JPH02191298A - ジゴキシゲニン誘導体、その製法、標識結合体の製法、核酸検出法及びジゴキシゲニン結合体 - Google Patents

ジゴキシゲニン誘導体、その製法、標識結合体の製法、核酸検出法及びジゴキシゲニン結合体

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JPH02191298A
JPH02191298A JP1278799A JP27879989A JPH02191298A JP H02191298 A JPH02191298 A JP H02191298A JP 1278799 A JP1278799 A JP 1278799A JP 27879989 A JP27879989 A JP 27879989A JP H02191298 A JPH02191298 A JP H02191298A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規ゾデキ７デニン誘導体、そ（Ｄ製法及びこ
れを使用した植種の方法に関する。
従来の技術 ジがキシｒ＝ンの基本骨格が他の分子又は巨大分子担体
に共有結合して存在するシイキシゲニン酵導体は多数の
生物学的分析目的に使用される。特に、そのようなジデ
キシｒニン酵導体は免疫学的テスト（イムノアッセイ）
において、臨床学的親点に２いて重要な、強心配糖体、
特にノコ１キシンの測定の丸めに使用されるＣ　Ｇ、０
゜０１１ｖｅｒ等着、Ｊ、ＣＨｎ、　Ｉｎｖｅａｋ、　
、第４７巻、１９６８年、第１０３５頁；　ＴＪ、Ｂａ
ｒｂｉｅｒｌ及びＣ，Ｇａｎｄｏｌｆｌ著、Ｃ１１ｎ、
　Ｃｈｉｎ、　ＡｃＬａ　、第７７巻、１ソ７７年、第
２５７頁；　Ａ、Ｃａａｔｒｏ及びＮ。
Ｍｏｎｊ　１著、’　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｌｃａｌ　
Ｍａｔｈｏｄａ　”　、Ｂ部、Ｊ、Ｌ、Ｌａｎｇｏｎｅ
及びＨ，ｖａｎ　Ｖｕｎａｋ１β、ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ　、１９８１年出版、第５２５ｊｆｔ　；　Ｊ
、Ａ。
Ｈｊｎｄ８等、Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｌａｔｒｙ
　％第６２巻、１９８６年、第１６頁、参照）。これら
のテストにおいてジゴキシデニン誘導体は測定すべき強
心配糖体に対する抗体と関連して使用され、この検出は
ハプテン−抗−ノ１ｆテンー抗体−相ｉ啼１吻ｖ　　ｆ
ｕｒ　　ｎｌｅｄｅｒｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ　Ｗ４ｒｋ
ｓｔｏｆｆｅ　　”Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ社、ス
ツユットガルト、１９７８年参照）。
その際、ジー？中シデエン紳導体としては一般に、ジコ
”＝？シグニンがステロイド骨格の３位を介して他の分
子に結合しているような誘導体を使用している。
しかしながら、従来免疫学的テストに使用され九ジプキ
シデニン誘導体は次のような欠点を１つ又は複数示すニ ジｔキシデニンステロイＦ骨格とエステル基を介して行
なわれた結合において、ゾコ’−？シデ二ノ酵導体はエ
ステル基の加水分解鋭敏性のために塩基条件下に着しく
塩基性不安定である：このことは特に通常使用されるヘ
ミサクシネート又はヘミグルタレートにのてはまる（ス
イス特許第６０４１６４号明細誉；米国特許第４０８２
７４７最明［４；　Ｎ、Ｍｏｎｊ１等著、Ｅｉｘｐｅｒ
ｊｅｎＬｊａ　％第３６巻、１９８０年、第１１４１頁
参照）；３（に類似のことは、例えばエステル基のかわ
シに使用したウレタン基においてもあてはまる（西ｒイ
ツ国特許公開第２６０７８２６号明細書参照）。従って
、使用の際には一定の条件下に不所望なジゴ中シデニン
の分解が生じる。
ジデキシデニンはステロイド骨格の３位の他にも１２位
に反応性ＯＨ基を有している；従って誘導体の製造の際
に３−及び１２−誘導体からなる混合物がしばしば生じ
、こｎは１部着しい製造費用においてのみ純粋な位ｔＩ
ｔ異性体に分離することができ、かつ１部、ガえば有利
に使用さルるヘミサクシネート及びヘミグルタレートの
場せ、クロリトグラフィーによっても分離することがで
きない。分離しない混合物の使用は誤差の多い結果に導
びく。
誘導体において、このステロイド基本骨格は１部、非変
性ステ１４１１本骨格に対する抗体によるハプテンのｄ
ＩＩｔＰＩ＆が強く損なわれるように変性されて存在す
る。これは例えば３位の酸素原子がアミノ窒素に変換さ
れているゾゴキシゲ二ン誘導体の場合である（例えばヨ
