BR112018009071B1 - Método in vitro para preparar uma amostra representativa para análise - Google Patents

Método in vitro para preparar uma amostra representativa para análise Download PDF

Info

Publication number
BR112018009071B1
BR112018009071B1 BR112018009071-9A BR112018009071A BR112018009071B1 BR 112018009071 B1 BR112018009071 B1 BR 112018009071B1 BR 112018009071 A BR112018009071 A BR 112018009071A BR 112018009071 B1 BR112018009071 B1 BR 112018009071B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
sample
cell
tissue
tumor
cells
Prior art date
Application number
BR112018009071-9A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112018009071A8 (pt
BR112018009071A2 (pt
Inventor
Nelson Alexander
Katherine Leith
Esteban Roberts
Stacey Stanislaw
Eric Walk
Melinda Day
Lisa Gallegos
Aoune Barhoumi
Samantha Rajkovich
Original Assignee
Ventana Medical Systems, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ventana Medical Systems, Inc filed Critical Ventana Medical Systems, Inc
Publication of BR112018009071A2 publication Critical patent/BR112018009071A2/pt
Publication of BR112018009071A8 publication Critical patent/BR112018009071A8/pt
Publication of BR112018009071B1 publication Critical patent/BR112018009071B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2866—Grinding or homogeneising
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/302—Stain compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
    • G01N2001/368—Mounting multiple samples in one block, e.g. TMA [Tissue Microarrays]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

a divulgação geralmente se refere à preparação de amostras representativas de amostras clínicas, por exemplo, tumores (inteiros ou parciais), nódulo linfáticos, metástases, cistos, pólipos ou uma combinação ou porção dos mesmos, usando métodos de dissociação mecânicos e/ ou bioquímicos para homogenizar. amostras intactas ou grandes porções das mesmas. o material homogenizado resultante fornece a capacidade de obter uma amostra representativa correta apesar da heterogeneidade espacial dentro da amostra, aumentando a probabilidade de detecção de subclones de baixa prevalência e é adequado para uso em vários testes diagnósticos, bem como na produção de terapêuticas, especialmente vacinas contra tumores ou terapias baseadas em células imunitárias.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido Provisório U.S. n° 62/418.146, depositado em 4 de novembro de 2016; Pedido de patente provisório U.S. n° 62/354.622, depositado em 24 de junho de 2016; Pedido de Patente Provisório U.S. n° 62/ 279.405, depositado em 15 de janeiro de 2016 e Pedido de Patente Provisório U.S. N° 62/252.153 depositado em 6 de novembro de 2015 cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A invenção geralmente se refere ao desenvolvimento de uma metodologia para gerar amostras de tecido representativas, por exemplo, órgãos inteiros, tumores, nódulos linfáticos, metástases ou combinações dos mesmos, para abordar a questão da heterogeneidade do tecido em amostras clínicas, especialmente amostras para uso em oncologia clínica. Mais particularmente, a invenção refere-se à aplicação de métodos de dissociação mecânicos, químicos e/ ou bioquímicos, por exemplo, enzimáticos, métodos de dissociação para amostras de tecidos intactos fixos (ou preservados), por exemplo, órgãos inteiros, tumores, nódulos linfáticos, tecidos metastizados ou combinações de qualquer um destes, a fim de criar uma amostra homogênea que forneça a capacidade de obter uma amostra representativa correta, apesar da heterogeneidade espacial dentro do tecido, por exemplo, um tumor, aumentando a probabilidade de detecção para populações menores de clones e/ ou eventos de baixa prevalência. A amostra de tecido representativa, por exemplo, uma amostra de tumor, é adequada para utilização em vários ensaios de diagnóstico. Particularmente, estas amostras tumorais representativas e porções das mesmas são úteis em métodos de ensaio para avaliar o prognóstico do câncer (por exemplo, estágio do tumor) e na seleção e concepção de regimes de tratamento apropriados. As amostras de tecido representativas, por exemplo, amostras tumorais e suas porções, podem ser usadas como terapêuticas ou para gerar terapêuticas, por exemplo, como vacinas ou na fabricação de vacinas contra câncer ou terapias baseadas em células imunes, pois as amostras representativas contêm um conjunto diverso de antígenos expressos por um dado tumor ou tumores.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] As técnicas de amostragem de tumores usadas para todos os testes de diagnóstico em oncologia médica estão enraizadas na co-evolução da patologia anatômica e da oncologia cirúrgica no final do século XIX. Antes da descoberta da anestesia à base de éter, em 1842, e da invenção das técnicas cirúrgicas antissépticas, em 1867, amostras de patologia eram tipicamente adquiridas em autópsias. Precedendo a esses dois avanços significativos nas técnicas cirúrgicas, as amostras de tecido obtidas pelos patologistas geralmente eram provenientes de pacientes que morreram na mesa de cirurgia devido a um choque ou logo depois devido a uma infeção. As altas taxas de mortalidade da cirurgia, portanto, não permitiram que os patologistas correlacionassem a caracterização anatômica e microscópica das estruturas tumorais com as estatísticas de sobrevida dos pacientes. O impacto da anestesia e técnicas antissépticas provocou um aumento imediato e dramático no número de pacientes que sobreviveram cirurgias e levou a um aumento substancial no número de procedimentos cirúrgicos complicados.
[004] Os avanços descritos acima no centro cirúrgico coincidiram com o advento da inclusão de tecido em parafina em 1869 e a utilização generalizada da fixação da formalina a partir de 1893. Com essas duas inovações, anatomopatologistas tiveram clareza sem precedentes na arquitetura de tecidos e morfologia microscópica. Começando no início dos anos 1900, foram feitas percepções que conectavam padrões distintos de arquitetura e morfologia de tecidos com tipos específicos de tumores. Com o tempo, anatomopatologistas e oncologistas cirúrgicos conseguiram relacionar essas características anatômicas e microscópicas específicas dentro do mesmo tipo de tumor com diferenças na sobrevida global. As correlações entre as características histológicas dos tumores e o prognóstico dos pacientes foram finalmente codificadas no sistema de estadiamento TNM no início dos anos 50.
[005] O sistema de estadiamento TNM tem como objetivo determinar o prognóstico de um paciente com câncer, avaliando os aspectos morfológicos do tumor (T), a extensão em que as células tumorais se espalharam para os nódulos linfáticos regionais (N) e se o tumor tem ou não metástase para órgãos distantes (M). A informação que é necessária para a porção “T” da análise de estadiamento TNM requer que um punhado (tipicamente 3-5) de amostras muito pequenas de tumor seja tomadas na interface do tumor e do tecido normal circundante. As amostras devem ter um tamanho consistente (cerca de 20 x 20 x 3 milímetros) para permitir a fixação adequada de formol e a incorporação de parafina. Uma seção de quatro mícrons da amostra fixada em formol e incluída em parafina (FFPE) é cortada por um micrótomo e colocada em uma lâmina de vidro para ser revisada por um patologista. A maioria dos laboratórios de patologia terá a instrumentação básica que permite o estadiamento TNM dos tumores: cassetes de tecido plástico, tampão de fixação de formalina, um processador de tecidos para desidratar e incorporar o tecido em parafina, um micrótomo para cortar seções finas (geralmente quatro mícrons de espessura) e lâminas de vidro em que se coloca as seções de tecido.
[006] O sistema de estadiamento TNM tornou-se o método internacionalmente reconhecido para o estágio do câncer em 1987 e agora é governado pela American Joint Commission on Cancer (AJCC) e pelo Union Internationale Contre le Cancer (UICC). A AJCC e a UICC, bem como o College of American Pathologists (CAP), revisam e atualizam periodicamente as diretrizes para os critérios mundiais de estadiamento TNM. As características histológicas e anatômicas que são as entradas na rubrica TNM são dependentes de patologistas cirúrgicos que adquirem amostras de tecidos consistentes em todo o mundo. Portanto, as técnicas de amostragem necessárias para o sistema de estadiamento TNM, baseadas em tecnologia e métodos desenvolvidos no final do século XIX, foram fixadas em oncologia médica.
[007] Obter as amostras de tecido “corretas” para o estadiamento TNM dos tumores é o objetivo principal da patologia cirúrgica, como evidenciado pelo fato de que vários livros descrevem e ilustram como os patologistas cirúrgicos devem abordar uma amostra cirúrgica. Geralmente, são tomadas seções que melhor demonstram as características vistas no exame bruto. Muitos desses livros estabelecem os procedimentos aprovados pela AJCC, UICC e CAP de instituições médicas reconhecidas e contêm ilustrações detalhando as porções exatas do tumor a ser amostrado (veja as Figuras 1A - 1C). O objetivo desses livros didáticos é treinar patologistas cirúrgicos em todo o mundo para pegar regiões específicas de tumores sólidos ressecados de forma consistente e reprodutível, de modo a evitar a amostragem aleatória. Veja-se, por exemplo, Surgical Pathology Dissection: An Illustrated Guide, Segunda Edição, na pág. 29 afirmando: “A chave para uma abordagem que seja econômica e inteira é a amostragem seletiva. A amostragem seletiva é uma abordagem estratégica que tenta maximizar as informações que podem ser obtidas de uma determinada seção de tecido. Ao contrário da amostragem aleatória e indiscriminada de uma amostra, a amostragem de tecido que é seletiva aumenta a informação que pode ser obtida histologicamente, e requer menos seções para fazê-lo”. Essas referências determinam que regiões específicas de tumores sólidos devem ser coletadas de uma maneira consistente e reprodutível para facilitar o estadiamento TNM. Geralmente, a seção com o grau mais alto é usada para todos os testes de diagnóstico e a amostra restante é descartada.
[008] Os patologistas cirúrgicos são ensinados a abster-se de aumentar o número total de amostras retiradas de um espécime cirúrgico, uma vez que não há mais informações obtidas com o aumento da amostragem de tumores. Não há reconhecimento de que mais informações de diagnóstico possam estar disponíveis dentro do tumor residual que não é amostrado.
[009] A metástase tumoral para os nódulos linfáticos de drenagem locais é um indicador significativo de prognóstico (ou seja, o “N” do sistema de estadiamento TNM prognóstico). Presença de células tumorais dentro dos nódulos linfáticos regionais pode ser o fator decisivo para se um paciente recebe quimioterapia adjuvante. Convencionalmente, as células tumorais são detectadas nos nódulos linfáticos após a remoção cirúrgica e exame microscópico de uma única seção fina de tecido FFPE. Os tumores metastáticos nos nódulos linfáticos podem preencher todo o órgão, ou podem ser microscópicos, contendo apenas um punhado de células cancerígenas. Pequenos crescimentos metastáticos podem ser perdidos nos nódulos linfáticos, já que apenas uma única seção delgada do nódulo linfático excisado será examinada quanto à presença de um tumor metastático. Dependendo do tamanho do nódulo linfático, uma única seção de tecido FFPE pode conter apenas alguns décimos de um por cento do volume total do nódulo excisado. Um tumor metastático que cresce na área do nódulo linfático que não foi amostrado não será identificado, resultando em uma análise falso-negativa. Isto pode resultar no paciente a receber um regime terapêutico menos agressivo do que o necessário para um indivíduo com câncer regionalmente avançado (isto é, metástase nos nódulos linfáticos, N-positivo).
[010] Um relatório de caso é finalizado pelo departamento de patologia e submetido ao oncologista após a amostra do tumor ter sido cortada do material do tumor ressecado e o estadiamento TNM ter sido calculado. O material cirúrgico remanescente contendo o tecido tumoral residual que não foi utilizado no estadiamento TNM é então destruído, tipicamente por incineração conforme exigido pela Lei de Portabilidade e Responsabilidade de Seguro Saúde (HIPAA) de 1996. No entanto, o CAP recomenda que todos os blocos de parafina e lâminas de corte sejam mantidos por 10 anos. Existe um sistema mundial no qual todas as informações de diagnóstico derivadas de tumores sólidos são baseadas na minoria do tumor em si. Ver, por exemplo, De Petris, Proteome Science, 8: 9 (2010) (“De Petris”). Em De Petris, apenas “[a] biópsia de uma região representativa do tumor” foi levada para exame mais aprofundado, com os requisitos de hemólise e não fixação tornando a amostra inadequada para o estudo histológico de acompanhamento.
[011] A descoberta da heterogeneidade do tumor é contrária às teorias convencionais sobre o desenvolvimento do tumor. Na década de 1950, a ideia predominante era de que o tumor final, clinicamente detectável, era um produto da seleção sequencial de subpopulações específicas de “stemlines (clone de células básicas)” tumorais. Nesta teoria, a maior parte do tumor é dominada por um único “stemline” que superou outros “stemlines” devido à seleção natural. O sistema de estadiamento TNM foi desenvolvido durante o mesmo período que os conceitos de “stemlines” tumorais, onde a maioria do tumor será composta de um único “tipo” de tumor. Veja Peter Nowel, Science (1976) 194: 23-28.
[012] Em vez de serem uniformes na composição, os tumores sólidos são, de fato, heterogêneos. Tem sido relatado que alguns tumores sólidos são compostos por múltiplas populações de células cancerígenas geneticamente distintas e espacialmente segregadas. Ver Gerlinger et al., NEJM (2012) 366: 883-92; e Yachida et al. nature (2010) 467 (7319): 1114-1117. Como adicionalmente descrito aqui, os inventores mostraram que os métodos de amostragem convencionais para análise histológica de tumores fornecem uma amostra inadequada de um tumor (ou tecido potencialmente contendo células cancerosas, tal como, um nódulo linfático) e pode ser melhorado.
[013] Médicos e cientistas, guiados pela patologia moderna, normalmente não atribuem qualquer valor médico significativo ao tecido tumoral remanescente, uma vez que as amostras foram tomadas para o sistema de estadiamento TNM, ou seja, a sua destruição. A análise morfológica e baseada em biomarcadores de seções histológicas também é limitada pelas heterogeneidades fenotípicas, morfológicas e genéticas exibidas pelas populações malignas dentro de um tumor ou entre tumores. Uma pequena população de células tumorais pode compreender a principal fonte de malignidade e metástase e constitui uma quantidade insignificante de composição genômica de todo o tumor. Como resultado, os biomarcadores desenvolvidos contra uma massa volumosa do tumor podem não capturar as razões da mortalidade por câncer que é frequentemente causada por uma pequena proporção do tumor.
[014] A composição genética heterogênea dentro de um determinado tumor representa desafios significativos para as decisões de terapia em oncologia diagnóstica, que utiliza informações obtidas da minoria de um tumor, na suposição de que os tumores são compostos de células que são uniformes em sua composição. Por exemplo, a localização espacial dos subtipos genéticos dentro da amostra influencia grandemente o resultado clínico. Procedimentos tradicionais de cortes de tecidos de rotina, mesmo com base na amostragem seletiva guiada por literatura reconhecida, são incapazes de amostrar o espécime cirúrgico inteiro. Além disso, os procedimentos de amostragem atuais só podem testar a minoria do tumor, deixando a vasta maioria do tumor sem exame de qualquer forma e, eventualmente, destruída.
[015] Sob os procedimentos aprovados pelo AJCC, UICC e CAP, os patologistas usarão apenas pequenas frações do espécime de tecido ressecado cirurgicamente e descartarão a amostra restante. Como uma amostra de tumor pode abrigar múltiplas populações de células tumorais geneticamente e espacialmente distintas, as 3 a 5 amostras pequenas tomadas até mesmo pelo patologista mais experiente não podem representar todos os grupos geneticamente diversos de malignidades ou metástases em todo o espécime. Além disso, a localização de quaisquer populações geneticamente distintas de células cancerígenas não pode ser conhecida a priori, uma vez que a sequência de DNA das células tumorais não é aparente no exame macroscópico. Na verdade, é o material de tumor residual descartado que contém a maior parte de toda a heterogeneidade celular, genômica, e proteômica dentro do tumor primário, ainda não há nenhuma metodologia ou instrumentação com tempo e custo eficaz que permita a amostragem de tumores inteiros.
[016] A prática patológica atual requer métodos de amostragem e processamento mais inteiros para todo o tumor, o que pode ajudar a garantir que a heterogeneidade celular, genômica e proteômica em todo o tumor primário seja capturada em uma amostra diagnóstica.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[017] A invenção proporciona uma composição homogeneizada processada que é derivada de uma amostra de tecido heterogênea que compreende estruturas celulares substancialmente homogeneamente distribuídas, em que uma proporção de estruturas celulares em cada subconjunto do material homogeneizado é substancialmente semelhante à proporção de estruturas celulares na amostra de tecido heterogêneo original. A composição homogeneizada é uma nova amostra de tecido única que representa as principais características da amostra de tecido heterogêneo original. A composição divulgada aborda e ultrapassa as limitações dos métodos do estado da técnica que não conseguem explicar a heterogeneidade do tecido em amostras clínicas, especialmente amostras para utilização em oncologia clínica.
[018] A composição homogeneizada é derivada ou proveniente de vários tecidos, órgãos ou amostras dos mesmos, por exemplo, um nódulo linfático, uma metástase, um pólipo, um cisto, uma ressecção, um órgão ou uma fração do mesmo ou células espacialmente segregadas. Em um aspecto, o material homogeneizado compreende de cerca de 25 % a cerca de 100 % das estruturas celulares da amostra de tecido. O material homogeneizado pode compreender uma fração de proteína, lipídio, ácidos nucleicos ou outras porções que estão presentes no tecido de partida, por exemplo, um tumor inteiro, nódulos linfáticos ou metástases utilizadas para derivar o seu material homogeneizado, em que as proporções relativas de tais componentes substituintes são representativas do tecido de partida. As estruturas celulares substancialmente homogêneas podem compreender células isoladas ou uma pluralidade de aglomerados celulares isolados a partir de um tecido normal ou anormal. Em certos aspectos, o material homogeneizado pode compreender uma amostra de tecido líquido ou não líquido, obtido por uma variedade de métodos, tais como, um aspirado de agulha de citologia, amostra de efusão ou um esfregaço de Papanicolau.
[019] Em outros aspectos, o material homogeneizado pode ser isolado a partir de tecido preservado, por exemplo tecido fixado com formalina. Em outros aspectos, a amostra de tecido não é preservada ou fixa e/ ou compreende células vivas. A amostra de tecido heterogêneo pode ser isolada de um ou mais tecidos obtidos de um ou mais pacientes.
[020] O material homogeneizado é adequado para uso em várias aplicações diagnósticas, prognósticas e clínicas, incluindo, mas não limitado a, geração de dados representativos incluindo dados oncológicos representativos, estágio do câncer, identificação e avaliação do prognóstico de doenças (por exemplo, estágio do tumor), seleção e projeto de regimes de tratamento, comparação de ensaios clínicos, identificação e caracterização de marcadores, perfilamento de tecidos e armazenamento da composição homogeneizada. A composição homogeneizada também é útil para o rastreio de agentes terapêuticos ou para gerar terapêutica no tratamento de pacientes, por exemplo, como vacinas ou na produção de vacinas para o câncer ou terapias a base de células imunes, como as amostras representativas contêm um conjunto diverso de antígenos expressos por um dado tumor ou tumores.
[021] A invenção também fornece métodos para a produção de uma composição de material homogeneizado que é representativa da amostra de tecido heterogêneo, por exemplo, uma amostra representativa. Mais particularmente, a invenção compreende a aplicação de métodos de dissociação mecânicos, químicos e/ ou bioquímicos, por exemplo, enzimáticos, métodos de dissociação para amostras contendo tecidos intactos, por exemplo, órgãos inteiros, tumores, nódulos linfáticos, tecidos metastizados ou combinações de qualquer um destes (a partir do mesmo paciente ou pacientes diferentes) para fornecer uma amostra representativa precisa apesar da heterogeneidade espacial dentro do tecido ou órgão original, por exemplo, um tumor, aumentando assim a probabilidade de detecção para populações de subclones menores e/ ou eventos de baixa prevalência.
[022] Em um aspecto, a invenção refere-se geralmente ao desenvolvimento de uma metodologia para a geração de amostras representativas de tecido de, por exemplo, órgãos inteiros, tumores, nódulos linfáticos, metástases, ou combinações dos mesmos, a fim de resolver o problema de heterogeneidade, por exemplo, heterogeneidade tumoral, em espécimes clínicos, especialmente espécimes clínicos para utilização em oncologia clínica, e o uso de tais amostras representativas ou porções dos mesmos em vários métodos de diagnóstico e terapêuticos, bem como composições que compreende essas amostras representativas para utilização em diagnóstico e terapia, em especial em oncologia.
[023] Além disso, amostras representativas de diferentes pacientes ou diferentes tecidos do mesmo paciente ou pacientes diferentes podem ser marcadas com marcadores de identificação únicos, por exemplo, um hapteno, e as amostras marcadas de diferentes pacientes ou tecidos combinados e utilizados em métodos de ensaio desejados.
[024] As amostras representativas derivadas por formas de realização exemplificativas da invenção podem ser utilizadas para melhorar a precisão da detecção, diagnóstico, e/ ou de teste de diferentes tipos de tumor, independentemente do tipo de tumor de tecido, a localização, tamanho ou volume. Os métodos presentemente divulgados são úteis para a produção de uma amostra representativa de tecidos normais ou tecidos pré-cancerosos putativos (por exemplo, obtidos de indivíduos com maior risco de desenvolver câncer devido a um risco genético ou um câncer anterior) para identificar células raras.
[025] Em um aspecto, a invenção proporciona um método para a produção de uma amostra biológica adequado para avaliar a heterogeneidade das células dentro de um tumor, nódulo linfático, ou metástases e/ ou avaliar o prognóstico de uma doença cancerosa em particular em um indivíduo e/ ou determinação de um adequado terapêutico protocolo para um sujeito com uma condição cancerosa. Este método compreende (i) a obtenção de um tecido (tal como uma amostra tumoral ou um nódulo linfático ou metástases) que compreende regiões espacialmente distintas do tecido ou que compreende um tumor inteiro ou uma porção substancial deste, e (ii) homogeneizar o tecido tal que a heterogeneidade das células é substancialmente homogeneamente distribuída dentro do material homogeneizado resultante ou uma porção ou fração deste. A amostra ou amostras podem ser fixadas e/ ou conservadas, por exemplo, fixadas em formalina, fixadas em etanol, congeladas ou liofilizadas, armazenadas em cera (como parafina), etc. antes ou depois da homogeneização de um tumor inteiro ou substancialmente inteiro, nódulos linfáticos, metástases ou até mesmo um órgão inteiro, como um rim.
[026] Em outro aspecto, a invenção providencia um método para a produção de uma amostra biológica adequado para avaliar a heterogeneidade de células dentro de uma amostra (tal como uma amostra de tumor, nódulo linfático, metástases ou uma combinação dos mesmos) e/ ou avaliar o prognóstico de um estado canceroso específico em um assunto que compreende: (I) a obtenção de uma ou mais amostras intactas a partir de um tumor sólido ou um nódulo linfático, preferencialmente em que cada amostra intacta compreende, pelo menos, cerca de 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 - 1.000.000.000; 1.000.000.000 - 5.000.000,0000 ou mais células, ou, pelo menos, 1.000; 10.000; 100.000; 1.000.000; 5.000.000; 10.000.000; 50.000.000; 100.000.000; 500.000.000; 1.000.000.000; 5.000.000.000; 10.000.000.000; 50.000.000.000; 100.000.000.000; 500.000.000.000; 1.000.000.000.000; 5.000.000.000.000; 10.000.000.000.000; 50.000.000.000.000; 100.000.000.000.000 ou mais células, e, opcionalmente, fixa ou conservadas (tal como formalina, parafina, ou etanol fixo ou amostra conservada), e (ii) separadamente ou em combinação homogeneizar a uma ou mais amostras, em que o um ou mais materiais homogeneizados de cada uma substancialmente homogeneamente expressa a heterogeneidade da respectiva amostra ou amostras. Em uma forma de realização, a amostra intacta ou amostras de tumor sólido ou o nódulo linfático compreendem ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistir de uma porção do tumor sólido ou o nódulo linfático. Em outra forma de realização, a amostra intacta ou amostras do tumor sólido ou do nódulo linfático compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda em porções substanciais do tumor sólido ou do nódulo linfático. Em uma outra forma de realização, a amostra ou amostras intactas do tumor sólido ou do nódulo linfático compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda no tumor sólido inteiro ou no nódulo linfático inteiro.
[027] As amostras representativas opcionalmente podem ainda ser dissociada e/ ou tratada para remover ou isolar tipos específicos de moléculas, tais como, determinados tipos de células, proteínas, ácidos nucleicos, ou lipídios, e semelhantes e utilizando, por exemplo, análise computacional CAVA da saída de sequenciação Illumina para ser usado em métodos diagnósticos e terapêuticos.
[028] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para a produção de uma amostra biológica adequada para avaliar a heterogeneidade das células dentro de um nódulo ou metástases ou combinação de tumor ou nódulo linfático do mesmo, que compreende (i) obtenção de uma ou mais amostras de biópsia de um tumor sólido ou um nódulo linfático ou metástases, de um modo preferido, em que cada amostra de biópsia compreende pelo menos cerca de 100 - 200; 200 - 1,000; 1,000 - 5,000; 10,000 - 100,000; 100,000 - 1,000,000; 1,000,000 - 5,000,000; 5,000,000 - 1,000,000,000; 1,000,000,000 - 5,000,000,0000, ou alternativamente pelo menos 1,000; 10,000; 100,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000; 10,000,000,000; 50,000,000,000; 100,000,000,000; 500,000,000,000; 1,000,000,000,000; 5,000,000,000,000; 10,000,000,000,000; 50,000,000,000,000; 100,000,000,000,000 ou mais células, e, opcionalmente, fixadas ou conservadas (tal como formalina, parafina, ou etanol fixo ou amostra conservada), e (ii) separadamente ou em combinação homogeneizar a uma ou mais amostras de biópsia, sob condições em que o material homogeneizado resultante ou materiais homogeneizados são substancialmente dissociados em células individuais e os materiais homogeneizados ou materiais homogeneizados resultantes são substancialmente homogêneos.
[029] Em outro aspecto, a invenção providencia um método para a produção de uma amostra biológica adequada para avaliar se um sujeito tem ou está em risco de desenvolver uma forma virulenta de um câncer em particular, e/ ou se um tem uma forma de câncer virulento que compreende (i) a obtenção de uma ou mais amostras de biopsia intactas a partir de um tumor sólido ou um nódulo linfático ou metástases ou cisto pré-canceroso, preferencialmente em que cada amostra de biópsia compreende pelo menos cerca de 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 - 1.000.000.000; 1.000.000.000 - 5.000.000,0000 ou mais células, ou, pelo menos, 1.000; 10.000; 100.000; 1.000.000; 5.000.000; 10.000.000; 50.000.000; 100.000.000; 500.000.000; 1.000.000.000; 5.000.000.000; 10.000.000.000; 50.000.000.000; 100.000.000.000; 500.000.000.000; 1.000.000.000.000; 5.000.000.000.000; 10.000.000.000.000; 50.000.000.000.000; 100.000.000.000.000 ou mais células, e, opcionalmente, fixadas ou conservadas (tal como formalina, parafina, ou etanol fixo ou amostra conservada), e (ii) separadamente ou em combinação homogeneizar a uma ou mais amostras de biópsias, em que os resultantes de um ou mais materiais homogeneizados de cada uma substancialmente contém homogeneamente a heterogeneidade da respectiva amostra de biópsia ou amostras e, opcionalmente, isolar ou detectar a presença de pelo menos um biomarcador. Neste aspecto, a presença ou ausência do biomarcador é indicativa de uma forma virulenta de câncer, ou, alternativamente, a regulação positiva ou negativa do biomarcador está associada a uma forma virulenta do câncer em particular.
[030] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para caracterizar uma paisagem dentro de um tumor heterogêneo, nódulos linfáticos ou metástases ou cisto pré-canceroso e/ ou detectar subclones geneticamente distintos dentro de um nódulo linfático tumoral heterogêneo ou metástase ou cisto pré-canceroso e/ ou identificação de acontecimentos de baixa prevalência nos nódulos linfáticos ou metástases tumorais ou cisto pré- cancerígeno e/ ou determinação da prevalência de alvos nos nódulos linfáticos tumorais ou metástases ou cisto pré-canceroso incluindo (i) a obtenção de uma amostra ou amostras dos nódulos linfáticos ou metástases ou cisto pré- cancerígeno que engloba regiões espacialmente distintas dos nódulos linfáticos tumorais ou metástases ou cisto pré-canceroso, que é ou são opcionalmente fixados ou preservados antes da homogeneização, por exemplo, com formalina, parafina e/ ou etanol e (ii) homogeneização as amostras dos nódulos linfáticos ou metástases ou cisto pré-canceroso ou amostras separadamente, produzindo assim um conjunto de materiais homogeneizados que é representativo da paisagem da heterogeneidade dentro do tumor, nódulos linfáticos, metástases ou cisto pré-canceroso e é adequada para caracterizar a paisagem do tumor e/ ou detectar subclones geneticamente distintos dentro de um nódulo linfático heterogêneo ou metástase tumoral ou cisto pré-canceroso e/ ou identificar eventos de prevalência dentro de um tumor ou nódulos linfáticos ou metástases ou cisto pré-cancerígeno e/ ou determinar a prevalência de alvos dentro de um nódulo linfático tumoral ou metástases ou cisto pré-cancerígeno. Estas paisagens se relacionam com a diversidade genômica (por exemplo, o número de mutações pontuais, inserções e deleções dentro do tumor), a diversidade de fenótipos tumorais (por exemplo, quantidade do tumor que sofreu transição epitelial para mesênquima), diversidade na resposta imune do hospedeiro (por exemplo, a diversidade da expressão dos reguladores do ponto de verificação imunológico nas células tumorais e imunes), a diversidade de todos os mecanismos potenciais de resistência (por exemplo, o número e a diversidade das mutações tumorais que conferem resistência à terapia direcionada), a diversidade de histologia de tecidos (por exemplo, quantidade do tumor que é escamoso vs. adenocarcinoma no câncer de pulmão), a diversidade de neo- antígenos expressos pelo tumor e/ ou outras paisagens fenotípicas, morfológicas, histológicas, genômicas, proteômicas e metabolômicas complexas todos os tecidos afetados ou potencialmente afetados que são ressecados de um indivíduo.
[031] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um método para detectar células pré-cancerosas ou células cancerígenas em tecidos supostamente normais ou tecidos pré-cancerosos putativos em um paciente, por exemplo, em risco de desenvolver câncer devido a uma mutação genética ou câncer anterior, ou um paciente com cistos ou pólipos pré-cancerosos que compreende (i) a obtenção de uma amostra ou amostras de tecidos supostamente normais ou tecidos pré-cancerosos putativos, tais como, cistos ou pólipos pré-cancerosos que abrangem regiões espacialmente distintas dos tecidos supostamente normais ou tecidos pré-cancerosos putativos do paciente, que é opcionalmente fixa ou preservada antes da homogeneização, e (ii) homogeneizar a amostra ou amostras, produzindo assim um material homogeneizado que seja representativo dos supostos tecidos normais ou supostos tecidos pré-cancerosos e que seja adequado para detectar células cancerosas raras ou células-tronco cancerosas, por exemplo, mesmo antes de qualquer sinal de doença se manifestar no paciente.
[032] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de utilização de amostras representativas e porções dos mesmos produzidos por qualquer um dos métodos anteriores em diferentes formatos de ensaio, em que estes ensaios podem ser efetuados em elevado rendimento, realizados simultaneamente ou em alturas ou locais diferentes, e/ ou por automação (totalmente automatizada ou semiautomatizada).
[033] Em outro aspecto, a invenção proporciona amostras representativas ou porções dos mesmos produzidas pelos qualquer dos métodos anteriores que são armazenados para utilização futura, exemplos não limitativos de tais incluem, por exemplo, congelados, fixados em formol, incluídos em parafina, processados com etanol ou liofilizado.
[034] Em outro aspecto, a invenção providência amostras representativas ou suas porções produzidas pela qualquer um dos métodos anteriores são usadas para derivar (e, opcionalmente, purificar) anticorpos ou antígenos específicos de um antígeno específico a partir de uma célula de câncer ou tipos de células em uma amostra do doente, quais anticorpos ou antígenos potencialmente podem ser usados em medicina personalizada, isto é, na produção de vacinas contra o câncer terapêutico ou profilático.
[035] O passo de homogeneização em todos os métodos acima mencionados pode ser efetuado por um método que preserve a integridade das células dentro da amostra, ou seja, a maior parte das células dentro da amostra ou amostras homogeneizadas não são lisadas e pelo que o resultante material homogeneizado e suas partes são “representativas” da amostra ou amostras. Portanto, as células dentro da amostra ou uma porção do mesmo refletir as percentagens dos diferentes tipos de células no interior da totalidade da amostra de tecido ou amostras de, por exemplo, um tumor sólido ou um nódulo linfático. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por dissociação mecânica da amostra de tumor ou uma sua porção (tal como dissociação mecânica realizada com ou sem a adição de líquido para a amostra de tumor ou uma porção da mesma) e/ ou químicas ou dissociação enzimática do amostra de tumor ou uma sua porção (tal como o tratamento com uma enzima que seletivamente ou, de preferência ou principalmente atua sobre as proteínas da arranjo extracelular, em comparação com as proteínas associadas à membrana). Alternativamente, os métodos de homogeneização podem resultar na dissociação das células enquanto ainda geram uma amostra que é representativa do tecido de partida, tal como, um tumor inteiro. As amostras representativas homogeneizadas opcionalmente podem ainda ser dissociado e/ ou tratado para remover ou isolar tipos específicos de moléculas, tais como, determinados tipos de células, proteínas, ácidos nucleicos ou lipídios, e semelhantes, gerando, assim, outras amostras representativas que podem ser utilizados em diagnóstico e terapêutica métodos.
[036] Qualquer dos métodos acima mencionados pode incluir a detecção da expressão de, pelo menos, um biomarcador, por exemplo, pelo menos um lipídio, proteína, biomarcador ou ácido nucleico, no material homogeneizado ou uma porção ou fração. Adicionalmente, os métodos podem ainda incluir a detecção da percentagem de células tumorais no material homogeneizado ou uma porção ou fração destas que expressam um biomarcador particular ou combinação de biomarcadores. Opcionalmente, as células estaminais tumorais e/ ou a frequência relativa ou percentagem de subclones tumorais no material homogeneizado ou uma porção ou fração deste são detectadas e/ ou isoladas. Adicionalmente, os métodos podem também incluir a detecção de um alvo genético (tal como uma mutação pontual, uma deleção, uma inserção, uma translocação, uma fusão genética ou uma amplificação de um gene).
[037] Qualquer um dos métodos anteriores pode também ser utilizado para detectar, isolar e/ ou quantificar células imunes específicas (tais como linfócitos B, linfócitos T, macrófagos, células NK, monócitos ou uma sua combinação) presentes no material homogeneizado ou em uma porção ou sua fração, que fornece informações clínicas valiosas, por exemplo, estado imunológico e estado de doença, e também para selecionar protocolos de tratamento adequados, tais como, inibidores de ponto de verificação, citocinas ou outros moduladores imunológicos.
[038] Os materiais homogeneizados resultantes ou amostras representativas podem compreender, consistir essencialmente em, ou ainda consistir ainda em cerca de 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 - 1.000.000.000; 1.000.000.000 - 5.000.000,0000 células ou, alternativamente, pelo menos 1.000; 10.000; 100.000; 1.000.000; 5.000.000; 10.000.000; 50.000.000; 100.000.000; 500.000.000; 1.000.000.000; 5.000.000.000; 10.000.000.000; 50.000.000.000; 100.000.000.000; 500.000.000.000; 1.000.000.000.000; 5.000.000.000.000; 10.000.000.000.000; 50.000.000.000.000; 100.000.000.000.000 ou mais células.
[039] Os materiais homogeneizados resultantes ou uma fração ou porção da mesma, opcionalmente, podem ser congeladas ou liofilizadas, incluído em cera (tal como parafina) ou, alternativamente, usado em outros passos sem tais congelação ou secagem por congelação ou cera. Por exemplo, um bloco parafínico representativo, produzido a partir de um material homogeneizado ou uma fração ou porção dele incluída em parafina, é adequado para uso no fluxo de trabalho de patologia anatômica atual, por exemplo, seccionamento, preparação de lâminas, coloração, microscopia, recuperação antigênica, etc.
[040] Os materiais homogeneizados podem ser derivados de dois ou mais tumores retirados de um ou mais sujeitos ao mesmo tempo de diferentes pontos de tempo (por exemplo, o mesmo sujeito antes ou depois do tratamento ou sujeitos múltiplos antes e depois dos mesmos ou diferentes tratamentos um do outro), e os materiais homogeneizados resultantes ou suas frações de cada tumor são utilizados para avaliar as semelhanças e/ ou diferenças dos dois ou mais tumores ou estados de doença de diferentes pacientes. Em um aspecto adicional, os materiais homogeneizados de um ou mais sujeitos podem ser combinados para os propósitos de uma amostra representativa de múltiplos sujeitos.
[041] Os materiais homogeneizados podem ser derivados de dois ou mais tecidos normais ou pré-cancerosos putativos, por exemplo, cistos ou pólipos de mama, cervicais, colorretais ou pré-cancerosos obtidos de um indivíduo ou de múltiplos sujeitos, por exemplo, um com uma mutação BRCA e os materiais homogeneizados ou frações resultantes do mesmo utilizado para avaliar se estão presentes quaisquer células anormais ou biomarcadores de doenças.
[042] Além disso, as células não humanas (tais como células de inseto e/ ou de células de rato) ou outras proteínas estranhas, ácidos nucleicos, ou moléculas pequenas podem ser adicionados ao material homogeneizado para criar um controlo interno para a proteína positiva ou detecção de ácido nucleico.
[043] Moléculas pequenas (como haptenos, marcadores de peptídios, marcadores de proteínas, marcadores fluorescentes e/ ou marcadores de ácido nucléico) podem ser adicionadas à amostra e usadas para fornecer informações espaciais na amostra representativa. Por exemplo, uma amostra (como um tumor ou nódulo linfático) pode ser selecionada, por exemplo, cortada em quadrantes, e um hapteno diferente (ou outra pequena molécula adequada) pode ser “dopado” em cada seção antes de homogeneizar as seções para gerar um exemplo representativo. Deve ser entendido que o número de seções que podem ser geradas a partir de cada amostra para “doping” antes da homogeneização não é limitado, mas, provavelmente, selecionado em escala com o tamanho da amostra, ou seja, quanto maior a amostra, maior o número de seções que podem ser “marcadas” com uma pequena molécula antes da homogeneização. Deste modo, a informação espacial pode ser mantida nos materiais homogeneizados resultantes ou nas suas frações.
[044] Em uma forma de realização, as moléculas pequenas podem também ser adicionados à amostra antes de se combinar a amostra com uma amostra diferente de um outro paciente ou o mesmo paciente e, assim, proporciona um meio para diferenciar amostras quando executado em um formato de ensaio multiplex.
[045] As amostras que são homogeneizadas podem ser conservadas, por exemplo, fixadas em formalina, ou podem ou ser tratadas com etanol antes ou depois da homogeneização. Devido a questões de segurança, as amostras de tecido são geralmente formalina ou fixadas de outra forma antes de serem processadas usando a análise computacional CAVA da saída de sequenciamento Illumina de um laboratório de patologia antes de serem usadas na maioria dos métodos diagnósticos. A formalina ou outros métodos de fixação podem ser realizados por técnicas que são geralmente conhecidas na técnica. Em tais casos, a amostra de tumor fixada em formalina pode ser incluída em água ou solução salina tamponada (tal como PBS) antes da homogeneização no passo (ii).
[046] Alternativamente, ou adicionalmente, a amostra de tumor utilizada nos métodos divulgados pode ser preservada em etanol antes da homogeneização. No entanto, a fixação de formalina, a fixação com metanol ou etanol ou outros procedimentos de conservação não são essenciais para os métodos em questão e podem ser eliminados sem comprometer a adequação da amostra representativa homogeneizada resultante.
[047] A homogeneização de tecido não fixado pode ser utilizada para produzir uma amostra viva representativa. Uma amostra representativa viva pode ser cultivada para criar uma amostra de cultura de tecidos representativa de pacientes individuais. Essa amostra representativa pode ser dividida várias vezes para criar múltiplas amostras de cultura representativas, que podem ser usadas para determinar a eficácia da quimioterapia (como um anticorpo, ácido nucléico, molécula pequena ou polipeptídio, que antagoniza, inibe ou bloqueia a expressão ou atividade funcional de pelo menos um biomarcador conhecido ou desconhecido). Além disso, tipos específicos de células (tais como células imunes ou células tumorais) podem ser selecionados usando análise FACS. Por exemplo, as células imunes infiltradas no tumor podem ser selecionadas e cultivadas para determinar os anticorpos específicos do tumor que são secretados pelo sistema imunitário.
[048] Também, como aqui mostrado, os métodos divulgados para produzir amostras representativas e a sua utilização em métodos de diagnóstico e terapêuticos são adequados para amostras de tecidos fixos e não fixados.
[049] Qualquer um dos métodos divulgados para a preparação de uma amostra representativa pode incluir a adição de pelo menos uma colagenase (ou outra combinação enzimática ou enzimática adequada ou outro produto químico, tal como, um sal que se decomponha ou que facilite a quebra da arranjo extracelular) antes, durante ou após a homogeneização; a utilização de condições de temperatura e/ ou tampão elevadas (tais como um tampão de condicionamento de células, por exemplo, CC1 ou CC2, que perturba ligações cruzadas celulares); e/ ou o uso de um dispositivo para cisalhamento mecânico (como um liquidificador IKA, um desassociador suave de MACs ou um equivalente funcional). Mais uma vez, estes métodos podem ou não ser afetado, sob condições que mantêm a viabilidade e a integridade das células no interior da amostra, por exemplo, sob algumas condições de homogeneização das células substancialmente não são lisadas.
[050] Em um aspecto, os processos de homogeneização compreendem o uso de um processo mecânico, exemplos não limitantes incluem almofariz e pilão, um material homogeneizador dounce ou moinho de tecidos, um material homogeneizador eletrônico de tecido de lâmina rotativa manual (como o Omni-TH disponível pela Thomas Scientific), um material homogeneizador de batimento de esferas (tal como um misturador de balas ou um homogeneizador de tecidos Burton Precellys 24 ou um ruptor de contas disponível pela OMNI), opcionalmente a uma velocidade entre cerca de 100 e cerca de 75.000 RPM para material homogeneizadores rotativos ou uma velocidade de cerca de 0,5 m/s a cerca de 2,5 m/s para batedores de contas, e durante um comprimento de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos, cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos, cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos ou cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos. Como notado aqui, o processo de homogeneização mecânica pode ser usado sozinho ou em combinação com outros processos.
[051] Em outra forma de realização, a homogeneização compreende, por si só ou em combinação com outros processos, a utilização de uma preparação de enzima, os exemplos não limitativos de tais incluem, por exemplo, colagenase intersticial, gelatinase-A, estromelisina 1, matrilisina, Neutrófilos colagenase, gelatinase-B, Estromelisina 2, Estromelisina 3, Metaloelastase Macrófago, Colagenase 3, MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, Colagenase 4, Enamelisina, X-MMP, CA - MMP, MT5-MMP, MT6- MMP, Matrilisina-2, MMP-22, endoproteinase, tripsina, quimotripsina, endoproteinase Asp-N, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Glu-C (proteinase V8), endoproteinase Lys-C, pepsina, termolisina, elastase, papaína, proteinase K, subtilisina, clostripaína, exopeptidase, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B, carboxipeptidase P, carboxipeptidase Y, catepsina C, acilamino-ácido-enzima libertadora, piroglutamatoaminopeptidase, ou qualquer combinação dos mesmos, opcionalmente, a uma concentração de cerca de 0,001 μg/ml a cerca de 1000 mg/ml, e para um comprimento de cerca de 1 minuto a cerca de 120 minutos.
[052] O tumor ou outra amostra utilizada nos métodos divulgados que englobam regiões espacialmente distintas do tumor ou outro tecido podem compreender pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, pelo menos 85 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou, de preferência, a totalidade de uma amostra de tumor ou tecido removida cirurgicamente de um paciente. A amostra do tumor pode ter pelo menos 1, 5, 10, 20, 50, 100 ou mais milímetros (mm) ou centímetros (cm) de diâmetro.
[053] As amostras utilizadas nos métodos em questão serão geralmente derivadas de qualquer amostra de tecido apropriada, por exemplo, um tumor sólido ou tumores (incluindo tumores primários e tumores metastáticos), nódulos linfáticos, metástases ou tecidos pré-cancerosos, tais como, cistos ou pólipos. Alternativamente, ou adicionalmente, os métodos podem também ser eficazes com tumores não sólidos, por exemplo, cânceres do sangue. Por exemplo, as amostras de tecido ou amostras de tumor sólido que são homogeneizadas opcionalmente podem ser combinadas com amostras de pacientes líquidos, por exemplo, sangue, fluido linfático, amostras de efusão, fluido cerebrospinal, bílis, muco e/ ou amostras de urina do paciente. As amostras que são homogeneizadas podem, adicional ou alternativamente, compreender amostras completas ou parciais, por exemplo, um tecido “normal” ou pré-canceroso por biópsia, por exemplo, para detectar células doentes antes da manifestação da doença.
[054] Tal tumor ou outra amostra de tecido ou amostras utilizadas nos métodos divulgados podem ser derivados de qualquer fonte, por exemplo, de mama, cólon, pulmão, pâncreas, vesícula biliar, pele, osso, músculo, fígado, rim, colo do útero, ovário, próstata, esôfago, estômago, ou outros órgãos, por exemplo, um tumor do câncer da mama, um tumor do câncer do pulmão, tumor hepático, um tumor do câncer da próstata, um tumor do câncer do cólon, um tumor do câncer da bexiga, um tumor ou câncer do rim. Em uma forma de realização, a amostra de tumor ou outro tecido utilizado nos métodos divulgados são de origem humana, mas pode ser de qualquer fonte de tecido apropriada.
