JPH02216055A - 炭水化物含有化合物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、炭水化物含有化合物の検出方法に関する。

従来の技術 炭水化物含有化合物は広く分布している。例えば乳化剤
として使用されかつ食物中に存在するグリセリン誘導体
、例えばモノグリセリドの他に、就中、糖、特にペント
ースおよびヘキソースならびにそれらの誘導体はいたる
ところに存在している。糖は、多数の変形で、特にまた
複合糖質、例えば糖タンパク質の形で生体中に存在して
いる。生体中の極めて多数の作用物質は、配糖化された
形で存在する時のみ輸送されうるかまたは活性を有する
。従ってこのような化合物を試料溶液からおよび組織片
で定量的ならびに定性的に高い精度をもって検出できる
ことが望ましい。さらに、個々の糖、つまりＯＨ基を有
する化合物を相互に区別できることも重要である。

炭水化物含有化合物を、化学的または生化学的方法で定
量的ならびに定量的に検出できる多数の方法はすでに公
知である。すなわち、例えば糖混合物をクロマトグラフ
ィーまたは電気泳動法により分離し、次に着色によって
個々の糖を可視化することは公知である。例えばフェノ
ール−硫酸との反応、過沃素酸塩との反応、次のンッフ
試薬または銀による着色または次のダンシル蛍光定量法
が適当である。これらの方法ＩＪ１極めて特異的でない
かまたは鋭敏でないのが欠点である。鋭敏な化学的方法
も、実施か極めて面倒でありかつ、妨害を受けやずいと
いう欠点を有する。

また、例えば西独国特許出願公開第３６２９１９４号明
細書から、ビオチン誘導体と反応させ、次に標識ストレ
プタビジンと反応させることによって抱合体（複合糖質
）中の糖基を検出することも公知になった。しかしこの
方法は、高いバックグラウンドのためにあまり鋭敏でな
いのが欠点である。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は、炭水化物含有化合物を定性的
ならびに定量的に、鋭敏にして特異的に、検出すること
のできる方法を提案することであった。また、容易に実
施することができ、広（１利用範囲を提供する方法を開
発することも要求される。

課題を解決するための手段 前記課題は、被検出化合物を、同化合物の炭水化物部分
に特異的に結合することのできる原子団および分子量３
００〜１２００のハプテンを含有する化合物（以下抱合
体と称する）と反応させ、次に生成された複合体を、ハ
プテンを標的とする標識抗体と接触させ、該標識を公知
法で測定することを特徴とする炭水化物含有化合物の検
出方法によって解決される。

意外にも、本発明による方法によって炭水化物含有化合
物を極めて鋭敏に検出できることが判明した。該方法は
、クロマトダラムおよび組織片で着色しかつ定量的に評
価するのに適している。ビチオン／アビジン相互作用の
結合定数Ｋ　−１０１５ｍｏｆ２−１は、ハブチント相
応ノ抗体トの相互作用の結合定数（Ｋ−２Ｘ　Ｉ　Ｏ８
ｍｏ０．１−７　Ｘ　１０９ｍｏＱ−’　）よりも少な
くとも１０５倍だけ高く、またビチオン／アビジン相互
作用も、アヒジン分子中に４個のヒチオン結合位置か存
在するために有利であるにしても、本発明による方法は
、少なくともビチオン／アビジン系の検出感度と同じ大
きさの検出感度を許す。また、他の意外な利点は、ハプ
テンと相応の抗体を使用する場合には、事実上バックグ
ラウンドを生じないことである。また、本発明による方
法は、容易にかつ再現可能に実施することができる。

本発明による方法は、炭水化物含有化合物の検出用に適
している。特に該方法は、ヘキソース、ペントースおよ
びシャル酸、それらの誘導体ならびに糖含有物質（複合
糖質）、例えば糖タンパク質の検出に好適である。本発
明による方法は、臨床的、生化学的および食品化学的鑑
別法において、糖の全含分ならびに混合物中の個々の化
合物を検出できるように変更することができる。

