な、強心配糖体、
特にジゴキシンの測定のために使用される（G.C.Oliver
等著、J.Clin.Invest.、第４７巻、１９６８年、第１０
３５頁；U.Barbieri及びC.Gandolfi著、Clin.Chim.Act
a、第７７巻、１９７７年、第２５７頁；A.Castro及び
N.Monji著、″Immunochemical Methods″、Ｂ部、J.L.L
angone及びH.van Vunakis、Academic Press、１９８１
年出版、第５２３頁；J.A.Hinds等、Clinical Chemistr
y、第３２巻、１９８６年、第１６頁、参照）。これら
のテストにおいてジゴキシゲニン誘導体は測定すべき強
心配糖体に対する抗体と関連して使用され、この検出は
ハプテン−抗−ハプテン−抗体−相互作用の原理を基礎
として行なわれる（K.Luebke及びB.Nieuweboer著、″Im
munologische Teste fr niedermolekulare Wirkstoff
e″、Thieme Verlag社、スツユツトガルト、１９７８年
参照）。
その際、ジゴキシゲニン誘導体としては一般に、ジゴキ
シゲニンがステロイド骨格の３位を介して他の分子に結
合しているような誘導体を使用している。
しかしながら、従来免疫学的テストに使用されたジゴキ
シゲニン誘導体は次のような欠点を１つ又は複数示す： ジゴキシゲニンステロイド骨格とエステル基を介して行
なわれた結合において、ジゴキシゲニン誘導体はエステ
ル基の加水分解鋭敏性のために塩基条件下に著しく塩基
性不安定である；このことは特に通常使用されるヘミサ
クシネート又はヘミグルタレートにあてはまる（スイス
特許第６０４１６４号明細書；米国特許第４０８２７４
７号明細書；N.Monji等著、Experientia、第３６巻、１
９８０年、第１１４１頁参照）；更に類似のことは、例
えばエステル基のかわりに使用したウレタン基において
もあてはまる（西ドイツ国特許公開第２６０７８２６号
明細書参照）。従つて、使用の際には一定の条件下に不
所望なジゴキシゲニンの分解が生じる。
ジゴキシゲニンはステロイド骨格の３位の他にも１２位
に反応性OH基を有している；従つて誘導体の製造の際に
３−及び１２−誘導体からなる混合物がしばしば生じ、
これは１部著しい製造費用においてのみ純粋な位置異性
体に分離することができ、かつ１部、例えば有利に使用
されるヘミサクシネート及びヘミグルタレートの場合、
クロマトグラフイーによつても分離することができな
い。分離しない混合物の使用は誤差の多い結果に導び
く。
誘導体において、このステロイド基本骨格は１部、非変
性ステロイド基本骨格に対する抗体によるハプテンの認
識が強く損なわれるように変性されて存在する。これは
例えば３位の酸素原子がアミノ窒素に変換されているジ
ゴキシゲニン誘導体の場合である（例えばヨーロツパ特
許第１０４５２７号明細書参照）。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題は強心配糖体の免疫学的測定テストに好適
であり、かつこれをもちいて前記欠点を回避可能なジゴ
キシゲニン誘導体を製造することである。この課題は本
発明により解決される。
課題を解決するための手段 本発明の課題は一般式(I) 〔式中、ｎは１〜４の整数、有利には１を表わし、かつ
Ｚは-CN,-COOC2H5， を表わす］のジゴキシゲニン誘導体である。
一般式(I)の本発明によるジゴキシゲニン誘導体におい
て、ステロイド骨格と橋部との間の結合は３位のエーテ
ル結合を介して行なわれ、これによりエステル基と関連
した塩基不安定性は回避される。更に、これにより、ジ
ゴキシゲニンステロイド骨格の３位に存在する基（オキ
シ基）は保持されるので、このことにより一般に非変性
ステロイド骨格に対する抗体によるハプテンの良好な認
識が達せられる。本発明による３位のエーテル結合は式