[055] O tumor ou outra amostra de tecido utilizada nos métodos divulgados pode ter um volume de pelo menos 1 cm3, pelo menos 2 cm3, pelo menos 3 cm3, pelo menos 4 cm3, pelo menos 5 cm3, pelo menos 6 cm3, pelo menos 7 cm3 pelo menos 8 cm3, pelo menos 9 cm3, pelo menos 10 cm3, pelo menos 15 cm3, pelo menos 20 cm3, pelo menos 25 cm3, pelo menos 50 cm3, pelo menos 100 cm3, pelo menos 250 cm3, pelo menos 500 cm3, pelo menos 1.000 cm3, pelo menos 2.500 cm3, pelo menos 5.000 cm3, pelo menos 7.500 cm3, pelo menos 10.000 cm3 ou maiores.
[056] O tumor ou outra amostra de tecido utilizada no método divulgado pode ter uma largura no ponto mais largo de pelo menos 0,5 cm, pelo menos 1 cm, pelo menos 1,5 cm, pelo menos 2 cm, pelo menos 2,5 cm, pelo menos 3 cm, pelo menos 3,5 cm, pelo menos 4 cm, pelo menos 4,5 cm, pelo menos 5 cm, pelo menos 6 cm, pelo menos 7 cm, pelo menos 10 cm, pelo menos 25 cm, pelo menos 50 cm ou maiores.
[057] Em uma forma de realização adicional, podem ser feitas amostras representativas de tecido previamente fixado em formol e incluído em cera de parafina. Em particular, a cera pode ser fundida, o tecido recuperado e hidratado, e depois os métodos aqui descritos, isto é, a homogeneização, aplicada à amostra, que é adequada para utilização em qualquer número de ensaios. Deste modo, os métodos divulgados podem ser utilizados para gerar uma amostra representativa utilizando uma amostra ou amostras já preparadas para o estágio de TNM, por fusão da cera, recuperação da amostra, reidratação do tecido e homogeneização em conformidade.
[058] Qualquer um dos métodos anteriores pode ainda compreender (iii) distribuição do material homogeneizado ou uma porção ou fração em um ou mais lâminas ou outros suportes sólidos e, opcionalmente, manchando as uma ou mais lâminas ou outros suportes sólidos contendo o material homogeneizado ou uma porção ou sua fração com coloração de hematoxilina e eosina; realização de coloração imuno-histoquímica no lâmina ou outro suporte sólido contendo o material homogeneizado ou uma porção ou fração do mesmo; ou realizar hibridação in situ sobre a lâmina ou outro suporte sólido contendo o material homogeneizado ou uma porção ou fração do mesmo, isto é, qualquer uma das quais poderia ser considerado o passo (iv) nos métodos. Por exemplo, o material homogeneizado ou uma parte dele pode ser analisado em uma plataforma automatizada para análise. Tais plataformas são conhecidas na técnica e comercialmente disponíveis na Ventana Medical Systems, Inc. (ver Ventana.com para plataformas automatizadas exemplares).
[059] Além disso, qualquer um dos métodos anteriores pode ainda compreender (iii) purificar ácidos nucleicos (tais como DNA ou mRNA) a partir do material homogeneizado ou uma porção ou fração. Os ácidos nucleicos purificados podem ser sujeitos a Northern blot, sequenciação de DNA, PCR, RT- PCR, de perfis de micro arranjo, apresentação diferencial, ou hibridação in situ. Alternativamente, o ácido nucleico purificado pode ser conjugado com uma nanopartícula (tais como pontos quânticos, nanopartículas paramagnéticas, nanopartículas super paramagnéticas, e nanopartículas metálicas, pontos quânticos de preferência, de liga, incluindo a título de exemplo e sem limitação, CdSe, ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs, e InGaN, por como exemplo).
[060] Está também contemplado que qualquer um dos métodos acima pode ainda compreender lipídios purificadores ou exossomos ou outras organelas do material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. Os lipídios purificados podem ser sujeitos a espectrometria de massa ou histoquímica.
[061] Além disso, é também contemplado que qualquer um dos métodos acima pode ainda compreender a purificação de proteínas a partir do material homogeneizado ou uma porção ou fração. As proteínas purificadas podem ser submetidas a Western blot, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), imunoprecipitação, cromatografia, espectrometria de massa, perfil micro arranjo, interferometria, coloração eletroforética ou coloração imuno- histoquímica. Alternativamente, ou para além do precedente, as proteínas purificadas podem ser utilizadas para produzir antissoros específicos para o tumor ou amostra de tecido.
[062] Além disso, está contemplado que qualquer um dos métodos acima compreende ainda (iii) realizar uma análise genômica, epigenômica, transcriptômica, proteômica e/ ou metabolômica no material homogeneizado ou em uma porção ou fração deste.
[063] Além disso, está contemplado que qualquer um dos métodos acima compreende ainda (iii) tipos de células específicas de purificação por afinidade do homogeneizado ou uma porção ou sua fração. Os tipos de células específicos podem conter um biomarcador de interesse. Biomarcadores exemplares de interesse podem incluir Her2, bRaf, uma amplificação de ERBB2, uma mutação Pl3KCA, uma amplificação de FGFR2, uma mutação p53, uma mutação BRCA, uma amplificação CCND1, uma mutação MAP2K4, uma mutação ATR ou qualquer outro biomarcador cuja expressão está correlacionado com um câncer específico; pelo menos um de AFP, ALK, BCR- ABL, BRCA1 / BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER / Pr, UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT e TMPRSS2; ou pelo menos um biomarcador selecionado de ABCB5, AFP-L3, alfa-fetoproteína, alfa-metil acil-CoA racemase, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA-125, CA15-3, CA19-9, Calcitonina, Antígeno Carcinoembrionário, Antígeno Carcinoembriônico Peptídeo 1, Protrombina Desgama carboxila, Desmin, Antígeno 2 de Câncer de Próstata Precoce, Receptor de Estrogênio, Produto de degradação de Fibrina, Glicose-6-fosfato isomerase, Antígeno de HPV tal como vE6 , E7, L1, L2 ou p16INK4a Gonadotrofina coriônica humana, IL-6, Queratina 19, Lactato desidrogenase, Leucil aminopeptidase, Lipotropina, Metanefrinas, Neprilisina, NMP22, Normetanefrina, PCA3, Antígeno prostático específico, Fosfatase ácida prostática, Sinaptofisina, Tiroglobulina, TNF, um fator de transcrição selecionado a partir de ERG, ETV1 (ER81), FL1, ETS1, ETS2, ELK1, ETV6 (TEL1), ETV7 (TEL2), GABPa, ELF1, ETV4 (E1AF; PEA3), ETV5 (ERM), ERF, PEA3 / E1AF, PU.1, ESE1 / ESX, SAP1 (ELK4), ETV3 (METS), EWS / FL1, ESE1, ESE2 (ELF5), ESE3, PDEF, NET (ELK3; SAP2), NERF (ELF2) ou FEV, associação tumoral glicoproteína 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit e vimentina..
[064] Alternativamente, ou adicionalmente, o biomarcador de interesse pode ser um inibidor do ponto de verificação imunológico, tal como, mas não limitado a, CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, a LAG-3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN- 15049, CHK 1, Chk2, A2aR, TL1A, e B-7 ligandos da família ou uma combinação dos mesmos, ou é um ligando de uma proteína posto selecionado a partir do grupo constituo por CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B- 7 ligandos da família, ou uma combinação dos mesmos.
[065] Os métodos desta invenção também podem compreender ou incluir a detecção de pelo menos um biomarcador associado a leucemia linfoblástica aguda (etv6, am11, ciclofilina b), linfoma de células B (Ig idiotípico), glioma (E-caderina, .alfa. catenina, beta-catenina, .gama.-catenina, p120 ctn), câncer de bexiga (p21ras), câncer biliar (p21ras), câncer de mama (família MUC, HER2/ neu, c-erbB-2), carcinoma cervical (p53, p21ras), carcinoma do cólon (p21ras, HER2/ neu, c-erbB-2, família MUC), câncer colorretal (antígeno colorretal associado (CRC) -C017-1A/ GA733, APC), coriocarcinoma (CEA), célula epitelial câncer (ciclofilina b), câncer gástrico (HER2/ neu, c-erbB-2, ga733 glicoproteína), câncer hepatocelular (a-fetoproteína), linfoma de Hodgkin (Imp-1, EBNA - 1), câncer do pulmão (CEA, MAGE- 3, NY-ESO-1), leucemia derivada de células linfoides (ciclofilina b), melanoma (proteína p5, gp75, antígeno oncofetal, gangliosídeos GM2 e GD2, melan-A/ MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100.sup.Pmel117), mieloma (família MUC, p21ras), não carcinoma de pulmão de pequenas células (HER2/ neu, c-erbB-2), câncer de nasofaringe (Imp- 1, EBNA - 1), câncer de ovário (família MUC, HER2/ neu, c-erbB-2), câncer de próstata (Antígeno Prostático Específico (PSA) e seus epítopos antigênicos PSA - 1, PSA - 2 e PSA - 3, PSMA, HER2/ neu, c-erbB-2, ga733 glicoproteína), câncer renal (HER2/ neu, c-erbB- 2), cânceres de células escamosas do colo do útero e do esófago (produtos virais, tais como, proteínas do vírus do papiloma humano), câncer testicular (NY-ESO-1) e/ ou leucemia de células T (epítopos do HTLV-1).
[066] Os métodos da presente invenção compreendem ainda (iii) tratar o material homogeneizado ou uma porção ou fração com colagenase ou outra enzima ou químico ou combinação do mesmo que se decompõe arranjos extracelulares, incubação do material homogeneizado ou uma porção ou fração do mesmo sob condições de temperatura elevada, e/ ou mecanicamente agitando o material homogeneizado ou uma porção ou fração do mesmo, a fim de dissociar as células dentro do material homogeneizado ou uma porção ou fração. Geralmente, estes métodos irão gerar uma população de células individuais, ou pequenos aglomerados de células da amostra representativa que podem ser utilizados nos métodos analíticos ou terapêuticos divulgados ou uma combinação destes.
[067] Adicionalmente, qualquer um dos métodos acima mencionados compreende ainda (iii) filtrar ou dimensionar o material homogeneizado ou uma porção ou sua fração, o que pode resultar na obtenção de células individuais ou pequenos aglomerados de células, tais como, dupletos ou tripletos.
[068] A componente celular da amostra representativa pode ser separada por um ou vários passos de filtração. Por exemplo, após a homogeneização e dissociação do material homogeneizado através de meios físicos e/ ou bioquímicos, a amostra desassociada pode ser filtrada através de um filtro de 1 mícron para remover todo o material celular intacto. Espera-se que a amostra representativa não celular contenha fatores segregados do tumor e estroma normal de dentro do tumor que sejam de utilidade clínica, ou seja, anticorpos, fatores de crescimento, imunomoduladores e outros fatores desconhecidos. A amostra representativa não celular pode ser analisada por ELISA, espectrometria de massa, sequenciamento de nova geração e outros métodos de diagnóstico. Na medida em que as células individuais derivadas da amostra representativa são obtidas após filtração, essas células podem ser analisadas utilizando análise de fluorescência de células ativadas (FACS) e citometria de fluxo.
[069] Dada a natureza representativa do material homogeneizado gerado pelos métodos descritos, o material homogeneizado ou uma porção ou fração do mesmo pode ser utilizado para detectar um evento de baixa prevalência genética (tal como um acontecimento genético que ocorre com uma prevalência de 20 %, prevalência de 15 %, prevalência de 10 %, prevalência de 5 %, prevalência de 2 %, prevalência de 1 %, prevalência de 0,5 %, 0,1 % de prevalência, prevalência de 0,001 %, prevalência de 0,001 %, prevalência de 0,0001 %, prevalência de 0,00001 %, Prevalência de 0,000001 % ou menos). Exemplos de eventos genéticos incluem uma mutação pontual, uma deleção, uma adição, uma translocação, uma fusão genética ou uma amplificação de um gene. Além disso, os métodos também podem envolver a detecção de heterogeneidade genética ou epigenético dentro da amostra de tumor ou uma porção da mesma que compreende e/ ou células de detecção de variações genéticas raras ou epigenético. Tais células podem estar presentes na amostra de tumor com uma frequência de menos do que 5 %, menos do que 1 %, menor do que 0,5 %, menos do que 0,1 %, menos do que 0,05 % ou menos do que 0,01 %.
[070] As células raras detectadas podem compreender uma ou mais diferenças genéticas ou epigênicas que conferem resistência a uma terapia, uma sensibilidade a uma terapia em detrimento de outro, uma terapia anticâncer e/ ou promover a metástase. Por conseguinte, em um aspecto, a detecção de tais células facilitará o prognóstico do câncer, bem como a seleção de um regime terapêutico apropriado, tal como, quimioterapia, terapia dirigida combinada e/ ou a utilização de agentes biológicos.
[071] Os métodos anteriores podem também incluir a utilização de pelo menos um marcador detectável selecionada a partir de moléculas fluorescentes ou fluorocromos, tais como, 4- acetamido- 4’- isotiocianatoestilbeno- 2,2’disulfonic ácido, acridina e derivados, tais como, acridina e de isotiocianato de acridina, 5- Ácido (2’- aminoetil) aminonaftaleno- 1- sulfúrico (EDANS), 4- amino- N- [3- vinilsulfonil) fenil] naftalimida- 3,5- dissulfonato (Lucifer Yellow VS), N- (4- anilino- 1- naftil) maleimida, antranilamida, Amarelo Brilhante, cumarina e derivados, tais como, cumarina, 7- amino- 4- metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7- amino- 4-trifluorometilcuuarina (Coumaran 151); cianose; 4’, 6- diaminidino- 2- fenilindol (DAPI); 5’, 5’’- dibromopirogalol- sulfonaftaleína (Vermelho de Bromopirogalol); 7- dietilamino- 3- (4’- isotiocianatofenil) - 4- metilcumarina; pentaacetato de dietilenotriamina; Ácido 4,4’- diisotiocianatodi- hidro- estilbeno- 2,2’- dissulfônico; Ácido 4,4’- diisotiocianatostilbeno- 2,2’- dissulfônico; Cloreto de 5- [dimetilamino] naftaleno- 1- sulfonila (DNS, cloreto de dansilo); Ácido 4- (4’ -dimetilaminofenilazo) benzílico (DABCYL); 4- dimetilaminofenilazofenil- 4’- isotiocianato (DABITC); eosina e derivados, tais como, isotiocianato de eosina e eosina; eritrosina e derivados, tais como, eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etídio; fluoresceína e derivados, tais como, 5- carboxifluoresceina (FAM), 5- (4,6- diclorotriazin- 2- il) amino fluoresceína (DTAF), 2’7’- dimetoxi- 4’5’- dicloro- 6- carboxifluoresceina (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e QFITC (XRITC); 2’, 7’- difluorofluoresceína (OREGON GREEN®); fluorescamina; IR144; IR1446; Isotiocianato de malaquita verde; 4- metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Vermelho de fenol; B- ficoeritrina; o- ftaldialdeído; pireno e derivados, tais como, pireno, butirato de pireno e butirato de succinimidil 1- pireno; Vermelho Reativo 4 (Cibacron® Vermelho Brilhante 3B- A); rodamina e derivados, tais como, 6- carboxi- X- rodamina (ROX), 6- carboxirrodamina (R6G), lisamina rodamina B cloreto de sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, rodamina verde, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 e derivado de cloreto de sulfonila de sulforrodamina 101 (Texas Red); N, N, não’, N’- tetrametil- 6- carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil- rodamina (TRITC); riboflavina; ácido quaternário e derivados de quelato de térbio, quelatos de európio reagentes com tiol que emitem a aproximadamente 617 nm
[072] Os métodos divulgados podem ser automatizados, no todo ou em parte. Por exemplo, os passos (i) e (ii) podem ser automatizados, mas quaisquer passos subsequentes, por exemplo, passos (iii) e (iv), são manuais. Alternativamente, a título de exemplo, os passos (i) e (ii) podem ser manuais, enquanto os passos subsequentes, por exemplo, os passos (iii) e (iv), são automatizados. Além disso, todas as etapas abrangidas pelos métodos podem ser automatizadas, de modo que os métodos sejam totalmente automatizados.
[073] Os métodos revelados podem ser utilizados, isoladamente ou em combinação com outros métodos conhecidos (tais como TNM), para estágio do tumor. Em um aspecto, os métodos compreendem ainda a avaliação de um ou mais aspectos da amostra representativa do tumor e a extensão em que as células tumorais se espalharam para os nódulos linfáticos regionais através da análise da amostra representativa dos nódulos linfáticos ressecados para prever a probabilidade da recorrência e/ ou progressão da doença.
[074] Os métodos divulgados podem ainda compreender a utilização de um algoritmo para calcular a percentagem de células amostradas, por exemplo, células tumorais com ou sem um biomarcador específico. O risco relativo de progressão metastática (ou subclone virulento) pode ser determinado com base na percentagem de células dentro de uma amostra de tumor representativa e/ ou amostra linfonodal representativa com biomarcadores detectáveis específicos, ou combinação de biomarcadores.
[075] Os métodos revelados podem ainda compreender o desenvolvimento de uma dosagem ou regime de tratamento personalizados com base no perfil do biomarcador, no perfil do antígeno, no perfil mutacional, no perfil lipídico, no perfil proteico e/ ou no perfil exossomo contido na amostra representativa. Por exemplo, com base nas informações contidas na amostra representativa, ou em combinação com informações obtidas de uma amostra de nódulo linfático representativa, a seleção de um ou mais medicamentos e/ ou dosagem (quantidade, tempo de administração, etc.) de tais drogas administrado a um paciente pode ser modificado para personalizar o tratamento com base no tecido individual do paciente ou no perfil do câncer.
[076] Os métodos divulgados podem ainda compreender a comparação do perfil genômico da amostra representativa ao perfil genômico de uma amostra de tecido representativa do paciente da amostra ou outro paciente, por exemplo, amostra de nódulos linfáticos, e opcionalmente comparar estes perfis ao DNA de tumor circulante de qualquer metástase ou uma amostra tumoral metastática representativa.
[077] Os métodos revelados podem ainda compreender o desenvolvimento de critérios de inclusão para um ensaio clínico com base no perfil do biomarcador, o perfil do antígeno, o perfil mutacional, o perfil lipídico, o perfil proteico e/ ou o perfil exossomo contido na amostra representativa.
[078] A presente descrição também abrange as composições homogeneizadas representativas produzidas por qualquer um dos métodos anteriores, isoladamente ou em combinação com outras composições e veículos.
[079] Além disso, os resultados dos métodos anteriores (tais como a detecção de eventos genéticos e/ ou epigenéticos raros, células raras, etc.) ou composições produzidas por qualquer um dos métodos anteriores, que envolvem a homogeneização de uma amostra, como uma amostra de tumor para preparar uma amostra representativa adequada para análise posterior usando qualquer número de ensaios de diagnóstico padrão, pode ser usado na seleção de um regime terapêutico apropriado para um paciente com câncer O regime terapêutico pode incluir terapia gênica, quimioterapia, uma pequena molécula direcionada, outras terapias direcionadas, administração imunomoduladora, radiação, administração de citocina, cirurgia ou uma sua combinação.
[080] Além disso, os métodos revelados podem ser utilizados para selecionar pelo menos um agente terapêutico (tal como terapia gênica (por exemplo, CRISPR), terapia com células T (por exemplo, célula T CAR), um anticorpo, ácido nucleico, molécula pequena ou polipeptídio, que antagoniza, inibe ou bloqueia a expressão ou atividade funcional de pelo menos um biomarcador detectado) adequado para utilização em um sujeito cuja amostra ou tumor foi a fonte para a amostra representativa gerada pelos métodos proporcionados.
[081] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um modo para preparar uma amostra representativa para análise, que compreende (1) obtenção de uma amostra de tecido de ressecção cirúrgica de pelo menos um indivíduo; e (2) homogeneizar a amostra de tecido de ressecção cirúrgica para obter uma amostra homogeneizada. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção da amostra de tecido de ressecção cirúrgica é fixa. Em uma forma de realização adicional, o modo compreende ainda o processamento de uma primeira porção da amostra de ressecção cirúrgica e a geração de um ou mais blocos de tecido incluídos fixos e homogeneização adicional de uma segunda porção da restante amostra de ressecção de tecido cirúrgico. Uma porção de um ou mais blocos de tecido fixos e incluídos pode ser processada por micrototomia para produzir uma ou mais seções finas de tecido para análise morfológica. Adicionalmente, pelo menos um dos um ou mais blocos de tecido incluídos fixos pode ser material homogeneizado. Em um aspecto, a amostra de tecido de ressecção cirúrgica inclui um ou mais pedaços separados de tecido. Em uma forma de realização adicional, o ou mais pedaços separados de tecido compreendem pelo menos uma porção de uma ou mais massas de tecido tumoral sólidas primárias ressecadas de um indivíduo para obter a amostra de ressecção cirúrgica. Em outro aspecto, o um ou mais pedaços separados de tecido compreendem pelo menos uma porção de um ou mais nódulos linfáticos ressecados do sujeito.
[082] Em uma forma de realização adicional, o método compreende ainda a homogeneização separada de pelo menos uma porção das partes separadas de tecido para produzir amostras homogeneizadas separadas. Em uma forma de realização adicional, a amostra de tecido de ressecção cirúrgica compreende uma única massa de tecido que pode ser ainda dividida em duas ou mais partes da massa de tecido único. Adicionalmente, pelo menos um dos dois ou mais pedaços da massa de tecido único pode ser material homogeneizado e preservado. Em um aspecto, a homogeneização pode compreender separação física, tal como, corte, corte ou picagem. Em outro aspecto, a homogeneização pode compreender dissociação mecânica, tal como, mistura ou sumo. Ainda em um outro aspecto, a homogeneização é realizada por dissociação bioquímica, por exemplo com uma proteinase.
[083] Em um aspecto adicional, uma ou mais biomoléculas podem ser purificadas a partir de pelo menos uma porção do material homogeneizado, essas biomoléculas podem incluir DNA, RNA, proteínas, lipídios e metabolitos. As biomoléculas podem então ser analisadas, por exemplo por PCR, espectrometria de massa, sequenciação de nova geração ou ELISA. Essa análise produz pelo menos um conjunto de dados.
[084] Em uma forma de realização adicional, pelo menos uma porção da amostra homogeneizada pode ser incluída em parafina. Em um aspecto adicional, o método compreende ainda preparar uma ou mais seções finas da amostra homogeneizada incluída em parafina e realizar análise histológica na amostra. Tal análise histológica pode incluir coloração H & E, coloração IHC, coloração ISH e coloração FISH. A análise histológica pode ser interpretada por um ser humano ou quantificada em um dispositivo automatizado. Em uma forma de realização adicional, a interpretação ou quantificação produz pelo menos um conjunto de dados.
[085] Em um aspecto, a invenção também se refere ao processamento adicional de pelo menos uma porção do material homogeneizado para gerar fragmentos celulares. Tal processamento pode incluir métodos físicos, mecânicos, químicos ou enzimáticos. Tais fragmentos celulares podem incluir núcleos, membranas celulares e organelas celulares. Em outro aspecto, pelo menos uma porção dos fragmentos celulares é afixada a pelo menos uma lâmina de vidro e opcionalmente sujeita a análise histológica. Tal análise histológica pode incluir coloração H & E, coloração IHC, coloração ISH ou coloração FISH. A análise pode ser interpretada por um ser humano ou quantificada por um dispositivo automatizado. A interpretação ou quantificação resulta na criação de pelo menos um conjunto de dados.
[086] Em um aspecto adicional, pelo menos uma porção dos fragmentos celulares é analisada por citometria de fluxo, FACS ou analisador de partículas, em que tal análise produz um conjunto de dados. Em um aspecto, pelo menos um fragmento celular da pelo menos uma porção dos fragmentos celulares é purificado. Tal purificação pode ocorrer, por exemplo, por FACS, purificação por afinidade, centrifugação diferencial por exclusão de tamanho, filtração ou eletroforese. Em outra forma de realização, as biomoléculas podem ser isoladas a partir do fragmento purificado de pelo menos um fragmento celular a partir de pelo menos uma porção dos fragmentos celulares. As biomoléculas podem ser analisadas por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de próxima geração ou ELISA. Em um aspecto, a análise produz pelo menos um conjunto de dados.
[087] Ainda em outra forma de realização, o método da presente invenção compreende adicionalmente processamento adicional de pelo menos uma porção do material homogeneizado para gerar pelo menos uma célula dissociada, por exemplo, por meio físico, mecânico, químico ou enzimático. A célula desassociada é uma célula normal, uma célula cancerígena ou uma célula bacteriana. Em um aspecto, a célula desassociada é afixada a pelo menos uma lâmina de vidro e submetida a análise histológica. Tal análise pode incluir, por exemplo, coloração H & E, coloração IHC, coloração ISH ou coloração FISH. Em uma forma de realização adicional, a análise é interpretada por um ser humano ou quantificada por um dispositivo automatizado. Em uma forma de realização adicional, a interpretação ou quantificação produz pelo menos um conjunto de dados. Em um aspecto adicional, pelo menos uma célula da pelo menos uma célula desassociada é purificada por meios, tais como, FACS, purificação por afinidade, centrifugação diferencial por exclusão de tamanho, filtração ou eletroforese. Em uma forma de realização adicional, as biomoléculas podem ser isoladas a partir da pelo menos uma célula purificada a partir de pelo menos uma célula desassociada. Em um aspecto adicional, as biomoléculas podem ser analisadas, por exemplo, por PCR, espectrometria de massa, sequenciação de nova geração ou ELISA. Em uma modalidade adicional, tal análise produz pelo menos um conjunto de dados.
[088] Em um aspecto adicional, a pelo menos uma célula purificada da pelo menos uma célula dissociada é afixada a pelo menos uma lâmina de vidro, e opcionalmente é submetida a análise histológica. Em uma forma de realização adicional, a análise histológica é coloração com H & E, coloração com IHC, coloração com ISH ou coloração com FISH. Tal análise pode ser interpretada por um ser humano ou quantificada por um dispositivo automatizado. Em um aspecto adicional, a análise ou interpretação produz pelo menos um conjunto de dados.
[089] Em uma forma de realização adicional, os conjuntos de dados produzidos pelos métodos acima descritos são ainda analisados. Em um aspecto, a análise compreende a determinação de uma diversidade de biomarcadores ou diversidade fenotípica. Em uma forma de realização adicional, a análise compreende a determinação de pelo menos uma decisão clínica. Tal decisão clínica, em um aspecto, inclui a determinação do prognóstico da doença, a previsão da recorrência da doença, a previsão de metas de terapia da doença, a inclusão de sujeitos de ensaios clínicos ou a estratégia de tratamento terapêutico para pelo menos um indivíduo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[090] O arquivo de patente ou aplicativo contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta publicação de patente ou pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[091] As Figuras 1A - 1C são representações esquemáticas dos métodos divulgados para aquisição de amostras em patologia. Figura 1A ilustra a aquisição de amostra de um cólon; Figura 1B ilustra a aquisição de sinal de tecido pulmonar; Figura 1C ilustra a aquisição de amostra de tecido renal.
[092] As Figuras 2A e 2B ilustram uma representação esquemática do material homogeneizado da invenção. Figura 2 É uma ilustração de como os métodos de homogeneização divulgados geram uma amostra representativa que contém subclones na proporção em que eles existiram dentro do tumor sólido. Figura 2B é uma ilustração de como a detecção de instalações de materiais homogeneizados de subclones de baixa prevalência.
[093] A Figura 3 é um fluxograma que representa esquematicamente o protocolo descrito utilizando métodos físicos, mecânicos, bioquímicos para gerar amostras de tumor representativas que são representativas da heterogeneidade dentro de um tumor.
[094] A Figura 4 é um gráfico que mostra os resultados do fraccionamento por tamanhos da amostra representativa.
[095] As Figuras 5A - C mostram coloração H & E das frações de fluxo e retidas recolhidas após filtração em série da amostra representativa digerida bioquimicamente. Figura 5A ilustra a coloração H & E da fração retida na malha (topo) e o fluxo através (baixo) da malha de mícron. Figura 5B ilustra a coloração de H & E da fração retida na malha (superior) e o fluxo (inferior) da malha de micros. A Figura 5C ilustra a coloração H & E da fração retida na malha (em cima) e o fluxo através (em baixo) da malha de micros.
[096] As Figuras 6A - 6D mostram a detecção de proteína em uma amostra representativa produzida a partir de um xenoenxerto de Her2 positivo derivada a partir de células de câncer da mama humano misturado com tecido animal através de homogeneização seguida por digestão bioquímica com calor e pH condicionado. Figura 6A ilustra pré-condicionamento em tampão CC1 a 85 °C. Figura 6B ilustra o pré-condicionamento em tampão CC1 a 85 °C seguido por digestão com colagenase H durante pelo menos 30 minutos. Figura 6C ilustra a amostra digerida mecanicamente dissociada, CC1 e amostra digerida com colagenase H. Figura 6D) uma imagem do tecido animal, ou seja, Peito de frango, filete de peixe e fado de galinha, com o xenoenxerto positivo Her2 misturado para gerar a amostra representativa analisada como mostrado nas Figuras 6A - 6C.
[097] As Figuras 7A e 7B mostram uma amostra representativa gerada a partir de tecido humano utilizando digestão bioquímica com condicionamento de calor e pH, após desassociação mecânica. Figura 7A ilustra o pré-condicionamento com CC1 seguido por uma digestão de 30 minutos com colagenase H. A Figura 7B ilustra a extensão da duração da digestão com colagenase H após o pré-condicionamento de CC1.
[098] As Figuras 8A - 8D mostram a detecção de proteína em uma amostra representativa produzida a partir de uma amostra de rim humano. Figura 8A ilustra a coloração H & E de uma amostra representativa de rim humano após desassociação mecânica, pré-condicionamento e digestão enzimática. Figura 8B ilustra a análise por DAB-IHC da amostra representativa de rim humano para detectar PD-L1. Figura 8C ilustra a análise por DAB-IHC da amostra representativa de rim humano para detectar CD8. Figura 8D ilustra a análise por DAB-IHC da amostra representativa de rim humano para detectar Ep-Cam. A coluna da esquerda mostra uma ampliação de 10x das lâminas contendo a amostra representativa, enquanto a coluna da direita mostra uma ampliação de 20x das lâminas contendo a amostra representativa.
[099] As Figuras 9A - 9D mostram a detecção de proteína em uma amostra representativa produzida a partir de uma amostra de pulmão humano. Figura 9A é uma imagem da amostra de tumor pulmonar com aproximadamente 3 cm usada como material de origem para gerar a amostra representativa; Figura 9B ilustra a coloração H & E de uma amostra de pulmão humano representativa após desassociação mecânica, pré-condicionamento e digestão enzimática; Figura 9C ilustra a análise por DAB-IHC da amostra de pulmão humano representativa para detectar PD-L1; Figura 9D ilustra a análise por DAB-IHC da amostra de pulmão humano representativa para detectar CD8; Figura 9E DAB - Análise IHC da amostra de pulmão humano representativa para detectar Ep- Cam.
[0100] A Figura 10 ilustra um protocolo DAB ICC exemplificativo, apresentado nas etapas 1-102, para detecção de proteína em amostras representativas. Neste exemplo particular, o protocolo foi usado para detectar Her2.
[0101] A Figura 11 proporciona um protocolo exemplificativo de fluorescência ICC (apresentado nos passos 1-38) para detecção de proteína em amostras representativas.
[0102] A Figura 12 mostra a detecção de CD20, que demarca células B, utilizando DAB ICC automatizado em uma amostra representativa preparada a partir de uma mistura de tecido animal e espécimes de amígdala humana. O CD20 foi detectado em células do tecido das amígdalas humanas contidas na amostra representativa.
[0103] As Figuras 13A e 13B mostram a detecção de células positivas para HER2 Calu-3 presentes em uma amostra representativa preparada a partir de tecido de amígdalas e um Her2 tumor positivo de xenoenxerto utilizando ICC fluorescência. Figura 13A ilustra uma amostra representativa contendo células Calu-3 incubadas apenas com anticorpo secundário (controlo negativo). O sinal de fundo em células Calu-3 geradas pelo anticorpo secundário é designado pela seta da linha tracejada. Figura 13B ilustra uma amostra representativa contendo células Calu-3 foram incubadas com um anticorpo de Her2 (4B5) antes da adição do anticorpo secundário
[0104] A Figura 14 proporciona um protocolo exemplar multiplex cromogênico ICC (expressos nos passos 1-225) para a detecção de várias proteínas em uma amostra representativa.
[0105] A Figura 15 mostra a detecção de Ki-67, CD20, e CD3 utilizando multiplex IHC cromogênico na amostra representativa gerada a partir de amostras de amígdalas humanos.
[0106] A Figura 16 mostra a detecção de células positivas para b- Raf, presentes em uma prevalência de cerca de 0,015 % em uma amostra representativa de amígdala.
[0107] A Figura 17 mostra uma ampliação de 5x de tecido de amígdala material homogeneizado. Observe a barra de escala indicando 50 mícrons de comprimento.
[0108] As figuras 18A e 18B mostram imagens do material cirúrgico residual. Figura 18A ilustra o material de uma ressecção do cólon que ainda contém um adenocarcinoma do cólon de oito (8) cm; Figura 18B ilustra tecido residual de uma nefrectomia parcial de um rim contendo um tumor renal urotelial papilar.
[0109] As Figuras 19A - 19C mostram coloração H & E de seções histológicas distintas obtidas a partir do adenocarcinoma do cólon. Figura 19A ilustra uma primeira seção obtida a partir do adenocarcinoma do cólon; enquanto a Figura 19B ilustra uma segunda e diferente seção do adenocarcinoma do cólon. Cada uma das seções nas Figuras 19A e 19B foram obtidos por um patologista. A diferença na coloração de H & E mostra a variação dentro do mesmo tumor. Figura 19C ilustra a coloração H & E de uma amostra representativa preparada a partir do adenocarcinoma do cólon.
[0110] As Figuras 20A - 20C mostram coloração H & E de seções histológicas distintas obtidas a partir do tumor renal urotelial papilar. Figura 20A ilustra uma primeira seção retirada do tumor renal urotelial papilar; Figura 20B ilustra uma segunda seção diferente tirada do tumor renal urotelial papilar. Cada uma das seções ilustradas nas Figuras 20A e 20B foram obtidos por um patologista. A diferença na coloração de H & E mostra a variação dentro do mesmo tumor. Figura 20C ilustra a coloração H & E de uma amostra representativa preparada a partir do tumor renal urotelial papilar.
[0111] As Figuras 21A - 21C mostram Alk DAB coloração de seções histológicas distintas obtidos a partir do adenocarcinoma do cólon. Figura 21A ilustra uma primeira seção retirada de um adenocarcinoma do cólon; Figura 21B ilustra uma segunda seção diferente tirada de um adenocarcinoma do cólon. Cada uma das seções ilustradas nas Figuras 21A e 21B foram obtidos por um patologista. A diferença na coloração de Alk DAB mostra a variação dentro do mesmo tumor. Figura 21C ilustra coloração Alk DAB de uma amostra representativa preparada a partir do adenocarcinoma do cólon.
[0112] As Figuras 22A - C mostram coloração com Alk DAB de seções histológicas distintas obtidas a partir do rim urotelial papilar. Figura 22A ilustra uma primeira seção retirada do tumor renal urotelial papilar; Figura 22B ilustra uma segunda seção diferente tirada do tumor renal urotelial papilar. Cada uma das seções ilustradas nas Figuras 22A e 22B foram obtidos por um patologista. A diferença na coloração de Alk DAB mostra a variação dentro do mesmo tumor. Figura 22C ilustra a coloração com Alk DAB de uma amostra representativa preparada a partir do tumor renal urotelial papilar.
[0113] A Figura 23 é uma imagem de plaquetas educadas em tumores e outras células sanguíneas isoladas a partir de uma amostra representativa bioquimicamente digerida por centrifugação. Um tumor de carcinoma seroso de ovário humano foi misturado e digerido com Accumax e Collagenase H seguido de centrifugação resultando no acúmulo de plaquetas e hemácias no topo da amostra centrifugada (linha vermelha).
[0114] A Figura 24 mostra a coloração de HPV16 ISH em células Caski em uma amostra representativa preparada a partir de tecido recuperado de um bloco de parafina. O tecido previamente incluído em cera de parafina foi recuperado e material homogeneizado em um IKA para gerar uma amostra representativa.
[0115] As Figuras 25A - D mostram imagens de lâminas histológicas coloridas por H & E feitas de amígdalas cortadas e picadas. As Figuras 25A e 25B ilustram tecido de corte manual (~ 2 mm2) enquanto as Figuras 25C e 25D ilustram tecido picado com um “Espremedor” (~ 200 um2).
[0116] As Figuras 26A - 26D mostram amostras de tumor de cólon mecanicamente misturadas e filtradas. Figura 26A é uma imagem de campo claro da coleta 1; Figura 26B é uma imagem de campo claro de coletar 2; Figura 26C é uma imagem de campo claro de coletar 3; e Figura 26D é uma imagem de campo claro do filtrado.
[0117] As Figuras 27A - Figura 27C mostram a distribuição de tamanho de células isoladas mecanicamente dissociadas e filtradas. Figura 27A mostra células de amostra de tumor do cólon; Figura 27B mostra células mecanicamente dissociadas e filtradas de células imunes de amígdalas; e Figura 27C mostra células positivas para EpCAM (células tumorais) separadas de células mecanicamente dissociadas e filtradas da amostra de tumor do cólon.
[0118] A Figura 28 mostra uma imagem fluorescente de células tumorais positivas para EpCAM, dissociadas mecanicamente e filtradas a partir de uma amostra de tumor do cólon e classificadas com o classificador de células SH800 da Sony.
[0119] As Figuras 29A - 29F mostram células tumorais de cólon filtradas mecanicamente dissociadas e filtradas coloridas com CK8/ 18 (Figura 29B), CD45 (Figura 29C), CD8 (Figura 29D), PD-L1 (Figura 29E) e células EGFR (29F) marcadores e analisados com citômetro de fluxo de foco acústico Attune. Figura 29A ilustra como FSC-A vs. FSC-H foi usado para discriminação de dupletos. Vermelho: células coloridas positivamente e violeta: controle (células coloridas sem Ab primário).
[0120] As Figuras 30A - 30C mostram a análise das células positivas separadas por EpCAM usando o classificador de células SH800 da Sony. Figura 30A utiliza o Texas Re; Figura 30B utiliza DAPI; Fig. 30C utiliza DAPI. As células positivas para EpCAM correspondem a células com maior conteúdo de DNA com base no gráfico de intensidade de DAPI.
[0121] As Figuras 31A e Figuras 31B mostram células de dissociação de amígdalas ordenando-se usando esferas magnéticas. Figura 31A mostra que FSC-A vs. FSC-H foi usado para discriminação de dupletos. Células fluorescentes acima de certo limite foram usadas na comparação. Figura 31B ilustra gráficos de barras mostrando a percentagem de células fluorescentes (células CD3 ou CD8 positivas) na população total de células antes e após a depleção.
[0122] A Figura 32 mostra sonicação de agregados multicelulares. A sonicação de agregados multicelulares (tamanho da população entre 12 e 18 um) dá células individuais (tamanho da população entre 5,5 e 9,3 um). O tamanho das células individuais geradas corresponde ao das células tumorais.
[0123] As Figuras 33A - 33D mostram agregados multicelulares tratados com colagenase e depois sonicados. Figura 33A mostra a distribuição de tamanho de agregados celulares tratados com colagenase com sonicação; Figura 34B mostra a distribuição de tamanho de agregados celulares tratados com colagenase sem sonicação. Figura 33C ilustra imagens das amostras exibidas na Figura 33A; Figura 33D ilustra imagens das amostras exibidas na Figura 33B.
[0124] A Figura 34 mostra RNA e DNA liberados de materiais homogeneizados feitos de amostras representativas (Rep) e tecido de tonsila fresca (Trad).
[0125] As Figuras 35A - 35D mostram a estabilidade do RNA em diferentes condições de armazenamento ao longo de 6 meses. Figura 35A ilustra que o tecido de uma neoplasma neuroendócrina bem diferenciada pancreática foi incubado em soluções de armazenamento de células padrão, conforme necessário; Figura 35B ilustra que o tecido de um carcinoma urotelial papilar foi incubado em soluções de armazenamento de células padrão, conforme necessário; Figura 35C ilustra que o tecido de um adenocarcinoma do cólon foi incubado em soluções de armazenamento de células padrão como indicado.
[0126] As Figuras 36A e B mostram estabilidade proteica em diferentes condições de armazenamento ao longo de 6 meses. Figura 36A ilustra que a proteína, medida por IHC para C-met, é estável no carcinoma urotelial papilar em todas as condições e temperaturas de armazenamento; Figura 36B ilustra que a proteína, medida por IHC para C-met, é estável no adenocarcinoma do cólon em todas as condições e temperaturas de armazenamento.
[0127] As Figuras37 e 37B mostram estabilidade de células e proteínas em ciclos repetidos de congelamento/ descongelamento para uma amostra representativa feita a partir de um adenocarcinoma do cólon. Figura 37Apresenta a estabilidade da morfologia celular como ensaiado pela coloração H & E; Figura 37B ilustra a estabilidade da proteína conforme determinado pela coloração das células para C-met.
[0128] A Figura 38 mostra a estabilidade do ácido nucleico (DNA e RNA) em ciclos repetidos de congelação/ descongelação para uma amostra representativa feita a partir de um adenocarcinoma do cólon.
[0129] A Figura 39 mostra uma ilustração da pilha de detecção Her2/ Chr17.
[0130] A Figura 40 mostra um estudo de desparafinização. Imagens de núcleos isolados preparados a partir de tecido do cólon e corados para Her2 (prata) e Cromossomo 17 (vermelho) (40x). As opções de desparafinização exploradas foram desparafinização A LCS, desparafinização B EZ de preparação e opção de carga úmida C em vez de desparafinização.
[0131] A Figura 41 mostra um estudo de incubação de hibridação. Imagens de núcleos isolados preparados a partir de tecido do cólon e corados para Her2 (prata) e Cromossomo 17 (vermelho) (40x). As opções de hibridização exploradas foram: hibridação de 1 hora, hibridização de 2 horas e hibridização de 4 horas.
[0132] As Figuras 42A e 42B mostram amostras representativas de tecido de amígdala dissociado com métodos enzimáticos. Figura A Figura 42A ilustra lâminas coloridas por H & E de tecido digerido com Pepsina, 5 mg/ml, a 37 graus C, durante 30 min (painel esquerdo) ou 24 horas (painel direito). Figura 42B ilustra lâminas coloridas por H & E de tecido digerido com Tripsina, a 0,25 %, a 37 graus C durante 30 min (painel da esquerda) ou 24 horas (painel da direita).
[0133] A Figura 43 é um gráfico de partículas sub-100 mícron isoladas a partir de amostras de amígdalas representativas paralelas utilizando diferentes métodos enzimáticos listados na Tabela 6.
[0134] A Figura 44A mostra um gráfico que ilustra partículas de sub-100 mícron isoladas a partir de amostras representativas de amígdalas dissociadas por métodos mecânicos ou de proteinase K-pepsina. Barras de erro representam S.D. de três experimentos independentes ** p = 0,0037 usando teste T não pareado. Figura 44B mostra imagens de campo claro de lâminas de partículas coloridas por H & E isoladas usando dissociação mecânica; Figura 44C mostra imagens de campo claro de lâminas de partículas coloridas com H & E isoladas utilizando métodos de dissociação de pepsina de proteinase K.
[0135] As Figuras 45A e 45B mostram reprodutibilidade do Isolamento Nuclear. Figura 45A é um gráfico de barras mostrando o rendimento médio de partículas nucleares isoladas a partir de alíquotas de amostras representativas de um cólon (N = 3) e um tumor de pulmão (N = 4). Figura 45B é um gráfico que mostra a distribuição de partículas nucleares preparadas a partir de alíquotas de uma amostra representativa de tumor do cólon em caixas de partículas dimensionadas.
[0136] As Figuras 46A e 46B mostram a medição do dano celular associado ao tratamento mecânico e enzimático. Figura 46A é um gráfico de barras que mostra a percentagem média de DNA libertado por dissociação de amostras representativas de amígdalas utilizando métodos mecânicos (Mech) ou Proteinase K (ProtK) -Pepsina. Figura 46B é um gráfico de barras que mostra a percentagem de DNA libertado por dissociação de amostras representativas de tumores.
[0137] As Figuras 47A e 47B mostram uma análise por citometria de fluxo da agregação de partículas isoladas a partir de tecido de amígdala fixado em formalina utilizando o método da proteinase K-pepsina. Figura 47A mostra amostras preparadas usando o tampão autoMACS; Figura 47B mostra amostras preparadas utilizando autoMACS com Tween 20 a 1 %.