化合物は、溶液中で（好ましくはＥＬ　Ｉ　ＳＡテスト
による）ならびにキャリヤーに結合されて検出されうる
。本発明による方法は、キャリヤー上であろうとまたは
組織中であろうと、固定された形で存在するすべての複
合糖質に対して好適である。

糖タンパク質は、混合物の分離のために用いられるゲル
ですでに直接検出することができるしかし、分離された
混合物を先つキャリヤー上に移して、次に所望の化合物
を検出するのが有利である。

本発明による方法の実施のためには、先づ被検出化合物
を、同化合物に特異的に結合することのできる原子団お
よび分子量３００〜１２００のハプテンを含有する抱合
体と反応させる。

前記原子団は、検出が特異的であるように選択される。

一つには、被検出化合物と不変の形で特異的に反応する
物質が適当である。この場合特にレクチンまたは炭化水
素特異的抗体［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１．２４５、（’１
９８７）１−１１］が該当する。個々の糖種と特異的に
結合する種々のレクチンは公知である［Ａｎｎ、　Ｒｅ
ｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

５５　（１９８６）３５〜６７］。これらのレクチンは
植物から単離されかつ市販されている。

例えば末端位に結合されたガラクトース基に特異的に結
合する落下生アグルチニン（ＰＮＡ）Ｎ−アセチルグル
コザミンに対して特異的である小麦胚アグルチニン（Ｗ
ＧＡ）、末端位に結合されたマンノース基に特異的に結
合するガランラス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ　ｎ
１ｖａｌｉｓ）アクルヂニン（ＧＮＡ）　、２〜６結合
シャル酸に対して特異的なサンブクス・ニグラ（Ｓａｍ
ｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ）アグルチニン（ＳＮＡ）および
２〜３結合シャル酸と特異的に結合するマアキア・アム
レンシス（Ｍａａｃｋｉａ　ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）レク
チン（ＭＡＬ）を使用する。従って、当業者は、その都
度の目的にとって適当なレクチンを容易に選択すること
ができる。抗体としては、被検出物質と特異的に反応す
る抗体およびそれらの断片が適当である。また、被検出
化合物を特異的を二酸化し、次に原子団として、特異的
に酸化された生成基（一般にアルデヒド基またはカルボ
キシル基）ど反応する官能基を使用することもできる。

この場合、前処理は自体公知の方法で実施することかで
きる。好ましくは、測定すべき化合物の炭水化物部分を
特異的酵素または過沃素酸塩で酸化する。この際その都
度アルデヒド基か生成する。アルデヒド基と結合できる
基としてはアミンおよびヒドラジンか適当である。

従って特定な実施態様の場合には、被検出化合物を、ア
ミンまたはヒドラジド部分を有する抱合体と反応させる
。アミンの場合には、この際生じるシック塩基を、極め
て好ましくは前記反応に続いてさらに脱水化して、不安
定なアルドイミン化合物を安定なアミン化合物に変える
。

炭水化物部分の酸化は公知条件下で行なわれる。特異的
酵素（例えばガラクトースオキシタゼまたはグルコース
オキシダーゼ）を使用する場合には、酵素活性にとって
極めて有利な条件を選択する。過沃素酸との酸化の条件
も同様に公知である。一般には、過沃素酸塩５〜１５ｍ
ｍｏＱ／４との酸化を室温で約１０〜３０分実施する。

単一化合物を特異的に検出しようとする場合には、酸化
条件を自体公知の方法で、所望の化合物のみが酸化され
るように調整する。さらにまた処理すべき化合物に応じ
てよりゆるやかな条件も有意となるであろう。過沃素酸
塩の酸化の次に、なお溶液中に存在する過剰の過沃素酸
塩を重亜硫酸塩を加えることによって分解するのが有利
である。