(I)の化合物及びその誘導体及び結合体を純粋な位置異
性体として、すなわち、３位及び１２位で結合している
誘導体からの混合物の回避下に製造することをも可能と
する。
本発明による一般式(I)の化合物の製造は、ジゴキシン
（後記反応式の化合物１）からペンタアセチルジゴキシ
ン（同化合物２）へ変換した後、自体公知法で酸性鹸化
することにより得られる１２−Ｏ−アセチル−ジゴキシ
ゲニン（同化合物３）から出発することにより行なわれ
る。１２−Ｏ−アセチル−ジゴキシゲニンにおいて、３
位の遊離OH基をエーテル基 に変換する。この反応はジアゾカルボン酸エステルと、
ｎ＝１の場合例えばジアゾ酢酸エステルと、自体公知法
で３−アルコキシカルボニルアルキルエーテルの形成下
に行なうことができる（Ｚ＝COOC2H5；化合物４に相応
する）。得られたアルコキシカルボニルアルキルエステ
ルにおいて、所望の場合、エステル基を鹸化により遊離
カルボキシ基（Ｚ＝COOH；化合物５）に、又は他の官能
カルボン酸基Ｚに変換することができ、かつ所望の場合
には、このように得られた反応生成物において基Ｚを自
体公知法で他の基Ｚに変換することができる。Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドとの反応によりCOOH基は例えば基
-COONR3R4（Ｒ３及びＲ４は一緒になつて１，４−ジオ
キソ−テトラメチレン基を形成する；化合物６）に変換
される；この基はアミンHNR1R2と反応させることにより
Ｚ＝CONR1R2を有する化合物(I)（化合物７： に相応する）に変換する。このようにして、又は類似の
方法で、式中のＺが前記の意味を有する式(I)の得られ
た化合物をＺが他の異なる意味を有する式Ｉの他の化合
物に自体公知法で変換することも官能である。
個個の、前記方法工程、例えばジアゾ酢酸エステルとの
反応、鹸化工程、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドとの反
応及びアミンHNR1R2との反応はこれらの反応に常法で、
例えば次の実施例に記載されているような方法で行なう
ことができる。
ジゴキシゲニン誘導体の他の重要な使用分野は核酸及び
核酸誘導体の標識化及び検出へのその使用でもある。本
願出願人によるドイツ特許出願第ｐ３８００６４４．８
号明細書（１９８８年１月１２日）及び同第ｐ３８１３
２７８．８号明細書（１９８８年４月２０日）には、化
学結合を介して少なくとも１つのハプテンを標識として
結合して含有する補体核酸ゾンデとハイブリツド化する
ことによる核酸検出法が記載されている。ハプテンとし
てはステロイドを使用しており、このステロイドは核酸
ゾンデの水素結合に関与していない少なくとも１位置に
少なくとも４つの原子長さの橋部を介して結合してい
る；このハイブリツドゾンデを標識抗−ハプテン−抗体
を介して検出する。ステロイドとしては有利にジゴキシ
ゲニン又はジゴキシンが使用される。ハプテンを核酸ゾ
ンデに光−ハプテン(Foto-Hapten)を用いて光化学的に
組込む場合（NuCl.Acid Res.第１３巻、１９８５年、第
７４５〜７６１頁；及びM.Wilchek及びE.A.Bayer著、An
al.Biochem.第１７１巻、１９８８年、第１頁参照）、
光ハプテンとして有利に光−ジゴキシゲニン、すなわち
橋部を介して４−アジド−ベンゾイルと結合したジゴキ
シゲニンを使用する。UV−照射の際に、アジド基から窒
素が脱離し、ニトレンラジカルが生じ、これは次いで核
酸に共有結合する。光−ジゴキシゲニンとしてはジゴキ
シゲニン−３−ヘキサクシネート−〔Ｎ′−（４−アジ
ドベンゾイル）〕−８−アミノ−３，６−ジオキサオク
チルアミドを使用する。
その特性、特に塩基安定性及び非変性ステロイド骨格の
ために、本発明による一般式(I)のジゴキシゲニン誘導
体は前記核酸検出法の標識ハプテンとして著しく好適で