[0138] As Figuras 48A - 48D mostram adenocarcinoma do cólon (ADC) colorido para citoqueratina 8/18 (CK-8/18). A Figura 48A ilustra uma imagem de campo claro de uma seção de tecido colorida para CK-8/18 utilizando imuno-histoquímica (IHC). Os tecidos de ADC visualizados com CK-8/18 são corados em marrom; Figura 48B ilustra uma imagem de campo claro de uma amostra representativa que foi mecanicamente dissociada, incluída em cera de parafina, selecionada e colorida para CK-8/18 utilizando IHC. Tecidos positivos para CK-8/18 são corados de marrom; a Figura 48 C ilustra uma imagem fluorescente de uma amostra representativa dissociada usando o método da proteinase K-pepsina e colorida em solução para DAPI e CK-8/18, visualizada com Alexa 488. Imagens pseudo-coloridas refletem CK-8/18 (verde) e DAPI (azul) coloração. Figura 48D ilustra amostras de controlo negativo dos tecidos descritos na Figura 48C, incubado sem o anticorpo CK-8/18. Todas as amostras foram preparadas a partir do mesmo tumor ADC do cólon.
[0139] As Figuras 49A e 49B mostram amplificação de sinal de tiramida (TSA) melhora a coloração do material isolado de amostras representativas. Figura 49A ilustra imagens (20x) de células isoladas mecanicamente de tecido de amígdala fixo colorido para CD45 (vermelho) por imunofluorescência padrão (IF, painel superior esquerdo) ou métodos TSA (painel superior direito). Coloração DAPI (azul) marca os núcleos. A exposição de 100 ms foi usada para ambas as imagens. Figura 49B ilustra imagens (40x) de núcleos isolados a partir de tecido tumoral fixo colorido utilizando TSA. Painéis esquerdos mostram imagens de células coloridas sem anticorpo primário (controle Neg), e os painéis direitos mostram coloração com anticorpos primários anti-citoqueratina (vermelho). Coloração DAPI (azul) marca os núcleos. A exposição de 2 ms foi usada para todas as imagens.
[0140] A Figura 50 mostra coloração de citoqueratina (CK) positiva que distingue os núcleos de tumor do normal. Histogramas de dados de citometria de fluxo para núcleos isolados a partir de amostras representativas de um tumor do cólon (painel superior) ou de um tumor do pulmão (painel inferior).
[0141] As Figuras 51A - 51C mostram composição celular de tumores. A Figura 51A ilustra uma fração de núcleos isolados a partir de um adenocarcinoma do cólon (389); Figura 51B ilustra uma fração de núcleos isolados de um carcinoma escamoso de pulmão (528) que foram designados normal vs. tumor usando citometria de fluxo
[0142] A Figura 52 ilustra um gráfico mostrando a quantificação do rendimento de DNA a partir de núcleos isolados de amostras representativas.
[0143] As Figuras 53A e 53B são imagens inteiras em lâmina de um corte histológico retirado de uma amígdala intacta colorida com um anticorpo de pan-queratina. Figura 54A descreve uma seção histológica tradicional de uma amígdala normal detectada por DAB para Pan-Queratina. Figura 54B representa uma seção de uma amostra representativa de amígdala detectada por DAB para Pan-Queratina.
[0144] As Figuras 55A e 55B são imagens de amostras de tonsila homogeneizada incluídas em parafina e seccionadas. Figura 55A representa uma seção histológica tradicional de uma amígdala normal detectada por DAB para CD8. Figura 55B representa uma seção de uma amostra representativa de amígdala detectada por DAB para CD8.
[0145] A Figura 56 é um diagrama do fluxo de trabalho da invenção atual.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0146] Deve-se entender que a presente invenção não se limita a aspectos particulares descritos, uma vez que, como é evidente, podem variar. É também para ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever apenas aspectos particulares, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[0147] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente entendido por um especialista na técnica ao qual esta tecnologia pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente tecnologia, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações técnicas e de patentes aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Nada aqui é para ser interpretado como uma admissão de que a presente tecnologia não tem o direito de antecipar tal invenção em virtude da invenção anterior.
[0148] A prática da presente tecnologia empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de cultura de tecidos, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que estão dentro da perícia na arte. Ver, por exemplo, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vetors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); and Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology.
[0149] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo intervalos, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 1,0 ou 0,1, conforme apropriado, ou alternativamente por uma variação de +/ - 15 %, ou alternativamente 10 %, ou alternativamente 5 %, ou alternativamente 2 %. É para ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo “sobre”. Também deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que os reagentes aqui descritos são meramente exemplificativos e que equivalentes de tais são conhecidos na arte.
[0150] Deve ser inferido sem recitação explícita e, a menos que se pretenda de outra forma, que quando a presente tecnologia se refere a um polipeptídio, proteína, polinucleotídico ou anticorpo, um equivalente ou um biologicamente equivalente está dentro do escopo da presente tecnologia.
[0151] Conforme utilizado na especificação e nas reivindicações, a forma singular “um” e “e” inclui referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas.
[0152] Como aqui utilizado, o termo “animal” refere-se a organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui, por exemplo, mamíferos e aves. O termo “mamífero” inclui mamíferos humanos e não humanos.
[0153] Os termos “sujeito”, “hospedeiro”, “indivíduo” e “paciente” são usados aqui indistintamente para se referir a humanos e veterinários, por exemplo, humanos, animais, primatas não humanos, cães, gatos, ovelhas, camundongos, cavalos e vacas. Em algumas formas de realização, o sujeito é um humano.
[0154] Uma “composição” tipicamente pretende uma combinação do agente ativo, por exemplo, composto ou composição, e um transportador de ocorrência natural ou não natural, inerte (por exemplo, um agente ou etiqueta detectável) ou ativo, tal como, um adjuvante, diluente, aglutinante, estabilizador, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou semelhantes e incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os portadores também incluem excipientes farmacêuticos e aditivos de proteínas, peptídios, aminoácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra- oligossacarídeos e oligossacarídeos; açúcares derivados, tais como, alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e semelhantes, e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em combinação, que compreende isoladamente ou em combinação 1 - 99,99 % em peso ou volume. Excipientes de proteína exemplificativos incluem albumina de soro, tal como, albumina de soro humano (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e semelhantes. Componentes de aminoácidos/ anticorpos representativos, que também podem funcionar em capacidade tamponante, incluem alanina, arginina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e similar. Os excipientes de hidratos de carbono também se destinam ao escopo desta tecnologia, exemplos dos quais incluem mas não se limitam a monossacarídeos, tais como, frutose, maltose, galactose, glucose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacarídeos, tais como, lactose, sacarose, trealose, celobiose e semelhantes; polissacarídeos, tais como, rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e semelhantes; e alditóis, tais como, manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e mioinositol.
[0155] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um especialista na técnica à qual pertence a invenção.
[0156] O termo “amostra representativa” na invenção refere-se a uma amostra (ou um subconjunto dela) que reflete com precisão os componentes da totalidade e, assim, a amostra é uma indicação imparcial de toda a população. As amostras são derivadas de órgãos sólidos, tecidos e tumores (“OTT”) que são originalmente compostas de estruturas celulares segregadas espacialmente, e ainda organizadas em tipos de células espacialmente segregadas. Técnicas e métodos de amostragem representativa são aqueles que suficientemente homogeneízam, misturam ou de outro modo rompem a estrutura tridimensional espacialmente estratificada de um OTT de modo que os componentes (estruturas celulares, células, peptídios, ácidos nucleicos, lipídios, metabólitos, etc.) do original OTT espacialmente estratificado estão presentes em uma sub amostra (amostra também analítica) na proporção em que existiam no órgão, tecido ou tumor original. Em algumas formas de realização, a amostra representativa refere-se a uma amostra do OTT que constitui o máximo possível do OTT, aproximando-se da totalidade do OTT ou abrangendo uma porção significativa do OTT para se aproximar do objetivo de representar a diversidade do OTT. ao nível de aglomerados de células ligadas, células individuais, fragmentos de células, organelas, peptídios, ácidos nucleicos, lipídios, metabolitos, etc. A amostra representativa pode conter a quantidade mínima de OTT intacta necessária para abranger a diversidade do OTT. Em uma forma de realização adicional, a amostra representativa pode compreender uma pluralidade de segmentos ou partículas em que pelo menos uma parte dessas partículas estão incluída em parafina e pelo menos uma porção das restantes partículas são homogeneizadas.
[0157] Várias amostras representativas podem ser feitas a partir de um único OTT. Nesta forma de realização, o OTT removido cirurgicamente ou removido é primeiro processado ou de outro modo manipulado em subunidades separadas, de tal modo que cada subunidade é composta por estruturas celulares espacialmente estratificadas, células, peptídios, ácidos nucleicos, etc. Cada subunidade é então suficientemente homogeneizada, misturado ou de outra forma interrompido para produzir uma amostra representativa da subunidade OTT.
[0158] A amostra representativa pode ser homogeneizada ou de outro modo misturada ou rompida, a ponto de qualquer amostra analítica, ou porção da amostra representativa, conter uma amostragem aleatória do material presente na amostra representativa. A amostra analítica é uma fração suficientemente grande da amostra representativa, de modo a abranger a diversidade da amostra representativa em relação à saída pretendida do teste analítico a ser aplicado (isto é, células v. Aglomerados de células ligadas). Qualquer amostra analítica usada para um ensaio específico produzirá dados consistentes com outra amostra analítica usada para o mesmo ensaio, com erro experimental. Além disso, qualquer amostra analítica escolhida para um ensaio específico forneceria informações que pudessem ser cruzadas com dados gerados com diferentes ensaios usando amostras analíticas tiradas da mesma amostra representativa, ou de outras amostras representativas feitas de OTTs do mesmo paciente, um paciente diferente, ou uma combinação de pacientes ou sujeitos. Como as proporções dos componentes biológicos originais estão presentes em todas as amostras analíticas tiradas de uma amostra representativa, os dados produzidos a partir de amostras analíticas relativas às proporções dos componentes biológicos dos OTTs podem ser comparados entre pacientes ou combinações de pacientes.
[0159] Outras amostras contendo menos diversidade do que uma amostra analítica pode ser retirada de uma amostra representativa para análise, por exemplo, uma única célula. No entanto, milhões de células individuais retiradas de uma amostra representativa de um OTT gerariam um “conjunto de dados representativos”, que inclui “dados oncológicos representativos”.
[0160] Em uma forma de realização, as células ou componentes celulares estão dissociados na amostra representativa de tal modo que a sua proporção relativa ou percentagens dentro da amostra representativa ou uma porção da mesma reflete ou imita com exatidão a proporção relativa ou percentagens destes tipos de células ou componentes dentro de todo o tecido intacto. espécime. A amostra pode ser, em uma forma de realização, um tumor sólido, nódulo linfático, metástases, pólipo, cisto ou sua porção ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.
[0161] Em uma forma de realização, as amostras representativas aqui divulgadas são obtidas por homogeneização de grandes volumes de um tecido ou amostra de tumor intacto (tal como uma amostra de tumor clínico) ou nódulo linfático ou metástases ou suas combinações obtidas a partir de um indivíduo. Por exemplo, o tumor inteiro ou uma sua porção substancial pode ser utilizado como material de entrada a partir do qual é gerada a amostra representativa, por exemplo, pelo menos 50 %, pelo menos 75 %, ou pelo menos 95 %, ou preferivelmente todos de um tumor ou nódulo linfático. A amostra representativa pode ser gerada a partir de uma amostra de biópsia de tumor intacta a partir de um tumor sólido. Em uma forma de realização, a amostra compreende pelo menos cerca de 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 -1.000.000.000; 1.000.000.000 - 5.000.000,0000, ou mais células, opcionalmente de regiões espacialmente distintas do tumor. Geralmente, existem cerca de 1 bilhão de células em um tumor ou parte dele tendo um diâmetro de cerca de 1 cm e, em sua maior parte, essa relação procede em uma escala linear. Por exemplo, uma amostra excisional, tal como, uma biópsia com cerca de 2 cm de diâmetro, pode compreender 3 a 5 mil milhões de células. Em outra forma de realização, as amostras representativas aqui divulgadas são obtidas por homogeneização de um ou mais espécimes de tecido normais putativos, por exemplo, derivados de um indivíduo em risco de desenvolver câncer como resultado de uma mutação genética ou câncer anterior, ou tecido normal adjacente de uma ressecção cirúrgica para uso como amostra controle.
[0162] Em uma forma de realização adicional, o termo “amostra de tumor representativa” refere-se a uma amostra representativa preparada a partir de um tumor, por exemplo, um tumor ressecado, ou de uma amostra potencialmente contendo células cancerosas, ou de uma amostra a ser testada quanto à presença potencial de câncer células, como um nódulo linfático. Da mesma forma, a frase “amostra de tumor” engloba amostras preparadas a partir de um tumor ou de uma amostra potencialmente contendo células cancerosas, ou uma amostra a ser testada para a presença potencial de células cancerosas, como um nódulo linfático.
[0163] Em uma forma de realização adicional, o termo “amostra normal representativa” refere-se a uma amostra representativa preparada a partir de um tecido normal putativo, por exemplo, uma biópsia, pólipo ou cisto obtido de um paciente ou uma amostra a ser testada quanto à presença potencial de câncer ou células pré-cancerosas ou células imunes sugestivas de uma irregularidade imune. Da mesma forma, a frase “amostra normal” abrange amostras preparadas a partir de um putativo tecido normal, por exemplo, uma biópsia, pólipo ou cisto potencialmente contendo células cancerígenas, ou para ser testado quanto à presença potencial de células cancerosas, tal como, um nódulo linfático. Em uma forma de realização adicional, uma “amostra normal” também pode referir-se a um tecido que é provavelmente livre de doença ao qual a amostra de tumor pode ser comparada para identificar alterações fenotípicas devido ao estado da doença.
[0164] O termo “dados representativos”, como usado aqui, refere- se a qualquer conjunto de dados (por exemplo, expressão de um gene, porcentagem de certo tipo de célula (por exemplo, células imunes), expressão proteica, expressão de SNP ou sua falta, nível, quantidade de expressão de microRNA, ou número de subtipos histológicos) ou uma quantidade relativamente pequena de dados que reflete com precisão um conjunto de dados inteiro, cuja fonte é derivada de uma amostra representativa de um tecido, órgão ou tumor. Em uma forma de realização, os dados representativos são os dados imparciais indicando a diversidade de todo o tecido, órgão ou tumor. Como usado aqui, um “conjunto de dados” é uma coleção de dados. Em uma forma de realização, o conjunto de dados é composto por elementos separados, mas pode ser manipulado como uma unidade. Em uma forma de realização, um conjunto de dados pode incluir informação sobre a diversidade de biomarcadores ou diversidade fenotípica.
[0165] Como usado aqui, o termo “análise histológica” refere-se ao estudo da anatomia microscópica de células e tecidos de plantas e animais. Esta análise é útil na recolha de informação sobre os componentes biológicos da amostra, por exemplo, ácidos nucleicos (RNA, DNA), proteínas, lipídios ou metabolitos. As técnicas histológicas incluem aquelas conhecidas pelos especialistas na técnica, alguns exemplos não limitativos incluindo PCR, espectrometria de massa, sequenciação de nova geração e ELISA. Adicionalmente, a análise histológica pode incluir a detecção simultânea de mais de um componente biológico, isto é, multiplexação.
[0166] Como usado aqui, “tomada de decisão clínica” refere-se a coletar informações e integrar essas informações para tirar conclusões diagnósticas e determinar quais tratamentos dar a um paciente. Tais conclusões diagnósticas podem incluir a doença da qual um paciente sofre e que teste deve ser realizado no paciente. Em uma forma de realização, uma decisão clínica também pode incluir a determinação do prognóstico da doença, prever a recorrência da doença, prever alvos de terapia da doença, inclusão de sujeitos de ensaios clínicos ou determinação de uma estratégia de tratamento terapêutico para pelo menos um sujeito.
[0167] Como usado aqui, o termo “material homogeneizado” refere-se à biomassa obtida após um tecido ser material homogeneizado ou processado. Um material homogeneizado pode conter quaisquer componentes celulares do tecido, incluindo, mas não se limitando a células, peptídios, ácidos nucleicos, lipídios, metabólitos, etc. Em um aspecto, o material homogeneizado é a amostra representativa que reflete com precisão a porção, razão ou fração de os componentes do tecido do qual é derivado. Em algumas formas de realização, a proporção de estruturas celulares, componentes celulares ou quaisquer constituintes (células, peptídios, ácidos nucleicos, lipídios, metabolitos, etc.) do material homogeneizado (ou algum ou cada subconjunto do material homogeneizado) a mesma, similar ou substancialmente semelhante à proporção de estruturas celulares, componentes celulares ou quaisquer constituintes no tecido original intacto. Como uma amostra representativa, o material homogeneizado pode conter a quantidade mínima do órgão, tecido ou tumor intacto necessário para abranger a diversidade do órgão, tecido ou tumor.
[0168] O(s) tecido(s) de onde o material homogeneizado é derivado pode vir de um tecido, dois tecidos ou múltiplos tecidos. Em algumas formas de realização, o material homogeneizado provém de um sujeito, dois sujeitos ou mais de dois sujeitos. Em um aspecto, os dois ou mais sujeitos são sujeitos geneticamente homogêneos. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são sujeitos fenotipicamente homogêneos. Em alguns aspectos, os dois ou mais sujeitos são sujeitos geneticamente diversos. Em um aspecto, os dois ou mais sujeitos são sujeitos fenotipicamente diversos. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são do mesmo gênero. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são de gêneros diferentes. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são de diferentes grupos étnicos. Em um aspecto, os dois ou mais sujeitos são do mesmo grupo étnico. Em outro aspecto, o sujeito é selecionado do grupo consistindo de um animal ou um sujeito humano.
[0169] Como usado aqui, o termo “substancialmente” significa um alto grau de identidade em qualidade ou quantidade, por exemplo, pelo menos cerca de 60 %, ou alternativamente pelo menos cerca de 70 %, ou alternativamente cerca de 80 %, ou alternativamente cerca de 85 %, ou alternativamente cerca de 90 %, ou alternativamente cerca de 95 %, ou alternativamente cerca de 98 %.
[0170] “Semelhante” significa menos do que 100 % idêntico ou alternativamente maior que 98 % idêntico ou alternativamente maior que 95 % idêntico ou alternativamente maior que 90 % idêntico ou alternativamente maior que 85 % idêntico ou alternativamente maior que 80 % idêntico, ou alternativamente maior que 75 % idêntico. O termo “uniforme” significa identidade de pelo menos 80 %, ou alternativamente de pelo menos 85 %, ou alternativamente pelo menos 90 %, ou alternativamente pelo menos 95 %, ou alternativamente pelo menos 98 %, ou alternativamente pelo menos 100 %, idênticos. Não uniforme significa menos do que 80 % idêntico.
[0171] Como aqui utilizado, o termo “processado” significa que a composição de material homogeneizado foi submetida a, no mínimo, tratamento físico, mecânico ou químico. Em um aspecto, a composição homogeneizada resultante é submetida a mais de dois tipos de processamento. Em outros aspectos, a composição homogeneizada é submetida a três tipos de processamento. Ainda em um outro aspecto, o material homogeneizado é submetido a quatro ou mais tipos de processamento.
[0172] O termo “derivado de” significa que a amostra foi obtida ou recebida de uma fonte.
[0173] O termo “subconjunto” significa uma parte ou componente de um grupo maior. “Razão” é um valor quantitativo relativo de uma parte em relação a um grupo maior de componentes ou partes.
[0174] Como usado aqui, os termos “estrutura celular”, “componente celular” ou “componente” podem ser usados indistintamente para se referir a quaisquer substâncias ou materiais dentro das células, tecidos ou organismos, ou quaisquer substâncias ou materiais que são produzidos durante e depois que as células, tecidos ou organismos são processados. As substâncias ou materiais podem ser nativos ou estranhos às células, tecidos ou organismos. Em alguns aspectos, a “estrutura celular” e o “componente celular” podem também incluir quaisquer substâncias ou materiais que são modificados ou processados, por exemplo, as células ou ácido nucleico com corante ou materiais radioativos. As estruturas celulares ou componentes celulares incluem, mas não estão limitados a células, receptores, proteínas, lipídios, organelas celulares, membranas, químicos, ácidos nucleicos, moléculas pequenas, bactérias, protozoários, vírus, parasitas e/ ou porções ou frações destes. Como usado aqui, “fragmentos de células” incluem porções de uma célula inteira, tais como, núcleos, membranas celulares e organelas celulares.
[0175] Como usado aqui, o termo “espacialmente distinto” ou “espacialmente segregado” refere-se a elementos que são distribuídos em diferentes regiões de um espaço tridimensional. Em uma modalidade, a amostra representativa captura todas as subpopulações espacialmente distintas de células cancerígenas dentro de um tumor. Em outra forma de realização, as amostras de tumor utilizadas para gerar a amostra representativa são retiradas de diferentes regiões da amostra de tumor. Por exemplo, regiões proximais versus distais do tumor, diferentes faces do tumor, diferentes camadas do tumor, etc., em um esforço para capturar a diversidade dentro do tumor inteiro.
[0176] Os termos “homogeneização” ou “homogeneização” referem-se a um processo (como um processo mecânico e/ ou um processo bioquímico) pelo qual uma amostra biológica é levada a um estado tal que todas as frações da amostra são iguais em composição. Amostras analíticas representativas podem ser preparadas por remoção de uma porção de uma amostra que foi homogeneizada. Em geral, um tumor, nódulo linfático ou outra amostra referida como “liquefeita” no contexto da presente invenção entendida como tendo sido misturada ou misturada suficientemente de modo a ser homogeneizada. Uma amostra homogeneizada é misturada de tal modo que remover alguma da amostra (uma alíquota) não altera substancialmente a composição global da amostra restante e os componentes da alíquota removida são substancialmente idênticos aos componentes da amostra restante. Na presente invenção, a “homogeneização” irá, em geral, preservar a integridade da maioria das células dentro da amostra, por exemplo, pelo menos 50, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9 % ou superior a porcentagem das células na amostra não será rompida ou lisada como resultado do processo de homogeneização. Os materiais homogeneizados podem ser substancialmente dissociados em células individuais (ou aglomerados de células) e os materiais homogeneizados ou materiais homogeneizados resultantes são substancialmente homogêneos (consistindo em ou compostos de elementos semelhantes ou uniformes por toda a parte). Em uma forma de realização, o termo “homogeneização” refere-se a um processo no qual um tecido ou uma amostra biológica é processada na medida em que quaisquer subconjuntos, porções ou frações do tecido são semelhantes, substancialmente semelhantes ou idênticos em alguns aspectos.
[0177] Em uma forma de realização, o termo “homogeneização mecânica” refere-se à homogeneização resultante de meios mecânicos.
[0178] Como aqui utilizado, o termo “dissociação bioquímica” significa dissociação utilizando uma enzima, tal como, uma proteínase. A dissociação bioquímica pode ser afetada pela concentração de proteínase, tempo de incubação e temperatura.
[0179] Como aqui utilizado, o termo “separação física” ou “dissociação física” de uma amostra de tecido refere-se à homogeneização ou dissociação da amostra com um objeto pontiagudo por meios mecânicos, por exemplo cortando, picando ou cortando. O “corte” geralmente resulta em seções de tecido de aproximadamente 1,0 mm - 5,0 mm. no tamanho. A trituração geralmente resulta em seções de tecido de aproximadamente 0,5 a 2,0 mm de tamanho. A trituração geralmente resulta em seções de tecido de aproximadamente 0,1 - 1,0 mm de tamanho.
[0180] Como usado aqui, “separação mecânica” ou “dissociação mecânica” de uma amostra de tecido refere-se à homogeneização ou dissociação da amostra com uma fonte mecânica, como um liquidificador tradicional, um espremedor ou um batedor de contas, como é do conhecimento de um especialista na arte.
[0181] Como aqui utilizado, uma “célula desassociada” é uma célula que fazia parte de um tecido ou órgão, mas que não é separada desse tecido ou órgão.
[0182] Dependendo do processo de dissociação mecânica e/ ou bioquímica aplicado à amostra para gerar o material homogeneizado, os aglomerados de células podem compreender mais de uma (1) célula para milhares de células. Os aglomerados podem ser dissociados (diminuição no tamanho e/ ou número de células contidos) pela aplicação de outros métodos de processamento, por exemplo, por dissociação mecânica e/ ou bioquímica adicional e/ ou por exclusão de tamanho, dependendo do ensaio subsequente a ser realizada utilizando a amostra representativa (por exemplo, IHC requerendo aglomerados de células contendo dezenas a milhares de células, ou FACS ou citometria de fluxo requerendo células individuais ou fragmentos de células).
[0183] Os métodos presentemente descritos são flexíveis no que diz respeito ao grau de dissociação da amostra. O tamanho do agregado de célula alvo pode ser controlado por outros agrupamentos de células de processamento obtidos após a aplicação de um primeiro meio mecânico (tal como mistura ou o equivalente) de tal modo que os agrupamentos correspondam ao objetivo de dissociação do método de amostragem. Em um aspecto, cisalhamento mecânico e exclusão de tamanho, por exemplo peneiramento com uma série de malha, podem ser usados para remover aglomerados de células em ou abaixo de um certo tamanho enquanto retêm aglomerados celulares maiores para processamento adicional para alcançar o tamanho de partícula alvo. A distribuição resultante do tamanho das partículas do aglomerado celular é determinada por técnicas de exclusão de tamanho para remover certas partículas do processo de dissociação para alcançar um platô de dimensionamento em vez de uma distribuição.
[0184] Após homogeneização, os aglomerados resultantes podem conter pelo menos 1 - 2, 2 - 100, 100 - 500, 500 - 1.000, 1.000 - 10.000, 10.000 - 50.000 ou mais células. Em um aspecto, os aglomerados contêm células únicas, cerca de 2 - 10 células, cerca de 10 - 20 células, ou cerca de 20 - 40 células. O tamanho dos clusters resultantes irá variar. Veja-se, por exemplo, a Figura 20.
[0185] Como resultado da homogeneização da amostra, a distribuição de células dentro da amostra é substancialmente homogeneamente distribuída dentro do material homogeneizado resultante ou de uma porção ou fração do mesmo, de tal modo que o material homogeneizado ou qualquer sua fração representa a heterogeneidade da amostra original. Uma amostra homogeneizada pode ser referida como uma amostra líquida ou liquefeita com base na sua capacidade de fluxo, apesar de muitas ou a maioria das células permanecerem intactas.
[0186] Outras porções podem ser adicionadas a estes materiais homogeneizados ou amostras representativas, por exemplo, outras células, haptenos ou marcadores.
[0187] O termo “heterogeneidade” refere-se à diversidade ou incongruência, por exemplo, uma composição de partes diferentes ou dissimilares, ou variações na forma, função e comportamento. O termo “amostra de tecido heterogêneo” pretende uma amostra que não seja uniforme em composição ou caráter, por exemplo, diversa em forma, função ou comportamento. No contexto do câncer, o termo “heterogeneidade tumoral” descreve a observação de que diferentes células tumorais podem apresentar perfis morfológicos, fenotípicos e genéticos distintos, incluindo morfologia celular, expressão gênica, mutações gênicas, metabolismo, motilidade, proliferação e potencial metastático. A heterogeneidade pode ocorrer entre tumores (heterogeneidade inter-tumoral) e dentro de tumores (heterogeneidade intra-tumoral). Heterogeneidade tumoral tem sido observada em uma variedade de cânceres incluindo, mas não limitados a câncer de pulmão, leucemia, câncer de mama, câncer renal, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer cerebral, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, carcinomas ginecológicos, lipossarcomas e mieloma múltiplo. Dois modelos são propostos para explicar a heterogeneidade em células tumorais: o modelo de célula-tronco do câncer e o modelo de evolução clonal. O modelo de célula-tronco do câncer fornece que a heterogeneidade observada entre as células tumorais resulta de diferenças nas células-tronco cancerosas das quais as células tumorais se originam. O modelo de evolução clonal fornece que os tumores surgem de uma única célula mutada, mas acumulam mutações adicionais (que dão origem a subpopulações adicionais, cada uma das quais tem a capacidade de se dividir e sofrer mutações), o que explica a diversidade observada nas células cancerígenas do mesmo tumor. Acredita-se que esses modelos não sejam mutuamente exclusivos e, portanto, ambos provavelmente contribuem para a heterogeneidade em quantidades variáveis em diferentes tipos de tumores. A heterogeneidade do tumor compreende a variância global (variância da população) e a estrutura espacial dessa variação (estratificação espacial da população) e, portanto, ambos os elementos de variação devem ser considerados nos desenhos amostrais. A heterogeneidade tumoral pode surgir da heterogeneidade genética (por exemplo, resultante de fatores exógenos, instabilidade genômica, terapias etc.), outra heterogeneidade (por exemplo, epigenética) e/ ou do microambiente tumoral (por exemplo, diferença regional no tumor, como o oxigênio disponibilidade ou vigilância imunológica, impor diferentes pressões seletivas nas células tumorais).
[0188] As diferentes populações de células tumorais que surgem como resultado da heterogeneidade do tumor são chamadas de “subclones”, a progênie de uma célula mutante que surge em um clone.
[0189] A prevalência de subclones dentro de um tumor pode variar. Certos subclones compreendem a maioria do tumor, mas diminuem ao longo do tempo e/ ou após certos tratamentos. Outros subclones são inicialmente indetectáveis, mas depois se tornam abundantes. Vários subclones podem existir simultaneamente e variam em sua prevalência ao longo do tempo que leva para o tumor crescer o suficiente para ser detectável. O termo “eventos de baixa prevalência” ou “eventos genéticos de baixa prevalência” dentro de um tumor refere-se a eventos raros ou eventos genéticos raros (como mutações) que ocorrem a uma taxa de 10 - 1 %, 1 - 0,1 %, 0,1 - 0,01 %, 0,01 - 0,001 %, 0,001 - 0,0001 %, 0,0001 - 0,00001 %, 0,00001 - 0,000001 %, ou abaixo de 0,000001 %. Como a amostra gerada pelos métodos divulgados é representativa (ou substancialmente representativa) do tumor como um todo, mesmo subclones de baixa prevalência (como pelo menos 0,000001 %) em um tumor ou amostra biológica podem ser detectados, além de todos outros subclones que existem em taxas de prevalência mais altas.
[0190] O termo “amostra biológica” ou “amostra de tecido” refere- se a qualquer amostra incluindo uma biomolécula (como uma proteína, um peptídio, um ácido nucléico, um lipídio, um carboidrato ou uma combinação destes) que é obtida de qualquer organismo, inclusive vírus. Outros exemplos de organismos incluem mamíferos (como seres humanos; animais veterinários como gatos, cães, cavalos, gado e suínos; e animais de laboratório como ratos, ratos e primatas), insetos, anelídeos, aracnídeos, marsupiais, répteis, anfíbios, bactérias e fungos. Amostras biológicas incluem amostras de tecido (como seções de tecido e biópsias de tecido), amostras de células (como esfregaços citológicos, como esfregaços de sangue ou amostras de células obtidas por microdissecção), ou frações celulares, fragmentos ou organelas (como obtido pela lise de células e separação dos seus componentes por centrifugação ou de outra forma). Outros exemplos de amostras biológicas incluem sangue, soro, urina, sêmen, matéria fecal, líquido cefalorraquidiano, líquido intersticial, muco, lágrimas, suor, pus, tecido biopsiado (por exemplo, obtido por biópsia cirúrgica ou biópsia por agulha), aspirado no mamilo, cerume, leite, fluido vaginal, saliva, swabs (como swabs bucais) ou qualquer material que contenha biomoléculas derivadas de uma primeira amostra biológica. Em certas formas de realização, o termo “amostra biológica” como aqui utilizado refere-se a uma amostra (tal como uma amostra homogeneizada ou liquefeita) preparada a partir de um tumor ou uma sua porção obtida de um indivíduo.
[0191] Tal como aqui utilizado, “tecido normal” refere-se a um tecido não tendo lesão ou anormalidade detectável que supostamente correlaciona com um aumento da incidência de doença ou no contexto de câncer, malignidade. Estas amostras normais podem ser derivadas de pacientes com mutações ou condições genicas que se correlacionam com uma incidência aumentada de doença (genômica ou de outro modo), câncer ou malignidade. O tecido normal pode ser do mesmo tipo de tecido correspondente ao tecido patológico do mesmo indivíduo ou indivíduo diferente; ou tecido normal que não estão relacionados (por exemplo, de uma localização diferente no corpo ou com um tipo histológico diferente) ao tecido patológico do mesmo indivíduo ou de outros indivíduos.
[0192] Como aqui utilizado, “tecido pré-canceroso” refere-se a um tecido contendo alguma lesão ou anormalidade que supostamente se correlaciona com um aumento da incidência de câncer ou malignidade.
[0193] O termo “tumor” refere-se a uma massa ou neoplasia, que por si só é definida como um novo crescimento anormal de células que geralmente crescem mais rapidamente que as células normais e continuará a crescer se não for tratado, resultando em danos às estruturas adjacentes. Tamanhos de tumor podem variar amplamente. Um tumor pode ser sólido ou cheio de fluido. Um tumor pode se referir a tumores benignos (não malignos, geralmente inofensivos) ou malignos (capazes de metástase). Alguns tumores podem conter células neoplásicas benignas (como o carcinoma in situ) e, simultaneamente, conter células cancerígenas malignas (como o adenocarcinoma). Isso deve ser entendido para incluir neoplasias localizadas em vários locais em todo o corpo. Por conseguinte, para fins da invenção, os tumores incluem tumores primários, nódulos linfáticos, tecido linfático e tumores metastáticos. A linha divisória entre tumores cancerígenos, pré-cancerígenos e cancerígenos nem sempre é clara, mas existem propriedades gerais de cada tipo de crescimento. Tumores benignos são tumores não malignos. Um tumor benigno é geralmente localizado e não se espalha (metastatiza) para outras partes do corpo. A maioria dos tumores benignos responde bem ao tratamento. No entanto, se não for tratada, alguns tumores benignos podem crescer e levar a lesões graves ou danos devido ao seu tamanho. Desta forma, tumores benignos podem imitar tumores malignos e, assim, às vezes são tratados. Os tumores malignos são tumores cancerígenos que muitas vezes são resistentes ao tratamento, podem se espalhar para outras partes do corpo e às vezes se repetem após a remoção. “Câncer” é outro termo para um crescimento maligno (um tumor maligno ou neoplasia).
[0194] A virulência dos tumores pode variar. Certos tipos de câncer podem ser relativamente fáceis de tratar e/ ou curar, enquanto outros tipos de câncer são mais agressivos. A virulência tumoral pode ser determinada, pelo menos em parte, pela expressão gênica diferencial ou pela caracterização de alterações genômicas. Nas células cancerosas, os mecanismos que permitem que uma célula ative ou silencie os genes são danificados. Como resultado, há frequentemente uma ativação aberrante de genes específicos de outros tecidos e/ ou de outros estágios de desenvolvimento. Por exemplo, em cânceres de pulmão, células tumorais que expressam genes específicos para a produção de espermatozóides, que devem ser silenciosas, são extremamente virulentas (um câncer de alto risco que exibe aumento das habilidades proliferativas e uma facilidade de se esconder do sistema imunológico do corpo). Também foi demonstrado que em quase todos os cânceres, dezenas de genes específicos na germinal são ativados de forma aberrante. Ver, por exemplo, Rousseaux et al., Ectopic Activation of Germline and Placental Genes Identifies Aggressive Metastasis-Prone Lung Cancers. Science Translational Medicine (2013) 5(186): 186. Assim, como a regulação positiva ou negativa dos genes pode estar associada a uma forma virulenta de um câncer em particular, é possível prever, após testes de diagnóstico, quais são os tipos de câncer. um alto risco de recorrência e um prognóstico fatal, mesmo nos casos em que o tumor é tratado adequadamente, em um estágio de partida de seu desenvolvimento.
[0195] O termo “nódulo linfático” refere-se a um órgão oval ou em forma de rim do sistema linfático, presente amplamente em todo o corpo, incluindo a axila e o estômago, e ligado por vasos linfáticos. Os nódulos linfáticos contêm um número diversificado de células imunes, incluindo, entre outras, células B e células T. Os nódulos linfáticos são importantes para o bom funcionamento do sistema imunológico e podem atuar como filtros para partículas estranhas e células cancerígenas.
[0196] O termo “pólipo” ou “pólipos” refere-se a uma massa biológica anormal que se projeta a partir de uma membrana mucosa. Os pólipos podem ser encontrados em vários tecidos, incluindo, entre outros, cólon, estômago, nariz, ouvido, seio(s), bexiga urinária e útero.
[0197] O termo “metástase” ou “tumor metastático” refere-se a um tumor e/ ou seus componentes associados, incluindo, mas não se limitando a vasos sanguíneos, ossos, meninges, que se desenvolveram ou se espalharam de um órgão ou parte do corpo para outro.
[0198] O termo “cisto” refere-se a um saco fechado redondo ou oval que possui uma membrana e divisão distintas em relação ao tecido adjacente. Em alguns aspectos, um cisto é um aglomerado de células que se agruparam para formar um saco (não diferente da maneira pela qual as moléculas de água se agrupam, formando uma bolha). Em alguns aspectos, as células que formam a “casca” de tal saco ou cisto são distintamente anormais quando comparadas a todas as células circundantes para aquele local dado. Um cisto pode incluir, mas não está limitado a ar, fluidos ou qualquer material semissólido. Alguns tumores podem conter cistos ou serem descritos como “císticos”.
[0199] O termo “ressecção” refere-se a todo ou parte de um órgão ou outra estrutura corporal que é removida de um sujeito.
[0200] O termo “órgão” ou “órgãos”, como usado aqui, refere-se a qualquer parte anatômica ou tecido tendo uma função específica em um animal. O termo inclui uma porção ou toda uma parte anatômica ou um tecido, por exemplo, um lóbulo de um pulmão. Tais órgãos incluem, mas não estão limitados a glândula adrenal, apêndice, bexiga, cérebro, orelha, esôfago, olho, vesícula biliar, coração, rim, intestino (por exemplo, intestino grosso ou delgado), fígado, pulmão, boca, músculo, nariz, pâncreas, glândula paratireóide, glândula pineal, glândula pituitária, pele, baço, estômago, timo, glândula tireoide, traquéia, útero, apêndice vermiforme ou uma porção do mesmo.
[0201] O termo “aglomerado de células” (ou “aglomerados de células”) refere-se a uma agregação ou agregação de células, por exemplo, de células malignas, fibroblastos, células imunes, células-tronco ou células endoteliais. Em um aspecto, os clusters de células incluem 1 - 10, 10 - 100, 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 - 1.000.000.000; 1.000.000.000 -5.000.000,0000 ou mais células. O termo “pluralidade de clusters de células” significa mais de um cluster de células. Os clusters de células são agregados ou existem separadamente. As células dentro dos aglomerados de células são aderentes umas às outras por meio de proteínas, tais como, as caderinas, e são aderentes à arranjo extracelular circundante através de integrinas. Portanto, as células dentro de um cluster de células provavelmente estão relacionadas entre si e podem ser consideradas um subclone ou derivadas de um subclone.
[0202] Como usado aqui, o termo “organela” refere-se a estruturas ligadas a membranas celulares, tais como, o cloroplasto, mitocôndria e núcleo. O termo “organela” inclui organelas naturais e sintéticas.
[0203] O termo “peptídio”, como é usado no presente documento, significa um polímero curto de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Todos os aminoácidos podem ter uma configuração L ou D.
[0204] O termo “ácido nucleico” como aqui utilizado refere-se a uma forma polimérica de nucleotídica de qualquer comprimento, ribonucleotídios, desoxirribonucleotídios ou ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), que compreendem bases de purina e pirimidina, ou outros não naturais, modificados quimicamente ou bioquimicamente bases nucleotídicas naturais ou derivatizadas. A espinha dorsal do polinucleotídico pode compreender açúcares e grupos fosfato, como pode ser tipicamente encontrado em RNA ou DNA, ou grupos açúcar ou fosfato modificados ou substituídos. Em um aspecto, o polinucleotídico compreende nucleotídios modificados, tais como, nucleotídios metilados e análogos de nucleotídios.
[0205] O termo “lipídio” é usado em seu sentido convencional como um termo genérico englobando gorduras, lipídios, os constituintes solúveis em álcool e éter do protoplasma, que são insolúveis em água. Lipídios compõem as gorduras, óleos graxos, óleos essenciais, ceras, esteróides, esteróis, fosfolipídios, glicolipídios, sulfolipídios, aminolipídios, cromolipídios (lipocromos) e ácidos graxos. O termo abrange lipídios produzidos naturalmente e produzidos sinteticamente. Os lipídios preferidos em relação à presente invenção são: fosfolipídios, incluindo fosfatidilcolinas e fosfatidiletanolaminas, e esfingomielinas.
[0206] O termo “metabolito” refere-se a um composto, proteína ou qualquer substância, subproduto ou material resultante de reações enzimáticas, isto é, o composto sintetizado por um processo no qual uma enzima toma parte.
[0207] O termo “tecido líquido” refere-se a qualquer tecido que está ou pode estar na forma de líquido, que inclui, mas não está limitado a sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, secreções cervicais, saliva, urina, lágrimas, suor, mama leite e líquidos amnióticos. O termo “tecido não líquido” refere-se a qualquer tecido que não seja tecido líquido.
[0208] O termo “aspirado por agulha de citologia” refere-se ao procedimento de biópsia por aspiração com agulha fina (PAAF, PAAF ou BNA) ou citologia por aspiração com agulha fina (PAAF).
[0209] O termo “efusão” refere-se a um procedimento de coletar o fluido de um sujeito. Em alguns aspectos, o líquido coletado por efusão pode ser descrito como tendo uma condição patológica, distúrbio, sinal ou sintoma do anormal. Em outro aspecto, o fluido de um derrame pode ser um acúmulo excessivo de fluidos nas cavidades do corpo ou no espaço peritoneal.
[0210] O termo “Papanicolau” refere-se a um procedimento de rastreio para o câncer do colo do útero. Ele testa a presença de células pré- cancerígenas ou cancerígenas no colo do útero, a abertura do útero.
[0211] Como aqui utilizado, o termo “tecido anormal” significa um tecido que exibe uma característica definida que é diferente daquela característica em um tecido normal. Por exemplo, o tecido do câncer de mama pode, em um aspecto, ser “anormal” em comparação ao tecido mamário que não é fenotipicamente canceroso, mas pode, no entanto, ser “normal” para outra característica, como expressão gênica de um biomarcador especificado.
[0212] O termo “tecido fenotipicamente normal” refere-se ao tecido que tem as características físicas, por exemplo, aparência histológica, mesmo com, similar ou substancialmente similar às características que são consideradas normais. O termo “tecido fenotipicamente anormal” refere-se ao tecido que possui características físicas iguais, semelhantes ou substancialmente semelhantes às características consideradas anormais.
[0213] O termo “fenotipicamente homogêneo” significa que pelo menos uma ou mais características físicas, por exemplo, aparência histológica, são as mesmas, ou similares ou substancialmente similares às características identificadas como outros membros do grupo ou tipo de tecido, por exemplo, mama, cólon, pulmão.
[0214] O termo “tecido genotipicamente normal” refere-se ao tecido que possui o genoma, por exemplo, cromossômico, mitocondrial, RNA, microRNA e/ ou RNA não codificador, características, por exemplo, sequência genética, mesma, similar ou substancialmente similar às características que são consideradas normais. O termo “tecido genotipicamente anormal” refere-se ao tecido que tem as características genéticas, por exemplo, a sequência do gene, o mesmo com, similar ou substancialmente semelhante às características que são consideradas anormais.
[0215] O termo “geneticamente diverso” no que se refere a células, tecidos ou indivíduos, refere-se a um sujeito, tecido ou população celular onde pelo menos dois membros do grupo diferem um do outro ou pelo menos outro indivíduo, célula ou tecido no nível genômico. por exemplo, RNA cromossômico, mitocondrial, RNA, microRNA e/ ou não codificante. O termo “sujeito geneticamente homogêneo” no que se refere a dois ou mais indivíduos, refere- se a indivíduos que exibem um marcador específico ou característica substancialmente idêntica no nível genômico, por exemplo, cromossômico, mitocondrial, RNA, microRNA e/ ou RNA não codificante.
[0216] “Grupo étnico” refere-se a um grupo social que tem uma tradição nacional ou cultural comum. Em um aspecto, o termo significa membros de um grupo que deriva de uma origem genética comum ou intimamente relacionada.
[0217] O termo “molécula pequena” refere-se a um material orgânico de baixo peso molecular que pode ser usado para regular um processo biológico. Em um aspecto, o peso molecular varia de 0 - 100 daltons, 100 - 200 daltons, 200 - 300 daltons, 300 - 400 daltons, 400 - 500 daltons, 500 - 600 daltons, 600 - 700 daltons, 700 - 800 daltons, 800 - 900 daltons ou 900 - 1000 daltons. Em outro aspecto, o peso molecular é inferior a 1000 daltons. As pequenas moléculas incluem, mas não estão limitadas a compostos orgânicos, peptídios, metabolitos e lipídios.
[0218] O termo “corante” refere-se a uma substância que pode dar cor a um sujeito por absorção seletiva de luz. Em algumas formas de realização, um corante é solúvel ou sólido. Em outra forma de realização, o corante é retido no substrato por absorção, solução e retenção mecânica, ou por ligações químicas iónicas ou covalentes. Em uma outra forma de realização, um corante é qualquer molécula ou porção orgânica ou inorgânica que absorve radiação eletromagnética, por exemplo, com um comprimento de onda seletivo.
[0219] Como aqui utilizado, o termo “dados quantitativos” significa dados que expressam uma certa quantidade, quantidade ou intervalo que está associado com as unidades de medida. Por exemplo, os dados quantitativos para tumores incluem, mas não estão limitados aos tamanhos de tumores, ou níveis de expressão de biomarcadores.
