CN118420461A - 一种羧基蒽醌衍生物、免疫传感器及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及传感器检测技术领域，涉及一种羧基蒽醌衍生物、免疫传感器及其制备方法及应用。所述羧基蒽醌衍生物用于免疫传感器中的电信号标记分子，所述羧基蒽醌衍生物的结构式如式(Ⅰ)所示：其中，式(Ⅰ)中，n＝2，3，4，5或6中的至少一者。利用本发明所提供的羧基蒽醌衍生物与抗原免疫层所对应的抗体通过化学偶联形成标记抗体，可以实现对样本中目标物的高准确度检测的同时，还具备高灵敏度、高检测效率以及可重复使用等优点。

Description

一种羧基蒽醌衍生物、免疫传感器及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及传感器检测技术领域，涉及一种羧基蒽醌衍生物、免疫传感器及其制备方法及应用。

背景技术

生物传感器是一类独立的分析装置，由生物识别元件和信号转导元件(电化学、光学、声学和机械换能器)构成，在生物分析领域应用广泛。近年来，纳米材料、抗体和寡核苷酸/肽适体等电极表面改性材料和信号放大策略的涌现，为电分析生物平台的发展填补了许多不足，赋予电化学生物传感器简便、经济以及与多重检测和即时检测(Point-of-caretest，POCT)医疗新策略兼容的特点，使之逐渐成为各种疾病生物标志物的可靠分析工具。除了高灵敏度和高精度，与传统的色谱、光谱、质谱或免疫学等分析技术相较，电化学分析平台的显著优势在于可以直接在复杂的生物体液或药品、食物样本，甚至活体内对特定分子进行连续实时、快速的原位检测。

免疫传感器是基于抗原抗体特异性识别功能而研制成的一类生物传感器。由于免疫传感器技术具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便及成本低等优点，它的应用已涉及到临床医学与生物监测技术、食品工业、环境监测与处理等广泛领域。基于电化学探针的免疫传感器以其独特的性能，已在体外诊断方面开始替代传统ELISA检测方法。如，现有技术CN105722847A公开了一种标记化合物和它们在测定中的用途，具体公开了以一系列二茂铁衍生物作为电化学探针以实现对氨基酸、肽、核苷酸等目标物的含量检测；再如，现有技术CN109596697A公开了一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用，其公开的电化学传感器利用抗原抗体的特异反应，“三明治”夹心法制备，其中二抗标记二茂铁甲酸，利用二茂铁作为活性物质实现信号放大，进行定性或定量分析；再如，现有技术CN110398585A公开了一种测定甲胎蛋白抗原的免疫生物传感器及其制备方法与应用，其通过将二茂铁标记物修饰于电极上，二茂铁与抗体共价偶联后形成抗体识别层，孵育不同浓度的目标抗原后以电信号间接检测目标物；再如，现有技术CN110261451A公开了一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法与应用，其利用该标记抗原竞争性结合抗体，达到目标物定量分析的目的。

在现有技术公开的免疫传感器中，大多以二茂铁作为信号放大分子对目标物进行分析，但二茂铁的氧化还原峰电位相对较窄，不利于调节实验条件和实现特定的电化学反应，且在某些溶剂和条件下，二茂铁的氧化还原反应不够可逆，容易发生多电子转移反应，使得电化学循环性能较差。因此，针对以二茂铁作为信号方法分子制备免疫传感器所存在的上述问题，选择合适的电化学探针显得尤为重要。

发明内容

本发明目的在于提供一种羧基蒽醌衍生物、免疫传感器及其制备方法及应用。

基于背景技术部分所述的以二茂铁作为信号方法分子制备免疫传感器所存在的问题，蒽醌由于其稳定性和小尺寸，最大限度地减少了对生物分子相互作用的干扰，可以作为引入任何生物分子的良好替代氧化还原标记。蒽醌化合物相较于其他电化学探针(如二茂铁/铁氰化钾)氧化电位更低，能避免较高电位引发副反应所产生的干扰信号。相较二茂铁探针而言，由于蒽醌结构中存在共轭体系，电子迁移更容易，蒽醌化合物的氧化还原反应速率较快。蒽醌化合物的氧化还原反应一般具有较好的可逆性，电化学循环稳定性较高。部分现有技术公开含二茂铁和含蒽醌标签的2种低密度脂蛋白免疫型电化学传感器，两种传感器具有较好的重复性、选择性、灵敏度和稳定性，但保存期和电信号响应不够理想，与此同时，现有技术公开的制备传感器的方法大多平涉及多步合成工艺和多材料掺杂，例如使用金/铂电极材料作为传感器基底，同时掺杂硅或钼等材料。这导致该类传感器制备过程复杂、耗时和成本较高。这些因素一定程度限制了传感器的实际应用和推广。基于此，本发明提供了一种羧基蒽醌衍生物、免疫传感器及其制备方法及应用。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种羧基蒽醌衍生物，所述羧基蒽醌衍生物用于免疫传感器中的电信号标记分子，所述羧基蒽醌衍生物的结构式如式(Ⅰ)所示：