ーロッパ特許第１０４５２７号明細書参照）。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題は強心配糖体の免疫学的測定テストに好適
であシ、かつこれをもちいて前記欠点を回避可能なジ♂
キシゲニノー導体を製造することである。この課題は本
発明によシ解決される。
疎１１！Ｉ４を解決するための手段 本珀明の課題は一般式（１） 〔式中、ｎは１〜４の整数、有利には１を表わし、かり
２はカルボキシ基又はこれから縛導された官能−導体を
表わす〕のクコ９キシゲニンー導体である。有利には、
２は基−Ｃｏｏｌ（、−ＯＮ、−ＣＯＯＲ’　　−ＣＯ
ＮＲ’Ｒ”　　−ＣＯＯＮＲ３Ｒ４−ＣＯＮ３、−　Ｃ
００ＣＯＯＲ’又は−〇〇〇〇ＯＲ”　’ｉ表わし、Ｃ
ＣでＲ’。
Ｒ８、Ｒ３及びＲ４は相互に独立して水素原子、アルキ
ル基、アラルキル基又はアリール基を表わすか又はＲ１
及びＨａ又はＲ３及びＲ４が一緒になって炭ｌＡ環系又
は複索環系を形成していてよい。
Ｒ５はアルキル基又はアラルキル基であシ、有利には炭
素原子数１〜７のものであシ、特にメチル、エチル、プ
ロピル、イソブチル、フェニル、ベンジル基である。
前記基に２いてアルキル基は分校又は有利に直鎖であっ
て工〈；有利には炭素原子数１〜１２、特に２〜Ｂのア
ルキル基である。アルキル基は１り又ｒｉ？Ｊ！　ｌｌ
ｌのへテロ原子、例えば酸素により中断されていてよく
、かつ＃侯又は非置換であってよい。
アリール基とは有利には環構成原子５〜１４でめる単核
又は多核炭素環系又は複素環系芳合諌基であってよく；
これらは１侯されていても非＃侯であってもよく、特に
フェニル基である。
アラルキル基とは前記アルキル基及びアリール基から誘
導されるものであシ；これらは例えばベンジル又はフェ
ニルエチル基でアル。
基−ＣＯＮＲＩＲ”　ｄ　Ｍ　、ｔ　ハ基−ＣＯＮｆ（
ヤＣＨ，ＣＨ２ＯうＩＩＣＨざＣＨ，ＮＨ，であり、こ
こで洲２基は置換されていてよく、有利には４−アジド
ベンゾイル基によシｔｊ１１侯されていてよい。基−Ｃ
ＯＯＮＲ”Ｒ’はＮ−ヒげロキシサクシ／イミドエステ
ル基 又は基 である。
アルキル基Ｒδは特にエチル、イソブチル又はベンシル
基である。
一般式（１）の本発明によるジゴキシデニン酵導体にお
いて、ステロイド骨格と橋部との間の結合は３位のエー
テル結合を介して行なわれ、これによりエステル基と関
連した塩基不安定性は回避される。更に、これによシ、
クコ１キシデ二ンステロイド骨格の３位に存在する基（
オキシ基）は保持されるので、このことによシ一般に非
変性ステロイド骨格に対する抗体によるハプテンの良好
な認識が達せらｎる。本発明による３位のエーテル結合
は式（１）の化合物及びその誘導体及び結合体を純粋な
位＃異性体として、すなわち、６位及び１２位で結合し
ている誘導体からの混合物の回避下に製造することをも
司目゛ヒとする。
本発明による一般式ＣＤの化合物＋２）［造は、ジゴキ
シン（後記反応式の化合物１）からペンタアセチルノコ
９キシン（同化合物２）へ変換した俊、自体公知法で酸
性鹸化することにより得られる１２−ｏ−アセチル−ジ
ゴキシゲニン（同化合物６）から出発することによシ行
なわれる。１２−ｏ−アセチル−ジゴキシゲニンにおい
て、３位の遊離０Ｈ４４金エーテル基ＺｉＣＨ２すｎ〇
−に変換する。この反応はジアゾカルボン酸エステルと
、ｎ；１の場合例えばジアゾ酢酸エステルと、自体公知
法で３−アルコキシカルボニルアルキルエーテルの形成
下に行なうことができる（　Ｚ＝ＣＯＯＲ５ｚ化合物４
に相応する）。
得られたアルコキシカルボニルアルキルエステルにおい
て、所望の場合、エステル基を鹸化Ｋｊ　り　Ｉｔ　ｐ
ｇ　ｌｙ　ルＭ　中シ基（Ｚ＝ＣＯＯＨ；化合＄５）に
、又は他の官能カルボン＃Ｒ基ＺＫ変侠することができ
、かつ所望の場合には、このように得られた反応生成物
に２いて基２を自体公知法で他の基２に変換するＣとが
できる。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドとの反応によシ
ＣＯＯＨ基は例えば基−ＣＯＯＮＲ３Ｒ’　（Ｒ３及び
Ｒ４は一緒になって１．４−ジオキ°ンーテトラメチレ
ン基を形成する；化合物６）に変換される；この基はア
ミンＩ（ＮＲＩＲ”と反応させることによ、９　Ｚ＝Ｃ
ＯＮＲＩＲ”を有する化合物（１）（化合物７に相応す
る）に変換する。このようにして、又は類似の方法で、
式中０２が異なる意味を有する式（１）の得られた化合
物を２が他の異なる意味を有する式！の化合物に自体公
知法で変換することも可能である。
個個の、前記方法工程、例えばジアゾ酢酸エステルとの
反応、鹸化工程、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドとの反
応及びアミンＨＮＲＩ　Ｒ”との反応はこれらの反応に
常法で、例えば次の実施例に記載されているような方法