ある。光−ハプテン（光−ジゴキシゲニン；光化学法で
のハプテンの結合、NuCl.Acid Res.第１３巻、１９８５
年、第７４５〜７６１頁；及びM.Wilchek及びE.A.Bayer
著、Anal.Biochem.第１７１巻、１９８８年、第１頁参
照）としては例えばＮ−〔Ｎ−（４−アジドベンゾイ
ル）−８−アミノ−３，６−ジオキサオクチル〕−３−
カルバモイルメチル−ジゴキシゲニン（反応式の化合物
７）である。
本発明による一般式(I)のジゴキシゲニン誘導体を用い
て、ステロイドの３位がそこに存在する酸素で、すなわ
ち基本骨格の変性なしに、橋部分子を介して免疫原担体
材料、例えば蛋白質−又はポリペプチド−担体材料に、
又は核酸に結合することを可能とする。
一般式(I)の本発明によるジゴキシゲニン誘導体は標識
結合体（labeled conjugate）の製造にも非常に好適で
あり、これは強心配糖体、特にジゴキシンの測定のため
に通常のイムノアツセイで用いられる。好適な結合体は
例えば標準法と相応して放射性に標識することができる
か、又は蛍光基で標識することができる。標識構造単位
（labeling moiety）は有利な均一系法においては、例
えば酵素基質、補欠分子団、酵素モデユレーター又は酵
素であり、これは本発明による一般式(I)のジゴキシゲ
ニン誘導体と結合し、結合体となつている。
担体材料、核酸又は標識構造単位への結合は基-O-(CH2)
n-Zを介して行なわれ、ここで基Ｚは有利に担体材料、
Ｚと反応性の基又は結合に依存して選択される。担体と
O-(CH2)n-z-基との結合は第１又は第２アミノ基を介し
て行なわれ、これは活性カルボン酸基ｚ、例えばＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル（Ｚ＝-COONR3R4、Ｒ
３及びＲ４は一緒になつて１，４−ジオキソテトラメチ
レン基を形成する）で変換される；この際、この反応は
このような反応に自体公知の方法で行なわれる。この基
-O-(CH2)n-Zは光化学法によつても（Nucl.Acid Res.第
１３巻、１９８５年、第７４５〜７６１頁；及びM.Wilc
hek及びE.A.Bayer著、Anal.Biochem.、第１７１巻、１
９８８年、第１頁参照）担体、例えば核酸に結合するこ
とができる；この場合、担体材料、例えば核酸ゾンデは
前記光−ジゴキシゲニン（反応式中化合物７参照）の存
在においてＵＶ域を有する可視光で照射し、この際窒素
（Ｎ２）の脱離下にニトレンラジカルが生じ、これは核
酸に共有結合する。
従つて、本発明の課題は通常のイムノアツセイで強心配
糖体、特にジゴキシンを測定するための標識結合体（la
beled conjugate）を製造するために一般式(I)のジゴキ
シゲニン誘導体を使用すること、並びに少なくとも１つ
のハプテンを標識として化学結合を介して含有する補体
核酸ゾンデとのハイブリツド化により核酸を検出するた
めの標識ハプテンとしてこれを使用することである。
本発明のもう１つの課題は本発明による一般式Ｉのジゴ
キシゲニン誘導体を使用して一般式(II) 〔式中、担体は免疫原担体材料、例えば免疫原蛋白質又
はポリペプチド−担体材料、核酸又はイムノアツセイに
使用するための標識ジゴキシゲニン結合体の標識構造単
位を表わし、ｙは平均して１〜担体中の提供可能な結合
位の数を表わし、有利に１〜２０であり、Ｙは本発明に
よる一般式(I)のジゴキシゲニン誘導体のカルボニル官
能基Ｚと担体材料の反応位との反応により生じた基、例
えばアミド基を表わす〕の新規ジゴキシゲニン結合体を
製造することである。
本発明のもう１つの課題は式中の担体が免疫原を表わす
一般式(II′)を使用して抗体形成に好適な生物の免疫化
法でもある。このようにして、担体が免疫原を表わす式
(II′)の本発明によるジゴキシゲニン結合体を用いて抗
体を製造し、次いでこれをジゴキシンの測定のために常
用のイムノアツセイ法（例えば凝集法、ラジオイムノア