其中，式(Ⅰ)中，n＝2，3，4，5或6中的至少一者。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种所述羧基蒽醌衍生物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将2-羟基蒽醌与羟基保护试剂反应，得到带有羟基保护基的2-氧-蒽醌衍生物；

(2)将带有羟基保护基的蒽醌衍生物与支链试剂反应，支链试剂对2-氧-蒽醌衍生物的羟基保护基进行取代，得到带有支链的2-氧-蒽醌衍生物；

(3)将带有支链的2-氧-蒽醌衍生物与羧化试剂进行反应，在2-氧-蒽醌衍生物的支链上引入羧基，得到支链带羧基的2-氧-蒽醌衍生物，即得到所述羧基蒽醌衍生物。

在本发明的一些实施方案中，所述支链试剂的结构式为：X(CH₂)_nCH₃，其中，X选自卤族元素中的至少一种，n＝2，3，4，5或6中的至少一者。

在本发明的一些实施方案中，X选自Br、Cl中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述支链试剂选自卤代丙烷、卤代丁烷、卤代戊烷、卤代己烷、卤代庚烷中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述羟基保护试剂选自三甲基氧基硅烷。

在本发明的一些实施方案中，所述羧化试剂选自氯甲酸、氯甲酸酐的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，步骤(1)中，所述将2-羟基蒽醌与羟基保护试剂反应，得到带有羟基保护基的2-氧-蒽醌衍生物包括如下步骤：

将2-羟基蒽醌与羟基保护试剂用有机溶剂进行超声溶解后，室温下，搅拌8-15h后，停止反应；向反应停止后的溶液体系中加入碱液进行混合搅拌，去除有机相，去除有机相后的水相溶液进行旋转蒸发，得到所述带有羟基保护基的2-氧-蒽醌衍生物。

在本发明的一些实施方案中，所述碱液选自氢氧化钠溶液。

在本发明的一些实施方案中，所述有机溶剂选自三氯甲烷。

在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中，所述将带有羟基保护基的蒽醌衍生物与支链试剂反应，支链试剂对2-氧-蒽醌衍生物的羟基保护基进行取代，得到带有支链的2-氧-蒽醌衍生物包括如下步骤：

用溶解溶剂将带有羟基保护基的蒽醌衍生物、支链试剂进行溶解后，在50-70℃条件下，磁力搅拌反应18-30h后，得到所述带有支链的2-氧-蒽醌衍生物。

在本发明的一些实施方案中，步骤(3)中，所述将带有支链的2-氧-蒽醌衍生物与羧化试剂进行反应，在2-氧-蒽醌衍生物的支链上引入羧基，得到支链带羧基的2-氧-蒽醌衍生物包括如下步骤：

将步骤(2)进行反应后的体系中加入碱液和羧化试剂，在50-70℃条件下，磁力搅拌反应18-30h；用酸溶液对反应后得到的反应物进行水解，对水解后的反应物进行分离纯化，得到所述支链带羧基的2-氧-蒽醌衍生物。

在本发明的一些实施方案中，所述酸溶液选自盐酸溶液。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种免疫传感器，所述免疫传感器以本发明第一方面所述的羧基蒽醌衍生物或者以本发明第二方面任一项所述的制备方法制备得到的羧基蒽醌衍生物作为电信号标记分子。

在本发明的一些实施方案中，所述免疫传感器包含：

电极：采用三电极体系，主电极选择碳、或者金材料中的任意一种，辅助电极和参比电极选自银/氯化银材料，电极无需预处理；

修饰于电极上的抗原免疫层；

标记抗体：以所述羧基蒽醌衍生物与所述抗原免疫层所对应的抗体通过化学偶联形成的抗体作为标记抗体。

在本发明所提供的免疫传感器中，所述抗原免疫层可选用市面上常有的体外诊断原料，包括蛋白质、多肽、小分子偶联物等。电极的主电极材料可选用碳、金材料中的任意一种，选用碳材料时可利用传统ELISA中被动吸附形式，将抗原免疫原层修饰于电极；选用金材料时可利用Au-S共价键，将抗原免疫源层修饰于电极。

在本发明的一些实施方案中，所述抗原免疫层所使用的抗原为25OHVD3；所使用的抗体为抗人25OHVD3。25OHVD3，即25羟维生素D3。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种如本发明第三方面任一项所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)准备电极；