[0220] Como usado aqui, o termo “dados qualitativos” refere-se a informações que descrevem as características, características ou outras naturezas de um objeto. Por exemplo, os dados qualitativos para o câncer incluem, mas não estão limitados aos estágios, aparência e outras características físicas do tumor.
[0221] Como usado aqui, o termo “normalizado”, no que se refere a um valor medido, visa o ajuste de um valor medido em diferentes escalas para uma escala nocionalmente comum.
[0222] Os genes são apenas um tipo de biomarcador de câncer. Como usado aqui, o termo “biomarcador” ou “marcador” refere-se a uma molécula biológica encontrada no sangue, outros fluidos corporais ou tecidos que é um sinal de um processo normal ou anormal, ou de uma condição ou doença (como câncer). Um biomarcador pode ser usado para determinar quão bem o corpo responde a um tratamento para uma doença ou condição ou se o sujeito está predisposto a uma doença ou condição. No contexto do câncer, um biomarcador refere-se a uma substância biológica que é indicativa da presença de câncer no corpo. Um biomarcador pode ser uma molécula secretada por um tumor ou uma resposta específica do corpo à presença de câncer. Os biomarcadores genéticos, epigenéticos, proteômicos, glicosídicos e de imagem podem ser usados para o diagnóstico, prognóstico e epidemiologia do câncer. Tais biomarcadores podem ser analisados em biofluidos coletados de forma não invasiva, como sangue ou soro. Vários biomarcadores baseados em genes e proteínas já foram utilizados no tratamento de pacientes, incluindo, mas não limitados a, AFP (Câncer de Fígado), BCR-ABL (Leucemia Mielóide Crônica), BRCA1/ BRCA2 (câncer de mama/ ovário), BRAF V600E (Melanoma/ Câncer Colorretal), CA - 125 (Câncer de Ovário), CA19.9 (Câncer de Pâncreas), CEA (Câncer Colorretal), EGFR (Carcinoma de pulmão de não-pequenas células), HER-2 (Câncer de Mama), KIT (tumor estromal gastrointestinal)), PSA (Antígeno Prostático Específico), S100 (Melanoma) e muitos outros. Os biomarcadores podem ser úteis como diagnósticos (para identificar cânceres em estágio de partida) e/ ou prognósticos (para prever quão agressivo é um câncer e/ ou prever como um indivíduo responderá a um tratamento específico e/ ou a probabilidade de recorrência de um câncer).
[0223] Como aqui utilizado, o termo “marcador clinicamente relevante” significa um marcador ou biomarcador que está relacionado com um resultado ou condição clínica, por exemplo, a presença ou ausência de uma doença ou condição, por exemplo, câncer.
[0224] Como aqui utilizado, o termo “tecido canceroso” refere-se a qualquer tecido contendo células tumorais. Os tecidos cancerosos incluem, mas não estão limitados a músculo, pele, cérebro, pulmão, fígado, baço, medula óssea, timo, coração, nódulo linfático, sangue, osso, cartilagem, pâncreas, rim, vesícula biliar, estômago, intestino, testículos, ovário, útero, reto, sistema nervoso, olho, glândula ou tecido conjuntivo.
[0225] “Prognóstico” significa previsão ou provável resultado da condição atual de um sujeito, incluindo a possibilidade de recidiva de câncer e/ ou metástase do câncer no paciente.
[0226] Como aqui utilizado, o termo “preservar” ou “fixar” refere-se a um passo na preparação de amostras biológicas, por exemplo seções histológicas. Os métodos de preservação ou fixação incluem, mas estão limitados a fixação química, fixação de calor, imersão, perfusão e/ ou liofilização. Assim, uma “amostra fixa” é uma amostra processada conforme mencionado acima.
[0227] O termo “células vivas” refere-se a quaisquer células que não foram fixadas ou preservadas. Em algumas formas de realização, o termo “célula viva” inclui uma célula funcional. Os peritos na especialidade podem facilmente distinguir entre uma célula viva e uma célula morta para os fins da presente invenção.
[0228] Como usado aqui, o termo “incorporação de cera” ou “inclusão em parafina” é usado para um processo no qual a amostra de tecido é infundida com cera de parafina para preservar suas estruturas celulares quando selecionada usando um micrótomo, e tem o benefício adicional de ser adequado para armazenamento de longo prazo.
[0229] Como aqui utilizado, o termo “um ou mais tecidos” refere-se a tecidos de um ou mais sujeitos, ou um ou mais tecidos do mesmo sujeito. O termo “dois ou mais tecidos” é usado para tecido de dois ou mais sujeitos, ou dois ou mais tecidos do mesmo sujeito ou paciente.
[0230] Como usado aqui, o termo “células pré-malignas ou malignas” é usado para descrever quaisquer células que sofreram transformação maligna ou estão preparadas para sofrer transformação maligna. As características das células pré-malignas ou malignas incluem, mas não estão limitadas a proliferação descontrolada, metástase, metabolismo celular anormal, evasão de apoptose, autossuficiência com sinais de crescimento e angiogênese sustentada. Por exemplo, um pólipo do cólon pode ser pré-maligno para câncer de cólon.
[0231] Como aqui utilizado, o termo “células tumorais circulantes” refere-se a células tumorais ou cancerígenas que circulam no interior da vasculatura, vasos linfáticos ou outro fluido. As células tumorais circulantes incluem, mas não estão limitadas a células leucêmicas.
[0232] Como aqui utilizado, o termo “tecido adjacente normal” refere-se ao tecido normal adjacente a uma célula tumoral ou a um tecido tumoral.
[0233] O termo “reconstruir”, no que se refere à reconstrução da amostra homogeneizada, visa misturar ou combinar.
[0234] O termo “extraindo um constituinte” no que se refere ao material homogeneizado pretende isolar ou purificar um componente de uma estrutura celular
[0235] Como aqui utilizado, o termo “amostra FFPE” significa amostra incluída em parafina fixada em formalina. A amostra de FFPE pode ser usada para vários estudos médicos, incluindo, mas não se limitando a diagnóstico, IHC e expressão genética ou origens de doenças.
[0236] O termo “valor predeterminado” aqui geralmente representa um valor que é usado para calcular a variação de dados. Em um aspecto, um valor predeterminado é calculado com base em dados históricos, ou um grupo diferente de amostras, ou um grupo de amostras que são semelhantes aos dados a serem estudados.
[0237] O termo “valor de risco” refere-se ao valor quantitativo ou qualitativo associado a um risco. Por exemplo, o valor do risco de câncer é o valor que quantifica ou qualifica o risco de contrair câncer.
[0238] O termo “translocação cromossômica” refere-se a uma anormalidade cromossômica causada pelo rearranjo de partes entre cromossomos não-homólogos.
[0239] O termo “inversão intra-cromossômica” refere-se a um rearranjo cromossômico no qual um segmento de um cromossomo é revertido de ponta a ponta. Em um aspecto, uma inversão ocorre quando um único cromossomo sofre ruptura e rearranjo em si mesmo.
[0240] O termo “regime terapêutico” é usado de acordo com um significado bem conhecido na técnica. Por exemplo, o termo refere-se a um plano de tratamento para um indivíduo que sofre de uma condição patológica (por exemplo, infeção crônica por hepatite C ou câncer) que especifica fatores incluindo, mas não limitado ao agente ou agentes a serem administrados ao paciente, as dosagens de tal agente(s) e o horário e duração do tratamento. Uma dosagem ou regime de tratamento personalizado é uma terapia ou regime de dosagem baseado em conceitos de medicina de precisão, levando em conta as características individuais do paciente ou do indivíduo, por exemplo, constituição genética, farmacogenética, etnia, história de tratamento, história familiar, química clínica ou outras características ou medições relevantes.
[0241] O termo “quimioterapia” refere-se ao tratamento com um agente químico. A quimioterapia pode ser definida como a utilização de produtos farmacêuticos especificamente projetados para atacar, combater e/ ou destruir células doentes. Exemplos não limitativos de doenças que podem ser tratadas por quimioterapia incluem cânceres, doenças autoimunes, tais como, esclerose sistêmica, lúpus eritematoso, artrite reumatóide, vasculite e infecções virais. Em um aspecto, o agente quimioterápico destrói as células cancerígenas, visando as células em rápida divisão no corpo. Devido à falta de especificidade para as células cancerígenas, os efeitos tóxicos da quimioterapia também são observados em outras células não cancerígenas de divisão rápida. Células sanguíneas, células da boca, trato intestinal, nariz, unhas e cabelos são algumas das células que se dividem rapidamente no corpo. A destruição de células normais no corpo causa efeitos colaterais como alopecia, caquexia, anemia, leucopenia e neutropenia. Esses efeitos colaterais limitam a eficácia da quimioterapia e aumentam o risco de redução da dose, impactando diretamente na sobrevida do paciente.
[0242] O termo “imunoterapia” refere-se a tratamento envolvendo ativação ou inativação de uma resposta imune específica e/ ou função (ões) imune efetoras.
[0243] O termo “radiação” ou “terapia de radiação” refere-se a um tratamento envolvendo o uso de partículas ou ondas de alta energia, incluindo, mas não limitado a raios X, raios gama, elétrons ou prótons, ao tratamento de doenças (por exemplo, câncer). ou uma condição patológica.
[0244] O termo “cirurgia” refere-se a qualquer ação metódica, com ou sem instrumentos, em um paciente, para produzir um efeito curativo ou corretivo.
[0245] O termo “terapia genética” refere-se à utilização de um processo de transferência de genes ou processo de edição de genes (por exemplo CRISPR), preferencialmente, com a finalidade de causar um efeito terapêutico em um sujeito ou em um paciente.
[0246] O termo “terapia hormonal”, como aqui utilizado, é definido como um tratamento pertencente à modulação de hormonas. Uma terapia hormonal pode incluir, mas não está limitada a remover a glândula que sintetiza o hormônio ou o pró-hormônio, bloqueando ou inibindo a síntese de hormônios, ou impedindo que o hormônio se ligue a seu receptor, ou regulando ou degradando o receptor hormonal.
[0247] O termo “terapia com células estaminais” como aqui utilizado é um tratamento utilizando células estaminais para tratar ou prevenir uma doença ou condição patológica.
[0248] O termo “transfusão” refere-se a um procedimento de receber sangue através de uma linha intravenosa.
[0249] Como aqui utilizado, o termo “fisioterapia” refere-se ao tratamento de disfunção ou lesão física pelo uso de exercício terapêutico e a aplicação de modalidades, destinadas a restaurar ou facilitar a função ou desenvolvimento normal.
[0250] Como aqui utilizado, o termo “terapia fotodinâmica” refere- se a um processo pelo qual a luz de um comprimento de onda específico é dirigida a tecidos ou células submetidas a tratamento ou investigação que se tornaram fotossensíveis através da administração de um agente foto reativo ou foto sensibilizador. Em uma forma de realização, o objetivo pode ser diagnóstico, em que o comprimento da onda da luz é selecionado para fazer com que o agente foto reativo fluorescência, proporcionando assim informação sobre o tecido sem danificar o tecido. O objetivo também pode ser terapêutico, em que o comprimento da onda da luz distribuído ao tecido alvo sob tratamento faz com que o agente foto reativo sofra uma interação fotoquímica com oxigênio que origina uma espie de elevada energia, tal como, oxigênio singleto, causando lise ou destruição tecidual local ou o desencadeamento de resposta imunológica do tecido ou célula foto sensibilizada.
[0251] Como aqui utilizado, o termo “expressão diferencial” refere- se às diferenças nos níveis de expressão de genes ou proteínas de duas ou mais amostras. Em um aspecto, os resultados da expressão diferencial podem ser usados para identificar a doença, um biomarcador ou quaisquer padrões que possam estar associados a condições patológicas.
[0252] Como usado aqui, o termo “primeiro perfil” refere-se ao conjunto de dados de um sujeito ou um grupo de sujeitos. Em um aspecto, o primeiro perfil pode ser usado como uma linha de base para determinar as alterações no(s) perfil(is) subsequente(s). Em outro aspecto, os dados no primeiro perfil podem ser incorporados na análise subsequente ou no processo de geração dos perfis subsequentes.
[0253] Como usado aqui, o termo “perfil predeterminado” refere-se a um conjunto de dados ou painéis de conjuntos de dados que estão associados a condições fisiológicas. O perfil predeterminado pode derivar de um sujeito ou grupo de sujeitos. Em um aspecto, o perfil predeterminado pode incluir o conjunto de dados histológicos ou conhecidos de condições fisiológicas. Em outro aspecto, o perfil predeterminado é utilizado como uma linha de base para determinar as alterações das condições fisiológicas (por exemplo, progressão do tumor).
[0254] Como aqui utilizado, o termo “pontuação quantitativa” refere-se a uma representação numérica das condições fisiológicas (por exemplo, risco de doença).
[0255] Como usado aqui, o termo “proliferação” significa crescimento e divisão de células. Em algumas formas de realização, o termo “proliferação”, como aqui utilizado em referência a células, refere-se a um grupo de células que podem aumentar em número durante um período de tempo.
[0256] O termo “apoptose” refere-se ao processo de morte celular programada. Em alguns aspectos, a apoptose é acompanhada de alterações morfológicas celulares e perda de viabilidade celular.
[0257] O termo “necrose” abrange estados de necrose celular, bem como estados intermediários, exibindo características necróticas e apoptóticas.
[0258] O termo “migração celular”, tal como, aqui utilizado, significa a migração de células induzida por substâncias fisiologicamente ativas ou como causada por alterações fisiológicas (por exemplo, transformação).
[0259] O termo “transição epitelial-mesenquimal” ou “EMT” refere- se a um processo no qual células epiteliais que são normalmente não proliferativas e não móveis sofrem transição para células mesenquimais caracterizadas por um fenótipo proliferativo e móvel. EMT é um mecanismo central para a diversificação de células encontradas em tecidos complexos, portanto, é um processo envolvido na organização da formulação do plano corporal (Kalluri and Nelson J Clin Invest 112(12):1776-1784, 2003). Apesar de as células epiteliais terem sido consideradas uma vez diferenciadas, é reconhecido que os epitélios possuem um elemento de plasticidade que permite a transição para células mesenquimais móveis (Boyer et al. Biochem Pharmacol 60:1099, 2000; Nieto Nat Rev Mol Cell Biol 3:155-166, 2002). A EMT é necessária, portanto, em tecido adulto para permitir a formação de fibroblastos em tecidos lesionados (Strutz et al. J Cell Biol 130:393-405, 1995; Iwano et al. J Clin Invest 110:341-350, 2002) e em iniciando, metástases em câncer epitelial (Kiermer et al. Oncogene 20:6679-6688, 2001; Janda et al. J Cell Biol 156:299313, 2002; Xue et al. Cancer Res 63:3386-3394, 2003).
[0260] Em um aspecto, a EMT é um processo de desagregação de unidades epiteliais e remodelação de epitélios para o movimento na formação de células mesenquimais. A transição requer uma reprogramação molecular do epitélio, geralmente considerada por uma variedade de citocinas, metaloproteinases e inibidores de montagem de membrana (Kalluri and Neilson 2003 supra; Yang and Liu Am J Pathol 159:1465-1475, 2001; Zeisberg et al. Am J Pathol 159:1313-1321, 2001; Fan Kindney Int 56:1455-1467, 1999).
[0261] Como usado aqui, o termo “mitose” pode ser usado de forma intercambiável com o termo “divisão celular”. Em algumas modalidades, mitose refere-se a apenas uma fase do processo de divisão celular: o processo no qual as cromátides irmãs são divididas igualmente entre as duas células filhas. Em células eucarióticas, a mitose é seguida por citocinese, que é o processo pelo qual o citoplasma da célula é clivado em duas células filhas distintas, mas geneticamente idênticas.
[0262] No início da mitose, pequenas estruturas filamentosas intracelulares conhecidas como microtúbulos citoplasmáticos, dos quais o principal componente é uma proteína chamada tubulina, desmontam-se em moléculas de tubulina. A tubulina então se reagrupa em microtúbulos formando uma estrutura intracelular conhecida como “fuso mitótico”. O fuso mitótico desempenha um papel crítico na distribuição de cromossomos dentro da célula divisória precisamente entre os dois núcleos filhos. As células cancerígenas são caracterizadas por uma divisão celular e proliferação mais rápidas do que as observadas na maioria das células saudáveis, e muitos agentes anticancerígenos operam inibindo a divisão celular. Uma vez que as células cancerígenas se dividem mais rapidamente do que as células saudáveis, as células cancerígenas são preferencialmente mortas por agentes anticancerígenos que inibem a mitose. Tais compostos são chamados de “antimitóticos”.
[0263] O termo “parada do ciclo celular” refere-se a um ponto de parada no ciclo celular no qual as células não estão nos processos que envolvem duplicação e divisão. O ciclo celular natural inclui vários pontos de verificação que permitem que a célula determine se deve prosseguir com a divisão ou parar. Essas paradas também podem ser induzidas por fatores externos, como exposição à radiação ou medicamentos usados para controlar o crescimento celular.
[0264] A primeira fase do ciclo celular é G1, onde uma célula se prepara para duplicar. O material genético das células é duplicado durante a fase S. O dano celular é reparado durante a fase G2 antes de passar para M, mitose. Após a mitose, uma célula pode entrar novamente em G1 ou se mover para G0, o estágio de repouso. Um ponto de verificação interrompe temporariamente o ciclo celular em cada fase para permitir que a célula decida se deve continuar. Algumas células são programadas para duplicar com pouca frequência, enquanto as células danificadas podem precisar de tempo para reparo ou destruição.
[0265] Em algumas formas de realização, a paragem do ciclo celular precede a apoptose ou morte celular. Isso ocorre quando uma célula não está mais funcional devido a danos no DNA. A célula é direcionada para destruição. A parada do ciclo celular permite células para a célula, verificando periodicamente os sinais de destruição do DNA que podem causar problemas funcionais ou levar ao desenvolvimento de um tumor.
[0266] O termo “fase S” refere-se ao período durante o ciclo celular no qual o DNA é replicado. A fase são ocorre normalmente entre a fase G1 e a fase G2. A replicação precisa e precisa do DNA durante a fase são é necessária para prevenir anormalidades genéticas.
[0267] O termo “senescência”, como usado aqui, refere-se à cessação permanente da replicação do DNA e crescimento celular que não é reversível por fatores de crescimento. Este fenômeno pode ocorrer no final da vida proliferativa de células normais ou em células normais ou tumorais em resposta a drogas citotóxicas, danos no DNA. A senescência é caracterizada por certas características morfológicas, incluindo, mas não se limitando a aumento do tamanho das células, morfologia celular achatada, granularidade aumentada e a presença de atividade da β-galactosidase associada à senescência (SA-β- gal).
[0268] Como aqui utilizado, o termo “diferenciação” refere-se a um processo no qual a estrutura ou função das células é especializada durante a divisão, proliferação e crescimento das mesmas. Geralmente, a diferenciação refere-se a um fenômeno em que um sistema relativamente simples é dividido em dois ou mais sistemas parciais qualitativamente diferentes.
[0269] Como usado aqui, o termo “detecção” refere-se à ação ou processo de identificação da presença de uma molécula específica. Em uma forma de realização, a detecção de um biomarcador pode referir-se à identificação da expressão de um biomarcador.
[0270] Como usado aqui, o termo “agente fixador” refere-se a um agente usado para fixação de tecido para vários propósitos, incluindo, mas não limitado a entrega, armazenamento, estudo histológico e processamento.
[0271] Como aqui utilizado, os termos “sequência de ácido nucleico” e “polinucleotídico” são utilizados alternadamente para referir uma forma polimérica de nucleotídios de qualquer comprimento, quer ribonucleotídios quer desoxirribonucleotídios. Assim, este termo inclui, mas não está limitado a, DNA ou RNA de cadeia simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, DNAc, híbridos DNA - RNA, ou um polímero que compreende bases de purina e pirimidina ou outras bases naturais, químicas ou bases nucleotídicas modificadas bioquimicamente, não naturais ou derivatizadas.
[0272] O termo “codificar” à medida que é aplicado às sequências de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídico quando no seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica pode ser transcrito e/ ou traduzido para produzir um mRNA. A cadeia antessentido é o complemento de um tal ácido nucleico, e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir daí.
[0273] Como aqui utilizado, o termo “vetor” refere-se a uma construção de ácido nucleico demarcada para transferência entre diferentes hospedeiros, incluindo, mas não limitado a um plasmídeo, um vírus, um cosmídeo, um fago, um BAC, um YAC, etc. Em algumas formas de realização, os vetores plasmídicos podem ser preparados a partir de vetores disponíveis comercialmente. Em outras formas de realização, os vetores virais podem ser produzidos a partir de baculovírus, retrovírus, adenovírus, AAV, etc., de acordo com técnicas conhecidas na técnica. Em uma forma de realização, o vetor viral é um vetor lentiviral.
[0274] O termo “promotor”, como aqui utilizado, refere-se a qualquer sequência que regula a expressão de uma sequência codificadora, tal como, um gene. Os promotores podem ser constitutivos, indutíveis, repressíveis ou específicos de tecidos, por exemplo. Um “promotor” é uma sequência de controlo que é uma região de uma sequência polinucleotídica na qual a iniciação e a taxa de transcrição são controladas. Pode conter elementos genéticos nos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como a RNA polimerase e outros fatores de transcrição.
[0275] Como usado aqui, o termo “célula isolada” geralmente se refere a uma célula que é substancialmente separada de outras células de um tecido.
[0276] Uma “quantidade efetiva” ou “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de um agente, ou quantidades combinadas de dois ou mais agentes, que, quando administrados para o tratamento de um paciente, mamífero ou outro indivíduo, é suficiente para efetuar tal tratamento. a doença. A “quantidade efetiva” irá variar dependendo do(s) agente(s), da doença e sua gravidade e da idade, peso, etc., do sujeito a ser tratado.
[0277] Como aqui utilizado, o termo “marcador ou marcador detectável” refere-se a pelo menos um marcador capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Uma lista não exaustiva de marcadores inclui enzimas que produzem um sinal detectável, por exemplo por colorimetria, fluorescência, luminescência, tal como, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, desidrogenase glicose-6-fosfato, cromóforos como fluorescentes, corantes luminescentes, grupos com densidade de elétrons detectados por microscopia eletrônica ou por suas propriedades elétricas como condutividade, amperometria, voltametria, impedância, grupos detectáveis, por exemplo cujas moléculas são de tamanho suficiente para induzir modificações detectáveis em suas propriedades físicas e/ ou químicas, como detecção pode ser realizado por métodos ópticos, como difração, ressonância plasmônica de superfície, variação de superfície, mudança de ângulo de contato ou métodos físicos, como espectroscopia de força atômica, efeito de túnel ou moléculas radioativas, como 32P, 35S ou 125I.
[0278] Como aqui utilizado, o termo “marcador de purificação” refere-se a pelo menos um marcador útil para purificação ou identificação. Uma lista não exaustiva de marcadores inclui His, lacZ, GST, proteína de ligação a maltose, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, cereja, tioredoxina, poli (NANP), V5, Snap, HA, proteína de ligação à quitina, Softag 1, Softag 3, Strep ou S-proteína. Marcadores de fluorescência diretos ou indiretos adequados compreendem FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, cereja, Cy3, Cy5, Cy5,5, Cy7, DNP, AMCA, Biotina, Digoxigenina, Tamra, Texas Red, rodamina, Alexa fluors, FITC, TRITC ou qualquer outro corante fluorescente ou hapteno.
[0279] Como aqui utilizado, o termo “expressão” refere-se ao processo pelo qual os polinucleotídios são transcritos em mRNA e/ ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídios, polipeptídios ou proteínas. Se o polinucleotídico é derivado do DNA genômico, a expressão pode incluir o processamento do mRNA em uma célula eucariótica. O nível de expressão de um gene pode ser determinado medindo a quantidade de mRNA ou proteína em uma amostra de células ou tecido. Em um aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado ao nível de expressão desse gene a partir de uma amostra de controle ou referência. Em outro aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado com o nível de expressão desse gene a partir da mesma amostra após administração de um composto.
[0280] Como usado aqui, “homologia” ou “idêntica”, “identidade percentual” ou “similaridade”, quando usada no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma percentagem especificada de nucleotídios ou resíduos de aminoácidos que são iguais, por exemplo, pelo menos 60 % de identidade, de preferência pelo menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % de identidade, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou superior em relação a uma região especificada (por exemplo, sequência nucleotídica que codifica um anticorpo aqui descrito ou sequência de aminoácidos de um anticorpo aqui descrito). A homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nessa posição. Um grau de homologia entre sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências. O alinhamento e a percentagem de homologia ou identidade de sequência podem ser determinadas utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo os descritos no Suplemento 30 dos Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) seção 7.7.18, Tabela 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrão são usados para o alinhamento. Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão. Em particular, programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; vertente = ambos; ponto de corte = 60; esperar = 10; Arranjo = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenar por = ALTA PONTUAÇÃO; Bancos de dados = não-redundantes, traduções do GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. Os termos “homologia” ou “idêntico”, “identidade percentual” ou “similaridade” também se referem ou podem ser aplicados ao complemento de uma sequência de teste. Os termos também incluem sequências que possuem eliminações e/ ou adições, bem como aquelas que têm substituições. Como aqui descrito, os algoritmos preferidos podem explicar as lacunas e semelhantes. De um modo preferido, existe identidade em uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídios de comprimento ou, de um modo mais preferido, sobre uma região que tem pelo menos 50-100 aminoácidos ou nucleotídios de comprimento. Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” partilha menos do que 40 % de identidade, ou alternativamente menos do que 25 % de identidade, com uma das sequências aqui divulgadas.
[0281] Em um aspecto, o termo “equivalente” ou “equivalente biológico” de um anticorpo significa a capacidade do anticorpo para se ligar seletivamente à sua proteína epitópica ou seu fragmento, conforme medido por ELISA ou outros métodos adequados. Os anticorpos biologicamente equivalentes incluem, mas não se limitam aos anticorpos, peptídios, fragmentos de anticorpo, variante de anticorpo, derivado de anticorpo e miméticos de anticorpo que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência.
[0282] Deve ser inferido sem recitação explícita e, a menos que se pretenda de outra forma, que quando a presente invenção se refere a um polipeptídio, proteína, polinucleotídico ou anticorpo, um equivalente ou um biologicamente equivalente de tal é pretendido dentro do escopo desta invenção. Como aqui utilizado, o termo “equivalente biológico do mesmo” pretende ser sinónimo de “equivalente do mesmo” quando se refere a uma proteína, anticorpo, polipeptídio ou ácido nucleico de referência, pretende que possuam homologia mínima enquanto ainda mantém a estrutura ou funcionalidade desejada. A menos que especificamente aqui descrito, é contemplado que qualquer polinucleotídico, polipeptídio ou proteína aqui mencionado também inclui equivalentes dos mesmos. Por exemplo, um equivalente pretende pelo menos cerca de 70 % de homologia ou identidade, ou pelo menos 80 % de homologia ou identidade e alternativamente, ou pelo menos cerca de 85 %, ou alternativamente pelo menos cerca de 90 %, ou alternativamente pelo menos cerca de 95 %, ou alternativamente 98 % por cento de homologia ou identidade e exibe atividade biológica substancialmente equivalente à proteína de referência, polipeptídio ou ácido nucleico. Alternativamente, quando se refere a polinucleotídios, um equivalente do mesmo, um polinucleotídio que hibrida sob condições rigorosas com o polinucleotídio de referência ou o seu complemento.
[0283] Uma região polinucleotídica ou polinucleotídica (ou uma região polipeptídica ou polipeptídica) com uma certa percentagem (por exemplo, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %) de identidade de sequência a outra sequência significa que, quando alinhada, essa percentagem de bases (ou aminoácidos) são as mesmas na comparação das duas sequências. O alinhamento e a percentagem de homologia ou identidade de sequência podem ser determinadas utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo os descritos no Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) suplemento 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrão são usados para o alinhamento. Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão. Em particular, programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; vertente = ambos; ponto de corte = 60; esperar = 10; Arranjo = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenar por = ALTA PONTUAÇÃO; Bancos de dados = não-redundantes, traduções do GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
[0284] “Hibridização” refere-se a uma reação na qual um ou mais polinucleotídios reagem para formar um complexo que é estabilizado através de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos nucleotídicos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson-Crick, ligação a Hoogstein, ou de qualquer outra forma específica única da sequência. O complexo pode compreender duas cadeias que formam uma estrutura de cadeia dupla, três ou mais cadeias formando um complexo de cadeia múltipla, uma cadeia de auto hibridação única ou qualquer combinação destas. Uma reação de hibridização pode constituir um passo em um processo mais extenso, tal como, o início de uma reação de PCR, ou a clivagem enzimática de um polinucleotídio por uma ribozima.
[0285] Exemplos de condições de hibridização rigorosas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 25 °C a cerca de 37 °C; concentrações em tampão de hibridização de cerca de 6x SSC a cerca de 10x SSC; concentrações de formamida de cerca de 0 % a cerca de 25 %; e lavar soluções de cerca de 4x SSC para cerca de 8x SSC. Exemplos de condições de hibridização moderadas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 40 a cerca de 50; concentrações de tampão de cerca de 9x SSC para cerca de 2x SSC; concentrações de formamida de cerca de 30 % a cerca de 50 %; e lavar soluções de cerca de 5x SSC para cerca de 2x SSC. Exemplos de condições de severidade elevada incluem: temperaturas de incubação de cerca de 55 °C a cerca de 68 °C; concentrações de tampão de cerca de 1x SSC a cerca de 0,1x SSC; concentrações de formamida de cerca de 55 % a cerca de 75 %; e lavar soluções de cerca de 1x SSC, 0,1x SSC, ou água deionizada. Em geral, os tempos de incubação da hibridização são de 5 minutos a 24 horas, com 1, 2 ou mais etapas de lavagem, e os tempos de incubação da lavagem são de cerca de 1, 2 ou 15 minutos. SSC é NaCl 0,15 M e tampão citrato 15 mM. Entende-se que os equivalentes de SSC utilizando outros sistemas tampão podem ser utilizados.
[0286] O termo “isolado”, tal como, aqui utilizado, refere-se a moléculas, células ou materiais biológicos ou celulares sendo substancialmente isentos de outros materiais. Em um aspecto, o termo “isolado” refere-se a ácido nucléico, como DNA ou RNA, ou proteína ou polipeptídio (por exemplo, um anticorpo ou derivado do mesmo), ou organela celular ou celular, ou tecido ou órgão, separado de outros DNAs ou RNAs, ou proteínas ou polipeptídios, ou células ou organelas celulares, ou tecidos ou órgãos, respectivamente, que estão presentes na fonte natural. O termo “isolado” também se refere a um ácido nucleico ou peptídio que é substancialmente isento de material celular, material viral ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Além disso, um “ácido nucleico isolado” pretende incluir fragmentos de ácido nucleico que não ocorrem naturalmente como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado” é também aqui utilizado para referir polipeptídios que são isolados de outras proteínas celulares e pretende abranger tanto polipeptídios purificados como recombinantes. O termo “isolado” também é usado aqui para se referir a células ou tecidos que são isolados de outras células ou tecidos e deve abranger tanto a cultura como a engenharia.
[0287] O termo “célula individual” ou “célula única” significa uma unidade estrutural e/ ou funcional de um organismo. Em alguns aspectos, a célula individual inclui, mas não se limita ao citoplasma, núcleo ou membrana celular.
[0288] Como aqui utilizado, o termo “anticorpo monoclonal” refere- se a um anticorpo produzido por um único clone de linfócitos B ou por uma célula na qual os genes das cadeias leve e pesada de um único anticorpo foram transfectados. Os anticorpos monoclonais são produzidos por métodos conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, produzindo células híbridas formadoras de anticorpos a partir de uma fusão de células de mieloma com células do baço imune. Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos monoclonais humanizados.
[0289] O termo “proteína”, “peptídio” e “polipeptídio” são utilizados alternadamente e no seu sentido mais lato para se referirem a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidades, análogos de aminoácidos ou pepeptídiomiméticos. As subunidades podem estar ligadas por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Uma proteína ou peptídio deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que pode compreender uma proteína ou sequência do peptídio. Como aqui utilizado, o termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos naturais e/ ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isómeros ópticos D e L, análogos de aminoácidos e pepeptídiomiméticos.
[0290] Como usado aqui, o termo “purificado” não requer pureza absoluta; em vez disso, é pretendido como um termo relativo. Assim, por exemplo, um ácido nucleico purificado, peptídio, proteína, complexos biológicos ou outro composto ativo é aquele que é isolado no todo ou em parte a partir de proteínas ou outros contaminantes. Geralmente, peptídios, proteínas, complexos biológicos ou outros compostos ativos substancialmente purificados para utilização na invenção compreendem mais de 80 % de todas as espécies macromoleculares presentes em uma preparação antes da mistura ou formulação do peptídio, proteína, complexo biológico ou outro composto ativo. com um veículo farmacêutico, excipiente, tampão, agente intensificador da absorção, estabilizante, conservante, adjuvante ou outro co-ingrediente em uma formulação farmacêutica inteira para administração terapêutica. Mais tipicamente, o peptídio, proteína, complexo biológico ou outro composto ativo purificado para representar mais de 90 %, frequentemente mais de 95 % de todas as espies macromoleculares presentes em uma preparação purificada antes da mistura com outros ingredientes da formulação. Em outros casos, a preparação purificada pode ser essencialmente homogênea, em que outras espécies macromoleculares não são detectáveis por técnicas convencionais.
[0291] Como aqui utilizado, o termo “proteína recombinante” refere-se a um polipeptídio que é produzido por técnicas de DNA recombinante, em que geralmente o DNA codificando o polipeptídio é inserido em um vetor de expressão adequado que é por sua vez utilizado para transformar uma célula hospedeira para produzir o heterólogo. proteína.
[0292] Como usado aqui, o termo “sonicação” refere-se à aplicação de ondas sonoras (energia acústica) transmitidas através de um meio líquido. As ondas sonoras podem causar partículas (por exemplo, células ou aglomerados de células) a oscilar em torno da sua posição média. Em um aspecto, a sonicação leva à dissociação de clusters de células para suspensão de células individuais.
[0293] Como utilizado aqui, “tratar” ou “tratamento” de uma doença em um sujeito refere-se a (1) prevenir que os sintomas ou doença ocorra em um sujeito que esteja predisposto ou ainda não exiba sintomas da doença; e/ ou (2) inibir a doença ou interromper seu desenvolvimento; e/ ou (3) melhorar ou causar a regressão da doença ou os sintomas da doença. Como entendido na técnica, “tratamento” é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para os fins da presente tecnologia, os resultados benéficos ou desejados podem incluir um ou mais, mas não estão limitados a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estabilizado (isto é, não agravamento) estado de um estado (incluindo doença), atraso ou abrandamento do estado (incluindo doença), progressão, melhoria ou paliação do estado (incluindo doença), estados e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectável.
AMOSTRAS SUBSTANCIALMENTE HOMOGÊNEAS REPRESENTATIVAS
[0294] A invenção aborda as limitações dos métodos de amostragem clínica do estado da técnica que falham em fornecer uma amostra representativa. As características de uma amostra representativa são paralelas às principais variáveis e características da entidade ou amostra maior. A prática atual de amostragem seletiva visa coletar amostras de tecido de modo a atender aos requisitos do sistema de estadiamento TNM. As amostras para o sistema de estadiamento TNM são especificamente tomadas de modo a refletir a anatomia normal do órgão removido contendo o tumor. Embora importante para o estágio prognóstico do sistema TNM, este método de amostragem seletiva produz amostras de tumor enviesadas, ou amostras que não contêm a diversidade genética e fenotípica encontrada em toda a massa tumoral.
[0295] A presente invenção proporciona uma composição homogeneizada processada derivada de uma amostra de tecido heterogênea, que compreende estruturas celulares substancialmente homogeneamente distribuas, em que uma proporção de estruturas celulares em cada e/ ou qualquer subconjunto da amostra representativa substancialmente semelhante relação de estruturas celulares na amostra de tecido heterogêneo de origem. A composição homogeneizada é uma nova amostra de tecido única que também representa as principais características da amostra original de tecido heterogêneo. As composições e métodos para preparar as composições como aqui descritas superam a incapacidade dos métodos do estado da técnica para explicar a questão de heterogeneidade de tecido em amostras clínicas, especialmente amostras para utilização em campos clínicos, por exemplo, oncologia clínica.
[0296] A amostra representativa da presente invenção é ilustrada nas Figuras 2A e 2B, que mostram uma representação esquemática do material homogeneizado da invenção. Figura 2 Mostra um tumor com três subclones presentes em diferentes proporções. Os métodos de homogeneização divulgados geram uma amostra representativa que contém subclones na proporção em que eles existiram dentro do tumor sólido. Qualquer amostra retirada do material homogeneizado conterá cada subclone na mesma proporção que a presente no tumor original. Figura 2B é uma ilustração de como a detecção de instalações de materiais homogeneizados de subclones de baixa prevalência.
[0297] As amostras representativas da presente invenção superam os desafios de amostragem impostos pela estrutura tridimensional espacialmente estratificada de um tecido. Na amostra representativa, os componentes (estruturas celulares, células, peptídios, ácidos nucleicos, lipídios, metabolitos, etc.) do órgão, tumor ou tecido espacialmente estratificado original (“OTT”) estão presentes em uma sub-amostra ou subconjunto de a amostra na proporção em que existiam no OTT original. Em algumas formas de realização, a amostra representativa refere-se a uma amostra do OTT que constitui o máximo possível do OTT, aproximando-se da totalidade do OTT ou abrangendo uma porção significativa do OTT para se aproximar do objetivo de representar a diversidade do OTT. ao nível de aglomerados de células ligadas, células individuais, fragmentos de células, organelas, peptídios, ácidos nucleicos, lipídios, metabolitos, etc. A amostra representativa pode conter a quantidade mínima de OTT intacta necessária para abranger a diversidade do OTT.
[0298] Várias amostras representativas podem ser feitas a partir de um único OTT. Nesta forma de realização, o OTT removido cirurgicamente é primeiro processado ou de outro modo manipulado em subunidades separadas, de tal modo que cada subunidade é composta por estruturas celulares espacialmente estratificadas, células, peptídios, ácidos nucleicos, etc. Cada subunidade é então suficientemente homogeneizada, misturada ou de outra forma interrompido para produzir uma amostra representativa da subunidade OTT.
[0299] A amostra representativa pode ser homogeneizada ou de outro modo misturada ou rompida, a ponto de qualquer amostra analítica, ou porção da amostra representativa, conter uma amostragem aleatória do material presente na amostra representativa. É característico da amostra analítica que é uma fração suficientemente grande da amostra representativa que abrange a diversidade da amostra representativa, relativa à saída pretendida do teste analítico a ser aplicado (isto é, células v. Pedaços de células). Na amostra representativa, qualquer amostra analítica usada para um ensaio específico produziria dados consistentes com outra amostra analítica usada para o mesmo ensaio, com erro experimental. Além disso, está contemplado que qualquer subconjunto da amostra representativa escolhida para um ensaio específico proporcionaria informação que poderia ser cruzada com dados gerados com diferentes ensaios utilizando amostras analíticas tiradas da mesma amostra representativa, ou de outras amostras representativas feitas de OTTs. do mesmo paciente. Está também contemplado que, porque as proporções originais dos componentes biológicos originais estão presentes em cada sub-amostra analítica, os dados produzidos a partir de sub-amostras analíticas referentes às proporções dos componentes biológicos dos OTTs podem ser comparados entre os pacientes.
[0300] Em uma forma de realização, a amostra representativa é uma composição homogeneizada processada derivada de uma amostra de tecido heterogêneo. A composição homogeneizada compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste ainda, em estruturas celulares substancialmente homogeneamente distribuas, em que uma proporção de estruturas celulares em cada subconjunto do material homogeneizado substancialmente similar relação de estruturas celulares na amostra de tecido. Em uma modalidade, a amostra de tecido é selecionada do grupo de: um tumor, um nódulo linfático, uma metástase, um pólipo, um cisto, uma ressecção, um órgão ou uma fração destes. Em outra forma de realização, a amostra de tecido compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em estruturas celulares espacialmente segregadas. Em outro aspecto, as estruturas celulares compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente de, ou ainda consistem ainda em um aglomerado de células, uma célula individual, um fragmento de uma célula, uma organela, um peptídio, um ácido nucleico, um lipídio, um metabolito, ou uma combinação destes. Em um aspecto, o material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em até 25 % de estruturas celulares a partir da amostra de tecido. Em um aspecto, o material homogeneizado compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda, consiste ainda em até 50 % de estruturas celulares a partir da amostra de tecido. Em outro aspecto, o material homogeneizado compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda, consiste ainda em até 75 % de estruturas celulares a partir da amostra de tecido. Em um aspecto diferente, o material homogeneizado compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda, consiste ainda em até 100 % de estruturas celulares a partir da amostra de tecido. Em outro aspecto, o material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em 100 % de estruturas celulares da amostra de tecido.
[0301] Em outra forma de realização, o material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste em, 100 % de estruturas celulares da amostra de tecido. Em um aspecto, a amostra de tecido compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda, em uma amostra de tecido não líquido. Em outro aspecto, a amostra de tecido compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em uma amostra de tecido líquido. Em um aspecto, a amostra de tecido líquido compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um tecido isolado por uma ou mais resseções cirúrgicas, um aspirado de agulha de citologia, uma amostra de efusão, ou um esfregaço de Papanicolau.
[0302] Ainda em outra forma de realização, as estruturas celulares substancialmente homogêneas compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda em uma pluralidade de células individuais ou em uma pluralidade de agregados de células. Em um aspecto, as estruturas celulares são isoladas de um tecido normal. Em outro aspecto, as estruturas celulares são isoladas de um tecido fenotipicamente ou genotipicamente normal. Ainda em outro aspecto, as estruturas celulares são isoladas de um tecido anormal. Em um aspecto, as estruturas celulares são isoladas de um tecido fenotipicamente ou genotipicamente anormal.
[0303] Em uma forma de realização, a amostra de tecido compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma célula estaminal, uma célula epitelial, uma célula sanguínea, uma célula graxa, uma célula da pele, uma célula endotelial, uma célula tumoral ou célula imune. Em um aspecto, a célula tumoral é derivada de um tecido canceroso selecionado do grupo de: câncer de pulmão, leucemia, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer cerebral, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, ginecológicos carcinomas, câncer dos ovários, câncer cervical, lipossarcoma, melanoma, linfoma, plasmacitoma, sarcoma, glioma, timoma, hepatoma e mieloma. Em outro aspecto, as células imunes são células selecionadas do grupo de: neutrófilos, monócitos, células dendríticas, macrófagos, linfócitos, células T, células B ou células assassinas naturais.
[0304] Em outra forma de realização, a amostra de tecido não é preservada ou fixa. Em um aspecto, a amostra de tecido compreende uma célula viva ou uma célula recentemente isolada do sujeito. Em outra forma de realização, a amostra de tecido é preservada ou fixa. Em um aspecto, a amostra de tecido preservada ou fixa compreende uma amostra que foi congelada ou fixada por um método do grupo de: congelação, liofilização e incorporação de cera.
[0305] Em uma forma de realização, a amostra de tecido heterogêneo é isolada de um ou mais tecidos do mesmo ou de diferentes sujeitos. Em um aspecto, a amostra de tecido é isolada de um sujeito. Em outro aspecto, a amostra de tecido compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em tecido isolado de dois ou mais sujeitos e dos mesmos tipos de tecidos ou tipos de tecidos diferentes ou semelhantes. Em um aspecto adicional, os dois ou mais sujeitos são sujeitos geneticamente homogêneos. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são sujeitos fenotipicamente homogêneos. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são sujeitos geneticamente diversos. Em um aspecto, os dois ou mais sujeitos são sujeitos fenotipicamente diversos. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são do mesmo gênero ou de gêneros diferentes.
[0306] Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são de gêneros diferentes. Em outro aspecto, os dois ou mais sujeitos são de diferentes grupos étnicos. Em um aspecto, os dois ou mais sujeitos são do mesmo grupo étnico. Em outro aspecto, o sujeito é selecionado do grupo consistindo de um animal, um animal de fazenda, um animal de estimação, um sujeito humano.
[0307] Em uma forma de realização, o material homogeneizado compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda, de uma ou mais de uma célula não humana, uma célula humana, um marcador detectável, um marcador de purificação, uma proteína não nativa, um ácido nucleico ou polinucleotídio, uma molécula pequena, um corante, um vírus, uma bactéria, um parasita, um protozoário ou um químico. Em um aspecto, a molécula pequena compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em um hapteno, um marcador peptídico, um marcador proteico, um marcador fluorescente, um marcador de ácido nucleico e uma combinação destes.
MÉTODO DE GERAÇÃO DE DADOS REPRESENTATIVOS
[0308] Esta invenção também se refere geração de dados representativos da amostra representativa ou da composição homogeneizada aqui descrita. Em um aspecto, o método para gerar dados representativos compreende analisar a composição homogeneizada como aqui descrito. Em um outro aspecto, a análise compreende a geração de dados quantitativos e/ ou qualitativos para um marcador na composição homogeneizada. Qualquer método apropriado para obter dados relacionados a um marcador pode ser utilizado, exemplos não limitantes incluem medição por sequenciamento unicelular, sequenciamento de núcleo único, citometria de fluxo, coloração por imuno-histoquímica, coloração por hematoxilina e eosina, sequenciamento inteiro do genoma, sequenciamento de produção, espectrometria de massa, DNA micro arranjo, ou uma combinação dos mesmos.