ツセイ、不均質系酵素イムノアツセイ、不均質系蛍光イ
ムノアツセイ及び均質系イムノアツセイ）の１つに使用
することができる。モノクローナル抗体をも包含する抗
体の製造及び単離をこれに常用で、一般的な方法で行な
うことができる。
担体が標識ジゴキシゲニン結合体の標識構造単位を表わ
す 一般式（II″) 〔式中、担体（２）は標識ジゴキシゲニン結合体の標識
構造単位を表わし、Ｙ、ｎ及びｙは一般式（II）のもの
と同じものを表わす〕のジゴキシゲニン結合体を常用の
イムノアツセイに使用し、強心配糖体グリコシド、特に
ジゴキシンを測定することもできる。
次に実施例につき本発明を詳説するが、本発明はこれに
のみ限定されるものではない。他に記載のない限り、量
は重量に、温度は℃に関連する。室温とは２５±２℃で
ある。
実施例 次の反応式Ａは実施例中に示した本発明による一般式
(I)のジゴキシゲニン誘導体の合成及びその相互の変換
に関する概要を示す。
例１ ペンタアセチル−ジゴキシン(2)の製造 ジゴキシン７８ｇ（０．１mol）を無水酢酸１中に溶
かし、かつ酢酸ナトリウム（無水）49.2ｇ（0.6mol）を
加える。還流下に１時間攪拌する。次いで、この溶液を
水流真空中で蒸発させ、酢酸エステル１中に残分を溶
かし、場合により不溶性の成分を濾別する。この濾液を
それぞれ水0.5で３回洗浄し、Na2SO4５０ｇで乾燥さ
せ、水流真空中で蒸発させる。この粗生成物はなお無水
酢酸を含有する。
収量：粘性油状物質１１０ｇ ＤＣ：シリカゲル、酢酸エステル／クロロホルム１：
１、Ｒｆ＝0.33 例２ １２−Ｏ−アセチル−ジゴキシゲニン(3)の製造 例１により得られた蒸発残分（化合物２）をメタノール
２中に溶かし、0.1Ｎ H2SO4２と混合し、還流下に
１時間攪拌する。その後、クロロホルム1.8で１回、
６００mlで１回抽出し、合した抽出物を２回それぞれ水
１で洗浄し、Na2SO4５０ｇで乾燥させ、水流真空中で
蒸発させる。得られた油状物質（９５ｇ）を酢酸エステ
ル２５０ml中に僅かに加温しながら溶かし、室温で放置
する。短時間後に結晶が生じる。室温で約４時間、さら
に＋４℃で２時間晶出させ、次いで固体を吸引濾過し、
酢酸エステル約１００mlで短時間洗浄する。
収量：無色結晶３１ｇ ＤＣ：シリカゲル、酢酸エステル；Ｒｆ＝0.50 例３ １２−Ｏ−アセチル−ジゴキシゲニン−３−cme−エチ
ルエステル(4)の製造 例２により得られた化合物(3)28.1ｇ（６５m mol）をテ
トラヒドロフラン（THF）２５０ml中に懸濁させ、５時
間かけてTHF５０ml中のジアゾ酢酸エステル６９ml（0.6
5mol）を攪拌下に滴加する。反応開始のために、かつそ
れぞれ１時間後に、酢酸ロジウム(II)５０mgを添加す
る。その際、反応溶液がわずかに発熱するので、この溶
液を水浴（２５℃）で冷却することが望ましい。室温で
１６時間攪拌し、次いで前記の方法で更にジアゾ酢酸エ
ステル６９ml及び全体で酢酸ロジウム２５０ｇを添加す
る。更に１６時間後、この全工程の３回目を繰り返す。
更に、１日後反応させ、次いでメタノール２５０mlを加
え、かつこの溶液を真空中で蒸発させる。油状残分を３
回それぞれ石油エーテル１で浸漬し傾瀉後、クロロホ
ルム／酢酸エステル＝2/1１００ml中に溶かす。粗生成
物をシリカゲルカラム（8.5×５０cm）に入り、クロロ
ホルム／酢酸エステル＝2/1で溶離する。純粋な生成物
(4)を含有するフラクシヨンを合し、かつ溶剤を水流真
空中で除去する。
収量：粘性油状物質18.2ｇ ＤＣ：シリカゲル、酢酸エステル／石油エーテル２：
１、Ｒｆ＝0.60 例４ ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル（cm
e）(5)の製造 例３により得られた化合物(4)15.5ｇ（３０m mol）をメ
タノール４７０ml中に溶かし、水１００ml中のKHCO36.0