2)修饰于电极上的抗原免疫层的制备：将经稀释后的抗原溶液滴附于主电极上，进行一次孵育，对所述抗原进行固定；用缓冲液对经固定处理后的电极进行一次冲洗；将封闭液滴附于经冲洗后的电极上，进行二次孵育后，对用缓冲液对电极进行二次冲洗，得到所述修饰于电极上的抗原免疫层；

3)标记抗体的制备：分别对羧基蒽醌衍生物以及羧基活化试剂进行超声溶解；将经超声溶解后的羧基蒽醌衍生物以及羧基活化试剂进行混合，1-5℃条件下，反应2-4h；将与所述抗原免疫层所对应的抗体溶液与反应后得到的混合液进行混合后，1-5℃条件下，反应10-20h，得到标记抗体反应液；将所述标记抗体反应液进行分离纯化，得到所述标记抗体。

对于本发明所提供的免疫传感器的制备方法，在抗原免疫源层的修饰中，通过添加封闭试剂，阻断非特异性的结合位点；进一步的，在对标记抗体的制备中，可以采用缓冲液配置羧基蒽醌衍生物溶液，加入成为活性酯形式；抗体溶液中加入羧基活化试剂，形成活化剂；将活化剂溶液加入羧基蒽醌衍生物溶液中，使其与蛋白质或多肽发生偶联反应。此时，羧基蒽醌衍生物的羧基与蛋白质或多肽的氨基发生反应，形成酰胺键；用洗涤缓冲液对反应体系进行洗涤，去除未反应的活化剂和副产物，对偶联得到的产物进行纯化和分析，可以很高纯度的标记抗体。

在本发明的一些实施方案中，所述抗原免疫层所使用的抗原为25OHVD3；所述抗体为抗人25OHVD3。

在本发明的一些实施方案中，步骤2)中，所述经稀释后的抗原溶液的浓度为1.0-3.0μg/mL。

在本发明的一些实施方案中，孵育的条件为：35-39℃条件下，孵育25-35min。

所述冲洗所用的缓冲液为含0.01-0.1wt％Tween 20的PBS缓冲液；优选地，所述冲洗所用的缓冲液为含0.02-0.08wt％Tween 20的PBS缓冲液；优选地，所述冲洗所用的Tween20浓度为0.05wt％。

在本发明的一些实施方案中，所述封闭液为含0.1-1.0wt％明胶的PBST，所述PBST为含0.01-0.1wt％.Tween 20的PBS缓冲液；优选地，所述封闭液为含0.2-0.8wt％明胶的PBST，所述PBST为含0.01-0.1wt％.Tween 20的PBS缓冲液。

在本发明的一些实施方案中，步骤3)中，所述羧基活化试剂为EDC和Suflo-NHS的组合；EDC和Suflo-NHS的浓度均为50-60mM；所述EDC是指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，所述Suflo-NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺。

在本发明的一些实施方案中，所述经超声溶解后的羧基蒽醌衍生物的浓度为15-20mM。

在本发明的一些实施方案中，基蒽醌衍生物与EDC、Suflo-NHS的体积混合比为3-5:1:1。

在本发明的一些实施方案中，抗体溶液的浓度为0.1-1mg/mL；所述抗体溶液与混合液的体积混合比为0.5-2:4-6。

在本发明的一些实施方案中，所述抗原免疫层所使用的抗原为25OHVD3；所述抗体为抗人25OHVD3。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的羧基蒽醌衍生化合物/或者如本发明第三方面任一所述的免疫传感器在检测领域的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述检测领域包括对样本中25OHVD3的定量检测。

在本发明的一些实施方案中，所述样本可以选自血清样本、全血样本中的任意一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明依靠免疫学、免疫化学和生物化学等基本原理，提供了一种可用于免疫传感器中的电信号标记分子-羧基蒽醌衍生物，利用本发明所提供的羧基蒽醌衍生物与抗原免疫层所对应的抗体通过化学偶联形成标记抗体，可以实现对样本中目标物的高准确度检测的同时，还具备高灵敏度、高检测效率以及可重复使用等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1中羧基蒽醌衍生物的合成示意图；

图2为本发明实施例1中制备得到的4-(蒽醌-2-氧)丁酸化合物的原料氢谱图；

图3为本发明实施例3中不同浓度25OHVD3抗体标准品及其对应的峰电流线性图；

图4为对通过本发明实施例2的方法制备得到的免疫传感器的稳定性测试结果；

图5为采用本发明实施例2制备得到的免疫传感器和对比检测盒对样本的检测结果的相关性测试结果；

图6为基于本发明实施例1以及对比例1、对比例2制备得到的羧基蒽醌衍生物制备免疫传感器对目标物进行检测的结果对比；

图7为基本本发明实施例2以及对比例4制备免疫传感器的重复检测数据对比结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1