[0309] O método presentemente descrito é uma ferramenta poderosa para gerar conjuntos de dados em parte devido às técnicas de amostragem únicas e à composição da invenção. As estruturas celulares e/ ou componentes discretos da amostra representativa essencialmente refletem ou imitam a proporção relativa ou porcentagens dessas estruturas celulares (incluindo, mas não se limitando a, tipos, composição e variações) dentro de toda a amostra de tecido, geralmente um tumor sólido, nódulo linfático, metástases, pólipo, cisto ou sua porção ou combinação de qualquer um dos anteriores. Por conseguinte, o conjunto de dados da análise da amostra representativa (ou da composição homogeneizada) ou do seu subconjunto refletiria com precisão a informação respectiva de todo o tecido ou amostra biológica a partir da qual a amostra representativa é derivada. Em algumas formas de realização, os dados representativos são indicativos de todas as características de toda a população do órgão, tecido ou tumor original a partir do qual a amostra representativa foi derivada.
[0310] Como notado acima, o método para gerar dados representativos compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda, de gerar dados quantitativos e/ ou qualitativos para um marcador na composição homogeneizada.
[0311] No contexto deste método e composição, o marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um polinucleotídico, um DNA, uma proteína, um RNA, um lipídio, uma organela celular, um metabolito ou uma célula. Em um aspecto, a proteína que compreende uma modificação, a referida modificação é selecionada de um grupo consistindo de acetilação, ribosilação de ADP, acilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de uma flavina, ligação covalente de um heme, ligação covalente de um nucleotídio ou um derivado de nucleotídio, ligação covalente de um derivado lipídico ou lipídico, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligações dissulfureto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama- carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, arginilação e ubiquitinação. Em outro aspecto, o marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um polimorfismo genômico, um polimorfismo de nucleotídio único (SNP) farmacogenômico, um SNP genômico, um polimorfismo somático e expressão diferencial de uma proteína, um lipídio, e/ ou uma organela celular. Em um outro aspecto, o marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma posição de nucleotídio único; uma região intragênica ou uma região intergênica; um exôn ou um intrôn ou seu fragmento; uma região codificadora ou uma região não codificante; um promotor, um potenciador, uma região 5’n traduzida (5’ UTR), ou uma região não traduzida a 3’(3’ UTR), ou seu fragmento; um DNAc ou seu fragmento; um SNP; uma mutação somática, uma mutação da linha germinal ou ambas; um ponto ou uma única mutação; uma mutação de deleção; uma deleção in-frame, uma deleção intragênica, uma deleção inteira do gene; uma mutação de inserção; uma inserção intragênica; uma mutação de inversão; uma inversão intra-cromossômica; uma mutação de ligação; uma mutação de inserção ligada; uma mutação de duplicação invertida; uma duplicação em tandem; duplicação tandem intracromossômica; uma translocação; uma translocação cromossômica, uma translocação não recíproca; um rearranjo; um rearranjo genômico; um rearranjo de um ou mais intrôns, ou seu fragmento; um intrôn rearranjado; 5’- ou 3’-UTR, ou uma combinação destes. Em um aspecto diferente, o marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma sequência nucleotídica alterada, codifica uma sequência de aminoácidos alterada, uma translocação cromossômica, uma inversão intra-cromossomal, uma alteração no número de cópias, uma alteração em nível de expressão, uma alteração no nível proteico, uma alteração na atividade proteica ou uma alteração no estado de metilação, em um tecido cancerígeno ou célula cancerígena, em comparação com um tecido ou célula normal, saudável.
[0312] Em outro aspecto, o marcador é um marcador tumoral que é selecionado do grupo que consiste em: uma proteína, um antígeno, uma enzima, um hormônio, um DNA, um RNA, um microRNA ou um carboidrato. Em um outro aspecto, o marcador é um marcador tumoral que é selecionado do grupo que consiste em: Her2, bRaf, ERBB2, Pl3KCA, FGFR2, p53, BRCA, CCND1, MAP2K4, ATR, AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/ BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/ Pr, UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT, TMPRSS2; ABCB5, AFP-L3, alfa- fetoproteína, alfa-metil acil-CoA racemase, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA - 125, CA15-3, CA19-9, Calcitonina, antígeno carcinoembrionário, antígeno carcinoembriônico peptídio-1, Prothrombin Des-gama carboxi, Desmin, antígeno de câncer de próstata-2 precoce, receptor de estrogênio, produto de degradação de fibrina, glicose-6-fosfato isomerase, vE6, E7, L1, L2 ou p16INK4a, gonadotrofina coriônica humana, IL-6, Queratina 19, Lactato desidrogenase, Leucilaminopeptidase, Lipotropina, Metanefrinas, Neprilisina, NMP22, Normetanefrina, PCA3, Antígeno Prostático Específico, Fosfatase Ácida Prostática, Sinaptofisina, Tiroglobulina, TNF, um fator de transcrição selecionado de ERG, ETV1 (ER81), FL1, EST1, EST2, ELK1, ETV6, ETV7, GABPa, ELF1, ETV4, ETV5, ERF, PEA3/ E1AF, UP.1, ESE1/ ESX, SAP1 (ELK4), ETV3 (METS), EWS/ FL1 ESE1, ESE2 (ELF5), ESE3, PDEF, NET (ELK3; SAP2), NERF (ELF2) ou FEV. XXX, glicoproteína 72 associada ao tumor, c-kit, SCF, pAKT, estojo pc, Vimentina, CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN- 15049, CHK1, CHK2, A2aR, família B-7, ou a sua combinação. Em um aspecto, o marcador é um marcador tumoral que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste em, um ou mais marcadores selecionados do grupo de: um polimorfismo genômico, um polimorfismo de nucleotídio único (SNP) farmacogenômico, um genômico SNP, um polimorfismo somático e expressão diferencial de uma proteína, um lipídio e uma organela celular. Em outro aspecto, o marcador tumoral é selecionado do grupo que consiste em: uma posição de um único nucleotídio; uma região intragênica ou uma região intergênica; um exôn ou um intrôn ou seu fragmento; uma região codificadora ou uma região não codificante; um promotor, um potenciador, uma região 5’ não traduzida (5’ UTR) ou uma região 3’ não traduzida (3’ UTR) ou seu fragmento; um DNAc ou seu fragmento; um SNP; uma mutação somática, uma mutação da linha germinal ou ambas; um ponto ou uma única mutação; uma mutação de deleção; uma deleção in-frame, uma deleção intragênica, uma deleção inteira do gene; uma mutação de inserção; uma inserção intragênica; uma mutação de inversão; uma inversão intra-cromossômica; uma mutação de ligação; uma mutação de inserção ligada; uma mutação de duplicação invertida; uma duplicação em tandem; duplicação tandem intracromossômica; uma translocação; uma translocação cromossômica, uma translocação não recíproca; um rearranjo; um rearranjo genômico; um rearranjo de um ou mais intrôns, ou seu fragmento; um intrôn rearranjado; 5’- ou 3’-UTR, ou uma combinação destes. Em um aspecto diferente, o fabricante é um marcador tumoral que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um marcador do grupo de: uma sequência nucleotídica alterada que codifica uma sequência de aminoácidos alterada, uma translocação cromossomal, uma inversão cromossômica, uma mudança no número de cópias, uma mudança no nível de expressão, uma mudança no nível de proteína, uma mudança na atividade protéica e uma mudança no status de metilação, em um tecido canceroso ou cancerígeno, cada um como “alterado” quando comparado para um tecido ou célula normal e saudável.
[0313] Os dados são gerados a partir da análise da composição homogeneizada como aqui descrito. Exemplos não limitantes do tecido para análise são amostras selecionadas do grupo de: uma ou mais células pré- malignas ou malignas, células de um tumor sólido, um tumor de tecido mole ou uma lesão metastática, tecido ou células de uma margem cirúrgica, um histologicamente tecido normal, uma ou mais células tumorais circulantes (CTC), um tecido adjacente normal (NAT), uma amostra de sangue do mesmo indivíduo tendo ou em risco de ter o tumor, ou uma amostra FFPE.
[0314] Em uma forma de realização, os dados representativos compreendem os dados qualitativos e quantitativos gerados a partir de um único marcador. Em um aspecto, os dados representativos compreendem os dados qualitativos e/ ou quantitativos gerados a partir de dois ou mais marcadores diferentes. Em um aspecto adicional, os dados representativos são gerados medindo o mesmo ou múltiplos marcadores em diferentes pontos temporais, por exemplo, antes e depois da terapia e em um aspecto, podem ser utilizados para monitorizar a terapia ou a condição do paciente ao longo do tratamento.
[0315] Em uma forma de realização, o método para gerar dados representativos compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na atribuição de um valor interno aos dados qualitativos e/ ou quantitativos. Em uma outra forma de realização, o método para gerar dados representativos compreende ainda, ou consiste alternativamente essencialmente, ou ainda consiste ainda em comparar os dados representativos com um valor predeterminado para os dados. Em um aspecto adicional, os valores medidos do marcador são normalizados e é obtida uma pontuação composta com base no valor medido normalizado do marcador. A pontuação composta pode ainda ser comparada a uma pontuação predeterminada. No contexto de câncer, ainda em outra forma de realização, o método para gerar dados representativos compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em (a) medir o marcador tumoral na primeira amostra biológica, em que os valores medidos da marcador tumoral é normalizado; (b) obter uma pontuação composta com base no valor medido normalizado; e (c) comparar o escore composto a um escore predeterminado para determinar um valor de risco de câncer do sujeito.
[0316] Em outra forma de realização, o valor predeterminado é selecionado de dados de ensaios clínicos, dados para um sujeito, dados da literatura científica e dados para uma molécula biológica ou pequena em desenvolvimento clínico. Em um aspecto, os dados representativos compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente de, ou ainda consistem ainda, de dados oncológicos representativos, em que os dados oncológicos representativos compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente de, ou ainda consistem ainda em dados quantitativos e/ ou qualitativos de pelo menos um marcador tumoral de uma primeira amostra biológica, o referido marcador tumoral está associado à presença de um tumor.
[0317] Em uma forma de realização, a pontuação predeterminada é derivada do grupo de: dados de um ensaio clínico, dados oncológicos representativos derivados de uma segunda amostra biológica, dados oncológicos representativos derivados de um grupo de amostras biológicas, dados para o desenvolvimento clínico, biológico ou biológico. pequena molécula.
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DE PERFIS FENOTÍPICOS
[0318] Em uma forma de realização, a invenção refere-se a um método para determinar um perfil fenotípico de uma amostra de tecido, o método compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na análise das estruturas celulares da composição homogeneizada. Em um aspecto, as estruturas celulares que podem ser analisadas quanto ao perfil fenotípico compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda em um aglomerado de células, uma célula individual, um fragmento de uma célula, uma organela, um peptídio, um núcleo ácido, um lipídio, um metabolito ou uma combinação destes. Em outro aspecto, as estruturas celulares compreendem uma única célula ou núcleo, em que a única célula ou núcleo está intacto. Em algumas formas de realização, a análise compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda na análise de números, tipos, estados, percentagens e/ ou expressões das estruturas celulares. Em outro aspecto, a análise compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em análise de células individuais, análise de núcleos individuais, análise de organelas individuais ou a sua combinação. Em um aspecto, o estado de estruturas celulares compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em proliferação, apoptose, necrose, migração, transição epitélio-mesenquimal (“EMT”), mitose, paragem do ciclo celular, fase S, senescência e/ ou diferenciação. Em outro aspecto, a análise compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na análise de um marcador do material homogeneizado.
[0319] Em uma forma de realização, o marcador é selecionado do grupo consistindo de um DNA, uma proteína, um RNA, um lipídio, uma organela celular, um metabolito ou uma célula. Em um aspecto, a análise do marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na detecção do marcador. Em outro aspecto, a análise do marcador compreende a análise de um marcador de uma única célula ou de um único núcleo.
MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENÇA
[0320] A invenção, em outro aspecto, refere-se a um modo de tratamento de doença selecionando um regime terapêutico eficaz com base nos dados representativos gerados utilizando os métodos da invenção. Com a quantidade certa ou tipo de informação do paciente, o regime terapêutico pode ser adaptado para a melhor resposta e maior margem de segurança para alcançar o resultado para o paciente. Além disso, a informação também pode permitir que o paciente receba muitos outros benefícios, por exemplo, diagnósticos anteriores, avaliações de risco e tratamentos eficazes, melhorando assim significativamente as qualidades dos cuidados de saúde.
[0321] A seleção de um regime terapêutico efetivo depende de vários fatores. Primeiro, um diagnóstico confiável da doença ou da condição médica precisa ser alcançado. No caso de doenças infecciosas, câncer ou outras doenças agudas, este diagnóstico deve ser rápido e eficiente, uma vez que o tempo desempenha um papel crucial na taxa de sobrevivência dos pacientes que sofrem dessas doenças. Em segundo lugar, um tratamento terapêutico de um paciente individual torna-se mais eficaz se o diagnóstico for preciso. Por exemplo, quando o câncer é às vezes tratado com um “coquetel” padrão de medicamentos anticâncer, o coquetel frequentemente exibe efeitos colaterais graves para o paciente. A menos que o tipo de câncer (ou outra doença) seja determinado com precisão, um regime de tratamento individual para esse tipo de doença não seria extraordinariamente eficaz do que qualquer outro regime de tratamento. Assim, a eficácia depende diretamente dos dados ou informações adquiridas do paciente a ser tratado. Um tratamento mais eficaz seria possível, se o regime de tratamento fosse cruzado com regimes já aplicados com sucesso a este paciente ou a outros pacientes com base na resposta fisiológica ao regime de partida. Além disso, um diagnóstico preciso da doença levaria a custos reduzidos para o regime de tratamento individual, uma vez que a medicação desnecessária e ineficaz é evitada. No entanto, mesmo aqueles que estão atualizados sobre as informações mais recentes sobre o tratamento precisam de tempo para assimilar essas informações e entender como elas se relacionam com outras informações sobre o tratamento, a fim de fornecer o melhor tratamento disponível para um paciente.
[0322] Por conseguinte, a invenção proporciona um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende, ou alternativamente consistindo essencialmente, ou ainda consistindo adicionalmente na seleção de um regime terapêutico apropriado com base nos dados representativos, em que os dados representativos compreendem um primeiro perfil do indivíduo.
[0323] Em um aspecto, os exemplos não limitativos do primeiro perfil compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistem ainda em um perfil do grupo de: um perfil marcador, um perfil de antígeno, um perfil de proteína, um perfil de mutação, um lipídio perfil, um perfil de exossomo ou uma combinação destes. Em outro aspecto, o marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um ou mais do grupo de: Her2, bRaf, ERBB2, Pl3KCA, FGFR2, p53, BRCA, CCND1, MAP2K4, ATR, AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/ BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/ Pr,UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT, TMPRSS2; ABCB5, AFP-L3, alfa-fetoproteína, alfa-metil acil-CoA racemase, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA - 125, CA15-3, CA19-9, Calcitonina, Antígeno carcinoembrionário, antígeno carcinoembriônico peptídio-1, Prothrombin Desgama carboxi, Desmin, antígeno de câncer de próstata-2 precoce, receptor de estrogênio, produto de degradação de fibrina, glicose-6-fosfato isomerase, vE6, E7, L1, L2 ou p16INK4a, gonadotrofina coriônica humana, IL-6, Queratina 19, Lactato desidrogenase, Leucilaminopeptidase, Lipotropina, Metanefrinas, Neprilisina, NMP22, Normetanefrina, PCA3, Antígeno Prostático Específico, Fosfatase Ácida Prostática, Sinaptofisina, Tiroglobulina, TNF, um fator de transcrição selecionado de ERG, ETV1 (ER81), FL1, EST1, EST2, ELK1, ETV6, ETV7, GABPa, ELF1, ETV4, ETV5, ERF, PEA3/ E1AF, UP.1, ESE1/ ESX, SAP1 (ELK4), ETV3 (METS), EWS/ FL1 ESE1, ESE2 (ELF5), ESE3, PDEF, NET (ELK3; SAP2), NERF (ELF2) ou FEV. XXX, glicoproteína 72 associada ao tumor, c-kit, SCF, pAKT, estojo pc, Vimentina, CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7- H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, família B-7 e a sua combinação. Em algum aspecto, o primeiro perfil compreende um perfil gerado a partir do grupo de: um ou mais marcadores, um ou mais antígenos, uma ou mais proteínas, uma ou mais mutações, um ou mais lipídios, um ou mais exossomos, ou uma combinação dos mesmos.
[0324] Em algumas formas de realização, o marcador do método é selecionado do grupo que consiste em: um polimorfismo genômico, um polimorfismo de nucleotídio único farmacogenômico (SNP), um SNP genômico, um polimorfismo somático e expressão diferencial de uma proteína, um lipídio e uma organela celular. Em um aspecto, o marcador é selecionado do grupo que consiste em: uma posição de um único nucleotídeo; uma região intragênica ou uma região intergênica; um exôn ou um intrôn ou seu fragmento; uma região codificadora ou uma região não codificante; um promotor, um potenciador, uma região não traduzida de 5’(5’ UTR) ou uma região não traduzida de 3’(3’ UTR) ou seu fragmento; um DNAc ou seu fragmento; um SNP; uma mutação somática, uma mutação da linha germinal ou ambas; um ponto ou uma única mutação; uma mutação de deleção; uma deleção in-frame, uma deleção intragênica, uma deleção inteira do gene; uma mutação de inserção; uma inserção intragênica; uma mutação de inversão; uma inversão intra-cromossômica; uma mutação de ligação; uma mutação de inserção ligada; uma mutação de duplicação invertida; uma duplicação em tandem; duplicação tandem intracromossômica; uma translocação; uma translocação cromossômica, uma translocação não recíproca; um rearranjo; um rearranjo genômico; um rearranjo de um ou mais intrôns, ou seu fragmento; um intrôn rearranjado; um 5’- ou um 3’-UTR, e uma combinação destes.
[0325] O método pode ser utilizado para determinar a utilização de um regime terapêutico que compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste ainda em um regime de dosagem personalizado. Em um aspecto, o regime terapêutico é selecionado do grupo que consiste em: quimioterapia, imunoterapia, radiação, cirurgia, terapia gênica, terapia hormonal, terapia com células-tronco, transfusão, fisioterapia, terapia fotodinâmica e combinação destes.
[0326] Em outra forma de realização, o método de tratamento de uma doença em um sujeito compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em comparar o primeiro perfil do indivíduo com um perfil predeterminado para determinar se o regime terapêutico é adequado para o indivíduo. Em um aspecto, o perfil predeterminado é determinado com base em dados selecionados do grupo de: dados de ensaios clínicos, um segundo perfil do indivíduo, um perfil de uma amostra biológica diferente ou um grupo de amostras biológicas, um perfil de um indivíduo diferente ou um grupo de sujeitos, um dado para uma molécula biológica ou pequena e uma combinação destes.
[0327] Em outro aspecto, o tratamento compreende a seleção de um ou mais fármacos e/ ou dosagem (quantidade, duração da administração, etc.) de tais fármacos administrados a um doente para personalizar o tratamento com base no tecido individual ou perfil de câncer do doente. Por exemplo, se dois biomarcadores na amostra representativa predizerem a resposta a um medicamento específico X e um medicamento diferente Y. for encontrado dentro de uma única amostra representativa, ambos os medicamentos podem ser administrados ao paciente. Se o biomarcador para o fármaco X estiver presente em 75 % e o biomarcador para o fármaco Y estiver presente em 25 %, então o fármaco X pode ser priorizado e administrado primeiro, seguido pelo fármaco Y. Alternativamente, o fármaco Y pode preceder o fármaco X.
[0328] O método pode ser repetido em diferentes cursos de tempo da terapia e modificado com base na mudança na expressão do marcador do perfil. Neste aspecto, o método é útil para monitorizar a terapia e a progressão da doença no paciente ou em diferentes pacientes com a mesma doença ou doença semelhante que recebem as mesmas ou diferentes terapias.
MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM MARCADOR CLINICAMENTE RELEVANTE
[0329] Dados ou informações sobre marcadores ou biomarcadores clinicamente relevantes podem fornecer uma indicação de uma probabilidade de condições patológicas. Os dados representativos nas divulgações podem ser utilizados para identificar os marcadores clinicamente relevantes, particularmente aqueles que não foram anteriormente associados a quaisquer condições patológicas.
[0330] Assim, outro aspecto desta invenção refere-se a um método de identificação de um marcador clinicamente relevante, que compreende a comparação dos dados representativos com dados predeterminados. Exemplos não limitativos de marcadores são indicados acima. Em um aspecto, o marcador é selecionado do grupo que consiste em: uma proteína, um antígeno, uma enzima, um hormônio, um DNA, um RNA, um microRNA ou um carboidrato. Em outro aspecto, o marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um polimorfismo genômico, um polimorfismo de nucleotídio único (SNP) farmacogenômico, um SNP genômico, um polimorfismo somático e expressão diferencial de uma proteína, um lipídio, uma modificação de proteína e uma organela celular. Em alguns aspectos, o marcador é selecionado do grupo que consiste em: uma única posição de nucleotídio; uma região intragênica ou uma região intergênica; um exôn ou um intrôn ou seu fragmento; uma região codificadora ou uma região não codificante; um promotor, um potenciador, uma região 5’ não traduzida (5’ UTR) ou uma região 3’ não traduzida (3’ UTR) ou seu fragmento; um DNAc ou seu fragmento; um SNP; uma mutação somática, uma mutação da linha germinal ou ambas; um ponto ou uma única mutação; uma mutação de deleção; uma deleção in-frame, uma deleção intragênica, uma deleção inteira do gene; uma mutação de inserção; uma inserção intragênica; uma mutação de inversão; uma inversão intra-cromossômica; uma mutação de ligação; uma mutação de inserção ligada; uma mutação de duplicação invertida; uma duplicação em tandem; duplicação tandem intracromossômica; uma translocação; uma translocação cromossômica, uma translocação não recíproca; um rearranjo; um rearranjo genômico; um rearranjo de um ou mais intrôns, ou seu fragmento; um intrôn rearranjado; uma UTR 5 ou 3, e uma combinação delas. Em um aspecto, o marcador é selecionado do grupo de: uma sequência nucleotídica alterada, codifica uma sequência de aminoácidos alterada, uma translocação cromossômica, uma inversão intra-cromossomal, uma alteração no número de cópias, uma alteração no nível de expressão, uma alteração na nível de proteína, uma alteração na atividade proteica e uma alteração no estado de metilação, em um tecido canceroso ou em uma célula cancerígena, cada um em comparação com um tecido ou célula normal, saudável.
[0331] Em uma forma de realização, os dados predeterminados são gerados a partir de dados selecionados do grupo de: dados de ensaios clínicos, dados de um indivíduo ou grupo de indivíduos, dados de uma amostra de tecido ou um grupo de amostras de tecido, dados de uma amostra biológica ou pequena. molécula em desenvolvimento clínico, ou uma combinação destes.
[0332] Em algum aspecto, é fornecido um método para determinar o prognóstico de um câncer em um indivíduo, que compreende o método a avaliação dos dados representativos de um sujeito. Em uma forma de realização, o método para determinar um prognóstico de um câncer compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda no círculo de uma pontuação quantitativa para o prognóstico do câncer, em que o prognóstico é classificado com base na pontuação quantitativa.
[0333] Em uma forma de realização, os dados representativos compreendem informação sobre o número, tipos, estados e/ ou percentagem das estruturas celulares no material homogeneizado. Em outra forma de realização, as estruturas celulares compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente de, ou ainda consistem ainda em células estaminais, células epiteliais, células sanguíneas, células graxas, células da pele, células endoteliais, células cancerosas ou células imunes. Em uma forma de realização, as células imunes compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou consistem ainda mais de neutrófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas, células assassinas naturais, células-T, e/ ou células B. Em algumas formas de realização, as células T compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente de, ou ainda consistem ainda em células T killer, células T auxiliares, células T reguladoras, células T pan, células T virgens, células T ativadas e/ ou gama delta. Células T.
[0334] Em uma forma de realização, os estados de estruturas celulares compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda em proliferação, apoptose, necrose, migração, transição epitelial-mesenquimal (“EMT”), mitose, paragem do ciclo celular, fase S, senescência e/ ou diferenciação. Em uma forma de realização, os dados representativos compreendem informação sobre um marcador no material homogeneizado. Em outra forma de realização, o marcador é selecionado do grupo de um DNA, uma proteína, um RNA, um lipídio, uma organela celular, um metabolito ou uma célula. Em algumas formas de realização, o marcador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em, um ou mais de Her2, bRaf, ERBB2, Pl3KCA, FGFR2, p53, BRCA, CCND1, MAP2K4, ATR, AFP, ALK, BCR-ABL. BRCA1/ BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/ Pr, UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT, TMPRSS2; ABCB5, AFP-L3, alfa- fetoproteína, alfa-metil acil-CoA racemase, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA - 125, CA15-3, CA19-9, Calcitonina, Antígeno carcinoembrionário, antígeno carcinoembriônico peptídio-1, Prothrombin Des-gama carboxi, Desmin, antígeno de câncer de próstata-2 precoce, receptor de estrogênio, produto de degradação de fibrina, glicose-6-fosfato isomerase, vE6, E7, L1, L2 ou p16INK4a, gonadotrofina coriônica humana, IL-6, Queratina 19, Lactato desidrogenase, Leucilaminopeptidase, Lipotropina, Metanefrinas, Neprilisina, NMP22, Normetanefrina, PCA3, Antígeno Prostático Específico, Fosfatase Ácida Prostática, Sinaptofisina, Tiroglobulina, TNF, um fator de transcrição selecionado de ERG, ETV1 (ER81), FL1, EST1, EST2, ELK1, ETV6, ETV7, GABPa, ELF1, ETV4, ETV5, ERF, PEA3/ E1AF, UP.1, ESE1/ ESX, SAP1 (ELK4), ETV3 (METS), EWS/ FL1 ESE1, ESE2 (ELF5), ESE3, PDEF, NET (ELK3; SAP2), NERF (ELF2) ou FEV. XXX, glicoproteína 72 associada ao tumor, c-kit, SCF, pAKT, estojo pc, Vimentina, CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN- 15049, CHK1, CHK2, A2aR, família B-7 e a sua combinação. Em outra forma de realização, o marcador é selecionado do grupo consistindo de: uma modificação de proteína, a referida modificação é selecionada de um grupo consistindo de acetilação, ribosilação de ADP, acilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de uma flavina, ligação covalente de um heme, ligação covalente de um nucleotídio ou um derivado nucleotídio, ligação covalente de um derivado lipídico ou lipídico, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligações dissulfureto, desmetilação, formação de ligações covalentes -ligações, formação de cistina, formação de piroglutamato,formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI,hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, arginilação e ubiquitinação. Em alguns aspectos, o marcador é selecionado do grupo que consiste em: um polimorfismo genômico, um polimorfismo de nucleotídio único farmacogenômico (SNP), um SNP genômico, um polimorfismo somático e expressão diferencial de uma proteína, um lipídio e/ ou um polimorfismo celular. organela, uma posição de nucleotídio único; uma região intragênica ou uma região intergênica; um exôn ou um intrôn ou seu fragmento; uma região codificadora ou uma região não codificante; um promotor, um potenciador, uma região 5’n traduzida (5’ UTR), ou uma região não traduzida a 3’(3’ UTR), ou seu fragmento; um DNAc ou seu fragmento; um SNP; uma mutação somática, uma mutação da linha germinal ou ambas; um ponto ou uma única mutação; uma mutação de deleção; uma deleção in-frame, uma deleção intragênica, uma deleção inteira do gene; uma mutação de inserção; uma inserção intragênica; uma mutação de inversão; uma inversão intra- cromossômica; uma mutação de ligação; uma mutação de inserção ligada; uma mutação de duplicação invertida; uma duplicação em tandem; duplicação tandem intracromossômica; uma translocação; uma translocação cromossômica, uma translocação não recíproca; um rearranjo; um rearranjo genômico; um rearranjo de um ou mais intrôns, ou seu fragmento; um intrôn rearranjado; uma 5’- ou uma 3’-UTR, uma sequência nucleotídica alterada, codifica uma sequência de aminoácidos alterada, uma translocação cromossômica, uma inversão intra-cromossômica, uma alteração no número de cópias, uma alteração no nível de expressão, uma alteração no nível proteico, uma alteração na atividade proteica ou uma alteração no estado de metilação, em um tecido canceroso ou em uma célula cancerígena, em comparação com um tecido ou célula normal, saudável.
[0335] Em outro aspecto, a invenção está relacionada com um modo de monitorização de uma doença em um doente, que compreende ou alternativamente consistindo essencialmente de, ou ainda consistindo adicionalmente, em análise do marcador clinicamente relevante, em que o marcador clinicamente relevante identificado com base nos dados representativos. Em um aspecto, o marcador é selecionado do grupo de: uma proteína, um antígeno, uma enzima, um hormônio, um DNA, um RNA, um microRNA ou um carboidrato. Em outro aspecto, o marcador DNA ou RNA isolado de uma amostra selecionada do grupo de: uma ou mais células pré- malignas ou malignas, células de um tumor sido, um tumor de tecido mole ou uma lesão metastática, tecido ou células de uma margem cirúrgica, um tecido histologicamente normal, uma ou mais células tumorais em circulação (CTC), um tecido adjacente normal (NAT), uma amostra de sangue do mesmo indivíduo tendo ou em risco de ter o tumor, ou uma amostra FFPE. Em um aspecto, a doença é câncer.
MÉTODOS DE ARMAZENAMENTO DA AMOSTRA REPRESENTATIVA (OU A COMPOSIÇÃO DO MATERIAL HOMOGENEIZADO)
[0336] Uma vez que a amostra representativa é construída, a amostra pode ser transportada para posterior processamento e/ ou análise. Por conseguinte, a invenção, em algumas formas de realização, também se refere a um modo de armazenar a composição homogeneizada, que compreende ou, alternativamente, consistindo essencialmente ou ainda mais consistindo em misturar a composição com uma quantidade eficaz de um reagente de armazenamento, exemplos não limitativos de que são fornecidos aqui.
[0337] Em uma forma de realização, o reagente de armazenamento compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um conservante, um agente caotrópico, um detergente, um agente redutor, um quelante, um tampão ou uma combinação destes. Em um aspecto, a composição mista retém as características fenotípicas e genotípicas da composição antes da mistura com o reagente de armazenamento. Em outro aspecto, a composição mista compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em proteínas desnaturadas, uma nuclease inativada, uma proteínase inativada, um patógeno inativado, um ácido nucleico não degradado ou uma combinação destes. Em alguns aspectos, o agente caotrópico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em tiocianato de guanidina, isocianato de guanidina, cloridrato de guanidina, ou uma sua combinação. Em um aspeto, o detergente compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em dodecil sulfato de sódio, dodecil sulfato de lítio, taurodesoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicolato de sódio, desoxicolato de sódio, colato de sódio, alquilbenzeno sulfonato de sódio, N-lauroil sarcosina ou uma combinação destes. Em outro aspecto, o reagente redutor compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda de são mercaptoetanol, tris (2-carboxietil) fosfina, ditiotreitol, dimetilsulfóxido, tris (2-carboxietil) fosfina, ou uma sua combinação. Em um outro aspecto, o quelante compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em ácido etilenoglicol tetra acético, ácido hidroxietilenodiaminotriacético, ácido dietilenotriaminopentacético, N, N- bis (carboximetil) glicina, etilenodiaminotetracético, citrato anidro, citrato de sio, citrato de cálcio, citrato de amônio, bicitrato de amônio, ácido crítico, citrato de diamônio, citrato férrico de amônio, citrato de lítio ou uma sua combinação. Em um aspecto diferente, o tampão compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em tris (hidroximetil) aminometano, citrato, ácido 2- (N-morfolino) etanosulfúrico, N, N-Bis (2-hidroxietil) -2 ácido - aminoetanossulfônico, 1,3-bis (tris (hidroximetil) metilamino) propano, ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazina etanossulfônico, ácido 3- (N-morfolina) propanossulfônico, bicarbonato, fosfato ou uma combinação disso.
MÉTODO DE GERAR A AMOSTRA REPRESENTATIVA
[0338] A invenção refere-se geralmente ao desenvolvimento de uma metodologia para gerar amostras de tecido representativas de, por exemplo, órgãos inteiros, tumores, nódulos linfáticos, metástases ou combinações dos mesmos, para abordar a questão da heterogeneidade, por exemplo, heterogeneidade de tumores, em espécimes clínicos, especialmente espécimes clínicos para utilização em oncologia clínica, e o uso de tais amostras representativas ou porções dos mesmos em vários métodos de diagnóstico e terapêuticos, bem como composições que compreende essas amostras representativas para utilização em diagnóstico e terapia, em especial em oncologia.
[0339] O presente pedido mostra que os métodos de amostragem aceites para o diagnóstico do câncer, que utilizam pequenas amostras de tumores para testes de diagnóstico, podem resultar em um viés de amostragem grave em patologia diagnóstica e oncologia. As decisões relativas ao atendimento ao paciente, tanto prognóstico (por exemplo, expectativas de tempo de sobrevida do paciente) quanto preditivas (por exemplo, se o paciente responderá a uma terapia específica), são feitas usando seções de tecido FFPE únicas em tumores considerados “pequenos”, ou seja, uma massa de dois centímetros, usando métodos convencionais, todos os dados de diagnóstico são tipicamente obtidos a partir de menos do que 0,03 % do volume do tumor (ou seja, uma única seção de um bloco FFPE). Além disso, estas amostras de tecido de tumores são convencionalmente retiradas de regiões muito discretas de tumores, deixando a oncologia de diagnóstico cega para a heterogeneidade presente no resto do tumor. Como resultado, o conjunto de dados é pequeno (em relação à população) e, consequentemente, tendencioso.
[0340] Da mesma forma, semelhante à baixa probabilidade de detectar pequenas subpopulações de células cancerígenas geneticamente distintas dentro de tumores sólidos, pequenos tumores metastáticos dentro dos nódulos linfáticos que circundam o local do tumor primário podem não ser detectados usando o exame histológico convencional. Nódulos linfáticos variam em tamanho de um milímetro de diâmetro, a alguns centímetros. A presença de células tumorais dentro de um nódulo linfático depende das mutações de DNA que resultam em motilidade e invasão de células tumorais, bem como as mutações que conferem a capacidade de sobreviver em um novo ambiente (ou seja, mama vs. nódulo linfático). O tamanho do tumor metastático no interior do nódulo linfático depende da taxa de proliferação do tumor e do tempo que o tumor metastático vem crescendo no interior do nódulo linfático. O teste de diagnóstico para a presença de células tumorais dentro dos nódulos linfáticos utiliza uma ou duas seções finas de tecido (tipicamente quatro mícrons de espessura) de um bloco FFPE. Usando esses métodos, o fator crítico para a detecção é o tamanho do tumor em relação ao tamanho do nódulo linfático. Enquanto um tumor metastático com 0,1 mm de diâmetro pode preencher 10 % do volume de um pequeno nódulo linfático e ter uma probabilidade razoável de detecção, o mesmo tamanho do tumor seria composto por apenas 0,005 % de um nódulo linfático com dois centímetros de diâmetro e probabilidade muito baixa de detecção usando técnicas histológicas atuais. Um número significativo de pacientes que seriam falsamente rotulados como negativos para nós usando técnicas convencionais poderia ser detectado e tratado de forma mais apropriada usando os métodos aqui divulgados. Por exemplo, a detecção mais sensível de pacientes com nódulos linfáticos positivos poderia informar melhor a decisão de administrar quimioterapia adjuvante.
[0341] A análise IHC de amostras representativas do tecido dos nódulos linfáticos (por exemplo, preparadas a partir de nódulos linfáticos removidos cirurgicamente) pode detectar micro metástases tumorais extremamente pequenas através da coloração de marcadores epiteliais combinados com marcadores de proliferação (por exemplo citoqueratina 8/18 dual IHC com Ki67). Isto pode ser conseguido utilizando marcadores que foram positivos no tumor primário utilizando outros marcadores de células metastáticas, ou outros marcadores de diagnóstico. As células tumorais metastáticas também podem ser detectadas por identificação de ácidos nucleicos, por exemplo, utilizando um painel de sequenciação de nova geração para identificar mutações associadas a câncer, incluindo mutações presentes no tumor primário. Estes métodos irão identificar células tumorais metastáticas. Além disso, o curso evolutivo natural da doença para cada paciente pode ser determinado e correlacionado com mutações específicas que podem ser direcionadas para a terapia.
[0342] A prática clínica atual para avaliar tumores envolve a aquisição de apenas uma pequena porção do tecido tumoral para inclusão e seccionamento. Em um cenário básico, a localização de uma região dentro do tumor contendo um subclone de interesse é considerada um evento aleatório. Portanto, enquanto a prática atual instruir cuidadosamente sobre qual região a amostra e obter as informações mais pertinentes para o estadiamento TNM, não é necessariamente informativo para a localização de regiões subclonais do tumor. Também não é possível, a partir de uma inspeção bruta, determinar se o subclone está presente.
[0343] As formas de realização dos presentes métodos podem abordar a heterogeneidade do tumor em contextos de oncologia clínica, proporcionando métodos para a produção eficiente e reprodutível de amostras celulares que são representativas de todo um nódulo linfático, tumor ou tumores de um paciente. Como mostrado na Figura 2A, uma amostra “representativa” de acordo com a invenção compreende as diferentes subpopulações de células cancerígenas compreendidas dentro de um tumor, independentemente do seu tamanho. Uma amostra’ Representativa’ De acordo com a invenção alternativa pode compreender as diferentes subpopulações dentro de populações normais ou de controlo, ou pode compreender uma amostra mista de células tumorais e células normais.
[0344] Ainda alternativamente, uma amostra representativa de acordo com a invenção pode compreender uma biomolécula representativa ou homogênea derivada de um tumor inteiro, nódulos linfáticos ou metástases, que compreende a fração uma proteína, lipídio, ácidos nucleicos ou outras porções que estão presentes no tecido de partida, por exemplo, um tumor inteiro, nódulos linfáticos ou metástases utilizados para derivar a amostra ou sua fração, em que as proporções relativas desses substituintes são novamente representativas do tecido de partida. Por exemplo, tais biomoléculas podem ser derivadas pela dissociação adicional ou tratamento químico ou enzimático da amostra e/ ou pelo uso de métodos que isolam ou removem porções específicas da amostra, tal como, pelo uso de exclusão de tamanho, por exemplo, peneiramento, para isolar ou remover moléculas de tamanho específico ou peso molecular, métodos de purificação por afinidade que isolam ou removem tipos específicos de moléculas da amostra representativa e semelhantes. Consequentemente, tais métodos resultam essencialmente em outros tipos de amostras representativas de acordo com a invenção, por exemplo, amostras homogêneas ou representativas que compreende todas as proteínas, ácidos nucleicos ou lipídios da amostra de partida, por exemplo, um tumor inteiro, nódulos linfáticos, metástases ou órgão, cuja amostra representativa pode ser utilizada para métodos de análise de proteína, ácido nucleico e/ ou lipídio, e que reflita toda a amostra do tumor.
[0345] Portanto, independentemente da origem, em tais amostras representativas as percentagens relativas de subpopulações celulares dentro de um tumor ou tumores, ou outras porções específicas presentes no tecido de partida, por exemplo, metástases ou órgãos de um tumor ou nódulo, são refletidas com precisão na amostra. Além disso, estas amostras representativas, ao contrário de amostras obtidas por métodos de diagnóstico convencionais, podem ser utilizadas em uma pluralidade de métodos de ensaio, sem comprometer a capacidade de usar a amostra em ensaios de diagnóstico tradicionais. Além disso, amostras representativas produzidas de acordo com a invenção podem ser utilizadas (e potencialmente reutilizadas) em vários formatos de ensaio diferentes separadamente ou simultaneamente, a fim de detectar a presença de populações subclones menores ou outras porções, tais como, antígenos tumorais ou ácidos nucleicos dentro de uma amostra, por exemplo, um tumor, nódulo linfático ou metástases.
[0346] Além disso, como discutido infra, amostras representativas de diferentes pacientes ou tecidos diferentes de pacientes individuais ou diferentes podem ser marcadas com etiquetas de identificação únicas, por exemplo, um hapteno, e as amostras marcadas de diferentes pacientes ou tecidos combinados e utilizados em métodos de ensaio desejados. Essencialmente, isso fornece multiplexação de diferentes amostras de pacientes.
[0347] Com base nelas, amostras representativas derivadas de formas de realização exemplificativas dos métodos presentemente descritos devem facilitar e melhorar substancialmente a precisão da detecção, diagnóstico e/ ou estágio de diferentes tipos de tumores, ou seja, diferentes tumores sólidos, independentemente do tipo de tecido tumoral, localização, tamanho ou volume. Além disso, os presentes métodos podem ser usados para produzir amostras representativas de supostas amostras de tecidos normais ou supostos tecidos pré-cancerosos (por exemplo, obtidos de indivíduos com maior risco de desenvolver câncer devido a um risco genético ou um câncer anterior) para identificar tipos celulares raros, tais como, como linhas de haste de câncer que podem estar presentes mesmo antes de qualquer sinal da doença ter se manifestado.
[0348] Em uma outra forma de realização, a invenção refere-se a um método para preparar um tecido ou amostras biológicas contendo estruturas celulares heterogêneas, que compreende: (a) homogeneizar a amostra; (b) reconstruir a amostra homogeneizada em um material homogeneizado, o referido material homogeneizado que compreende estruturas celulares substancialmente homogêneas, em que uma proporção das estruturas celulares em um subconjunto do material homogeneizado é substancialmente semelhante à proporção das estruturas celulares na amostra de tecido. Em um aspecto, o material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em uma pluralidade de células individuais ou em uma pluralidade de agregados de células.
[0349] Em uma forma de realização, o método para preparar uma amostra de tecido compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na fixação do material homogeneizado com um agente fixador. Em outro aspecto, o agente fixador compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda mais consiste em formalina, cálcio, ácido acético, solução salina, álcool, ureia, bronopol, água, ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto diferente, o material homogeneizado fixo é montado em uma lâmina.
[0350] Em algumas formas de realização, o método para preparar uma amostra de tecido compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda na extração de um constituinte do material homogeneizado. Em um aspecto, o constituinte é DNA, RNA, proteína, lipídio, uma organela celular, um exossomo, uma célula ou uma combinação destes. Em outra forma de realização, o método para preparar uma amostra de tecido compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda no isolamento de uma estrutura celular ou um constituinte do material homogeneizado. Em um aspecto, a estrutura celular ou o constituinte compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em uma única célula ou em um único núcleo. Em um aspecto, o isolamento compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em isolamento de célula única ou isolamento de núcleo único. Em outro aspecto, o isolamento de célula única é realizado por citometria de fluxo, microdissecção a laser, coleta manual de células, semeadura aleatória e diluição, um dispositivo micro fluídico, um dispositivo lab-on-a-chip ou a combinação dos mesmos. Em um aspecto, o isolamento de núcleo único é realizado por citometria de fluxo.
[0351] Em uma forma de realização, a homogeneização compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em dissociação química e/ ou bioquímica e/ ou, opcionalmente, homogeneização mecânica. Em um aspecto, o processo de homogeneização não lisiva as células. Em outro aspecto, o tratamento químico da amostra compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda mais consiste de digestão enzimática da amostra, o referido digestão enzimática que compreende o uso de uma enzima selecionada a partir de um grupo consistindo de colagenase intersticial, Gelatinase-A, Estromelisina 1, Matrilisina, Colagenase Neutrófila, Gelatinase-B, Estromelisina 2, Estromelisina 3, Metaloelastase de Macrófagos, Colagenase 3, MT1-MMP, MT2-MMP, MT3- MMP, MT4-MMP, Colagenase 4, Enamelisina, X-MMP, CA -MMP, MT5-MMP, MT6-MMP, Matrilisina-2, MMP-22, endoproteinase, tripsina, quimiotripsina, endoproteinase Asp-N, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Glu-C (proteínase V8), endoproteinase Lys-C, pepsina, termolisina, elastase, papaína, proteinase K, subtilisina, clostripaína, exopeptidase, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B, carboxipeptidase P, carboxipeptidase Y, catepsina C, enzima de liberação de ácido acilamino e piroglutamato aminopeptidase. Em um aspecto, a homogeneização mecânica é realizada por um dispositivo selecionado de um grupo consistindo de um liquidificador, um desassociador, um extrator, um almofariz, um pilão, um material homogeneizador dounce, um moedor de tecido, um material homogeneizador de tecido de lâmina rotativa, e um talão. batendo material homogeneizador. Em outro aspecto, o material homogeneizado é criado por corte manual usando um bisturi ou faca. Em uma forma de realização, a homogeneização compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em condicionamento de células, o referido condicionamento de células que compreende o ajuste do pH e/ ou tratamento da amostra com um tampão de condicionamento de células.
[0352] Em alguns aspectos, antes ou após a homogeneização da amostra, a amostra é tratada com hormônios, proteínas, enzimas, lipídios, detergentes, sonicação, agitação física ou sua combinação, antes ou após a homogeneização.
[0353] Em um outro aspecto, a amostra homogeneizada compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste ainda em células e/ ou aglomerados de células. Em alguns aspectos, a amostra homogeneizada compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste ainda em aglomerados de células de tamanhos uniformes. Em outro aspecto, a amostra homogeneizada compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste ainda em aglomerados de células de tamanhos não uniformes. Em alguns aspectos, os aglomerados de células compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente de, ou ainda consistem ainda de 1 - 100 células, ou 100 - 1.000 células, 1.000 - 10.000 células, ou 10.000 - 100.000 células. Em um aspecto adicional, os aglomerados de células compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda em mais de 100.000 células.