で行なうことができる。
ゾがキシゲニン誘導体の他の１１ＩＫ要な使用分野は核
酸及び核ａＲ誘導体の標識化及び検出へのその使用でも
ある。本願出願人によるドイツ特許出願１＠　ｐ　５８
００６４４．８号明細１（１９８８年１月１２日）及び
同第ｐ　５８１５２７８．８最明細誉（１９８８年４月
２０日）には、化学結合を介して少なくとも１つのハシ
テンｔ−標繊として結合して含有する補体核酸ゾンデと
ノ・イブリッド化することによる核酸検出法が記載され
ている。ハプテンとし一〇はステロイドを使用しておシ
、このステロイドは核酸ゾンデの水素結合に関与してい
ない少なくとも１位Ｗに少なくとも４つの原子長さの橋
部を介して結合している；このハイブリッドゾンデを標
織抗−ハプテン−抗体を介して検出する。ステロイドと
しては有利にゾデキシデニン又はジブキシンが使用され
る。ハプテンを核酸ゾンデに光−ハプテン（Ｆｏｂｏ−
Ｈａｐｔｅｎ）を用いて光化学的に組込む場合（ＮｕＣ
ｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒａｇ、第１３巻、１９８５年、第７４
５〜７６１頁：及びＭ、Ｗｉｌｃｈｅｋ及びＥ、Ａ。
Ｂａｙｓ　ｒ著、Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、第１７
１巻、１９８８年、第１頁参照）、光ハプテンとして有
利に光−ジがキシゲニン、すなわち橋部を介して４−１
シト−ベンゾイルと結合したノコ９キシデニンを使用す
る。ＵＶ−照射の際に、アジド基から窒素が脱離し、ニ
トνンラゾカルが生じ、これは次いで核酸に共有結合す
る。光−ノコ９キシデニンとしてはノコ９キシデニンー
３−ヘミサクシネ−）−ＣＮ’−（４−アジドベンゾイ
ル）〕−〕８−アミノー３＃６−シオキサオクチルアミ
を使用する。
その特性、特に塩基安定性及び非変性ステロイド骨格の
ために、本発明による一般式（］）のジデキシデニン酵
纒体は前記核酸検出法のｗ４緘ハプテンとして著しく好
適である。光−ハプテン（光−ゾデキシデニン：光化学
法でのハプテンの結合、ＮｕＣｊ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅａ
、第１３巻、１９８５年、第７４５〜７６１頁：及びＭ
、　Ｗｌｌｃｈｅｋ及びＥ、Ａ、Ｂａｙｅｒ著、Ａｎａ
ｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、第１７１巻、１９８８年、第１
貞参照）としては、本発明による一般式（１）の式中の
基Ｒ１、Ｈ′ｌ、　Ｒ３、Ｒ４及び／又はＲ６の１つが
４−アジド−ベンゾイル基を有しているシイキシゲニン
誘導体、例エバＮ−（Ｎ−（４−アジドベンゾイル）−
８−７ミノー６．６−ゾオキサオクチル〕−６−カルパ
モイルメチルーゾゴキシｒニン（反応式の化合物７）で
ある。
本発明による一般式（１）のシイキシゲニン誘導体を用
いて、ステロイドの６位がそこに存在する酸素で、すな
わち基本骨格の変性なしに、橋部分子金倉して免疫原担
体材料、例えば蛋白質−又はポリペプチド−担体材料に
、又は核酸に結合すること七可能とする。
一般式（１）の本発明によるジコ９キシｒニン誘導体は
標識結合体（１ａｂｅｌｅｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）
の製造にも非常に好適であり、これは強心配糖体、特に
ジブキシンの測定のために通常のイムノアッセイで用い
られる。好適な結合体は例えば標準法と相応して放射性
に標識することができるか、又は螢光基で標識すること
ができる。１ｓ誠榊造単位（ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｍｏｉ
ｅｔｙ　）は有利な均−未決においては、例えば酵素基
質、補欠分子団、酵素モデュレーター又は＃索であり、
これは本発明による一般式（１）のジブキシゲニン誘導
体と結合し、結合体となっている。
担体材料、核酸又はＩＩＩ織構造単位への結合は基−０
−（ＣＨｍ）ｎ−Ｚ　を介して行なわれ、ここで基２は
有利に担体材料、２と反応性の基又は結合に依存して選
択される。担体と０−（ＣＨｌｌ）ｎ−２−基との結合
は亀１又は第２７ミノ基を介して行なわれ、これは活性
カルボン酸基２１例えはＮ−ヒドロキシサクシンイミド
エステル（Ｚ−−ＣＯＯＮＲ３Ｒ４Ｒ３及びＲ４は一緒
になって１．４−ジオキソテトラメチレン１ｋｔ−形成
する）で変換される；この際、この反応はこのような反
応に自体公知の方法で行なわれる。この基−０−（ＣＨ
ｉ）ｎ−３は光化学法によっても（Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、第１３巻、１９８５年、第７４５〜
７６１頁；及びＭ、　Ｗｉｌｃｈｅｋ及びＥ、Ａ、　Ｂ