5ｇ（６０m mol）の溶液と混合する。還流下に攪拌し、
半時間ごとに反応をＤＣを用いて監視する。出発物質の
濃度が約５％になつた時（約3.5時間後）、反応を中断
する。pHを氷酢で5.0とし、メタノールを水流真空中で
蒸発させ、水で約５００mlに希釈する。粗生成物をそれ
ぞれ酢酸エステル２００mlで２回抽出し、水２００mlで
洗浄し、かつ有機溶剤をNa2SO4３０ｇで乾燥させる。濃
縮した後、残つた油状物質１１ｇを酢酸エステル／氷酢
酸＝9/1４０ml中に溶かし、室温に放置する。短時間後
に結晶が生じる。４℃で更に１時間冷却し、固体を吸引
濾過し、酢酸エステル／氷酢酸＝9/1約２０mlで後洗浄
する。エキシカーター中KOH上で乾燥させた生成物(5)３
ｇが得られる。
母液を蒸発させ、残分（約7.5ｇ）をシリカゲルカラム
（8.5×４０cm）上に担持させる。酢酸エステル／氷酢
酸＝9/1で溶離し、相応するフラクシヨンを濃縮した
後、生成物(5)2.2ｇがもう１回得られ、これは痕跡量の
１２−Ｏ−アセチル−ジゴキシゲニン−３−cmeを含有
している。
収量：無色固体物質5.2ｇ ＤＣ：シリカゲル、酢酸エステル／氷酢酸９：１、Ｒｆ
＝0.42 例５ ジゴキシゲニン−３−cme−Ｏ−サクシンイミド(6)の製
造 例４により得られたジゴキシゲニンカルボン酸(5)4.49
ｇ（１０m mol）をＮ−ヒドロキシサクシンイミド1.27
ｇ（１１m mol）と一緒に無水THF１４０ml中に溶かし、
無水THF２０ml中のＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド2.27ｇ（１１m mol）の溶液と混合する。室温
で２０時間攪拌し、次いで生じた尿素を濾別し、かつこ
の溶液を水流真空中で濃縮する。残分を酢酸エステル１
５０ml中に溶かし、濾過し、水１００mlで洗浄する。そ
の後、有機溶剤をすぐにNa2SO4５ｇで乾燥させ、濃縮す
る。粗生成物を酢酸エステル約３０ml中に溶かし、濾過
し、攪拌下にゆつくりとジイソプロビルエーテル２００
ml中に注ぐ。析出したエステル(6)を吸引濾過し、エキ
シカーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
収量：無色粉末5.1ｇ ＤＣ：シリカゲルＲＰ−１８、ニトロメタン／エタノー
ル９：１；Ｒｆ＝0.66 例６ 光ジゴキシゲニン(7)の製造 例５により得られた活性エステル(6)２７２mg（0.5m mo
l）をジオキサン１０ml中に溶かし、水５ml中のＮ−
（４−アジドベンゾイル）−１，８−ジアミノ−３，６
−ジオキサオクタン１６１mg（0.55mmol）の溶液と混合
する。室温で２時間攪拌し、次いでジオキサンを水流真
空中で蒸発させ、水５０mlで希釈する。この水相をそれ
ぞれ酢酸エステル５０mlで抽出し、合した有機抽出物を
Na2SO4５ｇで乾燥させ、濃縮する。残分をジイソプロピ
ルエーテル１００mlで浸漬し、吸引濾過し、エキシカー
ター中でCaCl2上で乾燥させる。
収量：無色粉末２１６mg ＤＣ：シリカゲルＲＰ−１８、ニトロメタン／エタノー
ル９：１；Ｒｆ＝0.36 次の反応式Ｂは、例えば補体の標識核酸とのハイプリツ
ド化により核酸を検出するための標識ハプテンとして使
用することのできる、例７〜９による、Dig−１１−dUT
Pの製造工程を概略的に示す。
反応式Ｂ： 例７ ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル−ε−
アミドカプロン酸(9) C31H47NO8 分子量：５６１．３ ２５０ml−丸底フラスコ中でジゴキシゲニン−３−カル
ボキシメチルエーテル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
エステル(8)４６５mg（0.85m mol）をジメチルホルムア
ミド（DMF）１５ml中に溶かし、これにDMF２ml中の６−