抱合体の第二成分は、分子量３００〜１２００を有する
ハプテンである。この／’１ブテンは、標識を特異的に
結合するに役立つ。例えばステロイド（例えばジゴキシ
ン、ジゴキシゲニン、コルチソル、エストリオール、エ
ストラジオールテオフィリン、テストステロール、胆汁
酸、プロゲステロンおよびアルドステロン）；短鎖ペプ
チド（例えばアルギブレシン、オキシダーゼおよびブラ
キキニン）；フルオレスセインおよびその誘導体、Ｔ３
．Ｔ４、アフラトキシン、アトラジン、例えばジベレリ
ンのような植物ホルモン：およびアルカロイド（例えば
レセルピンおよびアジマリンン）が適当である。好まし
くは、その都度の試料がそこから由来する生体内に内生
的に存在しないハプテンを使用する。特に天然に存在し
ないハプテン、例えば縮合芳香化合物（ａｎｅｌｌｉｅ
ｒｔｅ　Ａｒｏｍａｔｅｒ）を使用する。

ハプテンとしては、特に好ましくはジゴキシン、ジゴキ
シゲニン、フルオレスセインおよびそれらの誘導体、お
よびテオフィリンを使用する。

ハプテンは、特異的結合をもたらす原子団に直接結合さ
れていてもよい。しかし好ましくはハプテンはスペーサ
ー（５ｐａｃｅｒ）を介して前把原子団に結合されてい
る。この場合スペーサは３〜３２個の原子の長さを有す
るべきである。スペーサーは一般には、原子Ｃ２○、Ｓ
または／およびＮを含む分子から構成されている。

好ましい実施態様の場合には、ステロイドハプテンは３
〜１６個の原子長さを有するスベサーを介して結合され
ている。特に好ましくはレクチンの場合には３〜９個の
原子長さを有するスペーサーを使用し、アミンまたはヒ
ドラシトの場合には９〜１６個の原子長さを有するスペ
ーサーを使用する。好ましくはスペーサとしてＮ−アセ
チル−ε−アミノカプロン酸を使用する。特に好ましく
はＮ−アセチル−εアミノカプロン酸およびＮ−スクシ
ニル−εアミノカフロン酸を使用する。

本発明による方法の第一段階を行なった後、被検出化合
物と抱合体とから複合体が形成される。さて、クロマト
グラフィー、特にゲルクロマトグラフィーまたはゲル電
気泳動法で分離を行なおうとする場合には、分離を複合
体の形成前または後に行なうことができる。これは被検
出物質に依存している。本発明により使用される抱合体
は比較的小さい分子量を有するので、該抱合体は、被検
出化合物が高分子物質例えば糖タンパク質である場合に
は、ＳＤＳゲル電気泳動による分離を妨げない。従って
この場合には、先づ抱合体との反応を行ない、次にゲル
での分離を行なう。次いで直接ゲルで検出を行なうこと
ができる。好ましくは分離されたフラクシヨンをプロッ
ティング（Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって膜（例、ｊばニ
トロセルロースフィルター　ナイロンまたはポリビニル
膜）上に移し、そこで可視化する。

同様に、特に被検出化合物か比較的低い分子量を有する
場合には、先づ分離を行ない、次いで本発明による抱合
体との反応および標識の検出を行なうことができる。そ
の都度適当な方法は被検出物質に依存しており、特殊な
場合には容易に見出すことができる。

被検出物質と抱合体とから形成された複合体は、次にハ
プテンを標的とする標識抗体と反応される。このような
抗体としては、モノクロナルまたはポリクロナール抗体
またはそれらの断片または誘導体を使用することかでき
る。この種の抗体は当業者にとって公知である。