ａｙｅｒ著、Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、第１７１
巻、１９８８年、１１ＩＪ１頁参雇）担体、例えは猥厳
に結合することができる；この場合、担体材料、例えは
核酸ψンデは前記光−ジがキシｒ二ン（反応式中化合物
７参黒〕の存在においてＵＶ域を有する可視光で照射し
、このＩＭｌｉ木（Ｎａ　）の脱−下に二トレンラジカ
ルが生じ、これ扛核酸に共有結合する。
従って、本発明の課題は通常のイムノアッセイで強心配
糖体、特にジビキシンを測定する九めのＳ繊細合体（１
ａｂｅｌｅｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）　ｆ製造する九
めに一般式（１）のジブキ誘導体ン鋳導体を使用するこ
と、並びに少なくとも１りのノ１ブテンを標識として化
学結合を介して含有する補体核酸ゾンデとのハイブリッ
ド化により核酸を検出するための糠臓ノ１ブテンとして
これｔ使用することである。
本発明のもう１つの課題は本発Ｆ１４による一般式Ｉの
ジがキシゲニン誘導体を使用して一般式（ｍｌ 〔式中、担体は免疫原担体材料、例えば免疫原蛋白質又
はポリペプチド−担体材料、核酸又はイムノアッセイに
使用するための標識ノコ９キシｙニン結合体の標ａｍ造
率位ｔ−表わし、ｙは平均して１〜担体中の提供可能な
結合位の数を表わし、有利に１〜２０で６１、Ｙは一般
式（１）のジゴキシｒニン誘導体のカルボニル官能基２
と担体材料の反応位との反応により生じた基、例えはア
ばド基を表わす〕の新規ジブキシ？二ン結合体ｔ−製造
することである。
本発明のもう１つの課題は式中の担体が免疫原を表わす
一般式（ＩＩ’）ｔ−便用して抗体形成に好適な生物の
免疫化法でもある。このようにして、担体が免役鳳會表
わす式（ｆｉ’）の本発明によるジゴキシｙ＝ン結合体
食用いて抗体ｋｌｌｌｌ造し、次いでこれｔノコ９キシ
ンの測定のために常用のイムノアッセイ法（例えば凝集
法、ラジオイムノアッセイ、不均質系酵素イムノアッセ
イ、不均質系螢光イムノアッセイ及び均質系イムノ１１
１これに常用で、一般的な方法で行なうことができる。
担体がＳｔＳ＊ジゴキシゲニン結合体の標識構造単位ｔ
−ｈわす一般式ＣＩ’）のジゴ中シゲニン結合体會常用
のイムノアッセイに使用し、強心配糖体グリコシド、特
にジゴキシンｔ＃Ｊ定する友めの方法に関する。
次に実施例につき本発明を詳説するが、本発明はこれに
のみ限定されるものではない。他に記載のない限り、量
は１童に、感度は℃に関連する。室昌とは２５±２℃で
ある。
実施例 次の反応式ＡＦｉ実施実施例示し九本発明による一般式
（１）のジブキシゲニン篩導体の合成及びその相互の変
換に関するＩＮ１景會示す。
例　　１ ペンタアセチル−ノコ９ｄＰシン（２）の製造ジブキシ
ン７８＃（０，１ｍｏｔ）′ｔ−無水酢酸１ノ中に溶か
し、かつ酢酸ナトリウム（無水）４９．２　Ｊｉ’　（
０，６ｍｏＡ　）　ｆ加える。還流下に１時間攪拌する
。次いで、この溶液を水流真空中で蒸発させ、酢酸エス
テル１ノ中に残分ｔ−溶かし、場合により不溶性の成分
を濾別する。この濾液會それぞれ水０．５７で６回洗浄
し、Ｎａ１８０４５０ｇで乾燥させ、水流真空中で蒸発
させる。この粗生成物はなお無水酢酸ｔ−官有する。
収ｔ：粘性油状物質１１０ｇ ＤＣ：　　シリカゲル、酢酸エステル／クロロホルム１
　：１％　Ｒｆ−０，３３ 例　　２ １２−０−７セチルージがキシゲニン（３）の製造例１
により得られ次蒸発残分（化合物２）をメタノール２ノ
中に解かし、０．ＩＮＨＮａ１８０４２１合し、還流下
に１時間撹拌する。その後、クロロホルム１．８ノで１
回、６００Ｍで１回抽出し、合し九抽出物ｔ２回それぞ
れ水１１！で洗浄し、Ｎａ５１８０４　５０１１で乾燥
させ、水流真空中で蒸発させる。得られた油状物質（９
５＃）ｔ−Ｉｎ酸エステル２５０３１４中に僅かに加温
しながら溶かし、室銀で放置する。短時間後に結晶が生
じる。Ｍａで約４時間、さらに＋４°Ｃで２時間晶出さ
せ、次いで固体を吸引濾過し、酢酸ニスデル約１００紅
で短時間洗浄する。
収ｔ：無色結晶３１．９ ＤＣ：　　シリカゲル、酢酸エステル；Ｂｆ−０，５０ 例　　３ １２−０−７セテルーシゴキシゲニンー６−ｃｍｅ−エ
チルエステル（４）の製造 例２により得られた化合物（３１２８，１１９（６５ｍ
　ｍｏＬ）　ｔ−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ　）　２
５０継中に懸濁させ、５時間かけて’Ｉ’ＨＦ　５　Ｑ
　Ｉｌｂ中のジアゾ酢酸エステル６９Ｍ　（０，６５ｍ
ｏｔ）を攪拌下に滴加する。反応開始の友めに、かつそ
れぞれ１時間後に、酢酸ロジウム（１１５０■ｋ１ｍ加
する。その際、反応溶液がわずかに発熱するので、この