アミノカプロン酸１１２mg（0.85m mol）及びトリエチ
レルアミン0.12mlの懸濁液を加える。室温で１夜マグネ
ツトにより攪拌し、この際徐徐に均質溶液が生じる。こ
の時間の後、この反応が実質的に完全に終了したことを
薄層クロラトグラフイーが示す（シリカゲル；酢酸エチ
ルエステル／石油エーテル／エタノール１：１：１、検
出：氷酢酸１０ml＋濃硫酸0.2ml＋アニスアルデヒド0.1
mlの混合物で噴霧し、青黒色のスポツトが現われるまで
１２０℃に加熱する；Ｒｆ約0.7；Ｒｆジゴキシゲニン
−OSu−エステル約0.85）。
DMFを高真空中で残りなく蒸発させ、残つた油状物質をH
2O５ml中に濃アンモニア溶液の添加下に溶かす。次い
で、クエン酸水溶液22.5ml（クエン酸１００ｇ／ｌ）を
添加することにより、“遊離”ジゴキシゲニンアミドカ
プロン酸で析出する。この樹脂状粘性物質を水と一緒に
こすり固体とし；吸引濾過し、H2Oで複数回後洗浄し、
最後にP2O5上でオイルポンプ真空で乾燥させる。
収量：３２５mg＝理論値の６８％ 例８ ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル−ε−
アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル(10) C35H50N2O10 分子量：658.8 １００ml丸底フラスコ中で、ジゴキシゲニン−３−カル
ボキシメチルエーテル−ε−アミドカプロン酸(9)３２
０mg（0.57m mol）を無水ジメチルホルムアミド（DMF）
２ml中に溶かし、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（0.6m
mol）７０mg並びにジシクロヘキシルカルボジイミド
（0.63m mol）１３０mgを順次添加する。室温で１夜攪
拌し、翌日析出するジシクロヘキシル尿素から吸引濾過
して、DMFをオイルポンプ真空中で蒸発させる。残つた
油状物質を酢酸エチルエステル２ml中に取り込み、氷冷
（−２０℃）石油エーテル約１５ml中で攪拌する。析出
した、はじめになお樹脂状粘性の生成物を複数回氷冷乾
燥石油エーテルで固体になるまでこする。P2O5上で乾燥
させた後真空中で３１５mg＝理論値の８４％が得られ
る。
元素分析： 計算値：Ｃ63.8％、Ｈ7.6％、Ｎ4.2％ 実測値：Ｃ63.2％、Ｈ7.6％、Ｎ4.0％ 例９ ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル−ε−
アミドカプロイル−〔５−（アミドアリル）−２′−デ
スオキシ−ウリジン−５′−トリホスフエート〕−四ナ
トリウム塩(11) （Dig-11-dUTP） C43H61N4Na4O21P3 分子量：１１５４．７ ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル−ε−
アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル(10)２５４mg（0.37m mol）をDMF７ml中に溶かし、
H2O６ml中の５−アリルアミノ−２′−デスオキシ−ウ
リジン−５′−トリホスフエート−四リチウム塩２０mg
（0.37m mol）の溶液に加える。この混合物に0.1mol／
ｌ硼酸ナトリウム塩緩衝液、pH8.5 6.2mlを加え、室温
で１夜攪拌する（約１５時間）。
ペーパー電気泳動（0.05mol／ｌクエン酸塩緩衝液、pH
5.0、）において、この時間の後UV光中に僅かな量の未
反応アリルアミノ−dUTPの他に所望の化合物の僅かに低
く移動したスポツトが観察される（選択的方法：シリカ
ゲルを用いる薄層クロマトグラフイー（DC）、溶離剤；
イソ酪酸／濃アンモニア溶液／Ｈ２Ｏ＝６６：１：３
３、UV中での検出又はアニスアルデヒド試薬（例７参
照）で噴霧；Ｒｆ−値置：５−アリルアミノ−dUTP 0.