抗体の標識は、自体公知の方法で行なう。例えは酵素に
よる標識、放射標識、生物または化学発光性化合物また
は蛍光性化合物またはこのようなシグナルを惹起する化
合物による標識か適当である。好ましくは標識として酵
素を使用する。酵素としては、極めて好ましくはアルカ
リ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラ
クトシダーゼを使用する。本発明による方法を行なう際
、標識酵素としては極めて好ましくはアルカリ性ホスフ
ァターゼである。標識の測定は自体公知の方法で行なう
。標識として酵素を使用する場合には、検出のために検
出可能な反応を生じる基質を加えなければならない。こ
のために好ましくは酸化性化合物としてロイコ系、特に
インジゴイドを使用し、酸化剤としてテトラゾリウム塩
を使用する。特に、５ブロム−４−クロル−インドリル
ホスフェート（Ｘ−ホスフェート）とニトロブルー−テ
トラゾリウムとから成るレドックス系が適当である。こ
の場合アルカリ性ホスファターゼがＸホスフェ−１・を
分解し、このものがホスフェ−１・の脱離および酸化に
よって青色の難溶性シマーを形成し、同時にテトラゾリ
ウム化合物が還元されて同様に青色難溶性ホルマザンを
生成する。

標識の他の可能性は、組成片における検出にとって好適
な金を用いる標識である。

好ましくは抗ハプテン抗体との反応前に、キャリヤーお
よび被検出混合物の他の成分の反応可能な位置に結合す
る試薬による処理を行なう。このためには例えばカゼイ
ンが適当である。

個々の糖タンパク質の検出限界は、その都度の糖タンパ
ク質の種類に依存している。しかし本発明による方法の
感度は極めて高く、１０ｎｇの範囲まで糖タンパク質を
検出することができる。また本発明による方法によって
種々の糖基を区別することができる。すなわち例えば酸
化条件の変化によってシャル酸含有糖タンパク質とアン
アロ化合物を区別することができる。このために過沃素
酸塩を用いて０℃で極めてゆるやかな条件で酸化を行な
うと、このような条件でシャル酸はなお酸化されるけれ
ども、アシアロ化合物は酸化されない。同様に本発明に
より、被検出混合物を先づＮ−グリコシターゼで処理し
、次に分子量に従って分離することによってＯ−グリコ
シド結合糖をＮ−グリコシド結合糖から区別することも
できる。次に該抱合体の正の糖反応かＯ−グリコンド結
合を示す。

本発明による方法を実施する際に清浄剤が存在しても不
利ではない。

本発明の他の対象は、前記方法により炭水化物含有化合
物を検出するための試薬であって、その特徴とするとこ
ろは、該試薬が分子量３００〜１２００のハプテンおよ
び被検出物質に特異的に結合することのできる原子団か
ら成る抱合体ならびにそれとは物理的に別個に標識され
た抗ハプテン抗体を含有することである。

抗ハプテン抗体の標識として放射性または蛍光性物質ま
たは金を使用すれば該試薬は標識の可視化のために十分
である。標識として酵素を使用する場合には、本発明に
よる試薬は、好ましくはさらに、同酵素との反応によっ
て測定可能の生成物を生じる、同酵素の基質である検出
系も含有する。

該試薬は、実際の貯蔵の場合には極めて長時間安定であ
り、数カ月の貯蔵後にもなお再現可能の値を与える。

次に実施例により本発明を詳述する。

例１ ジゴキシゲニンー０−スクシニル−ε−アミドカプロン
酸（Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニル）−ヒドラジド 西独国特許出願公開第３８００６４４号明細書に記載さ
れた方法により製造されたジゴキシゲニンー〇−スクシ
ニル−ε−アミド−カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ−スク
シンイミドエステルｌ　−４０ｇ　（２ｍｍｏｆｆ）、
ｔ−ブチルオキシカルボニル−ヒドラジド０．２９　ｇ
　（２，２ｍｍｏｏ、）およびｌ・リエチルアミン０　
、２９　ｇ　（２、１ｍｍｏ１２）を、室温で水分排除
下にジオキサンＢｍＱ中で２０時間撹拌する。溶剤の真
空留去後に樹脂状残留物に氷水１００＋ｎ＋２を加え、
４時間放置する。この際生成物が結晶化する。吸引濾過
を行ない、氷水で洗浄し、ＣａＣ４２を介して真空乾燥
する。