溶液ｔ−氷水浴２５°Ｃ〕で冷却することが望ましい。
室温で１６時間攪拌し、次いで前記の方法で支にシアｆ
ＯＨ６９ｔｔｔ及び全体で酢酸ロジウム２５０ＩＩを添
加する。爽に１６時間後、この全工程の６回目を繰り返
す。丈に、１日後反応させ、次いでメタノール２５０５
１１加え、かつこの浴液ｔＸ空中で蒸発させる。油状残
分に３回それぞれ石油エーテル１１で浸漬り傾瀉後、ク
ロロホルム／ｌｎ酸エステル−２／１１００μ中に婢か
す。粗生取物會シリカゲルカラム（８，５Ｘ５０Ｃ１１
１）に入れ、クロロホルム／酢飯エステル−２７１で＃
４慝する。純粋な生成物（４）を官有するフラクション
を合し、かつ解剤會水流真空中で除去する。
収量二粘性油状物質１８．２＆ ＤＣ：　　シリカゾル、酢酸エステル／石油エーテル２
：１、ｐ、ｔ　−０，６０ 例　　４ ジビ午シｒニンー３−カルボキシメチルエーテル（ｃｍ
ｅ　）（５）の製造 例６により得られた化合物（４Ｎ　５．５．９　（３０
！ｎｍｏＡ　）　ｔメタノール４７０ＪＩｊ中に溶かし
、水１００紛中のＫＨＣＯｓ　６．０５１　（６０ｍ　
ｍｏｔ）の溶液と混合する。還流下に攪拌し、半時間ご
とに反応管ＤＣｔ用いて監視する。出発物質の濃度が約
５９ｂになった時（約６．５時間後）、反応を中断する
。−を゛木酢で５．０とし、メタノールを水流真空中で
蒸発させ、水で約５００μに希釈する。粗生成物をそれ
ぞれ酢酸エステル２００−で２回抽出し、水２００μで
洗浄し、かつ有機溶剤ｉ　Ｎａ５８０４　３０．９で乾
燥させる。濃縮した後、残った油状物質１１ｇｔ−＃酸
エステル／氷酢＃−９木酢　　４０ａｔ中に浴かし、室
温に放電する。短時間後に結晶が生じる。４℃で更に１
時間冷却し、固体を吸引濾過し、酢酸エステル／氷酢酸
−９７１約２０１Ｌｔで後洗浄する。工中シカーター中
ＫＯＨ上で乾燥させ九生成物（５）６ｇが得られる。
母液を蒸発させ、残分（約７．５．９　）　ｋシリカデ
ルカラム（８，５Ｘ　４０α）上に担持させる。
酢酸エステル／木酢１！−９／１で解離し、相応する７
ラクシヨン會濃縮した後、生成物（５）２．２９がもう
１回得られ、これは痕跡量の１２−〇−７セテルージゴ
キシｒニンー３−　ｃｍｅ　會含有している。
収量：無色固体物質５．２ｇ ＤＣ；　　シリカゲル、酢酸エステル／氷酢酸９：１、
Ｒｆ　−０，４２ 沙り　　５ ジゴキシｒニン−３−ｃｍｅ　−ｏ−サクシシイばド（
６）の製造 例４により得られ次ジゴキシｒニンカルボン酸（５）４
．４９　Ｊｉ’　（１０ｍｍｏＡ　）　ｆＮ−？：ドロ
キシサクシンイイド１−２７ｊ’（１１ｍｍｏｔ）と−
緒に無水Ｔａ２１４０Ｕ中に爵かし、無水ＴＨＦ　２０
紅中のＮ　、　Ｎ’　−ジシクロへキシルカルボシイば
ド２．２７１１　（１１ｍ　ｍ０ｔ）の浴液と混合する
。
室温で２０時間攪拌し、次いで生じた尿素ｔ−嫌別し、
かつこのＩＩＩ液を水流真空中で濃縮する。
残分を酢酸エステル１５０Ｕ中に溶かし、濾過し、水１
００紅で洗浄する。その後、有機溶剤ｔすぐにＮａ１８
０４　５　Ｊｉ’で乾燥させ、濃縮する。
粗生成物を酢酸エステル約６０鮎中に溶かし、濾過し、
攪拌下にゆつくりとジインプロピルエーテル２００ｊＬ
ａ中に注ぐ。析出したエステル（６）を吸引濾過し、エ
キシカーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
収量：無色粉末５．１ｇ ＤＣ：　　シリカゲルＲＰ−１８、ニトロメタン／エタ
ノール９：１；Ｒｆ−０，６６ 例　　６ 光ジゴキシｒニン（７）の製造 例５により得られた活性エステル＋６１２７２卿（０，
５ｍ　ｍｏｔ）をジオキサ７１０Ｍ中に溶かし、水５μ
中のＮ−（４−アシドペンψイル）−１，８−シアずノ
ー６．６−シオキサオクタン１６１′ｍｇ（０−５５ｍ
ｍｏｔ）Ｏ浴液とｍ合−ｊ、ｂ。
意蟲で２時間攪拌し、次いでジオ中サンを水流真空中で
蒸発させ、水５０Ｍで希釈する。この水相ｔそれぞれ酢
酸エステル５０Ｍで抽出し、合した有機抽出物２　Ｎａ
１８０４　５９で乾燥させ、濃縮する。残分ｔジイソプ
ロピルエーテル１００成で浸漬し、吸引濾過し、エキシ
カーター中でＣａＣ２ｇ上で乾燥させる。
収量：無色粉末２１６′Ｉ＃９ ＤＣ：　　シリカゲルＦＩＰ−１８、ニトロメタン／エ
タノール９　：　１　；　Ｒｆ−０−３６次の反応式Ｂ
は、例えば補体の標識核酸とのハイブリッド化により核
酸を検出する几めの標識ハプテンとして使用することの
できる、例７〜９による、Ｄｉｇ　−１１−ｄＵＴＰの
製造工程を概略的に示す。
例　　７ ジプキシゲニンー３−カルざキシメチルエーテル−１−
７ミドカプロン酸（９） Ｃ３ＬＨ４７ＮＯ８分子量：５６１．３２５０１−丸底
フラスコ中でジー／鴫・シｒニンー３−カルボキシメチ
ルエーテル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイζドエステル（