该实施例提供一种羧基蒽醌衍生化合物的制备方法，如图1所示，具体以2-羟基蒽醌为原料制备4-(蒽醌-2-氧)丁酸，具体包括如下步骤：

(1)以2-羟基蒽醌为原料，将1mM 2-羟基蒽醌与3mL三甲基甲氧基硅烷用200mL三氯甲烷超声完全溶解后，室温条件搅拌12h后停止反应；

(2)向步骤(1)反应停止后的溶液体系中加入5mL浓度为10M的氢氧化钠溶液充分搅拌混合，再去掉有机相，将去掉有机相后的水相溶液在40℃、真空度为0.1MPa的条件下进行旋转蒸发，直至无液体流出，得到第一反应物：三甲基-(2-氧-蒽醌)硅烷；

(3)用100mL乙腈溶解步骤(2)制备得到的第一反应物(三甲基-2-氧-蒽醌硅烷)和50mM溴代正丁烷，溶解后，在60℃条件下，磁力搅拌反应24h，得到第二反应物：1-溴-4-(蒽醌-2-氧)丁烷；

(4)向步骤(3)反应后的溶液体系中加入50mL浓度为1M的氢氧化钠溶液和50mL氯甲酸酐水溶液(浓度为20％，60℃条件磁力搅拌反应24h；

(5)用1M盐酸溶液对步骤(4)反应后得到的反应物进行水解，添加量为100mL(，并用柱层析(乙腈：二甲基亚砜＝85：15，V/V)对水解后的反应物进行分离纯化，最终分离得到4-(蒽醌-2-氧)丁酸。制备得到的4-(蒽醌-2-氧)丁酸化合物的原料氢谱图如图2所示。

实施例2

该实施例基于实施例1，提供一种基于羧基蒽醌衍生化合物的免疫传感器的制备方法，具体包括如下步骤：

一、抗原免疫层的制备

(1)首先，电极采用三电极体系，主电极为碳材料(面积为4mm²)，辅助电极和参比电极为银/氯化银材料，且电极无需预处理；

(2)抗原选用市售的25羟基维生素D3-BSA偶联物(25OHVD3-BSA)，用50mM CBS缓冲液将25OHVD3-BSA稀释至2.0μg/mL浓度；

(3)吸取步骤(2)稀释后得到的抗原溶液50μL滴附于主电极，于37℃条件下孵育处理30min，利用疏水作用力对25OHVD3-BSA进行固定；

(4)用含0.05wt％Tween 20的PBS缓冲液(PBST)对步骤(3)固定处理后的主电极进行冲洗；

(5)取40μL的预先配制的含0.5wt％明胶的PBST滴附于经步骤(4)冲洗后的主电极上，于37℃条件下孵育处理30min；

(6)用PBST对步骤(5)孵育处理后的主电极进行冲洗，去除水渍后保持干燥，于4℃低温保存，得到修饰于电极上的抗原免疫层。

二、基于羧基蒽醌衍生化合物的标记抗体的制备：

(1)分别称取4-(蒽醌-2-氧)丁酸(羧基蒽醌衍生化合物)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)，用PBS缓冲液分别进行超声溶解，并分别标记为A液(4-(蒽醌-2-氧)丁酸)、B液(EDC)和C液(Suflo-Suflo-NHS)，经超声溶解后得到的A液浓度为19.2mM、B液浓度为57.6mM、C液浓度为57.6mM；

(2)将步骤(1)得到的A液、B液、C液按体积比4:1:1进行混合，并于4℃条件下，反应3h，得到反应后的混合液；

(3)抗体选用与抗原同一厂家的抗人25羟基维生素D3单克隆抗体(MAB-25OHVD3)，用含0.1wt％Proclin300的PBS缓冲将MAB-25OHVD3稀释至0.5mg/mL浓度，将稀释后的MAB-25OHVD3与步骤(2)中的混合液按照体积比为1:5进行混合，于4℃条件下反应15h，得到标记抗体反应液；

(4)将步骤(3)得到的标记抗体反应液进行超滤和高效液相色谱纯化，得到高纯度的标记抗体液，经BCA蛋白检测浓度为0.48mg/mL。

实施例3

该实施例基于实施例2制备得到的免疫传感器，提供一种对血清样本中25OHVD3进行定量检测的方法，具体包括如下内容：

(1)将实施例2制备得到的高纯度的标记抗体液稀释至浓度为0.6μg/mL；配置含不同稀释浓度的25OHVD3抗体标准溶液，浓度依次为260nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12nM、8nM、4nM、1nM、250pM、63pM、15.8pM和3.9pM，将上述稀释后得到的浓度为0.6μg/mL的标记抗体液分别与上述不同浓度的25OHVD3抗体标准溶液按照体积比为200μL：200μL的比例进行混合，在37℃条件下孵育10min，分别得到标记抗体与不同浓度的25OHVD3抗体标准溶液的混合液；