2；Dig-アミドカプロン酸−OSu−エステル0.7；Dig−１
１−dUTP 0.45）。
処理のためには、反応混合物をオイルポンプ真空中で濃
縮し、固体残分とし、H2O２００ml中に取り込み、イオ
ン交換体カラム（DEAE−セフアデツクスＡ２５、▲ＨＣ
Ｏ- 3▼−型、カラム寸法1.5×３０cm）上に注ぐ。その
後短時間に水で洗浄し、次いで0.4mol／ｌTEAB（重炭酸
トリエチルアンモニウム）pH８に対してそれぞれH2O
１の傾斜溶液で溶離する。純粋な生成物を含有するフ
ラクシヨンを合し、真空中で濃縮し、メタノールと共に
多数回蒸発させ、過剰のTEABを除去する（遊離トリエチ
ルアミンの臭が全くなくなるまで！）。フラスコの内容
物を数mlの水に取り込み、この溶液を短かいカチオン交
換カラムDOWEX５０WS８（１×１０cm）；Ｎａ＋−型を
介して通し、このカラムを洗浄水中にODEがなくなるま
で洗い（２４０nmにおけるUVを測定）、かつ真空中で約
２０mlまで濃縮する。凍結乾燥の後Dig−１１−dUTP−N
a4１９４mg（理論値の４５％）が白色粉末として得られ
る。
分析：H2O測定：7.9％ 元素分析（H2O含量を考慮して） 計算値：Ｃ41.2％、Ｈ5.3％、Ｎ4.4％、Ｐ7.4％。
実測値：Ｃ41.0％、Ｈ5.4％、Ｎ4.6％、Ｐ7.2％。
UV−スペクトル（燐酸塩緩衝液pH7.0）：最大：２２０n
m、２９０nm Dig−１１−dUTPは“ランダム感作（random Primed）”
−DNA−標識法（DNA−Labeling and Detection Kit Non
radioactive、注文No１０９３６５７、ベーリンガー・
マンハイム社；Feinberg、A.P.及びVogelstein、Ｂ．
著、Anal.Biochem.第１３２巻、１９８３年、第６頁）
により核酸中に導入され、この際、標識ハプテンとして
ゴキシゲニンを含有する、これに補体の核酸を検出する
ためにの核酸ゾンデが得られる。
フロントページの続き (72)発明者 ヘルベルト・フオン・デル・エルツ ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・イン・ デル・アウ 21 (72)発明者 ブルーノ・ツインク ドイツ連邦共和国ウフイング・アン・デ ム・シユタツフエルゼー・ゼーブリツクシ ユトラーセ ４

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式（Ｉ） ［式中、ｎは１〜４の整数を表わし、かつＺは-CN,-COO
    C2H5,-CONH-(CH2CH2O)2-C を表わす］のジゴキシゲニン誘導体。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の式Ｉのジゴキシゲニン誘
    導体を製造するための方法において、１２−Ｏ−アセチ
    ル−ジゴキシゲニンの３位の遊離ＯＨ基を自体公知法で
    ジアゾ酢酸エステルと反応させることにより式Ｉ′（式
    中、ＺはCOOC2H5を表わす）の化合物とし、所望の場合
    得られた反応生成物のCOOC2H5基を自体公知法でCOOH基
    又は他の官能カルボン酸基Ｚに変換し、かつ所望の場
    合、このようにして得られた反応生成物のＺ基を自体公
    知法で他のＺ基に変換することを特徴とするジゴキシゲ
    ニン誘導体の製法。
  3. 【請求項３】イムノアッセイにおける強心配糖体の測定
    用標識結合体を製造する方法において、請求項１記載の
    式（Ｉ）のジゴキシゲニン誘導体を使用することを特徴
    とする標識結合体の製法。
  4. 【請求項４】化学結合を介して少なくとも１つのハプテ
    ンを標識として結合して含有する補体核酸ゾンデとハイ
    ブリッド化することにより核酸を検出するために、標識
    ハプテンとして請求項１記載の式Ｉのジゴキシゲニン誘
    導体を使用することを特徴とする核酸検出法。
  5. 【請求項５】一般式II 〔式中、担体は免疫原担体材料、核酸又はイムノアッセ
    イに使用するための標識ジゴキシゲニン結合体の標識構
    造単位を表わし、ｙは平均して１〜２０の数値を表わ
    し、かつＹは を表わす〕のジゴキシゲニン結合体。
JP1278799A 1988-10-27 1989-10-27 ジゴキシゲニン誘導体、その製法、標識結合体の製法、核酸検出法及びジゴキシゲニン結合体 Expired - Lifetime JPH0637513B2 (ja)

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