収量：］、２３ｇ（現論値の８６％） ＭＧ（分子量）ニア１．７．９、無色粉末、融点１６０
　°Ｃ ＤＣ（薄層クロマトグラフィー）：珪酸ゲル、ニー　ｈ
　口ｊ　タフ　／　）　夕／　−ル３　：　２、Ｒｆ＝
　０．３２例２ ジコ゛キシゲニンー０−スクシニル−ε−アミドカプロ
ン酸−ヒドラジド−ヒドロフリド［−ブチルオキシカル
ボニル−保護生成物１．１０　ｇ（１，５ｍｍｏ＋２　
）を、トリフルオル酢酸６ｍＱ中に溶かし、ＣＨ２（４
２６ｒｎＱで希釈する。室温で１時間撹拌した後、すべ
ての揮発性成分を４０°Ｃで真空で除去し、それぞれ５
ｍａのジオキサンを用いて２回共沸させる。この際得ら
れる無色の樹脂状物を次に５０％メタノール３０ｍＱ中
にとり、濾過しかつＤＥＡＥ−セファデックス（５ｅｐ
ｈａｄｅｘ）　／　ＣＱｅ２００　ｍ（ｌにより５０％
メタノールを用いてクロマトグラフィーを施す。

初めの画分が凍結乾燥後に所望の生成物を与える。

収量：０．６９ｇ（現論値の７０％）、無色粉末ＤＣ：
珪酸ケ、ル、二Ｉ・ロタタン／メタノール８２、Ｒｆ＝
０．１４ ＭＧ：６５３．２ 例３ ジゴキシゲニンー３−カルボキシメチルエーテル−ε−
アミドカプロン酸（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）
−ヒドラジド ジゴキシゲニンー３−カルボキシメチルエテル−ε−ア
ミドカプロン酸−Ｎ−ヒトロキシスクンンイミドエステ
ル（西独国特許出願公開第３８３６６５６号により製造
）１．３２ｇ（２ｍｍｏ（２）　、ｔ−ブチルオキシカ
ルボニルヒドラジン０．２９ｇおよびトリエチルアミン
０．２９ｍＱＣ２、１ｍｍｏ４）を、例１で記載したよ
うに反応させ、後処理する。

収量：１．１７ｇ（現論値の８９％） ＭＧ＋６９１．５、無色粉末 例４ ジゴキンゲニン−３−カルポキシメチルエーテルーε−
アミドカプロン酸ヒドラジド−ヒドロクロリド 予め得られたｔ−ブチルオキシカルボニル保護生成物１
．０４　ｇ　（１，５ｍｍｏＱ）を、例２で記載したよ
うに反応させる。

収量＋０．７６ｇ（現論値の８１％） ＭＧ：６２７．８ 例５ ジゴキシゲニル化レクチンの製造 レクチンＩ　Ｘ　］　Ｏ−３ｍｍｏ＜１／　Ｑを、燐酸
塩０．０５ｍｏ＋２／１２緩衝液（ｐｔ（８，５）　１
０　ｍＯ，に溶かす。

ジゴキシゲニンー〇−スクシニルーアミドカプロン酸−
〇−スクシンイミドエステル（西独国特許出願公開第３
８００６４４号により製造）４　Ｘ　Ｉ　Ｏ”ｍｍｏＱ
　（−２，８＋＋＋ｇ）をジメチルホルムアミドｐ、Ａ
、５００μρ中に溶かし、レクチン溶液に加える。

２５°Ｃで時々振盪しながら４時間反応させる。次に反
応溶液を＋４°Ｃでそれぞれ１０．のＨ２Ｏ（蒸留）に
対して４８時間透析する（少なくとも２回水を新しくす
る）。

透析溶液を凍結乾燥する。収率：９０〜１００％。

例６ 組織片中のグリジャン構造の検出： 大体において、Ｃ，Ｆ、Ａ、ＣｕｌｌｉｎｇＳＲ，Ｔ−
ＡｌｌｉｓｏｎおよびＷ、Ｔ、Ｂａｒｒ　： Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｔｅｃｈｕｎ
ｉｑｕｅ　（２１９−２２４頁、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔ
ｈｓ　Ｌｏｎｄｏｎ、　４版、１９８５）に記載されて
いるように行なう。