８）４６５＃（０，８５ｍｍｏ））をジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ　）　１５−中に溶かし、これにＤＭＦ　
２−中の６−７ミノカプロン酸１１２〜（０，８５ｍｍ
Ｏり及びトリエチルアζン０．１２Ｗｊの懸濁液を加え
る。室温で１夜マグネツトによシ攪拌し、この際除徐に
均質溶液が生じる。この時間の後、薄 この反応が実質的に完全に終了したことをｚ層りロラト
グ２フィーが示す（シリカゲル；酢酸エチルエステル／
石油エーテル／エタノール１１：１、検出：氷酢酸１０
１＋濃硫酸０，２１＋アニスアルデヒド０．１−の混合
物で噴霧し、青黒色のスポットが現われるまで１２０℃
に加熱する；Ｒｆ約０．７　；　Ｒｒジがキシゲニン−
０８ｕ−エステル約０．８５　）。
ＤＭＦを高真空中で残りなく蒸発させ、残った油状物質
をＨ２Ｏ５ｄ中罠濃アンモニア溶液の添加下に溶かす。
次いで、クエン酸水溶液２２．５−（クエン酸１ｏｃｌ
／Ｊ）を添加することＫよシ、“遊離”ジブキシゲニン
アきドカゾロン酸で析出する。この樹脂状粘性物質を水
と一緒にとすシ固体とし；吸引濾過し、Ｈ２Ｏで複数回
後洗浄し、最後にＰ２Ｏ５上でオイルポンプ真空で乾燥
させる。
収量：３２５ｔ＆９−理論値の６８％ 例　　８ ジ♂キシゲニン−６−カルポキシメチルエーテル−１−
アミＶカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミＰエス
テル（１０） ０３５ＨＩＳＯＮ２０１０　　分子量：　６５８．８１
００ｄ丸底フラスコ中で、ジゴキシｒニン−６−カルボ
キシメチルエーテル−５−アミドカメロン酸（９）３２
０ｍ９（０，５７ｍｍｏＪ　）を無水ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ　）　２１１ｊ中に溶がし、Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイｉドＣ０，６ｍｍｏｌ）　７０ダ並びにジ
シクロへキシルカルボシイｉ　ｌ’（０，６３ｍｍｏＪ
　）　１３０１９を順次添加する。室温で１夜攪拌し、
翌日析出するジシクロヘキシル尿素から吸引濾過して、
ＤＭＦをオイルポンプ真空中で蒸発させる。残った油状
物質を酢酸エチルエステル２−中に取シ込み、水冷（−
２０℃）石油エーテル約１５−中で攪拌する。析出し丸
、はじめになお樹脂状粘性の生成物を複数回水冷乾燥石
油エーテルで固体になるまでこする。ｐ２ｏ６上で乾燥
させた後真空中で３１５９−理論値の８４チが得られる
。
元素分析： 計算値：　Ｃ６３，８チ、Ｈ７，６チ、Ｎ　４．２　％
実測値：　ｃ　６５．２９ｋ、Ｉ’１７．６　％、　Ｎ
　４．０１例　　９ ジゴキシゲニンー３−カルボキシメチルエーテル−８−
アミドカシロイル−〔５−（アミドアリル）　−２’−
デスオキシ−ウリジン−５′−トリホスフェ−トコ−四
ナトリウム塩（１１）（Ｄｉｇ　　−１１−ｄＵＴＰ　
　） Ｃ４３Ｈ６１Ｎ４Ｎａ４０２１Ｐ３　　　分子量：　１
１５４．７ジプキシｒニンー３−カルボキシメチルエー
テル−Ｃ−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシンイミド
エステル（１０）　２４５　ＩＱ　（０，３７ｍｍｏｊ
）をＤＭＦ　７ｍ１４中に溶かし、Ｈｓｉｏ　６　”中
の５−アリルアきノー２′−デスオキシ−ウリジン−５
７−ドリホスフエートー四すテクム塩２０〜（０，３７
＊　ｍ’Ｊ　）の溶液に加える。この混合物に０．ｍｍ
Ｏｌ／ｌ硼酸ナトリウム塩緩衝液、ｐＨ８，５６，２１
を加え、室温で１夜攪拌する（約１５時間）。
ペーパー電気泳動（０，０５ｍｏｌ／ｌクエン酸塩緩衝
液、ｐ）１５．０、）において、この時間の後ＵＶ光中
に僅かな量の未反応アリルアミノ−ｄＵＴＰの他に所望
の化合物の僅かに低く移動したスポットが観察される（
選択的方法ニジリカゲルを用いる薄層クロマトグラ２イ
ー（ＤＣ）、溶離剤；イソ酪酸／ｍアンモニアＦｊ液／
Ｈ２Ｏ−６６’　１　：　３３　、Ｕｖ中での検出又は
アニスアルデヒド試薬（例７参照）で噴霧；Ｒｆ−置：
５−７　！Ｊ　ルア　ミ／　−ｄＵＴＰ　Ｏ−２；　Ｄ
ｉｇ　−７ｉ　Ｙカプロン酸−０８ｕ−エステル（Ｃ７
ｓ　Ｄｉｇ　−１１−、ＩＵＴＰ　Ｏ，４５）。
処理のためＫは、反応混合物をオイルポンプ真空中で濃
縮し、固体残分とし、Ｈ，０２００Ｒｔ中に取り込み、
イオン交換体カラム（ＤＥ紹−セ７アデツクスＡ２５、
ａｃｏ、Ｂ−製、カラム寸法１．５Ｘ３０ｃｍ）上に注
ぐ。その後短時間に水で洗浄し、次いで０．４　ｍｃ’
ｌ／ｌ　ＴＫＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）ｐ
）１８に対してそれぞれＨ，０１ｌの傾斜溶液で溶離す