(2)再将实施例2制备得到的单张电化学免疫传感器(修饰有抗原免疫层的电极)分别浸泡于步骤(1)得到的标记抗体与不同浓度25OHVD3抗体标准溶液的混合液中，在37℃条件下孵育10min后，使用PBST(含0.05wt％.Tween 20的PBS缓冲液)进行冲洗；

(3)以PBS缓冲液为电解液，通过扫描电化学差分脉冲法(DPV)，增幅为10mV，扫描电压为-1.0～-0.5V，测量电流值(IP)，建立不同浓度的25OHVD3抗体标准溶液对应的电流响应值的标准线性曲线；其中，测得的不同浓度的25OHVD3抗体标准溶液及其对应的电流响应值的线性图如图3所示；

(4)将混合血清样本经过解离剂处理后，用PBS缓冲液进行稀释至2～10倍，将步骤(1)中得到的浓度为0.6μg/mL的标记抗体溶液与稀释后的混合血清样本按照体积比200μL：200μL进行混合，在37℃条件下，孵育处理10min后，得到标记抗体溶液与混合血清样本的混合液；

(5)将实施例2制备得到的单张电化学免疫传感器(修饰有抗原免疫层的电极)浸泡于标记抗体溶液与混合血清样本的混合液中，在37℃条件下，孵育处理10min后，使用PBST(含0.05wt％.Tween 20的PBS缓冲液)进行冲洗；

(6)以PBS缓冲液为电解液，通过扫描电化学差分脉冲法(DPV)，增幅为10mV，扫描电压为-1.0～-0.5V，测量电流值(IP)；

(7)通过步骤(3)构建得到的不同浓度的25OHVD3抗体标准溶液对应的电流响应值的标准线性曲线，基于步骤(6)测量得到的电流值(IP)，进一步计算得到稀释后血清样本中的25OHVD3浓度，再乘以稀释倍数，即可得到混合血清样本中25OHVD3的实际浓度。

经过上述方法分别对20个血清样本中的25OHVD3浓度进行检测，结果如表1所述：

表1利用实施例中的方法对各血清样本中25OHVD3浓度进行检测的结果

效果例

一、产品稳定性测试

该效果例进一步对通过上述实施例2所提供的方法制备得到的免疫传感器的稳定性进行测试，具体如下：

在常规条件下，会将制备好的修饰有抗原免疫层的电极放置在4℃的环境下进行保存，将制备好的标记抗体液，进行分装后，放置在-20℃的条件下进行保存，以确保其稳定性和长期可用性。基于此，该效果例进一步将将实施例2制备得到的修饰有抗原免疫层的电极放置在4℃的环境下进行保存；与此同时，将实施例2制备得到的高纯度标记抗体液，进行分装后，放置在-20℃的条件下进行保存，分别于不同时间点取出修饰有抗原免疫层的电极及高浓度标记抗体液，对其所构成的电化学免疫传感器(n＝5)进行稳定性测试，测试的目标物为浓度为8nM的25OHVD3纯品溶液。结果如图4所示。

根据图4所示的结果，该效果例记载了将制备得到的电化学免疫传感器(n＝5)保存150天的稳定性结果，对结果进行分析，通过本发明实施例方法制备得到的电化学免疫传感器在短期(14天)内性能几乎无损耗，性能检测为初始状态的99％以上，显示出其优越的稳定性与持久性。而在长期测试中，如，于保存56天时，测试其性能降至初始状态的92％，于保存140天时，测试其性能降至初始状态的80％。总体而言，通过本申请所提供的方法制备得到的电化学免疫传感器的性能衰减仍在可接受的范围内，电化学免疫传感器和配套的标记抗体展现出较长的使用寿命和可靠性，因而在实际应用中具有较高的应用价值。

二、产品准确度测试

该效果例进一步将通过本申请实施例2中的方法制备得到的电化学免疫传感器对不同血样样本中25OHVD3浓度的检测结果与现有市售试剂盒产品对不同血样样本中25OHVD3浓度的检测结果进行对比，以验证免疫传感器准确度，具体如下：

通过本申请实施例2中的方法制备得到的电化学免疫传感器对不同血样样本中25OHVD3浓度进行检测：具体同实施例3；

通过现有总25-羟基维生素检测试剂盒(酶联免疫法)对不同血样样本中25OHVD3浓度进行检测：依照对比试剂盒产品的说明书，对表2所示的血清样本中的25OHVD3浓度进行检测，结果如表2所示。