次にパラフィン片をキジロールおよび下降するアルコー
ル系列中で固定し、蒸留水で洗浄し１％過沃素酸塩溶液
中で３０分酸化する。

蒸留水で洗浄した後、スライドガラス上に存在する該組
織片の上に、酢酸ナトリウム緩衝液（Ｊ）Ｈ５，５）　
０　、１　ｍｏｆｆ／Ｑ、　ジゴキシゲニンー〇スクシ
ニル−ε−アミノカプロン酸−ヒドラシト−ヒドロクロ
リド（例２　）　ｌ　ＯｍｍｏＯ／　Ｑまたはジゴキシ
ゲニンー３−カルポギシメチルエテルーε−アミドカプ
ロン酸−ヒドラシトヒドロクロリド（例４）を施こし湿
潤室で１〜２時間反応させる。

ＴＢＳ　　　［）　　リ　ス　ＨＣ（２（ｐＨ７、５）
　　　５　０　　ｍｍｏ４／　０．、ＮａＣＱ　Ｉ　５
０　ｍｍｏ４／　Ｑｌで３回洗浄した後、抗体と共に恒
温保持を行なう二通常はｌ：１００〜１：１００Ｏで希
釈したＴＢＳを該組織片上に施こしく約５０〜１００μ
Ｑ、）、同庁を湿潤室で約３０〜６０分間恒温保持する
。

ＴＢＳで３回洗浄した後、該組織片を、］・リスＨ（、
Ｑ（ｐＨ９，５）　０．１ｍｏ（２／４　、塩化ナトリ
ウムＯ、ｌ　ｍｏ＋２／　０．、塩化マグネシウム０．
０５ｍｏ４１０および５−ブロム−４−クロル−３−イ
ンドリル−ホスフェート（３７，５ｐＱ　／　ｌ　Ｏｍ
Ｑ；ジメチルホルムアミド中の母液５０　ｍｇ／　ｒｎ
Ｑ）およびニトロテトラゾリウムブルー（ＮＥＴ）（５
０μＱ／１０ｍＱニア０％ジメチルホルムアミド中の母
液７５　ｍｇ／　ｒｎＱ’）中に浸漬することによって
、アルカリ性ボスファターゼ反応を行なう。

呈色を顕微鏡により追跡する。呈色は一般には数分後に
最適となる。呈色を止めるためｌ二組縁片を蒸留水で洗
浄し、封埋する。

例７ 二トロセルロース膜上のプロッティングによる糖タンパ
ク質をジゴキシゲニル化レクチンで検出する： 糖タンパク質を含有する溶液を、常法で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより電気泳動法により分離するこの分離後に画分を
プロッティングによってニトロセルロース膜（５ｃｈｅ
ｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌｌＢＡ８５）上に移す。

ニトロセルロースは、移動後にポンソ（Ｐｏｎｃｅａｕ
）　Ｓでタンパク質特異的に呈色されるこのために、プ
ロット（Ｂｌｏｔ）を、メーカの指定により製造された
ボンソＳ溶液中で５分間恒温保持し、次に赤色に着色さ
れたバンドが可視化されるまで水で洗浄する。標準タン
パク質を鉛筆で標識する。

次に該プロットを、ＴＢＳ［＋−リスＨ（Ｊ　（ｐＨ７
，５）　５０ｍｍｏＱ／Ｑ　、ＮａＣｌ２１５０ｍｍｏ
＋２／４　］中の０．５％カゼイン溶液中で３０分間恒
温保持し、この際試薬２０ｍ１２１５０〜ｌ　００　ｃ
ｒｎ２を使用する。この恒温保持の際ボンソＳの色が再
び消失する。次に、それぞれＴＢＳ５Ｃｌｍ４を用いて
１０分間つづ２回、ＴＢＳ５０ｍ４を用いて１回洗浄す
る。ＴＢＳはそれぞれＩ　ｍｍｏｆｆのＭｇｃｃ２、Ｍ
ｎＣＱ２およびＣａＣｌ２２を含有する。