る。純粋な生成物を含有するフラクションを合し、真空
中で濃縮し、メタノールと共に多数回蒸発させ、過剰の
ＴｇＡＢを除去する（遊離トリエチルアミンの臭が全く
なくなるまでり。フラスコの内容物を数１の水に取）込
み、この溶液を短かいカチオン交換カラＡ　ＤＯＷＥＸ
　５０　Ｗ８８　（Ｉ　Ｘ１０口）を介して通し、Ｎａ
”−型ＫＬ、このカラムを洗浄水中Ｋ　ＯＤＥがなくな
るまで洗い（２４０ｎｍＫおけるＵＶを測定）、かつ真
空中で約２０１１で濃縮する。凍結乾燥の後Ｄｉｇ−１
１−ｄＵＴＰ−Ｎａ４１９５＃（理論値の４５％）が白
色粉末として得られる。
分析：Ｈ２０測定ニア、９％ 元素分析（Ｈ２０含量を考慮して） 計算値：Ｃ４１，２％％Ｈ５，３チ、Ｎ　４．４　ｑｂ
　％Ｐ７．４％。
実測値：　Ｃ４１，０％、　Ｈ５，４％、Ｎ　４．６　
％、Ｐ７．２チ。
匠−スペクトル（燐酸塩緩衝液−７，０）　：最大：２
２０ｎｍ、２９０ｎｍ Ｄｉｇ　−１１−ｄＵＴＰは“ランダム感作（ｒａｎｄ
ｏｍＰｒｉｍａｄ）　”　−ＤＮＡ−標識法（ＤＮＡ　
−Ｌａｂｅｌｉｎｇａｎｄ　Ｄｅｔａｃｔｉｏｎ　Ｋｉ
ｔ　Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　、注文Ｎ０１０９
５６５７、ベーリンガー・マンノ１イム社；Ｆｅｉｎｂ
ｅｒｇ　ＳＡ、Ｐ、及びＶｏｇｅｌａｔｅｉｎ　１Ｂ、
著、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第１６２巻、１９８
３年、第６頁）Ｋよシ核酸中に導入され、この際、標識
ハプテンとしてがキシゲニンを含有する、これに補体の
核酸を検出するためＫの核酸ψンデが得られる。
手続補正書（自発） 補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ベーリンガー・マンハイムーゲゼルシャフト・
ミツトＱペシュレンクテル・ハフソング ７、補正の内容　　　　つ （１、発明の名称を次のとおり補正する：［ジゴキシゲ
ニン誘導体、その製法、標識結合体の製法、核酸検出法
及びジゴキシゲニン結合体」 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。
（３）明細書第１４頁第１３行の「異なる意味」を「前
記の意味」と補正する。
（４）同第１４頁第１５行の「化合物」を「他の化合物
」と補正する。
（５）同第２１頁第５行の「一般式（Ｉ）」を「本発明
による一般式（Ｉ）」と補正する。
（６）同第２２頁第４行の「一般式（ＩＩ’）Ｊを「一
般式（■″）」 補正の対象 明細書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄及び発明
の詳細な説明の欄 〔式中、担体（２）は標識ジゴキシゲニン結合体の標識
構造単位を表わし、Ｙ、ｎ及びｙは一般式（ＩＩ）のも
のと同じものを表わす〕」と補正する。
（７）同第２２頁第６〜７行の「測定するための方法に
関する。」を「測定することもできる。」と補正する。
（８）同第２７頁第４行の「ジアゾ酢酸」を「ジアゾ酢
酸エステル」と補正する。
（９）同第３６頁第４〜５行の［ヒドロキシンイミド」
を「ヒドロキシサクシンイミド」と補正する。
（ｌＯ）同第３７頁第１行のｒＲｆ−置」をｒＲｆ−値
」と補正する。
（１１）同第３７頁第１９行の’　ｌ　Ｏｃｍ）を介し
て通し、Ｎａ”−Ｍにし、」　を　ｒ　ｌ　Ｏｃｍ）　
；　Ｎａ十−型を介して通し、」と補正する。
特許請求の範囲 〔式中、ｎは１〜４の整数を表わし、かつ２はカルボキ
シ基又はこれから誘導された官能誘導体を表わす〕のジ
ゴキシゲニン誘導体。
ム　請求項七に記載の式■のジゴキシゲニン誘導体を製
造するための方法において、１２−０−アセチルージゴ
キシゲニンの３位の遊離ＯＨ基を自体公知法でジアゾ酢
酸エステルと反応させることにより式Ｉ’　　（式中、
ＺはＣ００Ｃ２Ｈ＆を表わす）の化合物とし、所望の場
合得られた反応生成物のｃｏｏｃ２ｏ５基を自体公知法
でＣＯＯＨ基又は他の官能カルボン酸基２に変換し、か
つ所望の場合、このようにして得られた反応生成物の２
基を自体公知法で他の２基に変換することを特徴とする
ジゴキシゲニン誘導体の製法。
３、　イムノアッセイにおける強心配糖体の測定用標識
結合体を製造する方法において、請求頂上μ載の式（Ｉ
）のジゴキシゲニン誘導体を使用することを特徴とする
標識結合体の製法。
虹　化学結合を介して少なくとも１つのハプテンを標識
として結合して含有する補体核酸ゾンデとハイブリッド
化することにより核酸を検出するために、標識ハプテン
として請求頂上μ載の式Ｉのジゴキシゲニン誘導体を使
用することを特徴とする核酸検出法。
５、一般式■ 〔式中、担体は免疫原担体材料、核酸又はイムノアッセ
イに使用するための標識ジゴキシゲニン結合体の標識構