表2.25OHVD3免疫传感器与对比检测试剂盒对真实血清样本的检测对比结果

注：表2中“N/A”表示未检出。

根据表2所示的结果，对于低于对比试剂盒检测限的样本，在通过本申请实施例2所提供的方法制备得到的免疫传感器检测组中检测出浓度值，进一步表明通过本申请实施例所提供的方法制备得到的免疫传感器，具有较低的检测限，即具备更高的检测灵敏度。

进一步对通过本申请实施例2中的方法制备得到的电化学免疫传感器对不同血样样本中25OHVD3浓度的检测结果与通过对比试剂盒产品对不同血样样本中25OHVD3浓度的检测结果进行相关性测试，结果如图5所示。根据图5所示的检测结果，采用上述两种方法得到的检测结果之间具有高度相关性，R²＝0.9931，说明通过本申请实施例2所提供的方法制备得到的免疫传感器在检测实际样本时，具有极高准确度的同时，还具备较高的灵敏度。与此同时，本申请采用电化学标签作为信号输出的模式，相较于目前使用较广的化学发光法，具有显著的优势。具体而言，这种方法省去了酶与底物反应的时间，从而极大地提高了检测效率。从抗体孵育至检测结束，整个过程可以控制在22min以内。

对比例1

该对比例1基于实施例1，提供一种羧基蒽醌衍生化合物的制备方法，与实施例1的不同之处在于，将实施例1步骤(3)中所使用的溴代正丁烷替换为溴代丙烷，其余与实施例1均相同，具体步骤如下：

(1)以2-羟基蒽醌为原料，将2-羟基蒽醌与三甲基甲氧基硅烷用三氯甲烷超声溶解后，室温条件搅拌12h后停止反应；

(2)向步骤(1)反应停止后的溶液体系中加入氢氧化钠溶液充分搅拌混合，再去掉有机相，将去掉有机相后的水相溶液进行旋转蒸发，得到第一反应物：三甲基-(2-氧-蒽醌)硅烷；

(3)用乙腈溶解步骤(2)制备得到的第一反应物(三甲基-2-氧-蒽醌硅烷)和溴代丙烷，溶解后，在60℃条件下，磁力搅拌反应24h，得到第二反应物：1-溴-4-(蒽醌-2-氧)丁烷；

(4)向步骤(3)反应后的溶液体系中加入氢氧化钠溶液和氯甲酸酐水溶液，60℃条件磁力搅拌反应24h；

(5)用盐酸溶液对步骤(4)反应后得到的反应物进行水解，并用柱层析(乙腈：二甲基亚砜＝85：15对水解后的反应物进行分离纯化，最终分离得到4-(蒽醌-2-氧)丙酸。

对比例2

该对比例2基于实施例1，提供一种羧基蒽醌衍生化合物的制备方法，与实施例1的不同之处在于，将实施例1步骤(3)中所使用的溴代正丁烷替换为溴代正戊烷，其余与实施例1均相同，具体步骤如下：

(1)以2-羟基蒽醌为原料，将2-羟基蒽醌与三甲基甲氧基硅烷用三氯甲烷超声溶解后，室温条件搅拌12h后停止反应；

(2)向步骤(1)反应停止后的溶液体系中加入氢氧化钠溶液充分搅拌混合，再去掉有机相，将去掉有机相后的水相溶液进行旋转蒸发，得到第一反应物：三甲基-(2-氧-蒽醌)硅烷；

(3)用乙腈溶解步骤(2)制备得到的第一反应物(三甲基-2-氧-蒽醌硅烷)和溴代正戊烷，溶解后，在60℃条件下，磁力搅拌反应24h，得到第二反应物：1-溴-4-(蒽醌-2-氧)丁烷；

(4)向步骤(3)反应后的溶液体系中加入氢氧化钠溶液和氯甲酸酐水溶液，60℃条件磁力搅拌反应24h；

(5)用盐酸溶液对步骤(4)反应后得到的反应物进行水解，并用柱层析(乙腈：二甲基亚砜＝85：15对水解后的反应物进行分离纯化，最终分离得到4-(蒽醌-2-氧)戊酸。

对比例3

该对比例3基于实施例2，提供一种蒽醌-2-羧酸对抗体进行标记以用于免疫传感器的制备，与实施例2的不同之处在于，在实施例2的“基于羧基蒽醌衍生化合物的标记抗体的制备”步骤中，将4-(蒽醌-2-氧)丁酸替换为2-羧基-蒽醌，其余与实施例2均相同。