ＴＢＳ中の濃度ｌＯμｇ／ｍＱのジゴキシゲニル化レク
チン（例５により製造）ならびにそれぞれ］、　ｍｍｏ
Ｑ／　ＱのＭ　ｇ　Ｃ１２２、ＭｎＣ＋２２およびＣａ
ＣＱ２を含有する溶液を製造する。この溶液的１０ｍα
と共にプロットを室温で１時間恒温保持する。次にＴＢ
Ｓを用いて３回それぞれ１０分間洗浄する。

検出すべき複合糖質の標識のために、該プロントを、ア
ルカリ性ホスファターゼに結合された抗ジコキシゲニン
抗体の希釈液（１：　１０００ＴＢＳ中の希釈度）と−
緒に恒温保持し、次にＴＢＳで３回、１０分間づつ洗浄
する。

次に結合された標識を可視化するために、ブＣ７ｙ　　
ｌ・ヲ　　、　　ト　リ　ス　ＨＣｌ２１　０　０　　
ｍｍｏα／　（１，ＮａＣＱ　１　００　ｍｍｏＩ２／
　（ｌおよびＭｇＣｌ２２５０　ｍｍｏ０／　（ｌを含
有しかつｐＨ９，５を有する溶液中で短時間洗浄し、次
に、　ト　リ　ス　ＨＣｌ２１　０　０　　ｍｍｏＱ／
　（２、ＮａＣＱ、ｌ　　ＯＯｍｍｏＱ／　Ｑお、よび
ＭｇＣＱ２５０　ｍｍｏＩ２／　Ｑを含有ＬカッｐＨ（
Ｊ、５を有する溶液１０ｙａｆｆを含有する溶液、Ｘ−
ポス７エート３７，５μａ（ジメチルボルムアミド中５
０　ｍｇ／　ｍＱ）およびニトロテトラゾリウムプル（
ＮＢＴ）５０　ｐＱ　　（７０％ジメチルホルムアミド
中７５　ｒｎｇ／　ｒｎＱ）と共に恒温保持する。数分
後に発色する。次に白色溶液を除去し、該プロットを数
回水で洗浄する。検出すべき物質はプロット上で極めて
明瞭に可視化される。

例８ ブロッティングによる糖タンパク質をジゴキシゲニンヒ
ドラジドで検出する： 糖タンパク質を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）
　０　、ｌ　ｍａｎｌＱ中で、メタ過沃素酸ナトリウム
ｌ　Ｏｍｍｏｆｆ／　（ｌによって室温でかつ暗所で２
０分間酸化させる。過剰のメタ過沃素酸ナトリウムをＮ
　２０　ｍｍｏｆｆ／　Ｑの濃度の重亜硫酸の添加によ
って分解する。５分後にｌ　ｍｍｏｆ２／　（ｌの濃度
−２３〜 のジゴキシゲニンー３−カルポキシメヂルエーテルーε
−アミドカプロン酸〜ヒドラジドーヒドロクロリドまた
はジゴキシゲニンー〇−スクシニル〜ε−アミドカブロ
ン酸−ヒドラシトヒドロクロリドを加え、この溶液を室
温で１時間恒温保持する。このように処理した糖タンパ
ク質を、５ＤＳ−ゲル電気泳動法によって直接分離し、
電気泳動的にニトロセルロース（例えば５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ　＆　５ｃｈＧＩＩのＢＡ８５）上に移す。この
ニトロセルロース膜をＴＢＳ中の０．５％カゼイン２共
に恒温保持し、ＴＢＳ中での数回の洗浄後に、アルカリ
性ホスファターゼにＮ　合された抗ジゴキシゲニン抗体
（希釈度１：１０００）と共にＴＢＳｌＯｍｆｆ中で室
温で１時間恒温保持する。次に例７で記載したように引
続き処理する。