造単位を表わし、ｙは平均して１〜２０の数値を表わし
、かつＹは請求項ｔｇ載の式（１）のジゴキシゲニン誘
導体のカルボニル官能基２と担体材料の反応位との反応
により生じた基を表わす〕のジゴキシゲニン結合体。
６、一般式（■′） 〔式中、担体（１）は免疫原担体材料を表わし、Ｙ、ｎ
及びｙは請求項５による式（ｎ）のものと同じものを表
わす〕のジゴキシゲニン結合体を使用することを特徴と
する抗体形成に好適な生物の免疫化法。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは１〜４の整数を表わし、かつＺはカルボキ
    シ基又はこれから誘導された官能誘導体を表わす〕のジ
    ゴキシゲニン誘導体。 ２、式中、Ｚが基、−ＣＯＯＨ、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ＾
    ５、−ＣＯＮＲ＾１Ｒ＾２、−ＣＯＯＮＲ＾３Ｒ＾４、
    −ＣＯＮ＿３、−ＣＯＯＣＯＯ−Ｒ＾５又は−ＣＯＯＣ
    Ｏ−Ｒ＾５を表わし、ここでＲ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３及
    びＲ＾４は相互に独立して水素原子、アルキル基、アラ
    ルキル基又はアリール基を表わすか、又はＲ＾１及びＲ
    ＾２又はＲ＾３及びＲ＾４が一緒になつて炭素環系又は
    複素環系を形成していてよく、かつＲ＾５はアルキル基
    又はアラルキル基を表わす請求項１記載のジギトキシゲ
    ニン誘導体。 ３、式中、Ｚが−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣ＿２Ｈ＿５、▲
    数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ を表わす請求項１記載のジゴキシゲニン誘導体。 ４、式中、ｎが１である請求項１から３までのいずれか
    １項記載のジゴキシゲニン誘導体。 ５、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式 I のジゴ
    キシゲニン誘導体を製造するための方法において、１２
    −ｏ−アセチル−ジゴキシゲニンの３位の遊離ＯＨ基を
    自体公知法でジアゾ酢酸エステルと反応させることによ
    り式 I ′（式中、ＺはＣＯＯＣ＿２Ｈ＿５を表わす）
    の化合物とし、所望の場合得られた反応生成物の ＣＯＯＣ＿２Ｈ＿５基を自体公知法でＣＯＯＨ基又は他
    の官能カルボン酸基Ｚに変換し、かつ所望の場合、この
    ようにして得られた反応生成物のＺ基を自体公知法で他
    のＺ基に変換することを特徴とするジゴキシゲニン誘導
    体の製法。 ６、イムノアッセイにおける強心配糖体の測定用標識結
    合体を製造する方法において、請求項１から４までのい
    ずれか１項記載の式（ I ）のジゴキシゲニン誘導体を
    使用することを特徴とする標識結合体の製法。 ７、化学結合を介して少なくとも１つのハプテンを標識
    として結合して含有する補体核酸ゾンデとハイブリッド
    化することにより核酸を検出するために、標識ハプテン
    として請求項１〜４のいずれか１項記載の式 I のジゴ
    キシゲニン誘導体を使用することを特徴とする核酸検出
    法。 ８、一般式II ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中、担体は免疫原担体材料、核酸又はイムノアッセ
    イに使用するための標識ジゴキシゲニン結合体の標識構
    造単位を表わし、ｙは平均して１〜２０の数値を表わし
    、かつＹは請求項１から４のいずれか１項による式（
    I ）のジゴキシゲニン誘導体のカルボニル官能基Ｚと担
    体材料の反応位との反応により生じた基を表わす〕のジ
    ゴキシゲニン結合体。 ９、一般式（II′） ▲数式、化学式、表等があります▼（II′） 〔式中、担体（１）は免疫原担体材料を表わし、Ｙ、ｎ
    及びｙは請求項８による式（II）のものと同じものを表
    わす〕のジゴキシゲニン結合体を使用することを特徴と
    する抗体形成に好適な生物の免疫化法。 １０、一般式（II″） ▲数式、化学式、表等があります▼（II″） 〔式中、担体（２）は標識ジゴキシゲニン結合体の標識
    構造単位を表わし、Ｙ、ｎ及びｙは請求項８による式（
    II）のものと同じものを表わす〕のジゴキシゲニン結合
    体を使用することを特徴とするイムノアッセイにおける
    強心配糖体の測定法。
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