对比例4

该对比例4基于实施例2，提供一种二茂铁羧酸对抗体进行标记以用于免疫传感器的制备，与实施例2的不同之处在于，在实施例2的“基于羧基蒽醌衍生化合物的标记抗体的制备”步骤中，将4-(蒽醌-2-氧)丁酸替换为4-二茂铁基丁酸，其余与实施例2均相同。

分别将基于本申请实施例1、对比例1以及对比例2制备得到羧基蒽醌衍生化合物按照实施例2中相同的方法进行免疫传感器的制备，并进一步对比基于不同羧基蒽醌衍生化合物进行标记制备得到的免疫传感器对25OHVD3检测结果的影响，具体如下：

分别对浓度为25nM、4nM和63pM的3个25OHVD3抗体标准溶液进行孵育测试，具体测试方法同实施例3，结果如图6所示。根据图6所示的结果，当使用溴代丙烷或溴代正戊烷替换本申请实施例1中的溴代正丁烷进行羧基蒽醌衍生物的制备时，合成出的羧基蒽醌衍生物在结构上产生了明显的变化，这些变化影响了其与抗人25羟基维生素D3(25OHVD3)单克隆抗体的偶联效率和稳定性。在后续的免疫传感器检测中，这些变化导致电化学响应信号出现了明显的波动和不稳定，从而影响了25OHVD3浓度测定的准确性。具体来说，对于使用溴代丙烷制备的羧基蒽醌衍生物，由于烷基支链的缩短，其在抗体上的标记效率降低，导致免疫传感器对25OHVD3的响应信号减弱，检测下限升高或检测不灵敏。而在使用溴代正戊烷制备的羧基蒽醌衍生物中，由于烷基支链的延长，虽然其与抗体的偶联效率有所提高，但过长的支链可能导致抗体在传感器表面的空间位阻增大，影响了抗原与抗体的结合效率，从而导致响应信号的稳定性和准确性下降。而在对比例3中2-羧基-蒽醌标记抗体组几乎未能产生电信号，这一结果表明该组在实验条件下未能形成有效的标记。

与此同时，进一步将对比例4获得的基于4-二茂铁基丁酸的标记抗体与实施例2制备得到的基于4-(蒽醌-2-氧)丁酸的标记抗进行电化学循环测试，结果如图7所示，根据图7所示的检测对比数据可以看出，在10次重复检测后，实施例2中的标记抗体组电信号5次内几乎无损失，而对比例4的标记抗体组在第三次测试后信号已有较大损失(约10％)，且在6次循环后信号值已为原有60％。由此可见，相较于以二茂铁作为电信号标记分子，选择本申请所提供的羧基蒽醌衍生物作为电信号标记分子进行免疫传感器的制备，在重复检测的性能稳定性方面取得了突出的效果。

因此，通过上述对比实验可以看出，选择合适的烷基支链长度对于羧基蒽醌衍生物在免疫传感器中的应用至关重要。综合本申请实施例及上述对比例的效果数据对比，该实施例1中所使用的溴代正丁烷，在提供足够偶联效率的同时，也保证了抗体在传感器表面的良好排列和抗原-抗体结合的稳定性，从而实现了对25OHVD3浓度的准确检测。这一结果进一步验证了本实验方案的可行性和优化策略的有效性。

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本发明的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (10)

1.一种羧基蒽醌衍生物，其特征在于，所述羧基蒽醌衍生物用于免疫传感器中的电信号标记分子，所述羧基蒽醌衍生物的结构式如式(Ⅰ)所示：

其中，式(Ⅰ)中，n＝2，3，4，5或6中的至少一者。

2.一种如权利要求1所述的羧基蒽醌衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将2-羟基蒽醌与羟基保护试剂反应，得到带有羟基保护基的2-氧-蒽醌衍生物；

(2)将带有羟基保护基的蒽醌衍生物与支链试剂反应，支链试剂对2-氧-蒽醌衍生物的羟基保护基进行取代，得到带有支链的2-氧-蒽醌衍生物；

(3)将带有支链的2-氧-蒽醌衍生物与羧化试剂进行反应，在2-氧-蒽醌衍生物的支链上引入羧基，得到支链带羧基的2-氧-蒽醌衍生物，即得到所述羧基蒽醌衍生物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述支链试剂的结构式为：X(CH₂)_nCH₃，其中，X选自卤族元素中的至少一种，n＝2，3，4，5或6中的至少一者；

优选地，X选自Br、Cl中的至少一种；

优选地，所述支链试剂选自卤代丙烷、卤代丁烷、卤代戊烷、卤代己烷、卤代庚烷中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述羟基保护试剂选自三甲基氧基硅烷；