例９ プロッティングによる糖タンパク質をフルオレスセイン
イソチオシアネ−１−（ＦＩＴＣ）で検出する： 例８で記載したように処理する。但しジゴキシゲニンヒ
ドラジドの代りに５−（（（２−（カルボヒドラジノ）
メチル）チオ）アセチル）アミノフルオレスセイン（Ｒ
，Ｐ、Ｈａｎｇｌａｎｄ、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　
Ｆｌａｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　）１ｍｍ
ｏｆ２／ｆｆを加える。

例１Ｏ 微量滴定板で糖タンパク質を検出する：検出すべき糖タ
ンパク質［タンパク質濃度：炭酸す（・リウム緩衝液Ｃ
ｐＨ９−２５）０．０５　ｍｏ（１／Ｑ中０．１　ｐｇ
／ｍＱ−０，１ｍｇ／ｍ４］　　５０　ｐ（ｌ　を、検
出のために微量滴定板（例えはＮＵＮＣＭｉｋｒｏｗｅ
ｌｌ　Ｐｌａｔｔｅ　９６　Ｆ　）のカップ中に３０分
間入れる。酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）　０．１ｍｏ
（１／Ｑ中の過沃素酸ナトリウムｌ　ＯｍｍｏＱ／　Ｑ
の溶液１００μαを加え、室温で暗所で２時間恒温保持
する。次にＰＢＳ　［燐酸カリウム（ｐＨ６゜５　）０
．０５　ｍｏｌ／ｎ、塩化ナトリウム０１５ｍｏ＋２／
Ｑ、］で３回洗浄する。

ジゴギシゲニンー〇−スクシニル−ε−アミドカプロン
酸＝ヒドラジドーヒドロクロリドまたはジゴキシゲニン
ー３−カルボキシメチルエーテル−ε−アミドカプロン
酸−ヒドラシトヒドロクロリド溶液［酢酸ナトリウム（
ｐＨ５゜５）０−１　ｍｏｆｆ／　Ｑ中１　μｍｏＱ／
１２］１００１１０を加え、室温で６０分恒温保持する
。ＰＢＳで３回洗浄した後、遮断溶液［ＴＢＳ中０．５
％カゼイン、ＴＢＳ：ｌ−リスＨＣＱ　（ｐＨ７，５）
　　０．０５　ｍｏ（ｉ／　Ｑ、　Ｎａ（ＪＯ、１，５
ｍｏＱ／αコ０　、３　ｍ（２／カツプと共に室温で３
０分間恒温保持する。次にＴＢＳ。

０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。

抗体溶液［ペルオキシダーゼ（１５０Ｕ／ｍｌに結合さ
れた抗ジゴキシゲニン抗体を、ＴＢＳＱ、５ｔＱ、０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０に溶かした溶液１μＱ］５０μＩ２
／カツプを室温で６０分間恒温保持し、ＴＢＳ、０．１
％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄する。次にＡＢＴＳ■［２
，２−アジノージ−（３エチルベンゾチアゾリン−スル
ホネート）］を］燐酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐＨ４、４
）　９５　ｍｍｏＱｌｏ、に溶かした溶液１．　、６　
ｍｍｏｆｆ／　Ｑを過硼酸ナトリウム３　、１　ｍｍｏ
Ｑ／　Ｑと共に加え、室温で３０分恒温保持し、吸光度
を４０５ｎｍで測定する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被検出化合物を、同化合物の炭水化物部分に特異的
   に結合することのできる原子団および分子量３００〜１
   ２００のハプテンを含有する化合物と反応させ、次に生
   成された複合体を、ハプテンを標的とする標識抗体と接
   触させ、該標識を公知法で測定することを特徴とする炭
   水化物含有化合物の検出方法。 ２、被検出化合物を抱合体との反応前に特異的に酸化さ
   せる請求項１記載の方法。