[0354] Em uma forma de realização, o método para preparar uma amostra de tecido compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em passar a amostra homogeneizada através de uma malha, um filtro, ou uma série de malhas ou filtros. Em um aspecto, a malha ou filtro tem um tamanho de porção variando entre cerca de 1 mícron e cerca de 500 mícrons. Em outro aspecto, a malha ou filtro tem um tamanho de porção menor que 1 mícron. Em algum aspecto, a malha ou filtro tem um tamanho de porção variando de cerca de 1 mícron a cerca de 100 mícrons, de cerca de 100 mícrons a cerca de 200 mícrons, de cerca de 200 mícrons a cerca de 300 mícrons, de cerca de 300 mícrons a cerca de 400 mícrons, ou de cerca de 400 mícrons a cerca de 500 mícrons. Em um aspecto adicional, a malha ou filtro tem um tamanho de porção superior a 500 mícrons.
[0355] Em uma forma de realização adicional, a amostra de tecido é recolhida a partir de um tecido selecionado do grupo constituído por um tumor, nódulo linfático, uma metástase, pólipo, cisto, biopsia, um órgão inteiro e combinação destes. Em um aspecto, a amostra de tecido é uma amostra sólida ou uma amostra líquida. Em outro aspecto, a amostra líquida compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em aspirado de agulha de citologia, amostra de efusão ou esfregaço de Papanicolau. Em um aspecto, as estruturas celulares do material homogeneizado compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda em pelo menos uma célula. Em um aspecto diferente, as estruturas celulares do material homogeneizado compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda em pelo menos 100 células. Em outro aspecto, as estruturas celulares do material homogeneizado compreendem cerca de 100 a cerca de 200 células, cerca de 200 a cerca de 1.000 células, cerca de 1.000 a cerca de 5.000 células, ou cerca de 10.000 a cerca de 100.000 células. Em um aspecto diferente, as estruturas celulares do material homogeneizado compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem ainda de cerca de 100.000 a cerca de 1.000.000 células; cerca de 1.000.000 a cerca de 5.000.000 de células, cerca de 5.000.000 a cerca de 1.000.000.000 de células, ou cerca de 1.000.000.000 a cerca de 5.000.000.000 de células. Em um aspecto adicional, as estruturas celulares do material homogeneizado compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente, ou ainda consistem em mais do que cerca de 5.000.000.000 de células.
[0356] Em uma forma de realização, o material homogeneizado não é preservado ou fixo. Em um aspecto, o material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma célula viva. Em outro aspecto, o material homogeneizado é preservado ou fixado. Em um aspecto, o material homogeneizado é congelado, liofilizado ou incorporado em um meio de incorporação. Em um outro aspecto, o material homogeneizado compreende células de um ou mais tecidos e/ ou um ou mais sujeitos.
[0357] Em uma forma de realização, a amostra de tecido é isolada a partir de um tumor, um nódulo linfático, metástases, um pólipo, um cisto, uma ressecção, um órgão inteiro ou uma combinação destes. Em um aspecto, o material homogeneizado compreende adicionalmente, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma célula não humana, uma célula humana, uma proteína não nativa, um ácido nucleico ou uma molécula pequena. Em uma forma de realização, a molécula pequena é selecionada de um grupo consistindo de um hapteno, um marcador peptídico, um marcador proteico, um marcador fluorescente, um marcador de ácido nucleico e uma combinação destes. Em um aspecto adicional, a molécula pequena compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um hapteno, um marcador peptídico, um marcador proteico, um marcador fluorescente, um marcador de ácido nucleico, um marcador luminescente, uma biotina e uma combinação. disso.
[0358] Em uma forma de realização adicional, o método para preparar uma amostra de tecido compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na avaliação das estruturas celulares substancialmente homogêneas dentro do material homogeneizado. Em um aspecto, as estruturas celulares substancialmente homogêneas são avaliadas medindo a distribuição de um controlo interno dentro do material homogeneizado. Em outro aspecto, o controlo interno é selecionado de um grupo consistindo de uma célula não humana, uma célula humana, uma proteína não nativa, um ácido nucleico, uma molécula pequena, um corante, um produto químico e uma combinação destes.
[0359] Em outro aspecto, a invenção proporciona um modo para produzir uma amostra biológica adequada para avaliar a heterogeneidade de células dentro de uma amostra (tal como uma amostra de tumor ou nódulo linfático ou metástases ou uma sua combinação) e/ ou avaliar o prognóstico de uma condição cancerosa particular em um indivíduo que compreende (i) obtenção de uma ou mais amostras de biopsia intactas de um tumor sido ou de um nódulo linfático, de um modo preferido, em que cada amostra de biopsia compreende, pelo menos, cerca de 100 a 200; 200 a 1.000; 1.000 a 5.000; 10.000 a 100.000; 100.000 a 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 a 1.000.000.000; 1.000.000.000 a 5.000.000,0000 ou mais células e,opcionalmente, fixas ou conservadas (como uma amostra fixada ou conservada em formol, parafina ou etanol) e (ii) separadamente ou em combinação homogeneizar uma ou mais amostras de biópsia, em ou mais materiais homogeneizados expressam cada um substancialmente de forma homogênea a heterogeneidade da amostra ou amostras de biopsia respectivas.
[0360] Como mencionado, estas amostras representativas podem opcionalmente ser ainda dissociadas e/ ou tratadas para remover ou isolar tipos específicos de moléculas, tais como, tipos específicos de células, proteínas, ácidos nucleicos ou lipídios e semelhantes, gerando assim outras amostras representativas que podem ser utilizadas em métodos diagnósticos e terapêuticos.
[0361] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um método para produzir uma amostra biológica adequada para avaliar a heterogeneidade de células em um tumor ou nódulo linfático ou metástases ou combinações destas que compreende (i) obtenção de uma ou mais amostras de biopsia de um tumor sólido ou de um nódulo linfático. ou metástases, preferencialmente em que cada amostra de biopsia compreende pelo menos cerca de 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 - 1.000.000.000; 1.000.000.000 - 5.000.000,0000, ou mais células, e opcionalmente fixadas ou conservadas (como uma amostra fixada ou preservada em formol, parafina ou etanol), e (ii) separadamente ou em combinação homogeneizar uma ou mais amostras de biópsia, sob condições em que os materiais homogeneizados ou materiais homogeneizados resultantes são substancialmente dissociados em células individuais e o material homogeneizado ou materiais homogeneizados resultantes são substancialmente homogêneos.
[0362] Mais uma vez, estas amostras representativas podem opcionalmente ser ainda dissociadas e/ ou tratadas para remover ou isolar tipos específicos de moléculas, tais como, tipos de células especificas, proteínas, ácidos nucleicos ou lipídios e semelhantes, gerando desse modo outras amostras representativas que podem ser utilizadas em métodos diagnósticos e terapêuticos.
[0363] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para produzir uma amostra biológica adequada para avaliar se um indivíduo compreende ou estão em risco de desenvolver uma forma virulenta de um câncer em particular e/ ou se um indivíduo com câncer compreende uma forma virulenta desse câncer em particular que compreende (i) obtenção de uma ou mais amostras de biopsia intacta de um tumor sido ou de um nódulo linfático ou metástases ou cisto pré-canceroso, preferencialmente em que cada amostra de biopsia compreende pelo menos cerca de 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 - 1.000.000.000; 1.000.000.000 - 5.000.000,0000, ou mais células, e opcionalmente fixadas ou conservadas (como uma amostra fixada ou preservada em formol, parafina ou etanol), e (ii) separadamente ou em combinação homogeneizar a uma ou mais amostras de biópsia, em que a resultante um ou mais materiais homogeneizados expressam cada um substancialmente de forma homogênea qualquer heterogeneidade da respectiva amostra ou amostras de biopsia, e opcionalmente isolam ou detectam a expressão de pelo menos um biomarcador. A regulação positiva ou negativa do biomarcador está associada a uma forma virulenta do câncer em particular.
[0364] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um método para caracterizar uma diversidade fenotípica em um tumor heterogêneo, nódulos linfáticos ou metástases ou cisto pré-canceroso e/ ou detectar subclones geneticamente distintos dentro de um nódulo linfático tumoral heterogêneos ou metástases ou cisto pré-cancerígeno e/ ou identificar eventos de prevalência dentro de um nódulo linfático ou metástase tumoral ou cisto pré-canceroso e/ ou determinação da prevalência de alvos dentro de um nódulo linfático ou metástase tumoral ou cisto pré-canceroso que compreende (i) a obtenção de uma amostra ou amostras dos nódulos linfáticos ou metástases tumorais ou cisto pré-cancerígeno abrange regiões espacialmente distintas dos nódulos linfáticos tumorais ou metástases ou cisto pré-canceroso, que é ou são opcionalmente fixados ou preservados antes da homogeneização, por exemplo, com formalina, parafina e/ ou etanol, e (ii) homogeneização dos nódulos linfáticos ou metástases tumorais ou pré-cancerosas amostra de cisto ou amostras, produzindo assim um material homogeneizado representativo do fenômeno diversidade óptica dos nódulos linfáticos heterogêneos de tumores ou metástases ou cisto pré- canceroso e é adequado para caracterizar a paisagem do tumor e/ ou detectar subclones geneticamente distintos dentro de um nódulo linfático heterogêneo de tumores ou metástases ou cisto pré-canceroso e/ ou identificar eventos de baixa prevalência dentro de um nódulo linfático tumoral ou metástases ou cisto pré- canceroso e/ ou determinação da prevalência de alvos dentro de um nódulo linfático ou metástase tumoral ou cisto pré-canceroso.
[0365] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um método para detectar células pré-cancerosas ou células cancerígenas em tecidos supostamente normais ou tecidos pré-cancerosos putativos em um paciente, por exemplo, um em risco de desenvolver câncer devido a uma mutação genética ou câncer anterior, ou um paciente com cistos ou pólipos pré-cancerosos que compreende (i) a obtenção de uma amostra ou amostras de tecidos supostamente normais ou tecidos pré-cancerosos putativos, tais como, cistos ou pólipos pré-cancerosos que abrangem regiões espacialmente distintas dos tecidos supostamente normais ou tecidos pré-cancerosos putativos do paciente, que é opcionalmente fixa ou preservada antes da homogeneização, por exemplo, com formalina, parafina e/ ou etanol, e (ii) homogeneizar a amostra ou amostras, produzindo assim um material homogeneizado que é representativo dos supostos tecidos normais ou supostos tecidos pré-cancerígenos e que é adequado para a detecção de células cancerígenas raras ou células-tronco cancerígenas, por exemplo, mesmo antes de qualquer sinal de doença ter se manifestado no paciente.
[0366] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de utilização de amostras representativas e porções dos mesmos produzidos por qualquer um dos métodos anteriores em diferentes formatos de ensaio, em que estes ensaios podem ser efetuados em elevado rendimento, realizados simultaneamente ou em alturas ou locais diferentes, e/ ou por automação (totalmente automatizada ou semiautomatizada).
[0367] Em outro aspecto, as amostras representativas da invenção ou suas porções produzidas por qualquer um dos métodos anteriores são armazenadas para utilização futura, por exemplo, congeladas ou liofilizadas.
[0368] Em outro aspecto, as amostras representativas da invenção ou suas porções produzidas por qualquer um dos métodos anteriores são utilizadas para derivar (e opcionalmente purificar) anticorpos ou antígenos específicos de um antígeno particular de uma célula cancerígena ou tipos de células em uma amostra de paciente, anticorpos esses ou antígenos potencialmente podem ser utilizados em medicina personalizada, isto é, na produção de vacinas terapêuticas ou profiláticas contra o câncer.
[0369] O passo de homogeneização em todos os métodos acima mencionados pode ser efetuado por um método que preserve a integridade das células dentro da amostra, ou seja, a maior parte das células dentro da amostra homogeneizada ou amostras não são lisadas e pelo que o resultante material homogeneizado e suas partes são “representativas” da amostra ou amostras. Novamente, isto significa que as células dentro da amostra ou uma porção desta refletem as percentagens dos diferentes tipos de células dentro da totalidade da amostra de tecido ou amostras, por exemplo, um tumor sólido ou um nódulo linfático. Isto pode ser efetuado, por exemplo, por dissociação mecânica da amostra tumoral ou de uma sua porção (tal como dissociação mecânica realizada com ou sem a adição de liquido amostra de tumor ou uma sua porção) e/ ou dissociação química ou enzimática do tumor amostra ou uma porção desta (tal como o tratamento com uma enzima que seletiva ou preferencialmente ou primariamente atua sobre proteínas do arranjo extracelular em comparação com proteínas associadas à membrana). Alternativamente, os métodos de homogeneização podem resultar na dissociação das células enquanto ainda geram uma amostra que é representativa do tecido de partida, por exemplo, um tumor inteiro. Além disso, as amostras representativas homogeneizadas podem ser opcionalmente dissociadas e/ ou tratadas para remover ou isolar tipos específicos de moléculas, tais como, tipos de células específicas, proteínas, ácidos nucleicos ou lipídios e semelhantes, gerando desse modo outras amostras representativas que podem ser utilizadas em diagnóstico. e métodos terapêuticos.
[0370] Qualquer um dos métodos acima pode incluir a detecção da expressão de pelo menos um biomarcador, por exemplo, pelo menos um biomarcador de lipídio, proteína ou ácido nucleico, no material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. Adicionalmente, os métodos podem ainda incluir a detecção da percentagem de células tumorais no material homogeneizado ou uma porção ou fração destas que expressam um biomarcador particular ou combinação de biomarcadores. Opcionalmente, as células estaminais tumorais e/ ou a frequência relativa ou percentagem de subclones tumorais no material homogeneizado ou uma porção ou fração deste são detectadas e/ ou isoladas. Adicionalmente, os métodos podem também incluir a detecção de um alvo genético (tal como uma mutação pontual, uma deleção, uma adição, uma translocação, uma fusão genética ou uma amplificação de um gene).
[0371] Qualquer um dos métodos anteriores pode também ser utilizado para detectar, isolar e/ ou quantificar células imunes específicas (tais como linfócitos B, linfócitos T, macrófagos, células NK, monócitos ou uma sua combinação) presentes no material homogeneizado ou em uma porção ou sua fração, que fornece informações clínicas valiosas, por exemplo, estado imunológico e estado de doença, e também para selecionar protocolos de tratamento adequados, tais como, inibidores de ponto de verificação, citocinas ou outros moduladores imunológicos.
[0372] Os materiais homogeneizados resultantes ou amostras representativas podem compreender pelo menos 1.000; 10.000; 100.000; 1.000.000; 5.000.000; 10.000.000; 50.000.000; 100.000.000; 500.000.000; 1.000.000.000; 5.000.000.000; 10.000.000.000; 50.000.000.000; 100.000.000.000, 1.000.000.000.000 ou mais células.
[0373] Os materiais homogeneizados resultantes ou uma fração ou porção destes opcionalmente podem ser congelados ou liofilizados ou incluídos em cera (tal como parafina) ou, alternativamente, utilizados para passos adicionais (alguns dos quais são discutidos abaixo) sem tal congelação ou liofilização ou cera. Por exemplo, um bloco parafínico representativo, isto é, o material homogeneizado resultante ou uma fração do mesmo ou porção incluída em parafina, é adequado para utilização no fluxo de trabalho da patologia anatômica corrente, por exemplo, seccionamento, preparação de lâminas, coloração, microscopia, recuperação de antígenos, etc.
[0374] Os materiais homogeneizados podem ser derivados de dois ou mais tumores retirados de um ou mais sujeitos e os materiais homogeneizados resultantes ou suas frações de cada tumor são utilizados para avaliar as semelhanças e/ ou diferenças dos dois ou mais tumores ou estados de doença de diferentes pacientes.
[0375] Além disso, os materiais homogeneizados podem ser derivados de dois ou mais tecidos normais ou pré-cancerosos putativos, por exemplo, cistos ou pólipos de mama, cervicais, colorretais ou pré-cancerosos obtidos de um indivíduo, por exemplo, um com uma mutação BRCA e os materiais homogeneizados ou frações resultantes do mesmo utilizado para avaliar se estão presentes quaisquer células anormais ou biomarcadores de doenças.
[0376] Além disso, células não humanas (tais como células de inseto e/ ou células de rato) ou outras proteínas estranhas, ácidos nucleicos ou moléculas pequenas podem ser adicionadas ao material homogeneizado para criar um controlo interno para detecção de proteína positiva ou ácido nucleico.
[0377] Além disso, moléculas pequenas (tais como haptenos, marcadores de peptídios, marcadores de proteínas, marcadores fluorescentes e/ ou marcadores de ácido nucléico) podem ser adicionadas à amostra e usadas para fornecer informações espaciais na amostra representativa. Por exemplo, uma amostra (como um tumor ou nódulo linfático) pode ser selecionada, por exemplo, cortada em quadrantes, e um hapteno diferente (ou outra pequena molécula adequada) pode ser “dopado” em cada seção antes de homogeneizar as seções para gerar um exemplo representativo. Deve ser entendido que o número de seções que podem ser geradas a partir de cada amostra para “doping” antes da homogeneização não é limitado, mas, provavelmente, selecionado em escala com o tamanho da amostra, ou seja, quanto maior a amostra, maior o número de seções que podem ser “marcadas” com uma pequena molécula antes da homogeneização. Deste modo, a informação espacial pode ser mantida nos materiais homogeneizados resultantes ou nas suas frações.
[0378] Pequenas moléculas também podem ser adicionadas à amostra antes de combinar a amostra com uma amostra diferente de outro paciente ou do mesmo paciente e, assim, fornece um meio para diferenciar amostras quando executado em um formato de ensaio multiplex.
[0379] As amostras que são homogeneizadas são opcionalmente fixadas com formalina ou podem ser preservadas em etanol antes ou depois da homogeneização. Devido a questões de segurança, as amostras de tecido são geralmente formalinas ou fixadas de outra forma antes do uso em patologia ou métodos de diagnóstico. A formalina ou outros métodos de fixação são geralmente conhecidos na técnica. Métodos exemplares são divulgados infra. Nesse caso, a amostra de tumor fixada em formalina pode ser incluída em água ou solução salina tamponada (tal como PBS) antes da homogeneização no passo (ii).
[0380] Alternativamente, ou adicionalmente, a amostra de tumor utilizada nos métodos divulgados pode ser preservada em etanol antes da homogeneização. No entanto, deve ser enfatizado que a fixação de formalina ou etanol ou outro procedimento de preservação não são essenciais para os métodos em questão, e podem ser eliminados sem comprometer a adequação da amostra representativa homogeneizada resultante.
[0381] A homogeneização de tecido não fixado pode ser usada para produzir uma amostra viva representativa. Uma amostra representativa viva pode ser cultivada para criar uma amostra de cultura de tecidos representativa de pacientes individuais. Essa amostra representativa pode ser dividida numerosas vezes para criar várias amostras de cultura representativas, que podem ser usadas para determinar a eficácia da quimioterapia (como um anticorpo, ácido nucleico, molécula pequena ou polipeptídio, que antagoniza, inibe ou bloqueia a expressão ou atividade funcional de pelo menos um biomarcador conhecido ou desconhecido). Além disso, tipos específicos de células (tais como células imunes ou células tumorais) podem ser selecionados usando análise FACS. Por exemplo, as células imunes infiltradas no tumor podem ser selecionadas e cultivadas para determinar os anticorpos específicos do tumor que são secretados pelo sistema imunitário.
[0382] Também, como aqui mostrado, os métodos divulgados para derivar amostras representativas e a sua utilização em métodos de diagnóstico e terapêuticos são adequados para amostras de tecidos fixos e não fixados.
[0383] Qualquer um dos métodos divulgados para preparar uma amostra representativa (tal como um material homogeneizado preparado a partir de uma amostra de biópsia tumoral) pode incluir a adição de pelo menos uma colagenase ou outra combinação enzimática ou enzimática adequada ou outro produto químico, tal como, um sal que se decompõe ou o que facilita a quebra da arranjo extracelular antes, durante ou após a homogeneização; a utilização de condições de temperatura e/ ou tampão elevadas, tais como, um tampão de condicionamento celular, por exemplo, CC1 ou CC2, que perturba ligações cruzadas celulares; e/ ou o uso de um dispositivo para cisalhamento mecânico (como um liquidificador IKA, um desassociador suave de MACs ou um equivalente funcional). Estes métodos podem ou não ser realizados sob condições que mantêm a viabilidade e integridade das células dentro da amostra, por exemplo, sob algumas condições de homogeneização, as células não são substancialmente lisadas.
[0384] Em um aspecto, a homogeneização compreende o uso de almofariz e pilão, um material homogeneizador dounce ou moinho de tecidos, um material homogeneizador de tecido de lâmina rotativa eletrônico portátil (como o Omni-TH disponível da Thomas Scientific), um material homogeneizador de espatulação de contas (como um liquidificador de balas ou um Material homogeneizador Burton Precellys 24 Tecido ou um Ruptor de Contas disponível a partir de OMNI), opcionalmente a uma velocidade entre cerca de 100 e cerca de 75.000 RPM para material homogeneizadores rotativos ou uma velocidade de cerca de 0,5 m/s a cerca de 2,5 m/s para batedores de contas e durante um período de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos, cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos, cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos, ou cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos.
[0385] Em outra forma de realização, a homogeneização compreende a utilização de colagenase intersticial, Gelatinase-A, Estromelisina 1, Matrilisina, Neutrófilo colagenase, Gelatinase-B, Estromelisina 2, Estromelisina 3, Metaloelastase de Macrófagos, Colagenase 3, MT1-MMP, MT2- MMP, MT3- MMP, MT4-MMP, Colagenase 4, Enamelisina, X-MMP, CA - MMP, MT5-MMP, MT6-MMP, Matrilisina-2, MMP-22, endoproteinase, tripsina, quimiotripsina, endoproteinase Asp-N, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Glu-C (proteínase V8), endoproteinase Lys-C, pepsina, termolisina, elastase, papaína, proteinase K, subtilisina, clostripaína, exopeptidase, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B, carboxipeptidase P, carboxipeptidase Y, catepsina C, acilamino-ácido que liberta a enzima, aminopeptidase de piroglutamato, ou qualquer sua combinação, opcionalmente a uma concentração de cerca de 0,001 μg/ml a cerca de 1000 mg/ml e durante um período de cerca de 1 minuto a cerca de 120 minutos.
[0386] A amostra de tumor utilizada nos métodos divulgados que englobam regiões espacialmente distintas do tumor ou outro tecido pode compreender pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, pelo menos 85 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou, de preferência, a totalidade de um tumor removido cirurgicamente de um paciente. A amostra do tumor pode ter pelo menos 1, 5, 10, 20, 50, 100 ou mais milímetros (mm) ou centímetros (cm) de diâmetro.
[0387] As amostras utilizadas nos métodos em questão serão geralmente derivadas de um tumor sólido ou tumores (incluindo tumores primários e tumores metastáticos), nódulos linfáticos, metástases ou tecidos pré- cancerígenos, tais como, cistos ou pólipos. Alternativamente, ou adicionalmente, os métodos também podem também ser efetuados com tumores não sólidos, por exemplo, cânceres do sangue. Por exemplo, as amostras de tumores sólidos que são homogeneizadas opcionalmente podem ser combinadas com amostras de pacientes líquidos, por exemplo, sangue, fluido linfático, amostras de efusão, líquido cefalorraquidiano, bílis, muco e/ ou amostras de urina do paciente. As amostras homogeneizadas podem adicional ou alternativamente compreender tecidos “normais” ou pré-cancerosos por biópsia, por exemplo, para detectar células doentes antes da manifestação da doença.
[0388] Tal tumor ou outra amostra de tecido ou amostras utilizadas nos métodos divulgados podem ser de qualquer fonte, por exemplo, derivada de mama, cólon, pulmão, pâncreas, vesícula biliar, pele, osso, músculo, fígado, rim, colo do útero, ovário, próstata, esôfago, estômago, ou outros órgãos, por exemplo, um tumor do cancro da mama, um tumor do cancro do pulmão, tumor hepático, um tumor do cancro da próstata, um tumor do cancro do cólon, um tumor do cancro da bexiga, um tumor ou cancro do rim. Geralmente, a amostra de tumor ou outro tecido utilizado nos métodos divulgados é de origem humana
[0389] O tumor ou outra amostra de tecido utilizada nos métodos divulgados pode ter um volume de pelo menos 1 cm3, pelo menos 2 cm3, pelo menos 3 cm3, pelo menos 4 cm3, pelo menos 5 cm3, pelo menos 6 cm3, pelo menos 7 cm3 pelo menos 8 cm3, pelo menos 9 cm3, pelo menos 10 cm3, pelo menos 15 cm3, pelo menos 20 cm3, pelo menos 25 cm3, pelo menos 50 cm3, pelo menos 100 cm3, pelo menos 250 cm3, pelo menos 500 cm3, pelo menos 1.000 cm3, pelo menos 2.500 cm3, pelo menos 5.000 cm3, pelo menos 7.500 cm3, pelo menos 10.000 cm3 ou maiores.
[0390] O tumor ou outra amostra de tecido utilizada no método divulgado pode ter uma largura no ponto mais largo de pelo menos 0,5 cm, pelo menos 1 cm, pelo menos 1,5 cm, pelo menos 2 cm, pelo menos 2,5 cm, pelo menos 3 cm, pelo menos 3,5 cm, pelo menos 4 cm, pelo menos 4,5 cm, pelo menos 5 cm, pelo menos 6 cm, pelo menos 7 cm, pelo menos 10 cm, pelo menos 25 cm, pelo menos 50 cm ou maiores.
[0391] Adicionalmente, em algumas formas de realização, podem ser feitas amostras representativas de tecido que foi anteriormente fixado em formalina e incluído em cera de parafina. Em particular, a cera pode ser fundida, o tecido recuperado e hidratado e depois os métodos aqui descritos, isto é, homogeneização, aplicada à amostra, que é adequada para utilização em qualquer número de ensaios (ver, por exemplo, a Figura 24). Figura 24 mostra a coloração de HPV16 ISH em células Caski em uma amostra representativa preparada a partir de tecido recuperado de um bloco de parafina. O tecido previamente incluído em cera de parafina foi recuperado e material homogeneizado em um IKA para gerar uma amostra representativa. Deste modo, os métodos divulgados podem ser utilizados para gerar uma amostra representativa utilizando uma amostra ou amostras já preparadas para o estágio de TNM, por fusão da cera, recuperação da amostra, reidratação do tecido e homogeneização em conformidade.
[0392] Qualquer um dos métodos anteriores pode ainda compreender (iii) distribuição do homogeneizado ou uma porção ou fracção em um ou mais lâminas ou outros suportes sólidos e, opcionalmente, manchando as uma ou mais lâminas ou outros suportes sólidos contendo o homogeneizado ou uma porção ou sua fração com coloração de hematoxilina e eosina; realização de coloração imuno-histoquímica no lâmina ou outro suporte sólido contendo o homogeneizado ou uma porção ou fracção do mesmo; ou realizar hibridação in situ sobre a lâmina ou outro suporte sólido contendo o homogeneizado ou uma porção ou fracção do mesmo, isto é, qualquer uma das quais poderia ser considerado o passo (iv) nos métodos.
[0393] Além disso, qualquer um dos métodos acima pode ainda compreender (iii) a purificação de ácidos nucleicos (tais como DNA ou mRNA) do material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. Os ácidos nucleicos purificados podem ser sujeitos a Northern blot, sequenciação de DNA, PCR, RT- PCR, perfil de micro arranjo, apresentação diferencial ou hibridização in situ. Em vez disso, o ácido nucleico purificado pode ser conjugado a uma nanopartícula (tais como pontos quânticos, nanopartículas paramagnéticas, nanopartículas super paramagnéticas e nanopartículas metálicas, preferencialmente pontos quânticos ligados, incluindo, a título de exemplo e sem limitação, CdSe, ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAIAs, e InGaN, por como exemplo).
[0394] Está também contemplado que qualquer um dos métodos acima pode ainda compreender lipídios purificadores ou exossomos ou outras organelas do material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. Os lipídios purificados podem ser sujeitos a espectrometria de massa ou histoquímica.
[0395] Adicionalmente, também contemplado que qualquer um dos métodos acima pode ainda compreender purificar proteínas do material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. As proteínas purificadas podem ser submetidas a Western blot, ELISA, imunoprecipitação, cromatografia, espectrometria de massa, perfil micro arranjo, interferometria, coloração eletroforética ou coloração imuno-histoquímica. Alternativamente, ou para além do precedente, as proteínas purificadas podem ser utilizadas para produzir antissoros específicos para o tumor.
[0396] Além disso, está contemplado que qualquer um dos métodos acima compreende ainda (iii) realizar uma análise genômica, transcriptômica, proteômica e/ ou metabolômica no material homogeneizado ou uma porção ou fração deste.
[0397] Além disso, está contemplado que qualquer um dos métodos acima compreende ainda (iii) tipos de células específicas de purificação por afinidade a partir do material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. Os tipos de células específicos podem conter um biomarcador de interesse. Os biomarcadores exemplares de interesse podem incluir Her2, bRaf, uma amplificação de ERBB2, uma mutação Pl3KCA, uma amplificação de FGFR2, uma mutação p53, uma mutação BRCA, uma amplificação CCND1, uma mutação MAP2K4, uma mutação ATR ou qualquer outro biomarcador cuja expresse está correlacionado com um câncer específico; pelo menos um de AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/ BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/ Pr, UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT e TMPRSS2; ou pelo menos um biomarcador selecionado de ABCB5, AFP-L3, alfa-fetoproteína, alfa-metil acil-CoA racemase, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA - 125, CA15-3, CA19-9, Calcitonina, Antígeno carcinoembriônico, Antígeno carcinoembriônico Peptídio 1, Protrombina Des-gama carboxila, Desmin, Antígeno 2 de Câncer de Próstata Precoce, Receptor de Estrogênio, Produto de degradação de Fibrina, Glicose-6- fosfato isomerase, Antígeno de HPV, tal como, vE6, E7, L1, L2 ou p16INK4a Gonadotrofina coriônica humana, IL-6, Queratina 19, Lactato desidrogenase, Leucil aminopeptidase, Lipotropina, Metanefrinas, Neprilisina, NMP22, Normetanefrina, PCA3, Antígeno prostático específico, Fosfatase ácida prostática, Sinaptofisina, Tiroglobulina, TNF, um fator de transcrição selecionado a partir de ERG, ETV1 (ER81), FL1, ETS1, ETS2, ELK1, ETV6 (TEL1), ETV7 (TEL2), GABPa, ELF1, ETV4 (E1AF; PEA3), ETV5 (ERM), ERF, PEA3/ E1AF, PU.1, ESE1/ ESX, SAP1 (ELK4), ETV3 (METS), EWS/ FL1, ESE1, ESE2 (ELF5), ESE3, PDEF, NET (ELK3; SAP2), NERF (ELF2) ou G associado ao tumor de licoproteína 72, c-kit, SCF, pAKT, kit de pc e Vimentina.
[0398] Alternativamente, ou adicionalmente, o biomarcador de interesse pode ser um inibidor do ponto de verificação imunológico, tal como, mas não limitado a CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9. GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A e B-7 ou uma combinação destes ou um ligando de uma proteína de checkpoint selecionada do grupo constituo por CTLA - 4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B- 7 ligandos familiares ou uma combinação destes.
[0399] O método de qualquer uma das reivindicações anteriores que inclui a detecção de pelo menos um biomarcador associado à leucemia linfoblástica aguda (etv6, am11, ciclofilina b), linfoma de células B (Ig-idiotipo), glioma (E-caderina, .a catenina, beta-catenina, .-catenina, p120 ctn), câncer de bexiga (p21ras), câncer biliar (p21ras), câncer de mama (família MUC, HER2/ neu, c-erbB-2), carcinoma cervical (p53, p21ras), carcinoma do cólon (p21ras, HER2/ neu, c-erbB-2, família MUC), câncer colorretal (antígeno colorretal associado (CRC) -C017-1A/ GA733, APC), coriocarcinoma (CEA), célula epitelial câncer (ciclofilina b), câncer gástrico (HER2/ neu, c-erbB-2, ga733 glicoproteína), câncer hepatocelular (alfa-fetoproteína), linfoma de Hodgkin (Imp-1, EBNA - 1), câncer do pulmão (CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), leucemia derivada de células linfoides (ciclofilina b), melanoma (proteína p5, gp75, antígeno oncofetal, gangliosídeos GM2 e GD2, Melan-A/ MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100.sup.Pmel117), mieloma (família MUC, p21ras), carcinoma pulmonar de células não pequenas (HER2/ neu, c-erbB-2), câncer de nasofaringe (Imp-1, EBNA - 1), câncer de ovário (família MUC, HER2/ neu, c-erbB-2), câncer de próstata (Antígeno Prostático Específico (PSA) e seus epítopos antigênicos PSA - 1, PSA - 2 e PSA - 3, PSMA, HER2/ neu, c-erbB-2, ga733 glicoproteína), câncer renal (HER2/ neu, c-erbB- 2), cânceres de células escamosas do colo do útero e do esófago (produtos virais, tais como, proteínas do vírus do papiloma humano), câncer testicular (NY-ESO-1) e/ ou leucemia de células T (epítopos do HTLV-1).
[0400] Está também contemplado que qualquer um dos métodos acima mencionados compreende ainda (iii) tratar o material homogeneizado ou uma porção ou sua fração com colagenase ou outra enzima ou química ou combinação destes que decompõe arranjos extracelulares, incubando o material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. sob condições de alta temperatura, e/ ou agitar mecanicamente o material homogeneizado ou uma porção ou sua fração, de modo a dissociar as células dentro do material homogeneizado ou uma porção ou sua fração. Geralmente, estes métodos irão gerar outra amostra representativa que pode ser utilizada nos métodos analíticos ou terapêuticos divulgados ou em uma combinação destes.
[0401] Adicionalmente, está contemplado que qualquer um dos métodos descritos acima compreende ainda (iii) filtrar ou dimensionar o material homogeneizado ou uma porção ou fração deste, o que pode resultar na obtenção de células individuais ou pequenos aglomerados de células, tais como, dupletos ou tripletos.
[0402] A componente celular da amostra representativa pode ser separada por um ou vários passos de filtração. Por exemplo, após a homogeneização e dissociação do material homogeneizado através de meios físicos e/ ou bioquímicos, a amostra desassociada pode ser filtrada através de um filtro de 1 mícron para remover todo o material celular intacto. Espera-se que a amostra representativa não celular contenha fatores segregados do tumor e estroma normal de dentro do tumor que sejam de utilidade clínica, ou seja, anticorpos, fatores de crescimento, imunomoduladores e outros fatores desconhecidos. A amostra representativa não celular pode ser analisada por ELISA, espectrometria de massa, sequenciamento de nova geração e outros métodos de diagnóstico. Na medida em que as células individuais derivadas da amostra representativa são obtidas após filtração, essas células podem ser analisadas utilizando análise de fluorescência de células ativadas (FACS) e citometria de fluxo.
[0403] Dada a natureza representativa do material homogeneizado gerado pelos métodos divulgados, o material homogeneizado ou uma porção ou fração dele pode ser usado para detectar um evento genético de baixa prevalência (tal como um evento genético que ocorre a 20 % de prevalência, 15 % de prevalência, 10 % prevalência, 5 % de prevalência, 2 % de prevalência, 1 % de prevalência, 0,5 % de prevalência, 0,1 % de prevalência, 0,001 % de prevalência, 0,0001 % de prevalência, 0,00001 % de prevalência, 0,000001 % de prevalência ou menos). Exemplos de eventos gênicos incluem uma mutação pontual, uma eliminação, uma adição, uma translocação, uma fusão genômica ou uma amplificação de um gene. Do mesmo modo, os métodos podem também envolver a detecção de heterogeneidade genética ou epigenética de células dentro da amostra de tumor ou uma porção desta e/ ou detecção de células que compreende variações genéticas ou epigenéticas raras. Tais células podem estar presentes na amostra de tumor com uma frequência inferior a 5 %, inferior a 1 %, inferior a 0,5 %, inferior a 0,1 %, inferior a 0,05 % ou inferior a 0,01 %.
[0404] As células raras detectadas podem compreender uma ou mais diferenças genéticas ou epigenéticas que conferem resistência a uma terapia anticâncer e/ ou promovem metástase. Portanto, a detecção de tais células facilitará o prognóstico do câncer, bem como a seleção de um regime terapêutico apropriado, como cirurgia, quimioterapia e/ ou o uso de produtos biológicos.
[0405] Os métodos anteriores também podem incluir o uso de pelo menos um etiqueta detectável selecionado a partir de moléculas fluorescentes ou fluorocromos (como vendido pela Invitrogen, e.g., veja, The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg, ou revelado na Patente US No. 5.866.366 de Nazarenko et al., tal como, ácido 4-acetamido-4’- isotiocianatostilbeno-2,2’dissulfúrico, acridina e derivados, tais como, acridina e isotiocianato de acridina, 5- Ácido (2’-aminoetil) aminonaftaleno-1- sulfúrico (EDANS), 4-amino-N- [3-vinilsulfonil) fenil] naftalimida-3,5-dissulfonato (Lucifer Yellow VS), N- (4-anilino-1- naftil) maleimida, antranilamida, Amarelo Brilhante, cumarina e derivados, tais como, cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcuuarina (Coumaran 151); cianose; 4’, 6- diaminidino-2- fenilindol (DAPI); 5’, 5’’- dibromopirogalol-sulfonaftaleína (vermelho de bromopirogalol); 7- dietilamino-3- (4’-isotiocianatofenil) -4- metilcumarina; pentaacetato de dietilenotriamina; Ácido 4,4’-diisotiocianatodi- hidro-estilbeno-2,2’-dissulfônico; Ácido 4,4’-diisotiocianatostilbeno-2,2’- dissulfônico; Cloreto de 5- [dimetilamino] naftaleno-1-sulfonila (DNS, cloreto de dansilo); Ácido 4- (4’ -dimetilaminofenilazo) benzílico (DABCYL); 4- dimetilaminofenilazofenil-4’-isotiocianato (DABITC); eosina e derivados, tais como, isotiocianato de eosina e eosina; eritrosina e derivados, tais como, eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etídio; fluoresceína e derivados, tais como, 5-carboxifluoresceina (FAM), 5- (4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceina (DTAF), 2’7’-dimetoxi-4’5’-dicloro-6- carboxifluoresceina (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e QFITC (XRITC); 2’, 7’-difluorofluoresceína (OREGON GREEN®); fluorescamina; IR144; IR1446; Isotiocianato de malaquita verde; 4- metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Vermelho de fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdeído; pireno e derivados, tais como, pireno, butirato de pireno e butirato de succinimidil 1-pireno; Vermelho Reativo 4 (Cibacron® Vermelho Brilhante 3B-A); rodamina e derivados, tais como, 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), lisamina rodamina B cloreto de sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, rodamina verde, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 e derivado de cloreto de sulfonila de sulforrodamina 101 (Texas Red); N, N, não’, N’- tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC); riboflavina; ácido quaternário e derivados de quelato de térbio, quelatos de európio reagentes com tiol que emitem a aproximadamente 617 nm (Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216- 27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999), bem como GFP, LissamineTM, dietilaminocumarina, fluoresceína, clorotriazinilo, naftofluoresceína, 4, 7- diclororodamina e xanteno (como descrito na Patente US No. 5.800.996 de Lee et al.) e seus derivados. Outros fluoróforos conhecidos dos especialistas na técnica podem também ser utilizados, por exemplo os disponíveis em Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes (Eugene, Oreg.) E incluindo a série de corantes ALEXA FLUOR ™ (por exemplo, como descrito na Pat. 5.696.157, 6.130.101 e 6.716.979), a série BODIPY de corantes (corantes difluoreto de dipirrometenoboro, por exemplo como descrito nas Patentes US 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782, 5.274.113, 5.338.854, 5.451.663 e 5.433.896), Cascade Blue (um derivado reativo de amina do pireno sulfonado descrito na Patente US No. 5.132.432) e Marina Blue (Patente US No. 5.830.912), uma nanopartícula fluorescente, tal como, um nanocristal semicondutor, por exemplo, um QUANTUM DOTTM (obtido, por exemplo, de QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.; ver também, Patentes US 6.815.064, 6.682.596 e 6.649.138). Os nanocristais semicondutores descritos, por exemplo, na Pat. No. 6.602.671, Bruchez et. al. (1998) Science 281: 2013- 6, Chan et al. (1998) Science 281: 2016-8, e US Pat. No. 6.274.323, Pat. não 6,927,069; 6,914,256; 6,855,202; 6,709,929; 6,689,338; 6,500,622; 6.306.736; 6.225.198; 6,207,392; 6,114,038; 6,048,616; 5,990,479; 5,690,807; 5,571,018; 5.505.928; 5.262.357 e na Publicação de Patente US 2003/0165951, assim como Publicação PCT No. 99/26299 (publicada em 27 de Maio de 1999), radioisótopos (tais como 3H), quelatos metílicos, tais como, quelatos DOTA e DPTA de íons metílicos radioativos ou paramagnéticos como Gd3 +, e lipossomas, enzimas, por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, glicose oxidase, β-galactosidase, β-glucuronidase ou β lactamase, enzima em combinação com um composto cromogênico, fluorogênico ou luminogênico que gera um sinal detectável, por exemplo, aqueles vendidos pela Invitrogen Corporation, Eugene Oreg.). Exemplos particulares de compostos cromogênicos incluem diaminobenzidina (DAB), 4- nitrofenilfosfato (pNPP), vermelho rápido, bromocloroindolil fosfato (BCIP), nitro azul tetrazólio (NBT), BCIP/ NBT, vermelho rápido, AP Laranja, AP azul, tetrametilbenzidina (TMB), 2,2’-azino-di- [3-etilbenzotiazolinossulfonato] (ABTS), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-β-D-galactopiran0sido (ONPG), o-fenilenodiamina (OPD), 5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-galactopiran0sido (X-Gal), metilumbeliferil-β-D-galactopiranósido (MU-Gal), p-nitrofenil-aD-galactopiranósido (PNP), 5-bromo- 4-cloro-3-indolil-β -D-glicuronídeo (X-Gluc), 3-amino-9-etil carbazol (AEC), fucsina, iodonitrotetrazólio (INT), azul de tetrazólio e violeta de tetrazólio, entre outros.
[0406] Os métodos divulgados podem ser automatizados, no todo ou em parte. Por exemplo, os passos (i) e (ii) podem ser automatizados, mas quaisquer passos subsequentes, por exemplo, passos (iii) e (iv), são manuais. Alternativamente, a título de exemplo, os passos (i) e (ii) podem ser manuais, enquanto os passos subsequentes, por exemplo, os passos (iii) e (iv), são automatizados. Além disso, todas as etapas abrangidas pelos métodos podem ser automatizadas.
[0407] Os métodos revelados podem ser utilizados, isoladamente ou em combinação com outros métodos conhecidos (tais como TNM), para estágio do tumor. Em um aspecto, os métodos compreendem ainda a avaliação de um ou mais dos aspectos morfológicos do tumor, a extensão em que as células tumorais se espalharam para os nódulos linfáticos regionais e/ ou sistema linfático, e se o tumor metastizou ou não para órgãos distantes com base na informação genômica, proteômica e/ ou lipidômica contida na amostra representativa.
[0408] Os métodos divulgados podem ainda compreender a utilização de um algoritmo para calcular a percentagem de células tumorais com ou sem um biomarcador específico. O risco relativo de progressão metastática (ou subclone virulento) pode ser determinado com base na percentagem de células dentro de uma amostra de tumor representativa e/ ou amostra de nódulo linfático
[0409] Os métodos revelados podem ainda compreender o desenvolvimento de um regime de dosagem personalizado com base no perfil do biomarcador, o perfil do antígeno, o perfil mutacional, o perfil lipídico, o perfil proteico e/ ou o perfil exossomo contido na amostra representativa. Por exemplo, com base nas informações contidas na amostra representativa (ou em comparação com uma amostra de nódulo linfático representativa e/ ou perfil de DAN circulante), a seleção de medicamentos e/ ou dosagem (quantidade, duração da administração, etc.) de tais drogas administradas a um paciente podem ser modificadas para personalizar o tratamento com base no perfil de câncer individual do paciente.
[0410] Os métodos revelados podem ainda compreender a comparação do perfil genômico da amostra representativa com o perfil genômico de uma amostra de nódulo linfático representativa e, opcionalmente, a comparação destes perfis com o DNA tumoral circulante de quaisquer metástases à distância ou uma amostra de tumor metastático representativa.
[0411] A presente invenção também engloba composições produzidas por qualquer um dos métodos nesta invenção.
ANÁLISE DE AMOSTRA REPRESENTATIVA
[0412] Adicionalmente, a invenção contempla a utilização dos resultados dos métodos anteriores (tais como a detecção de eventos gênicos e/ ou epigênicos raros, células raras, etc.) ou composições produzidas por qualquer um dos métodos anteriores, que envolvem homogeneização de uma amostra tumoral para preparar uma amostra representativa adequada para posterior análise utilizando qualquer número de ensaios de diagnóstico padrão) na seleção de um regime terapêutico apropriado para o tratamento de um sujeito. O regime terapêutico pode incluir qualquer quimioterapia, administração imunomoduladora, radiação, administração de citoquinas, cirurgia ou uma sua combinação.
[0413] Além disso, o método revelado pode ser utilizado para selecionar pelo menos um agente terapêutico (tal como um anticorpo, ácido nucleico, molécula pequena ou polipeptídio, que antagoniza, inibe ou bloqueia a expressão ou atividade funcional de pelo menos um biomarcador detectado) adequado para uso em um sujeito cujo tumor foi a fonte para a amostra representativa gerada pelos métodos fornecidos.