优选地，所述羧化试剂选自氯甲酸、氯甲酸酐中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述将2-羟基蒽醌与羟基保护试剂反应，得到带有羟基保护基的2-氧-蒽醌衍生物包括如下步骤：

将2-羟基蒽醌与羟基保护试剂用有机溶剂进行超声溶解后，室温下，搅拌8-15h后，停止反应；向反应停止后的溶液体系中加入碱液进行混合搅拌，去除有机相，去除有机相后的水相溶液进行旋转蒸发，得到所述带有羟基保护基的2-氧-蒽醌衍生物；

优选地，所述碱液选自氢氧化钠溶液；

优选地，所述有机溶剂选自三氯甲烷。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述将带有羟基保护基的蒽醌衍生物与支链试剂反应，支链试剂对2-氧-蒽醌衍生物的羟基保护基进行取代，得到带有支链的2-氧-蒽醌衍生物包括如下步骤：

用溶解溶剂将带有羟基保护基的蒽醌衍生物、支链试剂进行溶解后，在50-70℃条件下，磁力搅拌反应18-30h后，得到所述带有支链的2-氧-蒽醌衍生物；

优选地，步骤(3)中，所述将带有支链的2-氧-蒽醌衍生物与羧化试剂进行反应，在2-氧-蒽醌衍生物的支链上引入羧基，得到支链带羧基的2-氧-蒽醌衍生物包括如下步骤：

将步骤(2)进行反应后的体系中加入碱液和羧化试剂，在50-70℃条件下，磁力搅拌反应18-30h；用酸溶液对反应后得到的反应物进行水解，对水解后的反应物进行分离纯化，得到所述支链带羧基的2-氧-蒽醌衍生物；

优选地，所述酸溶液选自盐酸溶液。

7.一种免疫传感器，其特征在于，所述免疫传感器以权利要求1所述的羧基蒽醌衍生物或者以权利要求2-6任一项所述的制备方法制备得到的羧基蒽醌衍生物作为电信号标记分子。

8.如权利要求7所述的免疫传感器，其特征在于，所述免疫传感器包含：

电极：采用三电极体系，主电极选择碳、或者金材料中的任意一种，辅助电极和参比电极选自银/氯化银材料，电极无需预处理；

修饰于电极上的抗原免疫层；

标记抗体：以所述羧基蒽醌衍生物与所述抗原免疫层所对应的抗体通过化学偶联形成的抗体作为标记抗体；

优选地，所述抗原免疫层所使用的抗原为25OHVD3；所使用的抗体为抗人25OHVD3。

9.一种如权利要求7-8任一项所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)准备电极；

2)修饰于电极上的抗原免疫层的制备：将经稀释后的抗原溶液滴附于主电极上，进行一次孵育，对所述抗原进行固定；用缓冲液对经固定处理后的电极进行一次冲洗；将封闭液滴附于经冲洗后的电极上，进行二次孵育后，对用缓冲液对电极进行二次冲洗，得到所述修饰于电极上的抗原免疫层；

3)标记抗体的制备：分别对羧基蒽醌衍生物以及羧基活化试剂进行超声溶解；将经超声溶解后的羧基蒽醌衍生物以及羧基活化试剂进行混合，1-5℃条件下，反应2-4h；将与所述抗原免疫层所对应的抗体溶液与反应后得到的混合液进行混合后，1-5℃条件下，反应10-20h，得到标记抗体反应液；将所述标记抗体反应液进行分离纯化，得到所述标记抗体；

优选地，步骤2)中，所述经稀释后的抗原溶液的浓度为1.0-3.0μg/mL；优选地，孵育的条件为：35-39℃条件下，孵育25-35min；优选地，所述冲洗所用的缓冲液为含0.01-0.1wt％Tween 20的PBS缓冲液；优选地，所述Tween 20的浓度为0.05wt％；优选地，所述封闭液为含0.1-1.0wt％明胶的PBST；

优选地，步骤3)中，所述羧基活化试剂为EDC和Suflo-NHS的组合；EDC和Suflo-NHS的浓度均为50-60mM；优选地，所述经超声溶解后的羧基蒽醌衍生物的浓度为15-20mM；

优选地，羧基蒽醌衍生物与EDC、Suflo-NHS的体积混合比为3-5:1:1；

优选地，抗体溶液的浓度为0.1-1mg/mL；所述抗体溶液与混合液的体积混合比为0.5-2:4-6；

优选地，所述抗原免疫层所使用的抗原为25OHVD3；所述抗体为抗人25OHVD3。

10.一种如权利要求1所述的羧基蒽醌衍生化合物/或者如权利要求7-8任一所述的免疫传感器在检测领域的应用；优选地，所述检测领域包括对样本中25OHVD3的定量检测。