[0414] Recentes avanços no campo da biologia do câncer minaram crenças prolongadas em relação à fisiologia do tumor. Anteriormente, o pensamento predominante era que todas as células dentro de um tumor eram semelhantes entre si, independentemente do estágio do câncer. No entanto, com o advento de novas tecnologias, como o sequenciamento de células individuais, entende-se agora que as células dentro de um tumor podem ser altamente diversificadas. Veja Campbell et al. Subclonal phylogenetic structures in cancer revealed by ultra-deep sequencing. PNAS 2008; 105:13081-13086; e Navin et al. Tumor evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 2011; 472:90-94. A descoberta da heterogeneidade intra-tumoral destaca novas complexidades que precisarão ser abordadas na oncologia clínica, inclusive no diagnóstico do câncer.
[0415] Os métodos patológicos atuais baseiam-se no corte de apenas algumas pequenas regiões de um tumor, colocando-os em blocos de parafina e cortando pequenas seções desses blocos para serem testados para biomarcadores de câncer. Veja Westra et al. Surgical Pathology Dissection: An Illustrated Guide. New York: Springer. 2003. Esse método pode ser útil no estágio do câncer, mas a confiança na amostragem de apenas uma pequena fração de todo o tumor torna improvável que os resultados diagnósticos sejam representativos do todo. Como resultado, os métodos atuais: 1) não identificam características importantes da doença, e 2) sobre amostram um traço de doença menor, que muitas vezes não determina ou influencia a progressão e/ ou o desfecho da doença.
[0416] Estes problemas são amplificados à medida que o tamanho do tumor aumenta e, como resultado, as taxas de sobrevivência a longo prazo de pacientes com câncer são frequentemente afetadas negativamente. Por exemplo, independentemente do estágio do câncer, à medida que o tamanho do tumor aumenta, as médias de sobrevida em cinco anos caem. Veja Lopez- Encuentra et al. Staging in lung cancer: is 3cm a prognostic threshold in pathological stage 1 non-small cell lung cancer? A multicenter study of 1,020 patients. Chest. 2002; 121(5):1515-1520; Miller and Grigsby. Measurement of tumor volume by PET to evaluate prognosis in patients with advanced cervical cancer treated by radiation therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2002; 53(2): 353-359; Elkin et al. The effect of changes in tumor size on breast carcinoma survival in the U.S.: 1975-1999. Cancer. 2005; 104(6): 1149-1157; BrookmanMay et al. Difference between clinical and pathological renal tumor size, correlation with survival, and implications for patient counseling regarding nephron-sparing surgery. AJR. 2011; 197(5): 1137-1145; e Kornprat et al. Value of tumor size as a prognostic variable in colorectal cancer: a critical reappraisal. Am J Clin Oncol. 2011; 34(1): 43-49).
[0417] Assim, novas tecnologias são necessárias para abordar a questão da heterogeneidade do tumor na oncologia clínica, especialmente para aqueles pacientes com grandes tumores sólidos. Além disso, métodos melhorados são necessários para identificar amostras de pacientes contendo células anormais antes da manifestação da doença, a fim de aumentar a probabilidade de um bom resultado terapêutico.
[0418] A fim de abordar a questão da heterogeneidade do tumor, alguns especialistas no campo da oncologia sugeriram testar várias regiões, aumentando assim a quantidade de tumor a ser amostrada de uma só vez. Ver, por exemplo, Alizadeh et al. Toward understanding and exploiting tumor heterogeneity. Nature Medicine. 2015; 21: 846-853. Como demonstrado pelo modelo probabilístico acima, esta técnica não pode resolver completamente os problemas de heterogeneidade do tumor. O aumento da carga de trabalho para um laboratório de patologia encarregado do processamento desse número de amostras por paciente torna esse método proposto proibitivo.
[0419] Para que uma amostra seja representativa, todos os diferentes fragmentos do material de partida devem ter uma chance igual de acabar na amostra e isso deve ser consistente em todas as amostras. Veja Petersen et al. 2005. No entanto, com os atuais procedimentos de seccionamento, uma grande proporção do tumor é incinerada após a criação dos blocos de parafina. Veja Westra et al. 2003. Portanto, até o momento, não apenas amostras representativas de tumores não foram feitas, mas práticas patológicas atuais desencorajam e até mesmo proíbem sua criação.
[0420] Em um aspecto adicional, o uso de métodos mecânicos, por exemplo, métodos de cisalhamento e/ ou bioquímicos, por exemplo, condicionamento de calor e pH e digestão enzimática do arranjo extracelular, pode ser usado para criar uma amostra representativa de um tumor. O acoplamento destas abordagens resulta em uma amostra representativa de uma amostra de tecido ou amostras, por exemplo, um tumor inteiro ou porção substancial deste sem comprometer a capacidade de usar a amostra em ensaios tradicionais baseados em tecido, por exemplo, coloração com hematoxilina e eosina, análise imuno-histoquímica, e isolamento de ácido nucleico. De fato, cada amostra representativa pode ser usada em vários ensaios diferentes simultaneamente. Além disso, a homogeneização do órgão, tecido ou tumor o torna adequado para uso em testes diagnósticos adicionais, como o sequenciamento do genoma inteiro, que pode ser importante para futuras descobertas farmacológicas e diagnósticas e para a medicina personalizada. Além disso, o material homogeneizado é passível de métodos de automação similares aos utilizados para testes diagnósticos do sangue. Portanto, uma amostra representativa pode ser usada para uma variedade de protocolos de diagnóstico, a fim de identificar sub-clones tumorais raros e, por extensão, melhorar o diagnóstico clínico e o tratamento personalizado do câncer. Além disso, as amostras representativas resultantes podem ser utilizadas para derivar anticorpos ou antígenos úteis no desenvolvimento de vacinas de tumores terapêuticos ou profiláticos.
[0421] Como aqui exemplificado, os inventores demonstraram a capacidade de criar uma amostra representativa de espécimes clínicos, por exemplo, espécimes clínicos de tumores humanos e mostraram ainda que fenótipos raros, que provavelmente não seriam reconhecidos usando seccionamento tumoral tradicional, podem ser detectados dentro da amostra representativa gerados pelos métodos aqui divulgados. Além disso, os inventores mostraram que os métodos divulgados podem ser usados para gerar uma amostra representativa de uma variedade de diferentes tipos de tecido, tecidos fixos ou não, e a amostra representativa resultante pode ser usada para uma variedade de testes de diagnóstico incluindo IHC e ácido nucleico isolamento.
[0422] Dependendo do processo de dissociação mecânica e/ ou bioquímica aplicado à amostra para gerar o material homogeneizado, os aglomerados de células podem compreender mais de uma (1) célula para milhares de células. Os aglomerados podem ser dissociados (diminuição no tamanho e/ ou número de células contidos nos mesmos) pela aplicação de outros métodos, por exemplo, por dissociação mecânica e/ ou bioquímica adicional e/ ou por exclusão de tamanho, dependendo do ensaio subsequente a ser realizado usando a amostra representativa (por exemplo, FACS e citometria de fluxo requerem células individuais).
[0423] O método é flexível no que diz respeito ao grau de dissociação da amostra. Assim, pode ser possível controlar o(s) processo(s) mecânico(s) para obter um tamanho agregado de células alvo, por exemplo, processando aglomerados de células obtidos após a aplicação de um primeiro meio mecânico (como mistura ou equivalente) até que os aglomerados correspondam o objetivo de dissociação do método de amostragem (como células individuais). Em um aspecto, o cisalhamento mecânico e a exclusão de tamanho, por exemplo, peneiramento com uma série de malhas, são usados para remover aglomerados de células em ou abaixo de um certo tamanho enquanto retêm aglomerados celulares maiores para processamento adicional para atingir o tamanho de partícula objetivo. Desta forma, enquanto o intervalo de tamanho pode parecer uma distribuição normal, a distribuição resultante do tamanho de partícula de cluster é manipulada pelo uso de exclusão de tamanho, por exemplo, tamanho de peneiramento, para remover certas partículas do processo de dissociação e, assim, alcançar dimensionamento planalto, em vez de uma distribuição.
[0424] Após homogeneização, os aglomerados resultantes podem conter pelo menos 1 - 2, 2 - 100, 100 - 500, 500 - 1.000, 1.000 - 10.000, 10.000 - 50.000 ou mais células. Em um aspecto, os aglomerados contêm células únicas, cerca de 2 - 10 células, cerca de 10 - 20 células, ou cerca de 20 - 40 células. O tamanho dos clusters resultantes irá variar. Veja - se, por exemplo, a Figura 17
[0425] Como resultado da homogeneização de uma amostra de tumor e/ ou nódulo linfático (ou homogeneização de uma amostra de tumor), qualquer heterogeneidade de células dentro da amostra, por exemplo, tumor ou nódulo linfático, é substancialmente homogeneamente (uniformemente) distribuída dentro do material homogeneizado resultante ou porção ou fração da mesma, tal que o material homogeneizado (ou qualquer fração deste) expresse substancialmente de forma homogênea a heterogeneidade da amostra de biopsia do tumor que foi a entrada. Através da homogeneização de tumores para gerar uma amostra (ou material homogeneizado) que é representativa do tumor na sua totalidade, é possível caracterizar a diversidade fenotípica (tal como a percentagem de células com uma mutação genética específica) do tumor. Uma amostra homogeneizada pode ser referida como uma amostra líquida ou liquefeita com base na sua capacidade de fluir ou ser vertida, apesar de muitas ou a maioria das células permanecerem intactas. Em alguns casos, a amostra representativa pode ser uma amostra líquida (como aspirado de agulha de citologia, amostra de efusão ou exame de Papanicolau).
[0426] Como mencionado, outras porções podem ser adicionadas a estes materiais homogeneizados ou amostras representativas, tais como, outras células, haptenos ou marcadores.
SEQUENCIAMENTO DAS AMOSTRAS REPRESENTATIVAS
[0427] Com o objetivo final da medicina personalizada, os oncologistas contam com os diagnosticadores para detectar as principais mutações dos tumores, de modo que possam vincular terapias direcionadas a mudanças específicas dentro do tumor. A captura de informação de sequências através de Sequenciação de Próxima Geração (NGS) a partir de tumores sólidos é um componente crítico do fluxo de trabalho de oncologia clínica, uma vez que as células tumorais podem tornar-se invariavelmente resistentes à terapia ao longo do tempo. Um dos obstáculos mais significativos inerentes a todos os fluxos de trabalho clínicos atuais da NGS é que os médicos não conseguem detectar as mutações que estão impulsionando o crescimento do tumor em todas as partes do tumor, nem podem detectar mutações que conferem resistência terapêutica pré-existente. Além disso, enquanto algumas das mutações podem estar em alta prevalência dentro do tumor, outras mutações (incluindo mutações motoras e mutações de resistência) podem estar presentes em apenas uma pequena fração do tumor. Normalmente, a raiz deste problema é o fato de que os clínicos utilizam seções de tecido fixadas em formol, incluídas em parafina (FFPE) de amostras retiradas do tumor primário. Embora a questão da amostragem possa ser completamente resolvida através do processo de amostragem representativa, ainda existem alguns problemas significativos que devem ser resolvidos nos fluxos de trabalho clínicos da NGS para realizar a medicina personalizada.
[0428] Hoje, a NGS na clínica só pode ser utilizada para detectar uma mutação alvo (isto é, mutação ligada a uma terapia alvo) que está presente na maioria do tumor. Clínicos e pesquisadores se concentraram em mutações direcionáveis principalmente devido ao volume de dados produzidos pelas tecnologias NGS. Por exemplo, em uma análise inteira do exoma de uma amostra de tecido, dezenas de milhares de genes serão examinados, cada gene sendo sequenciado em dezenas a centenas de pequenos segmentos. Em vez de usar todos os dados para tomar decisões clínicas, muitos grupos cegam a grande maioria dos dados e relatam apenas as mutações que são conhecidas por estarem ligadas a uma terapia.
[0429] A necessidade técnica e clínica não satisfeita, no entanto, é detectar todas as mutações presentes em um tumor sólido, sejam elas “direcionáveis” ou não. Além disso, é imperativo que os médicos determinem a porcentagem das células tumorais que contêm uma mutação específica. Somente com dados que capturam a diversidade genômica da grande maioria do tumor, os clínicos podem entender como tratar um paciente com múltiplas mutações “direcionáveis” ou “drogáveis”. Por exemplo, se um tumor sólido contém uma mutação no gene EGFR na prevalência de 55 %, uma mutação bRaf na prevalência de 20 % e uma mutação KIT na prevalência de 5 %, um clínico desejaria atingir a maior parte do tumor com um inibidor de EGFR (por exemplo, Cetuximabe, Panitumumabe) até ser observada uma resposta clínica por imagiologia ou por um período de tempo especificado. O inibidor de EGFR seria então parado, e o próximo alvo de terapia mais prevalente seria administrado, neste caso, um inibidor de bRaf (por exemplo, Vemurafenibe). Nesse momento, o clínico pode ou não ver uma resposta clínica por meio de exames de imagem. O inibidor de bRaf seria interrompido, e o alvo menos frequente da terapia seria dado, nomeadamente um inibidor de KIT (por exemplo, imatinibe, Sunitinibe). Este regime de três drogas pode então ser repetido. Se as drogas puderem ser toleradas juntas, a terapia combinada seria outra possibilidade. Alternativamente, os medicamentos podem ser administrados em ordem inversa; Inibidor do KIT, inibidor do bRaf, seguido por um inibidor do EGFR.
[0430] O componente crítico deste esquema de drogas não é a tecnologia NGS ou os inibidores, mas sim a determinação da presença de todos os alvos potenciais e sua prevalência relativa dentro do tumor usando técnicas de amostragem representativa. No exemplo acima, tanto a mutação KIT quanto a mutação bRaf teriam sido perdidas porque estão presentes em baixa prevalência. Se a área do tumor continha uma alta porcentagem das células mutantes bRaf amostradas, ela teria aparecido como se a mutação bRaf estivesse conduzindo a maior parte do tumor e um inibidor de bRaf teria sido administrado como agente único. Segmentar apenas uma das três mutações no exemplo acima teria levado à resistência à terapia, uma vez que as células tumorais que continham as outras duas mutações não teriam respondido ao agente único.
[0431] Outras utilizações de dados de NGS de tumores primários tentam determinar se as células tumorais podem ser alvejadas pelo sistema imunitário, ou seja, o uso de imunoterapia. Isso inclui a previsão de neo- antígenos que podem ser alvos do sistema imunológico. O sequenciamento do exoma de tumores pode detectar mutações que podem resultar em alterações na proteína expressa.
[0432] Um fator crítico na determinação da prevalência de uma mutação dentro de um tumor sólido é o enriquecimento/ purificação das células tumorais longe da população mista de células tumorais e normais. Uma técnica que pode ser usada para capturar uma alta porcentagem de células tumorais é a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Aplicando esta técnica a amostras representativas, o tumor sólido material homogeneizado deve primeiro ser desassociado em células únicas, ou pequenos fragmentos de tecido multicelular. Células individuais podem ser classificadas com base no tamanho celular e nuclear, além de uma detecção fluorescente de um marcador tumoral. A seleção negativa das células normais longe das células tumorais também resultará em uma amostra que é predominantemente composta de células tumorais. A triagem de fragmentos de tecido multicelular (MTFS) pode ser enriquecida via detecção fluorescente de um marcador tumoral ou, no caso de seleção negativa, um marcador normal. Essa técnica não apenas facilita a interpretação dos dados do NGS, mas também permite a detecção de mutações de prevalência extremamente baixas no tumor.
[0433] Adicionalmente, FACS ou MTFS podem ser utilizados para discriminar múltiplas populações distintas de células de tumores, cada uma das quais pode ser tratada como uma amostra única e analisada independentemente uma da outra. Exemplos disso seria a diferenciação de células tumorais, células epiteliais normais, células endoteliais e células imunes.
[0434] Ainda outra aplicação de NGS de uma amostra representativa é a detecção de neo-antígenos que podem ser detectáveis pelo sistema imunitário. Para efetivamente utilizar neo-antígenos em um regime terapêutico antitumoral, os clínicos devem detectar todas as potenciais mutações antigênicas do tumor. Semelhante à terapia direcionada, é crítico detectar a maioria dos neo-antígenos para terapia com receptores de antígenos quiméricos (CAR-T).
[0435] Além disso, a citometria de fluxo é um componente importante de um fluxo de trabalho de diagnóstico onde os clínicos podem usar os dados da citometria de fluxo para determinar a composição da amostra representativa, em relação à porcentagem da amostra que é tumor, tumor diplóide normal ou várias populações de células tumorais que são positivas para um biomarcador específico. Um exemplo desse fluxo de trabalho seria calcular o número mínimo de células necessárias para fornecer estatisticamente um ensaio IHC que requer 1.000 células positivas, calculando a porcentagem de tumor em uma amostra representativa.
HOMOGENEIZAÇÃO DE TUMORES OU PARTES DELES
[0436] A presente invenção é dirigida a métodos para homogeneizar um tumor ou outra amostra de tecido, por exemplo, tecidos normais pré-cancerosos ou putativos, que opcionalmente podem ser preservados ou fixados antes ou depois da homogeneização, por exemplo, com formalina, parafina e/ ou etanol, para gerar um “Amostra representativa” que é uma indicação imparcial da totalidade do tecido, por exemplo, um tumor, um nódulo linfático, metástases, pólipo, cisto, biópsia, órgão inteiro ou uma combinação de qualquer um dos precedentes. Mais uma vez, estes métodos podem preservar a integridade e/ ou a viabilidade das células dentro da amostra. Estas amostras representativas podem compreender clones maioritários (com uma prevalência superior a 50 %), sub-clones primários (com uma prevalência de cerca de 20 % a cerca de 50 %), subclones secundários (com uma prevalência de cerca de 10 % a cerca de 20 %) e subclones menores (com uma prevalência de menos do que 10 %, preferivelmente com uma prevalência inferior a 5 %, mais preferencialmente com uma prevalência inferior a 1 % e, de um modo muito preferido, com uma prevalência inferior a 0,1 %). Como discutido acima, as amostras representativas facilitam a detecção de eventos de baixa prevalência, isto é, abaixo ou abaixo da ocorrência de 0,000001 %. As amostras representativas, porque refletem a totalidade da amostra de tecido, por exemplo, um tumor sólido ou nódulo linfático, permitem a detecção de mutações em proporção à sua ocorrência no tecido, geralmente um tumor ou um tecido linfático/ linfático, que não pode confiável ser feito usando os métodos atuais (como coloração de lâmina FFPE).
[0437] O conceito de homogeneização de amostras clínicas, por exemplo, tumores humanos, é contrário aos métodos históricos de amostragem de patologia e oncologia. Não há precedência histórica para homogeneizar tumores humanos inteiros, ou mesmo grandes porções de tumores humanos. De fato, uma vez que as amostras para estadiamento TNM são tomadas, o material restante do tumor é destruído (desde que seja aceito que todas as informações medicamente relevantes estão dentro das seções coletadas do estadiamento TNM).
[0438] No entanto, os inventores identificaram que, em vez de destruir material tumoral residual, se todos (ou substancialmente todos) os tumores disponíveis são preservados e materiais homogeneizados como uma única amostra, a informação de pequenas subpopulações de células cancerosas pode ser detectada e analisada.
[0439] Em muitos casos, uma amostra (como um tumor, nódulo linfático ou metástase) é submetida inteiramente, seja um único bloco ou vários blocos, dependendo do tamanho da massa. Por exemplo, muitos tumores de mama com menos do que 2 cm de diâmetro são totalmente submetidos, assim como a maioria dos melanomas. Dos cerca de 935.000 casos estimados de câncer em 2015, estima-se que pelo menos um terço das amostras de tumores são passíveis de homogeneização. Os tumores especialmente sensíveis à homogeneização incluem tumores do cólon e tumores renais.
[0440] A natureza líquida do tumor material homogeneizado permite a análise estatística da população celular do tumor. Por exemplo, a análise de energia sugere que a probabilidade de detectar um subclone em baixa prevalência aumenta com a análise de um aumento percentual da amostra. Por exemplo, um tamanho de amostra de cerca de 95 células permite a detecção de um subclone com cerca de 20 % de prevalência, um tamanho de amostra de cerca de 200 células permite a detecção de um subclone com cerca de 0,1 % de prevalência, uma amostra de cerca de 2.000 células permite a detecção de um subclone com uma prevalência de cerca de 0,01 %, e um tamanho de amostra de cerca de 20.000 células permite a detecção de um subclone com uma prevalência de cerca de 0,001 %. É razoável antecipar que uma amostra de tumor da clínica compreende pelo menos cerca de 100 - 200; 200 - 1.000; 1.000 - 5.000; 10.000 - 100.000; 100.000 - 1.000.000; 1.000.000 a 5.000.000; 5.000.000 - 1.000.000.000; 1.000.000.000 - 5.000.000,0000, ou mais células (ou seja, trilhões de células), provavelmente a partir de regiões espacialmente distintas do tumor, e as amostras representativas geradas a partir desses tumores terão contagens de células suficientes para permitir a detecção adequada de subclones. Por conseguinte, alimentar cada ensaio de diagnostico com um número suficiente de células a partir das amostras tumorais representativas obtidas de acordo com os métodos revelados, permite a detecção de subclones raros em um tumor e, deste modo, facilita a determinação imparcial da paisagem mutacional de cânceres.
[0441] Os métodos divulgados para a preparação de amostras representativas não requerem lise celular e, em algumas formas de realização, mantêm a estrutura celular. Como resultado, as amostras representativas geradas de acordo com os métodos revelados, em que a integridade das células é mantida, podem ser utilizadas, por exemplo, em ICC, IHC e citometria de fluxo. Alternativamente, ou adicionalmente, a amostra ou amostra representativa ou porções da mesma opcionalmente podem ser tratadas para romper (lisar) as células e, assim, permitir a análise de componentes celulares utilizando, por exemplo, PCR, sequenciamento de nova geração (NGS) e massa espectrometria.
[0442] O passo de partida na amostragem inteira do tumor ou a identificação de tipos celulares raros em tecidos putativos normais ou pré- cancerosos é adquirir quantidade suficiente do tecido, por exemplo, tecido tumoral. Geralmente, quanto mais tecido tumoral disponível para homogeneização, maior a probabilidade de detectar subpopulações de tumores raros. Realisticamente, a quantidade total de material tumoral disponível para a criação de uma amostra representativa será inferior a 100 % (como resultado das amostras para o sistema de estadiamento TNM já terem sido removidas do tumor). Olhando para o futuro, no entanto, isto é, uma vez que os presentes métodos se tornem o padrão de cuidados, tumores inteiros (ou pelo menos mais do tumor residual) serão disponibilizados para homogeneização na clínica. A prática atual é fixar toda a ressecção cirúrgica em formalina antes da inspeção macroscópica e da amostragem pelo patologista cirúrgico; tecido fixo e não fixado é passível de amostragem representativa. No entanto, prevê-se que a fixação de formalina possa ser eliminada ou eliminada gradualmente, por exemplo, uma vez que os métodos atuais se tornem o padrão de tratamento. Embora seja também possível utilizar os métodos de escalonamento TNM existentes em combinação com os métodos de amostragem representativos aqui divulgados.
[0443] Uma vez que o tumor ou outro tecido tenha sido adquirido, tanto tumor quanto outro tecido é colocado no liquidificador (ou outro dispositivo adequado) e materiais homogeneizados, geralmente como resultado de cisalhamento mecânico (embora químico e/ ou bioquímico, por exemplo, enzimático), a dissociação também pode contribuir para a homogeneização).
[0444] Homogeneização por meios puramente mecânicos, por exemplo, mistura, produz uma gama de fragmentos de tecido de milhares a centenas de células cada, provavelmente ajustando-se a uma distribuição normal. Contudo, a aplicação de outros métodos de homogeneização, isoladamente ou em combinação com meios mecânicos, por exemplo, métodos de dissociação bioquímica/ química, isoladamente ou em combinação com meios mecânicos, pode distorcer a distribuição de fragmentos de tecido a partir de uma distribuição normal.
[0445] Além disso, uma combinação de meios mecânicos usados em paralelo ou séries que dissociam e homogeneízam a amostra, por exemplo, um tumor ou nódulo linfático, em fragmentos de tecido (como células únicas e aglomerados de células), pode ser usada para gerar uma amostra de biomarcador durante ou após a amostra celular ser criada. Por exemplo, uma amostra representativa que compreende células intactas pode ser gerada misturando a amostra, como discutido acima, e a “amostra de célula” resultante pode ser usada para analisar as células intactas; no entanto, a amostra de células pode ser ainda processada por outros meios mecânicos, por exemplo, sonicação, para produzir uma amostra de biomarcador, isto é, a ruptura (lise) das células intactas permite a análise dos biomarcadores de proteína e/ ou DNA na amostra.
[0446] A mediana do tamanho do fragmento de tecido é inversamente correlacionada com a energia do liquidificador (ou outro dispositivo adequado), de tal modo que, em alta energia, os fragmentos de tecido são muito pequenos. O componente do tecido que é mais relevante para a energia do liquidificador é o conteúdo de colágeno, já que a derme requer energia significativa para inteira dissociação. O tempo da mistura também é importante; no entanto, a aplicação clínica mais eficaz requer que o tumor inteiro seja desassociado em questão de minutos. Uma vez fixado o tempo de mistura, a energia necessária para atingir a dissociação do tumor no prazo desejado pode ser prontamente determinada.
[0447] Após o cisalhamento mecânico suficiente (via mistura ou outra força adequada) para desassociar todo o tumor, todas as subpopulações de células tumorais que foram originalmente segregadas espacialmente são distribuídas por toda a amostra de tumor recém-liquefeito. As amostras de teste podem ser retiradas da amostra homogeneizada e subpopulações tumorais (incluindo subpopulações raras ou de baixa prevalência ou menores) podem ser detectadas usando diferentes modalidades de teste.
[0448] Por exemplo, alíquotas da amostra de tumor inteiro liquefeito podem ser tomadas, lisadas para libertar os componentes celulares e os ácidos nucleicos purificados para análise por PCR ou NGS. Por exemplo, as células podem ser lisadas utilizando um microfluidificador e/ ou por lise, moagem, lise química ou enzimática e/ ou outras técnicas conhecidas na técnica. Alternativamente, ou adicionalmente, os componentes proteicos das células tumorais podem ser purificados para métodos de análise proteica, tal como, espectrometria de massa (MS). Além disso, os fragmentos de tecido podem ser incluídos em cera de parafina e amostrados usando o atual fluxo de trabalho de patologia. Para armazenamento a longo prazo, as amostras representativas que compreende o tumor liquefeito podem ser armazenadas em um tampão adequado e refrigeradas ou congeladas ou incluídas em cera (tal como parafina) para armazenamento.
[0449] Geralmente, ensaios como as mencionadas acima (como PCR, NGS, MS, IHC, ICC, etc.) que podem efetivamente utilizar a amostra de tumor total inicialmente misturada (que contém grupos de células) podem ser realizados após a aplicação de amostras mecânicas. força (através de um liquidificador ou sonicador ou outro dispositivo adequado para induzir o cisalhamento) e sem processamento bioquímico (enzimático). No entanto, os ensaios que requerem grupos menores de células (como 2 - 20 células ou até mesmo células individuais) também podem ser usados para analisar a amostra representativa, mas o processamento adicional da amostra é necessário para remover as ligações cruzadas proteína-proteína induzidas durante a formalina fixação do tecido removido cirurgicamente. Em particular, é necessária a digestão enzimática de tecido tumoral misturado para criar uma amostra representativa que consiste em células únicas e pequenos aglomerados de células adequados para utilização em determinados ensaios, por exemplo, triagem de células.
[0450] Como discutido acima, a homogeneização pode ser realizada utilizando apenas meios mecânicos (tais como misturas utilizadas isoladamente ou em sie ou paralelamente a outros meios mecânicos), apenas meios bioquímicos/ químicos (tal como digestão enzimática), ou uma sua combinação. A combinação de ruptura física e bioquímica (enzimática) dos fragmentos de tecido pode produzir uma amostra que é adequada para um ensaio de diagnóstico que requer células intactas. O primeiro método físico que inicia a quebra das ligações cruzadas da proteína é a incubação dos fragmentos de tecido em um tampão de pH baixo a cerca de 80 a cerca de 85 graus Celsius. A etapa de incubação começa a “abrir” os fragmentos de tecido de forma não específica, preparando-os para as próximas etapas do processo, que é a clivagem bioquímica das conexões célula-arranjo extracelular que mantêm os fragmentos de tecido juntos. Incubação com uma enzima como proteínases específicas não proteicas, por exemplo, pepsina, tripsina, proteinase K, furina, endoproteinases (como Asp-N e Glu-C, disponíveis em NEB, Sigma-Aldrich, Thermo Fisher, Promega e similares), enteroquinase e subtilisinas; proteínases específicas de proteína, por exemplo, colagenases (tais como Colagenase tipos IS, IA, IA - S, II, II-S, IV, IV-S, VIII, V, VS, XI, XI-S, III, VII, VII- S, S, F, H e L (disponível de NEB, Sigma-Aldrich, Thermo Fisher, Promega e semelhantes), gelatinases, estromelisinas, matrilisina, enamelisina e admats (tais como enzimas de degradação de proteoglicano) e/ ou substituições de enzimas não mamíferas/ não bacterianas, por exemplo, enzimas fúngicas, por exemplo, Accutase® e Accumax® (Innovative Cell Technologies, São Diego, CA) ou uma combinação de qualquer uma das anteriores, sob condições adequadas podem ser efetuadas por ordem Estas enzimas incluem, mas não se limitam a, colagenase intersticial, gelatinase-A, estromelisina 1, matrilisina, colagenase de neutrófilos, gelatinase-B, estromelisina 2, estromelisina 3, metaloelastase de macrófagos, colagenase 3, MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, Colagenase 4, Enamelisina, X-MMP, CA - MMP, MT5-MMP, MT6-MMP, Matrilisina-2, MMP-22, endoproteinase, tripsina, quimo tripsina, endoproteinase Asp-N, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Glu-C (proteínase V8), endoproteinase Lys-C, pepsina, termolisina, elastase, papaína, proteinase K, subtilisina, clostripaína, exopeptidase, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B, carboxipeptidase P, carboxipeptidase Y, catepsina C, enzima de libertação de ácido acilamino, aminopeptidase de piroglutamato em condições adequadas podem ser efetuadas de modo a clivar estas ligações. As enzimas podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação, por exemplo, uma colagenase (como a colagenase H) e outra enzima (como o AccuMax®), múltiplas colagenases, várias outras enzimas, etc.
[0451] Alternativamente ou adicionalmente, os fragmentos de tecido são cortados pela aplicação de força mecânica (como um almofariz e um pilão, um instrumento de moagem semelhante a um moedor de carne usado na produção de linguiça, ou sonicação), tanto antes, como alternativamente ou adicionalmente a seguir digestão bioquímica da amostra representativa.
[0452] Da mesma forma, a amostra representativa digerida bioquimicamente pode ser processada adicionalmente por meio de centrifugação, que pode ser usada para isolar certas células ou outro material da amostra para análise adicional. Por exemplo, a centrifugação de uma amostra representativa preparada a partir de um tumor de carcinoma seroso humano ovariano que foi misturado e digerido com AccuMax® e Colagenase H resulta no isolamento de plaquetas educadas em tumores e outras células sanguíneas (Figura 23). Figura 23 é uma imagem de plaquetas educadas em tumores e outras células sanguíneas isoladas a partir de uma amostra representativa bioquimicamente digerida por centrifugação. Um tumor de carcinoma seroso de ovário humano foi misturado e digerido com Accumax e Collagenase H seguido de centrifugação resultando no acúmulo de plaquetas e hemácias no topo da amostra centrifugada (linha vermelha).
[0453] Os inventores mostram aqui que o acoplamento de condicionamento celular utilizando pH e calor com digestão enzimática proporciona uma criação de amostra representativa dissociada eficiente. O processo de melhorar a acessibilidade da mancha (biológica ou química) ao alvo molecular é referido aqui como “condicionamento de células”. Por exemplo, o condicionamento celular em tampão CC1 ou em tampão CC2 (Ventana) em alto calor (70 - 100 graus Celsius) auxilia na digestão enzimática do tecido tumoral. Muitas alternativas ao tampão citrato podem ser empregadas como solução de condicionamento celular.
[0454] Uma medida eficaz do tamanho dos fragmentos de tecido a seguir ao processamento adicional compreende a avaliação de quão bem a amostra líquida passa através de uma malha ou filtro (ou de uma série dessas malhas ou filtros) com um tamanho de porção conhecido, por exemplo, inferior a 1 mícron (por exemplo, cerca de 0,5 mícrons), cerca de 1 - 6 mícrons, cerca de 6 - 10 mícrons, cerca de 10 - 20 mícrons, cerca de 20 - 30 mícrons, cerca de 30 - 40 mícrons, cerca de 40 - 100 mícrons, cerca de 100 - 300 mícrons, cerca de 300 - 500 mícrons, ou maior que 500 mícrons. Em um aspecto, uma série de filtros variando em tamanho de cerca de 1 mícron a cerca de 500 mícrons é usada para separar as células dentro do material homogeneizado. Também é possível usar um filtro com um tamanho de porção menor, por exemplo, menos do que 1 mícron, por exemplo, cerca de 0,45 um, para separar a porção subcelular de uma amostra de biomarcador da porção celular da amostra após criar uma fração celular representativa. Por conseguinte, podem utilizar-se métodos de exclusão por tamanho, por exemplo, crivagem, seguindo métodos de dissociação mecânica (tais como mistura ou o equivalente) como um método rápido para separar uma amostra de biomarcador de uma amostra celular.
ANÁLISE DA AMOSTRA REPRESENTATIVA OU DA COMPOSIÇÃO DO MATERIAL HOMOGENEIZADO
[0455] As amostras representativas, por exemplo, amostras de tumores geradas pelos métodos revelados, fornecem várias vantagens sobre amostras de tumores tradicionais usadas em patologia e diagnóstico, incluindo (i) a capacidade de usar a amostra representativa para vários testes de diagnóstico diferentes, alguns dos quais podem ser incompatíveis com tecido sólido; (ii) a capacidade aumentada para detectar subclones de baixa prevalência, ou seja, a criação de uma amostra representativa de um tumor inteiro remove vieses de sub amostragem que inibem a descoberta de subclones de baixa prevalência; e (iii) a eliminação da proliferação de amostras no laboratório de oncologia diagnóstica, criando assim um fluxo de trabalho laboratorial mais eficiente, isto é, a prática corrente determina que sejam feitos 3 a 10 blocos por tumor, embora apenas 1 bloco seja testado.
[0456] Por conseguinte, a invenção também se refere a métodos de análise da amostra representativa ou da composição homogeneizada. Em um aspecto, a análise compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma análise de ácidos nucleicos, uma análise de proteínas, uma análise de lipídios, uma análise de células, uma análise de metabolitos, uma análise genômica, uma análise transcriptômica, uma análise proteômica. análise, uma análise metabolômica, uma análise lipidômica, uma análise imunológica, uma análise citoquímica, uma análise genotípica, uma análise fenotípica ou uma combinação destas. Em um aspecto, a análise de ácido nucleico compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em uma análise de DNA ou em uma análise de RNA. Em outro aspecto, a análise de RNA compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma análise de microRNA. Em um aspecto diferente, a análise do material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na purificação de um ácido nucleico, uma proteína, uma organela, um metabolito, um produto químico, um componente não celular ou uma sua combinação.
[0457] Em outra forma de realização, a análise do material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda na ligação de um agente de ligação com um componente do material homogeneizado. Em algum aspecto, o agente de ligação compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda de um anticorpo, um marcador radioativo, um fluorocromo, um hapteno, uma enzima, um ácido nucléico, uma proteína, um produto químico, um primer, um ligando, uma célula, um peptídio, uma sonda, um corante fluorescente, um corante não fluorescente, uma enzima, uma biotina ou uma combinação destes. Em uma forma de realização, o componente do material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um ácido nucleico, uma proteína, uma organela, um metabolito, um produto químico, um componente não celular ou combinação destes.
[0458] Em uma forma de realização, a análise do material homogeneizado compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na detecção de um sinal do agente de ligação ou do componente. Em um aspecto, o sinal compreende, ou consiste alternativamente essencialmente, ou ainda consiste ainda em um sinal radioativo ou em um sinal não radioativo. Em outro aspecto, o sinal não radioativo compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em um sinal fluorescente, um sinal quimiofluorescente ou um sinal luminescente. Em um outro aspecto, a análise de material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em análise de sequenciação, análise histológica ou análise de imagem. Em um aspecto, a análise de sequenciação compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em análise de sequenciação de nova geração, análise de sequenciação de célula única e/ ou sequenciação de núcleo único. Em outro aspecto, a análise histológica compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste ainda em uma análise histológica de nova geração. Em um aspecto, a análise de imagem compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente de, ou ainda consiste em análise de próxima geração.
[0459] Em uma forma de realização, o método para preparar uma amostra de tecido compreende ainda, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na detecção ou quantificação de um componente do material homogeneizado, em que o componente compreende uma célula, um ácido nucleico, uma proteína, uma organela, um metabolito, um produto químico, um componente não celular, ou uma combinação destes. Em um aspecto, a célula compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em uma célula imune, uma célula tumoral, uma célula estaminal, uma célula progenitora, uma célula sanguínea, uma célula germinal e uma célula somática. Em outro aspecto, a análise do material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente, ou ainda consiste na análise da luz polarizada refletida a partir do material homogeneizado. Em um aspecto, a análise do material homogeneizado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda na análise de uma propriedade acústica, uma propriedade mecânica, ou propriedade ótica do material homogeneizado. Em outro aspecto, o material homogeneizado é analisado com citometria de fluxo, coloração com hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.
[0460] Em uma forma de realização, quando as células do tumor inteiro foram desassociadas no grau desejado, a amostra representativa pode ser depositada em uma linha de vidro na preparação para coloração, por exemplo, ISH ou ICC ou IHC.
[0461] Existem várias maneiras de depositar células em lâminas de vidro, todas envolvendo células de secagem em lâminas. Os tampões que permitem a deposição de células em lâminas de vidro variam de solventes orgânicos (como etanol, metanol, limoneno, formalina e acetona), solventes não- aquosos (propilenoglicol, polietilenoglicol, glicerol, óleos vegetais, como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila), solventes inorgânicos não aquosos (como amônia líquida, dióxido de enxofre líquido, cloreto de sulfurila e fluoreto de cloreto de sulfurila, cloreto de fosforila, tetróxido de dinitrogênio, tricloreto de antimônio, pentafluoreto de bromo, fluoreto de hidrogênio, ácido sulfúrico puro e outros inorgânicos ácidos), tampões comuns (tais como PBS, HEPES, MES, TUBOS, ácido cítrico, TAPS, Bicine, Tris, Tricina, TAPSO, TES, MOPS, TUBOS, CHES, cacodilato, ácido carbônico, bicarbonato, ou TE), a água. Por exemplo, as células podem ser diluídas em metanol, o que promove um espalhamento uniforme sobre uma lâmina de vidro e evapora rapidamente.
[0462] Além disso, outros solventes de alta volatilidade (como acetonitrila, octanol, clorobutano ou outros solventes de HPLC) e líquidos refrigerantes (como tetracloreto de carbono, triclorofluorometano, dibromodifluorometano e outros que têm pontos de ebulição próximos à temperatura ambiente (por exemplo, 25 °C)) pode ser utilizado para obter células representativas baseadas em células em lâminas de vidro sem os efeitos de solventes de álcoois.
[0463] Podem ser realizados métodos típicos de coloração H & E, ISH, PCR In Situ, Imuno-histoquímica (IHC), histoquímica (HC) ou histoquímica enzimática (EHC) utilizando métodos padrão e, de preferência, os métodos aqui apresentados (ver Figura 10, Figura 11 e Figura 14). Os formatos aplicáveis para a reação de detecção de acordo com a presente invenção podem ser técnicas de transferência, tais como, procedimentos Western-Blot, Southern-blot, Northern-blot, imuno-citoquímicos ou imuno-histoquímicos. As técnicas de transferência são conhecidas pelos especialistas na matéria e podem ser realizadas, por exemplo, como eletro-blots, blots semi-secas, blots a vácuo ou pontos-blots. Os procedimentos de coloração imunocitoquímicos/ histoquímicos são conhecidos dos especialistas na técnica e podem compreender a detecção mediada por agentes de ligação de polipeptídios bem como técnicas de hibridização in situ. Ambas as diferentes técnicas podem ser aplicadas simultaneamente. Em certas formas de realização, a captura híbrida de ácidos nucleicos pode ser utilizada para a detecção. A reação de amplificação pode também ser aplicável para a detecção de, e. moléculas de ácido nucleico.
[0464] A hibridização in situ (ISH) uma técnica que pode ser vantajosamente utilizada com a presente invenção, isoladamente ou em combinação com outras técnicas, uma vez que muitos dos passos na ISH devem ser cuidadosamente controlados por temperatura durante um período de tempo preciso. A quantidade precisa de calor durante um período de tempo específico é necessária para desnaturar suficientemente o DNA de modo a que a hibridação subsequente possa ocorrer sem sobreaquecimento até ao ponto em que a morfologia celular é degradada. Diferentes amostras podem ser desnaturadas usando diferentes temperaturas dependendo de como o tecido foi preparado e fixado. Os passos de desnaturação, hibridação e lavagens pós-hibridização podem ser efetuados a diferentes temperaturas que podem depender das particularidades da sonda e do tecido a ser testado. Essas temperaturas podem ser controladas através do controle individualizado dos aquecedores, como discutido anteriormente. As sondas de DNA são tipicamente hibridizadas entre 30 e 55 graus Celsius, enquanto as sondas de RNA são tipicamente hibridizadas em temperaturas mais altas com o tempo de hibridização variando de 30 min. para 24 horas, dependendo do número de cópias desejado, do tamanho da sonda e do tipo de amostra. Desnaturação padrão para preparações citogenéticas é realizada a cerca de 72 graus Celsius por 2 min, enquanto para seções de tecido as condições podem variar de 55 graus Celsius a 95 graus Celsius de 2 a 30 min. Temperaturas de lavagem pós-hibridização podem variar de cerca de 37 graus Celsius a 72 graus Celsius por 2 min. a 15 min. A concentração de sal pode variar de 0,1x a 2x SSC. As temperaturas de detecção da sonda podem variar de ambiente a 42 graus Celsius por 2 min. a 30 min.
[0465] A ISH pode ser empregada para detectar DNA, cDNA e mRNA de alta cópia. Pode ser aplicado a esfregaços, tecidos, linhas celulares e seções congeladas e, no contexto da presente invenção, as amostras representativas geradas de acordo com os métodos divulgados, bem como composições que compreende os métodos representativos. Normalmente, a amostra é montada em uma lâmina de vidro de 1” x 3”.
[0466] Uma vantagem da detecção de biomarcadores baseada em IHC é a sensibilidade da detecção de DAB. Com este método, pode-se detectar eventos muito raros em uma população mista de células. Por exemplo, os inventores mostraram que um subclone menor que é um componente espacialmente distinto de toda a amostra (isto é, uma célula Her-2 positiva presente em pouco mais de 0,1 % do volume total do tecido) era claramente visível em uma amostra representativa gerado de acordo com os métodos divulgados em imagem a ampliação de 20x. Veja o Exemplo 1 e as Figuras 6A - 6D. Além disso, os inventores mostraram que um subclone menor (um mutante bRaf expressando tumor de xenoenxerto presente em uma amostra global de tecido de amígdala dissociado a um nível de 0,015 % da amostra total) foi também claramente detectado. Veja o Exemplo 4 e a Figura 16
[0467] Para além da coloração IHC baseada em DAB, todos os ensaios baseados em lâminas padrão são adequados para utilização com amostras tumorais homogeneizadas. Por exemplo, os inventores mostraram que IHC multiplexado (utilizando três anticorpos detectados em uma única corrida de coloração), ISH baseada em RNA e DNA ISH podem ser utilizados para analisar as amostras representativas geradas de acordo com os métodos divulgados. Veja o Exemplo 3 e as Figuras 11 e 12.
[0468] Os procedimentos de detecção de acordo com a presente invenção podem ainda compreender um procedimento de coloração citoquímica que proporciona uma coloração cromogênica ou fluorescente de células ou compartimentos celulares. Tais procedimentos de coloração são conhecidos dos especialistas na técnica e podem, por exemplo, compreender, e. coloração para estruturas acidófilas ou basófilas, de regiões subcelulares (por exemplo, o núcleo, a mitocôndria, o golgi, o citoplasma etc.), de moléculas específicas (de cromossomos, de lipídios, de glicoproteínas, de polissacarídeos etc.) nos espécimes citológicos. Corantes de fluorescência, tais como, DAPI, Quinacrina, Cromomicina, etc. podem ser empregues. Além disso, podem ser aplicados corantes cromogênicos, tais como, Azan, Acridin-laranja, Hematoxilina, Eosina, Sudan-red, Tiazina-corantes (azul de toluidina, tionina). Em outras formas de realização, procedimentos de coloração como coloração, coloração de Giemsa, coloração com hematoxilina-eosina, coloração de van-Gieson, coloração de Schiff (usando reagente de Schiff), procedimentos de coloração empregando precipitação de metais (como, por exemplo, prata em procedimentos de coloração empregando Nitrato de prata) ou blots insolúveis, como por exemplo. de Turnbulls-blue (ou outros cianetos de metais insoleis), etc. podem ser utilizados no decurso de um modo como aqui divulgado. Deve ser entendido que os corantes nomeados e métodos de coloração devem ser exemplos para os métodos aplicáveis e que qualquer outro método conhecido na técnica pode ser aplicado a um método como aqui divulgado.
[0469] Os procedimentos de coloração podem produzir blots cromogênicas para inspeção microscópica de luz ou blots fluorescentes para inspeção sob condições microscópicas de fluorescência. Em outra forma de realização da presente invenção, procedimentos emissores de radiação, procedimentos que empregam substâncias que impedem a transmissão de radiação ou outro meio de contraste para imagiologia das condições citológicas em uma amostra (por exemplo, a geração de impressão óptica por meios, tais como, (micro) autorradiografia ou (micro) geração de imagem radiográfica) pode ser útil para um método de acordo com a presente invenção.
[0470] Todos os procedimentos de coloração e de imagem podem ser utilizados para análise não apenas em procedimentos microscópicos, mas também em procedimentos de análise automatizada, como citometria de fluxo, análise microscópica automatizada (computadorizada ou auxiliada por computador, como scanner de lâminas inteiras) ou qualquer outro método para análise de coloração. espécimes citológicos. “Automatizado” ou “Automático” significa atividade substancialmente controlada por computador ou máquina e substancialmente livre de intervenção humana.
[0471] Podem ser aplicados métodos de diagnóstico adicionais a amostras e composições representativas que compreende a amostra representativa, incluindo, mas não se limitando a detecção de proteínas baseadas em ELISA, purificação por afinidade de tipos celulares específicos, etc. Para ilustrar adicionalmente os numerosos diagnósticos e terapêuticos aplicações da presente invenção, a invenção proporciona abaixo uma visão geral adicional de várias técnicas que podem ser efetuadas com as amostras representativas da invenção e sub-amostras ou componentes isolados a partir das mesmas, por exemplo, células, ácidos nucleicos, proteínas, lipídios et al.
[0472] Abordagens de multiplexação e de lotes usando as amostras representativas ou a composição de material homogeneizado
[0473] Em um aspecto, uma amostra representativa preparada a partir de uma única amostra obtida de um único paciente pode ser utilizada para subsequente análise de diagnóstico utilizando qualquer um dos métodos aqui revelados e/ ou outros métodos comparáveis conhecidos na arte. A amostra obtida do paciente pode ser marcada com uma pequena molécula antes da homogeneização e processamento adicional opcional, por exemplo, peneiração. Através da introdução de uma pequena molécula na amostra, a amostra é agora capaz de ser distinguida de outras amostras (incluindo outros tecidos e/ ou amostras de tumor do mesmo paciente, bem como amostras de tecido e/ ou tumor obtidas de diferentes pacientes e usando esta abordagem de rotulagem, diferentes amostras representativas podem ser usadas em um formato de ensaio multiplex.
[0474] Por exemplo, um primeiro tumor, um segundo tumor e um terceiro tumor podem ser obtidos a partir de uma primeira patente. O primeiro tumor pode ser marcado com uma primeira molécula pequena, o segundo tumor marcado com uma segunda pequena molécula e o terceiro tumor marcado com uma terceira pequena molécula, de tal forma que cada pequena molécula se distingue das outras. O primeiro tumor marcado, o segundo tumor e o terceiro tumor podem então ser materiais homogeneizados, sozinhos ou em combinação, e o resultante material homogeneizado “misto” contém uma amostra representativa de cada tumor.
[0475] A mesma abordagem de “dosagem” pode ser usada para realizar um ensaio multiplex usando várias amostras de nódulo linfático do mesmo paciente e/ ou uma combinação de amostras de tumor e de nódulo linfático do mesmo paciente.
[0476] Em outro aspecto, uma amostra, por exemplo, tumor ou nódulo linfático, obtida de um paciente é selecionada e cada seção é abordada com uma pequena molécula antes de combinar e coletivamente homogeneizar as seções para gerar uma amostra representativa com informação espacial. Por exemplo, uma amostra (como um tumor ou nódulo linfático) pode ser cortada em quadrantes e um hapteno diferente (ou outra pequena molécula adequada) pode ser “dopado” em cada quadrante antes de homogeneizar coletivamente as seções, por exemplo, cada seção rotulada colocada no liquidificador e material homogeneizado, para gerar uma amostra representativa com informações espaciais. Deve ser entendido que o número de seções que podem ser geradas a partir de cada amostra para “doping” antes da homogeneização não é limitado, mas, provavelmente, selecionado em escala com o tamanho da amostra, ou seja, quanto maior a amostra, maior o número de seções que podem ser “marcadas” com uma pequena molécula antes da homogeneização. Por exemplo, uma amostra de tumor e/ ou nódulo linfático pode ser selecionada para formar 2 seções, 3 seções, 4 seções, 5 seções, 6 seções, 7 seções, 8 seções, 10 seções, 15 seções, 20 seções, 25 seções, 30 seções, 35 seções, 40 seções, 45 seções, 50 seções, 55 seções, 60 seções, 65 seções, 70 seções, 75 seções, 80 seções, 85 seções, 90 seções, 95 seções, 100 seções, ou mais. Novamente, o número de seções preparadas de cada amostra irá variar com o tamanho da amostra. Por exemplo, uma amostra de tumor de aproximadamente 2 cm pode ser selecionada em quadrantes, cada um dos quais é marcado com uma pequena molécula diferente, enquanto um tumor de 50 cm (como um tumor gástrico) pode ser seccionado em 100 seções, cada uma das quais é rotulada com uma pequena molécula diferente.
[0477] Deve-se notar que qualquer número de amostras diferentes do mesmo paciente ou de pacientes diferentes pode ser combinado e multiplexado, permitido que cada amostra seja endereçada com um etiqueta diferente, por exemplo, pelo menos 2 etiquetas, pelo menos 3 etiquetas, pelo menos 4 etiquetas, pelo menos 5 etiquetas, pelo menos 6 etiquetas, pelo menos 7 etiquetas, pelo menos 8 etiquetas, pelo menos 10 etiquetas, pelo menos 15 etiquetas, pelo menos 20 etiquetas, pelo menos 25 etiquetas, pelo menos 50 etiquetas, pelo menos 75 etiquetas, pelo menos 100 etiquetas, etc.
[0478] Amostras, tais como, amostras de tumores fornecidas a partir de tumores inteiros derivados de um único ou múltiplos indivíduos, ou seccionamento de tumores derivados de um único ou de múltiplos indivíduos, podem ser conjugadas a pequenas moléculas (tais como, mas não se limitando a haptenos, marcadores peptídicos, marcadores proteicos, marcadores fluorescentes ou marcadores de ácido nucleico, por exemplo) para identificar a origem da amostra tumoral sob investigação.
[0479] A conjugação pode ocorrer através da utilização de vários mecanismos, como detalhado em Lemus e Karol (Methods Mol Med. 2008; 138: 167-82) (que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Tais métodos de conjugação podem incluir, mas não se limitam a reações químicas espontâneas envolvendo haptenos caracterizados como isocianatos ou anidridos, reações químicas ativadas envolvendo haptenos portadores de um grupo carboxila, reações de reticulação envolvendo haptenos e carboiimidas ou haptenos e glutaraldeído. Meios adicionais de conjugação podem ocorrer através do uso de diisocianato e qualquer um dos seguintes grupos reativos: α- NH2, ε-NH2Lys, α-COOH, SH-Cys; anidrido de ácido e qualquer um dos seguintes grupos reativos: α-NH2, ε-NH2Lys, α-COOH, SH-Cys; Ácido 2,4,6- trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e um dos seguintes grupos reativos: α-NH2 e ε-NH2Lys; um aminoácido aromático e tirosina (em que o aminoácido aromático é convertido a um grupo de diazônio); um hidrato de carbono e α-NH2 ou ε- NH2Lys (em que o acoplamento pode ocorrer quer através da extremidade redutora, os grupos carboxila de hidratos de carbono ácidos, ou por meio de grupos hidroxilo); brometo de cianogênio e α-NH2 ou ε-NH2Lys (em que os hidratos de carbono ativados por brometo de cianogênio a par espontaneamente com grupos amino); ou um anidrido misto e α-NH2 ou ε-NH2Lys (em que o R- COOH é convertido no anidrido com isobutilclorocarbonato).
[0480] Formas adicionais de conjugação de uma pequena molécula a uma amostra tumoral ou de uma seção tumoral podem ocorrer através de reações químicas como uma reação NHS-éster (para formar uma ligação amina), uma reação maleimida (para formar uma ligação tioéter), uma reação de hidrazida (para formar uma ligação hidrazona), ou uma reação de acoplamento de EDC (para formar uma ligação amida). Adicionalmente, a conjugação de uma molécula pequena a uma amostra de tumor ou seção de tumor ou seção de nódulo linfático ou de nódulo linfático pode ocorrer através da utilização de reticulantes homobifuncionais ou heterobifuncionais (exemplos dos quais incluem, mas não estão limitados a sulfo-SMCC, DSS, ou sulfo-SBED).
[0481] Um exemplo de moléculas pequenas que podem ser usadas como identificadores podem incluir haptenos. Exemplos de haptenos que são tipicamente usados são digoxigenina, 2,4-dinitrofenila, biotina ou avidina, ou são haptenos selecionados entre azóis, compostos nitroarila, benzofurazanos, triterpenos, uréias, tioureias, rotenonas, oxazóis, tiazóis, cumarinas, ciclolignanas, compostos heterobiarílicos, azoarila ou benzodiazepinas. Outros exemplos de haptenos podem incluir, mas não estão limitados a 2,4-dinitrofenila, nitropirazol e sulfonamida de tiazol. Ver WO 2014/139979, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Exemplos adicionais de haptenos que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, serem selecionados de um azol (por exemplo, um oxazol, um pirazol, um tiazol), um benzofurazan, um triterpeno, uma uréia, uma tioureia diferente de uma rodamina tioureia, um nitroarila, com excepção do dinitrofenila ou trinitrofenila, um rotecóide, um ciclolignano, um heterobiarila, um azoarila, uma benzodiazepina ou uma cumarina (por exemplo, 2,3,6,7-tetra-hidro-l-oxolH, 5H, lH- ácido [l] benzopirano [6,7,8-ij] quinolizina-10-carboxico ou 7-dietilamino-3-carboxiacumarina). Veja os documentos WO 2012/003476 e WO 2008063378, os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Outros exemplos de haptenos que podem ser utilizados incluem mas não estão limitados a biotina, urushiol, hidralazina, fluoresceína, digoxigenina, dinitrofenol, ácido 2,4- diclorofenoxiacético, 2-cloro-4- (etilamino) -6- (isopropilamino) -s -triazina, nicotina, morfina, s-triazinas estruturalmente relacionadas, SulcoFuron, FlucoFuron, agatharesinol, sequirina C, sugiresinol, hidroxisugiresinol, hinokiresinol, álcool coniferílico, ácido p-cumárico, hinocinina, éter guaiacilglicerol-beta-guaiacil, morfina-3-glicuronídeo (M3G), codeína, nor- codeína, 6-monoacetilmorfina, (+) metanfetamina, ceftazidima, fenobarbital, p- hidroxifenobarbital, p-aminofenobarbital, diisocianato de hexametileno, ciclobarbital, 3’-cetociclobarbital, 3’-hidroxiciclobarbital, secobarbital, barbital, metharbital, ácido barbitúrico, tiopental, ácido tiobarbitúrico, primidona, glutetimida, pentobarbital, diacetilmorfina, morfina-6-glicuronídeo (M6G), L-11- alil-1,2,3,9,10,10a-hexa-hidro-4H-10 4a-iminoetanofenantren-6-ol, naloxona, pethidi ne, benzoilecgonina, ácido 5-benzimidazolcarboxílico, dexametasona, flumetazona, betametasona, 9-alfa-fluroprednisolona, desoximetasona, triancinolona, prednisolona, fluocortolona, cortisol, prednisona, cortisona, metilprednisolona, hexacetonido de triancinolona, carbofurano, BFNP (3 - [[2 Ácido, 3-di-hidro-2,2-dimetil-7-benzofuraniloxi) - carbonil] amino] propanóico), 2,3-di-hidro-2,2-dimetil-7- benzofuranol, bendiocarbe, carbaril, metiocarbe, propoxur, aldicarb, metomil, benalaxil, Bn-Ba (ácido 4- [2- (N-fenilacetil-N- 2,6- xililamino) propionamido] butico), Bn-COOH (4- [2- (N- fenilacetil-N-2,6) -xyil-DL- alanina), Bn-HG, furalaxil, metalaxil, acetocloro, dimetacloro, metolacloro, dietil- etil, benzoilprop-etil, propacloro, ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético, ácido 2,4- diclorofenoxibutírico (2, 4-DB), MCPA, diclorprop (2,4-DP), ácido 1- [(2- cloro) fenilsulfonil] monoamidossuccico, clorsulfur, clorbromur, amidossulfuron, clortoluron, isoproturon, diuron, linuron, O-metil-O- (4-nitrofenil) -N- (4- carboxibutil) - fosforamidotioato, paratião-metilo, paratião-etilo, fenitrotião, ftionão, bromofos, clorpirifos-metilo, paratião-metilo oxidado, paraçãoxon, diazinão, azinfos-metilo, pirimifos-metilo, metidationo, dimetilclorotiofosfato, 4- nitrofenol, 2-nitrofenol, 2-clorofenol, 4-cloro-3-metilfenol, fenitroxon, 3-metil-4- nitrofenol, nonilfenol, HOM (ácido 3- [2- hidroxi-5-nitro-benziltio] propiico, preco 103, 2,4,4’-triclorobifenil, 2- (5- carboxipentanoilamino) -4,4'-diclorobifenil, ácido 4-clorofenoxiacico, ácido 2- clorofenoxiacico, 1,1,1-tricloro-2, 2-bis- (p-clorofenil) etano, 1,1-dicloro-2, 2- bis (p-clorofenil) etileno, vitamina D2, vitamina D3, desetil-hidroxiatrazina (DEHA), isotiocianato de f osesina, metanefrina, propazina, terbutilazina, ametryn (2-etilamino- 4-isopropilamino-6-metiltio-1,3,5- triazina, cianazina, OH-terbutilazina, hidroxitriazina (EQ-0027), atratamento, ácido mercaptico de atrazina (AM), N4-acetil-sulfametazina, 2,4- diclorofenol, 4- bromofenol, amoxicilina, ácido 6-amino-penicilânico (6-APA), azlocilina, bacampicilina, carbenicilina, penicilina, 1-benzil-3- (4-nitrofenil) ureia, 1- (3- clorofenil) -3 - (2-metoxi-5-nitrofenil) ureia, 1- (3-clorofenil) -3- (4-metoxi-3- nitrofenil) ureia, 1- (4-clorofenil) -3- (4-nitrofenil) ureia, carbofurano-fenol,carbosulfan, benfuracarbe, endrina, nendrina, heptacloro, clordane, endosulfan, aldrin, dieldrin, iseros de fenvalerate, thiabendazol, derivados de tiabendazol, albendazol, mebendazol, fenbendazol, cambendazol, havalis de fenvalerate, pirimiphos-etilo, 4- (metiltio) -m-cresol, clorpirifos-oxon, fenchlorphos, tricloronato, diclofentião, paratião, triadimefona, diflubenzuron, metolazona, benzoato de furfurila, paraquat, dietilcarbamazina, 2, 4, 6-trifenil-N- (4- hidroxifenil) -piridínio, o-DNCP, congéneres de PCB, 1-2-diclorobenzeno, retronecina, dicofol, tetraconazol, 2- (2,4-diclorofenil) -3- (1H- 1,2,4-triazol-1-il) propanol, imazalil, fenarimol e metabolitos de lupanina. Para mais exemplos, ver Singh M.K., Srivastava S., Raghava G.P.S. and Varsheny G.C. (2004) HaptenDB. Nucleic Acids Research, e Singh M. et. al. HaptenDB: a comprehensive database of haptens, carrier proteins and anti-hapten antibodies. Bioinformatics. 2006, 22: 253-255, ambos os quais são aqui incluídos por referência na sua totalidade.
[0482] Identificadores adicionais de moléculas pequenas podem incluir, mas não se limitam a moléculas fluorescentes ou fluorocromos (como os vendidos pela Invitrogen, por exemplo, consulte The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg, ou descrito na Patente US No. 5.866.366 de Nazarenko et al., tal como, o ácido 4-acetamido-4’- isotiocianatostilbeno-2,2’dissulfúrico, acridina e derivados, tais como, acridina e isotiocianato de acridina, 5- (2’-aminoetil)) ácido aminonaftaleno-1-sulfúrico (EDANS), 4- amino-N- [3-vinilsulfonil) fenil] naftalimida-3,5-dissulfonato (Lucifer Yellow VS), N- (4- anilino-1-naftil) maleimida, antranilamida, Amarelo brilhante, cumarina e derivados, tais como, cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4- trifluorometilcuuarina (Coumaran 151); cianose; 4’, 6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5’, 5’’- dibromopirogalol-sulfonaftaleína (vermelho de bromopirogalol); 7-dietilamino-3- (4’-isotiocianatofenil) -4- metilcumarina; pentaacetato de dietilenotriamina; 4,4’- ácido diisotiocianatodi- hidro-estilbeno-2,2’-dissulfônico; Ácido 4,4’-diisotiocianatostilbeno-2,2’- dissulfônico; Cloreto de 5- [dimetilamino] naftaleno-1-sulfonila (DNS, cloreto de dansilo); Ácido 4- (4’ -dimetilaminofenilazo) benzílico (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil-4’-isotiocianato (DABITC); eosina e derivados, tais como, isotiocianato de eosina e eosina; eritrosina e derivados, tais como, eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etídio; fluoresceína e derivados, tais como, 5-carboxifluoresceina (FAM), 5- (4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceina (DTAF), 2’7’-dimetoxi-4’5’-dicloro-6- carboxifluoresceina (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e QFITC (XRITC); 2’, 7’-difluorofluoresceína (OREGON GREEN®); fluorescamina; IR144; IR1446; Isotiocianato de malaquita verde; 4-metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Vermelho de fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdeído; pireno e derivados, tais como, pireno, butirato de pireno e butirato de succinimidil 1-pireno; Vermelho Reativo 4 (Cibacron®. Vermelho Brilhante 3B-A); rodamina e derivados, tais como, 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), lisamina rodamina B cloreto de sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, rodamina verde, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 e derivado de cloreto de sulfonila de sulforrodamina 101 (Texas Red); N, N, não’, N’- tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC); riboflavina; ácido quaternário e derivados de quelato de térbio, quelatos de európio reagentes com tiol que emitem a aproximadamente 617 nm (Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999), bem como GFP, LissamineTM, dietilaminocumarina, fluoresceína, clorotriazinilo, naftofluoresceína, 4, 7- diclororodamina e xanteno (como descrito na Patente US 5.800.996 de Lee et al.) e seus derivados, série de corantes ALEXA FLUOR ™ (por exemplo, como descrito nas Patentes dos U.S. N° 5.696.157, 6.130.101 e 6.716.979), a série BODIPY de corantes (corantes de difluoreto de dipirrometenoboro, por exemplo como descrito nas Patentes US Nos. 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782, 5.274.113, 5.338.854, 5.451.663 e 5,433,896), Cascade Blue (um derivado reativo de amina do pireno sulfonado descrito na Patente US No. 5,132,432) e Marina Blue (Patente dos U.S. No. 5,830,912), uma nanopartícula fluorescente (tal como um nanocristal semicondutor, por exemplo, um QUANTUM DOTTM (obtido, por exemplo, da QuantumDot Co rp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.; ver também Pat. 6.815.064, 6.682.596 e 6.649.138)), uma nanopartícula (tal como pontos quânticos, nanopartículas paramagnéticas, nanopartículas superparamagnéticas e nanopartículas metálicas, de preferência pontos quânticos ligados, incluindo, a título de exemplo e sem limitação, CdSe, ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAIAs, e InGaN, por como exemplo), os nanocristais semicondutores descritos em, por exemplo, US Pat. No. 6.602.671, Bruchez et. al. (1998) Science 281: 2013-6, Chan et al. (1998) Science 281: 2016-8, e US Pat. No. 6.274.323, Pat. não 6,927,069; 6,914,256; 6,855,202; 6,709,929; 6,689,338; 6,500,622; 6.306.736; 6.225.198; 6,207,392; 6,114,038; 6,048,616; 5,990,479; 5,690,807; 5,571,018; 5.505.928; 5.262.357 e na Publicação de Patente US 2003/0165951, assim como Publicação PCT No. 99/26299 (publicada em 27 de Maio de 1999), radioisótopos (tais como 3H), quelatos metálicos, tais como, quelatos DOTA e DPTA de íons metálicos radioativos ou paramagnéticos como Gd3 +, e lipossomas, enzimas, por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, glicose oxidase, β-galactosidase, β-glucuronidase ou β lactamase, enzima em combinação com um cromógeno, fluorogênico ou composto que gera um sinal detectável, por exemplo, os vendidos pela Invitrogen Corporation, Eugene, Oreg.), compostos cromógenos (incluindo diaminobenzidina (DAB), 4- nitrofenilfosfato (pNPP), vermelho rido, fosfato de bromocloroindolil (BCIP), nitro azul tetrazio (NBT), BCIP/ NBT, vermelho rápido, AP Laranja, AP azul, tetrametilbenzidina (TMB), 2,2’-azino-di- [3-etilbenzotiazolinossulfonato] (ABTS), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4- CN), nitrofenil-β-D-galactopiran0sido (ONPG), o- fenilenodiamina (OPD), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactopiran0sido (X-Gal), metilumbeliferil-β -D-galactopiranósido (MU-Gal), p-nitrofenil-aD- galactopiranósido (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-pD-glucurónido (X-Gluc), 3- amino-9-etilcarbazol (AEC), fucsina, iodonitrotetrazio (INT), azul de tetrazio e violeta de tetrazio, entre outros).
[0483] Moléculas pequenas podem ser diretamente detectadas ou detectadas em combinação umas com as outras. Por exemplo, se um hapteno for conjugado a um ponto quântico, um ponto quântico pode ser detectado por sua fluorescência em um comprimento de onda característico. Em outros casos, a detecção de um hapteno inclui o contato de uma amostra com um anticorpo anti-hapteno e um etiqueta detectável, e a detecção de uma etiqueta. Em certas formas de realização, um marcador detectável é conjugado com um anticorpo anti-hapteno para formar um conjugado marcador anti-hapteno-anticorpo, e um conjugado liga-se a um hapteno. Em outros casos, uma amostra é contatada com um anticorpo anti-hapteno, que se liga a um hapteno. Uma amostra é então contatada com um conjugado de anticorpo capaz de se ligar a um anticorpo anti- hapteno, em que um conjugado de anticorpo inclui um marcador detectável ou um componente de um sistema de marcador detectável. Em certos casos, um componente do sistema de marcadores detectável é uma enzima, tal como, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina, que reage com um substrato cromogênico ou um complexo substrato/ cromogênio, produzindo assim uma deposição cromogênica detectável. Em outros exemplos, a etiqueta é uma etiqueta fluorescente, como um ponto quântico. Veja WO 2012/003476, que é aqui incorporado em sua totalidade.
[0484] Meios adicionais para a identificação da origem da amostra de tumor em um material homogeneizado misto que compreende amostras de tumor derivadas de sujeitos diferentes pode incluir a utilização de DNA com leitura de barras. O DNA barcoding (código de barras) é um método taxonômico que utiliza um marcador genético curto no DNA de um organismo para identificá- lo. Em combinação com métodos de sequenciamento de DNA de próxima geração, pode ser possível determinar a identidade de uma amostra em relação ao seu sujeito de origem por meio da detecção de uma sequência de DNA específica para um sujeito de origem. Adicionalmente, é possível que uma sequência de DNA artificial única e não derivada diretamente de um sujeito possa ser conjugada com uma amostra derivada de um sujeito antes da combinação com outras amostras de tumor com origens diferentes, e que este código de barras de DNA artificial único possa ser lipídio mais tarde Análise de sequência de DNA para identificar a origem de uma amostra sob investigação.
[0485] Do mesmo modo, meios adicionais para identificação do indivíduo em um material homogeneizado misto que compreende amostras de tumor derivadas de diferentes indivíduos ou amostra diferente derivada do mesmo indivíduo podem incluir os marcadores de afinidade de utilização (tais como os geralmente utilizados durante procedimentos laboratoriais de purificação de proteínas que podem incluir mas não são limitado a marcadores peptídicas e marcadores de proteínas) que são conjugados a uma amostra de seção tumoral. A marcador de afinidade poderia ser identificada no ponto desejado da análise da amostra para determinar a origem da amostra sob investigação, semelhante ao princípio do código de barras do DNA. Tais marcadores de afinidade incluem, mas não se limitam a, marcadores peptídicos ou marcadores proteicos, tais como, penta-histidina, tetra-histidina, glutationa sefarose transferase, CBP, CYD (peptídio NorpD covalente mas dissociável), Strep II, FLAG, HPC (cadeia pesada de proteína C), SUMO, AviTag, marcador de calmodulina, marcador de poliglutamato, E-marcador, HA - marcador, Myc- marcador, S-marcador, SBP-marcador, Softag 1, Softag 3, marcador TC, marcador V5, marcador VSV, Marcador Xpress, Isopeptag, MBP, SpyTag, BCCP, marcador de proteína verde fluorescente, halo marcador, marcador Nus, marcador tiorredoxina, marcador Fc e marcador Ty.
[0486] Qualquer número de ensaios analíticos, incluindo, mas não limitado a, coloração, coloração imuno-histoquímica, citometria de fluxo, FACS, classificação de gotículas ativadas por fluorescência, análise de imagem, hibridação, DASH, faróis moleculares, extensão de primer, micro arranjos, CISH, FISH, fibra PEIXE, FISH quantitativo, FISH de fluxo, hibridação genômica comparativa, blotting, Western blotting, Southern blotting, Western blotting, Western-blotting, Northwestern blotting, Northern blotting, ensaios enzimáticos, ELISA, ensaios de ligação a ligantes, imunoprecipitação, imunoprecipitação da cromatina (ChIP), ChIP-seq, ChIP-ChiP, radioimunoensaios, polarização de fluorescência, FRET, ressonância plasmônica de superfície, ensaios de ligação a filtros, cromatografia de afinidade, imunocitoquímica, eletroforese, eletroforese de ácido nucléico, eletroforese em gel de poliacrilamida, métodos de gel nativo eletroforese, focalização isoelétrica, imunoeletroforese, testes de desvio de mobilidade eletroforética, análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, zimografia, perfil de expressão gênica, perfil de DNA com PCR, micro arranjos de DNA, análise serial da expressão gênica, reação em cadeia da polimerase em tempo real, PCR com display diferencial, RNA - seq, espectrometria de massa, detecção de metilação do DNA, análises baseadas em lipidômica, quantificação de células imunes, detecção de marcadores associados ao câncer, purificação por afinidade de tipos específicos de células, sequenciamento de DNA, sequenciamento de próxima geração, detecção de proteínas de fusão associadas ao câncer e detecção de marcadores associados à resistência à quimioterapia ser efetuada utilizando o material homogeneizado “misto”.
[0487] Os ensaios multiplex são frequentemente, mas não necessariamente, usados em ensaios de rastreio de alto rendimento. As técnicas de ensaio multiplex exemplares incluem métodos multiplex baseados em ácidos nucleicos (tal como o micro arranjo de ADN utilizado para a expressão génica ou ensaios de detecção de SNP; SAGE para expressão génica; sequenciação de elevado rendimento (tal como NGS); PCR multiplex; Amplificação por sondas dependentes de ligação multiplex (MLPA);sequenciamento de DNA por ligação e multiplexação baseada em esferas (como Luminex/ LAMP) e métodos multiplex baseados em proteínas (tais como micro arranjos de proteínas, micro arranjos de anticorpos, micro arranjos de antígenos, perfis de anticorpos e multiplexação baseada em esferas Luminex/ LAMP)), bem como outros métodos multiplex (tais como micro arranjos de tecidos, micro arranjos celulares, micro arranjo de compostos químicos, análise de biomarcadores e ELISA).
VISÃO GERAL DE OUTRAS TÉCNICAS ANALÍTICAS
[0488] Uma amostra da presente invenção, por exemplo, produzida por qualquer dos métodos aqui descritos, pode ser submetida a etapas de processamento adicionais. Estas incluem, mas não se limitam a técnicas analíticas adicionais, tais como, as detalhadas no presente pedido, incluindo ensaios adicionais de diagnóstico são aplicáveis às análises dos materiais heterogêneos contidos em uma amostra de tumor representativa. As metodologias que se seguem podem ser utilizadas em conjunto com as amostras da invenção, que podem resultar em informação referente às identidades e propriedades biológicas da célula contida em uma população heterogênea de células tumorais. As análises combinadas proporcionadas pela invenção e as técnicas descritas abaixo podem permitir a identificação, detecção ou caracterização de populações de sub-clones menores mesmo dentro do tumor. Esses resultados podem ser informativos para o diagnóstico, a seleção de métodos de tratamento e o manejo do paciente.
[0489] Em formas de realização exemplificativas, uma amostra representativa da presente invenção pode ser submetida a um ou mais dos seguintes métodos ou etapas: coloração, coloração imuno-histoquímica, citometria de fluxo, FACS, separação de gotículas ativadas por florescia, análise de imagem, hibridização, DASH, balizas moleculares, extensão de primer, micro arranjos, CISH, FISH, FISH de fibra, FISH quantitativo, FISH de fluxo, hibridação genômica comparativa, blotting, Western blotting, Southern blotting, Western blotting, Western blotting, Western blotting, Northwestern blotting, e Northern blotting, enzimaticamente ensaios, ELISA, ensaios de ligação ao ligante, imunoprecipitação, ChIP, ChIP-seq, ChIP-ChiP, radioimunoensaios, polarização de fluorescência, FRET, ressonância plasmônica de superfície, ensaios de ligação de filtro, cromatografia de afinidade, imunocitoquímica, eletroforese, eletroforese de ácido nucléico, eletroforese em gel de poliacrilamida, métodos de gel nativo, eletroforese de fluxo livre, focalização isoelétrica, imunoeletroforese s, ensaios de deslocamento de mobilidade eletroforética, análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, zimografia, perfil de expressão gênica, perfil de DNA com PCR, micro arranjos de DNA, análise seriada da expressão gênica, reação em cadeia da polimerase em tempo real, PCR diferencial, espectrometria de massa, Detecção de metilação do DNA, energia acústica, análises baseadas em lipidômica, quantificação de células imunes, detecção de marcadores associados ao câncer, purificação por afinidade de tipos específicos de células, PCR quantitativo em silhueta de termopar, sequenciamento de DNA, sequenciamento de próxima geração, detecção de proteínas de fusão associadas a câncer, detecção de marcadores associados a resistência a quimioterapia e Ki67, ploidia de DNA ou outra análise genética ou fenólica. Formas de realização exemplificativas destes métodos são descritas abaixo, que se destinam a ilustrar estas técnicas. No entanto, é para ser entendido que variantes e alternativas destas metodologias, e outras metodologias, podem ser utilizadas.
TÉCNICAS DE COLORAÇÃO
[0490] Os fluidos podem ser aplicados para pré-tratamento (por exemplo, reticulação de proteínas, exposição de ácidos nucléicos, etc.), desnaturação, hibridização, lavagem (por exemplo, lavagem rigorosa), detecção (por exemplo, ligando uma molécula visual ou de marcador a uma sonda), amplificando (por exemplo, amplificação de proteínas, genes, etc.), contra coloração ou similares. Em várias modalidades, as substâncias incluem, sem limitação, blots (por exemplo, soluções de hematoxilina, soluções de eosina ou similares), agentes umectantes, sondas, anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos poli clonais, etc.), fluidos recuperadores de antígenos (por exemplo, soluções aquosas ou não aquosas de recuperação de antígeno, tampões de recuperação de antígeno, etc.), solventes (por exemplo, álcool, limoneno, ou similares), ou similares. Os corantes incluem, sem limitação, corantes, blots de hematoxilina, blots de eosina, conjugados de anticorpos ou ácidos nucleicos com marcadores detecteis, tais como, haptenos, enzimas ou porções fluorescentes, ou outros tipos de substâncias para conferir cor e/ ou para intensificar o contraste. Ver WO 2015/197742 e WO 2015/150278, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0491] As técnicas de coloração podem empregar sistemas e métodos para receber uma pluralidade de informações de ensaio, juntamente com uma consulta para uma ou mais características de interesse, e projetar informações anatômicas de um ensaio anatômico sobre uma imagem de um ensaio de coloração, por exemplo, ensaio imuno-histoquímicos (IHC) que é comumente registrado com o ensaio anatômico, para localizar ou determinar características apropriadas para análise. A informação anatômica pode ser usada para gerar uma máscara que é projetada em uma ou mais amostras registradas comumente ou IHC. Uma localização da característica de interesse no ensaio IHC pode ser correlacionada com o contexto anatômico fornecido pela máscara, com quaisquer características de interesse que correspondam à máscara anatômica selecionada ou indicada como apropriada para análise. Além disso, a máscara anatômica pode ser particionada em múltiplas regiões, e múltiplas características de interesse de múltiplos ensaios IHC podem ser correlacionadas com cada uma dessas regiões individualmente. Portanto, os sistemas e métodos divulgados fornecem abordagens sistemáticas, quantitativas e intuitivas para análise abrangente de múltiplos ensaios, superando assim as etapas limitantes de análise visual ad hoc ou subjetiva no estado da técnica. Ver WO 2015/052128 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0492] Tipicamente, as amostras de câncer são examinadas patologicamente fixando as células em lâminas microscópicas e colorindo-as utilizando uma variedade de métodos de coloração (por exemplo, blots morfológicas ou citogenéticas). Os espécimes corados são então avaliados quanto à presença ou ausência de células anormais ou cancerosas e morfologias celulares. Embora forneçam apenas informações gerais, os métodos de coloração histológica são os métodos mais comuns atualmente praticados para a detecção de células cancerosas em amostras biológicas. Outros métodos de coloração frequentemente usados para detecção de câncer incluem imuno- histoquímica e blots de atividade. Esses métodos são baseados na presença ou ausência de antígenos específicos ou atividades enzimáticas em células cancerígenas. Veja WO 2012/152747 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0493] Métodos, kits e sistemas para o tratamento de amostras contendo pigmentos ofuscantes são divulgados. O método inclui a aplicação de um reagente clarificador à amostra, de modo que os pigmentos ofuscantes dentro da amostra sejam descorados. A descoloração dos pigmentos ofuscantes aumenta a capacidade dos patologistas de examinar a amostra. Em formas de realização ilustrativas, é divulgado um método automatizado de tratamento de uma amostra montada em um substrato para aliviar as ofuscações de coloração associadas a pigmentos dentro da amostra. O método inclui a colocação do substrato sobre o qual a amostra é montada em um instrumento automatizado e a aplicação de um reagente de clarificação para que o reagente de clarificação entre em contato com a amostra e os pigmentos dentro da amostra sejam descolorados. O método compreende ainda a aplicação de um reagente de enxaguamento de modo a que o reagente de clarificação seja substancialmente removido da amostra e a aplicação de um reagente cromogênico de modo a que a amostra seja especificamente colorida. Os pigmentos dentro da amostra são descorados pelo reagente clarificador, de modo que a amostra especificamente colorida é interpretável por um leitor qualificado. Em outras formas de realização ilustrativas, é divulgado um kit para descoloração de pigmentos ofuscantes em uma amostra. O kit inclui um frasco de reagente e um reagente de clarificação depositado no frasco de reagente. O reagente de clarificação compreende uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio e o frasco de reagente é configurado para estar operacionalmente ligado a um dispositivo automático de coloração de lâminas de tal modo que o dispositivo automático de coloração de lâminas controla a aplicação do reagente de clarificação de modo a que o reagente de clarificação entre em contato com a amostra. Em outras formas de realização ilustrativas, é divulgado um sistema para aliviar a ofuscação de sinal específico para uma amostra histopatológica contendo pigmentos. O sistema inclui um instrumento automatizado, um reagente de clarificação e um reagente cromogênico. O instrumento automatizado é configurado para receber a amostra histopatológica aderida a um substrato, para entregar o reagente de clarificação e o reagente cromogênico à amostra, e fornecer aquecimento e mistura ao reagente de clarificação e ao reagente cromogênico fornecido à amostra. O reagente clarificador é configurado para contatar a amostra histopatológica e tornar os pigmentos ofuscantes descorados. O reagente cromogênico é configurado para entrar em contato com a amostra histopatológica e depositar um sinal específico. Ver WO 2014/056812 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0494] A imunocoloração e análise de DNA in situ podem ser ferramentas úteis no diagnóstico histológico. A imunocoloração pode basear-se na afinidade de ligação específica de anticorpos com epítopos em amostras e na disponibilidade crescente de anticorpos que se ligam especificamente a epítopos únicos que são por vezes presentes apenas em determinados tipos de células doentes. A imunocoloração pode incluir uma série de etapas de tratamento conduzidas em uma amostra montada em uma lâmina de vidro para destacar seletivamente certos indicadores morfológicos dos estados de doença. Em alguns casos, as etapas de tratamento podem incluir o pré-tratamento da amostra para reduzir a ligação não específica, tratamento e incubação de anticorpos, tratamento e incubação de anticorpos secundários marcados com enzima, reação do substrato com a enzima e contra coloração. O resultado pode produzir áreas destacadas fluorescentes ou cromogênicas da amostra possuindo epítopos que se ligam ao anticorpo. Em alguns casos, a análise de DNA in situ depende da afinidade de ligação específica de sondas com sequências nucleotídicas em células ou amostras. Imuno-histoquímica (IHC) ou imunocitoquímica (ICC) podem incluir a visualização de um componente celular in situ detectando interações anticorpo-antigo específicas onde o anticorpo foi marcado com um marcador visel. IHC é por vezes referido como a detecção de antígenos em tecidos, enquanto ICC é por vezes referido como a detecção de antígenos em ou em células cultivadas (JAVOIS, Métodos em Medicina Molecular, V. 115: Immunocytochemical Methods and Protocols, 2nd edition, (1999) Humana Press, Totowa, Nova Jérsei, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade), no entanto, os métodos descritos como IHC ou ICC podem ser igualmente aplicáveis à presente invenção. O marcador visível pode ser um corante fluorescente, metal coloidal, hapteno, marcador radioativo ou uma enzima. Independentemente do método de preparação, a intensidade máxima do sinal com mínima formação de fundo ou coloração não específica pode ser desejável para proporcionar a visualização ideal do antígeno. Ver WO 2013/139555 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0495] Com base nos estudos iniciais, miRNAs desempenham um papel na regulação do desenvolvimento e diferenciação celular em mamíferos, bem como na cardiogênese e no desenvolvimento de linfócitos. Além disso, o miRNA está envolvido em outros processos biológicos, como hipóxia, apoptose, diferenciação de células-tronco, proliferação, inflamação e resposta à infeção. O miRNA pode ser utilizado para atingir simultaneamente múltiplos efetores de vias envolvidas na diferenciação celular, proliferação e sobrevivência, características-chave da oncogênese. Vários miRNAs foram ligados ao câncer. Como resultado, a análise in-situ do miRNA pode ser útil para o diagnóstico e terapêutica do câncer, pois os miRNAs parecem atuar como oncogênese ou repressores tumorais. Por exemplo, muitas células tumorais têm padrões de expressão de miRNA distintos quando comparados com tecidos normais. Estudos usando camundongos geneticamente modificados para produzir o excesso de c-Myc - uma proteína com formas mutadas implicadas em vários tipos de câncer - estabeleceram que o miRNA afeta o desenvolvimento do câncer. Métodos para a detecção de miRNA, bem como proteínas traduzidas ou reguladas de outra forma pelo miRNA, são altamente desejáveis, particularmente em métodos automatizados para detecção rápida e eficiente. Os métodos anteriores para a detecção de miRNAs não detectam o miRNA e seus alvos de expressão proteica (potencialmente regulados pelo miRNA) na mesma amostra. Métodos exemplificativos utilizam tipicamente o condicionamento celular baseado em proteínases para digerir componentes celulares para expor alvos de ácido nucleico. Além disso, métodos exemplares correlacionam níveis de miRNA e níveis de proteína usando northern e western blots. Além disso, abordagens moleculares que “trituram e ligam” a amostra podem ser utilizadas. Abordagens baseadas em tecidos foram previamente demonstradas. Estes métodos geralmente incluem um passo enzimático. Ver WO 2013/079606 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0496] As formas de realização divulgadas podem utilizar um método automatizado particularmente adequado para a detecção multiplexada de miRNA e proteínas. Em formas de realização ilustrativas, a expressão da uma ou mais proteínas pode ser regulada pelo miRNA. Em outra forma de realização, o método permite que o contexto celular entre o miRNA e a proteína seja identificado. O método pode compreender, por exemplo, utilizar um sistema automatizado para aplicar a uma amostra (a) reagentes adequados para detectar um alvo de miRNA, (b) reagentes adequados para detectar um alvo proteico e (c) reagentes adequados para corar o alvo de miRNA e o alvo proteico. Um aspecto das presentes formas de realização refere-se ao uso de condicionamento de células não enzimáticas, isto é, evitando o condicionamento de células à base de proteínases, para preservar os alvos proteicos. Um passo de condicionamento celular pode envolver tratar a amostra com uma solução de condicionamento celular, tal como, um tampão com um pH ligeiramente básico, incluindo um tampão baseado em Tris tendo um pH de cerca de 7,7 a cerca de 9, a uma temperatura superior a ambiente, tal como, de cerca de 80 °C a cerca de 95 °C. O método automatizado pode detectar o miRNA e os alvos proteicos simultaneamente ou sequencialmente, embora os melhores resultados de coloração normalmente sejam obtidos pela primeira detecção e coloração do miRNA e, em seguida, detecção e coloração do alvo da proteína. Uma forma de realização mais particularmente divulgada compreende primeiro a realização de condicionamento de células não enzimáticas na amostra. A amostra é depois posta em contato com uma porção de ligação específica de ácido nucleico selecionado para um miRNA alvo particular, seguido pela detecção da porção de ligação específica miRNA. A amostra é depois posta em contato com uma porção de ligação da proteína específico selecionado para uma proteína alvo, seguido pela detecção da porção de ligação específico da proteína. Em certas formas de realização, a porção de ligação específica ao ácido nucleico é um ácido nucleico bloqueado (LNA) sonda conjugada com uma porção detectável, tal como, uma enzima, um fluoróforo, um luminóforo, um hapteno, uma nanopartícula fluorescente, ou as suas combinações. Certos haptenos adequados são comuns na arte, tais como, digoxigenina, dinitrofenila, biotina, fluoresceína, rodamina, bromodesoxiuridina, imunoglobulina de ratinho ou combinações dos mesmos. Outros haptenos adequados foram especificamente desenvolvidos por Ventana Medical Systems, Inc., incluindo haptenos selecionados a partir de oxazol, pirazol, triazoles, benzofurazan, triterpenos, uréias, tioureias, rotenóides, cumarinas, ciclolignanas, heterobiarila, azoarila, benzodiazepínicos e combinações dos mesmos. Os haptenos podem ser detectados usando um anticorpo anti-hapteno. Em certas formas de realização descritas, o anticorpo anti-hapteno é detectada por um conjugado anticorpo- enzima anti-espécie, em que a enzima é qualquer enzima adequada, tal como, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano. Ver WO2013079606 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0497] A contrastação é um método de pós-tratamento de amostras depois de já terem sido coloridas com agentes para detectar um ou mais alvos, de tal modo que as suas estruturas possam ser mais prontamente visualizadas ao microscópio. Por exemplo, uma contrastação é opcionalmente usada antes da aplicação da lamínula para tornar-se uma coloração imuno-histoquímica mais distinta. Counterstains diferem na cor de uma mancha primária. Numerosas contra-manchas são bem conhecidas, tais como, hematoxilina, eosina, metilo verde, azul de metileno, Giemsa, azul de Alcian, DAPI e Nuclear Fast Red. Em alguns exemplos, mais de uma mancha pode ser misturada para produzir a contra coloração. Isso proporciona flexibilidade e a capacidade de escolher blots. Por exemplo, uma primeira mancha pode ser selecionada para a mistura que tem um atributo específico, mas ainda não tem um atributo desejado diferente. Uma segunda mancha pode ser adicionada à mistura que exibe o atributo desejado ausente. Por exemplo, azul de toluidina, DAPI e azul de céu de pontamina podem ser misturados para formar uma contra-cor. Veja WO 2012/116949 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0498] A hematoxilina é um composto natural encontrado no cerne vermelho das árvores do gênero Hematoxylon. A própria hematoxilina é incolor em solução aquosa e não é o ingrediente ativo que mancha os componentes do tecido. Em vez disso, um produto de oxidação de hematoxilina, hematoína, torna-se o componente de coloração ativa de uma solução de corante de hematoxilina, particularmente após complexação com um mordente. A hematina é produzida naturalmente através da exposição ao ar e à luz solar. O processo natural é denominado “amadurecimento” e pode levar 3 ou mais meses para fornecer uma solução adequada para a coloração das células. Os procedimentos e sistemas automatizados de coloração usam sistemas mecânicos para fornecer soluções de coloração a uma amostra biológica. Os procedimentos padronizados de coloração de hematoína utilizaram um lote pré-misturado contendo tanto a hematoxilina/ hematoína como um mordente. Ver WO 2012/096842 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0499] A imunocoloração tipicamente utiliza uma série de etapas de tratamento conduzidas em uma amostra montada em uma lâmina de vidro para destacar pela coloração seletiva certos indicadores morfológicos dos estados de doença. Os passos ticos incluem o pré-tratamento da amostra para reduzir ligação não específica, tratamento com anticorpo e incubação, tratamento com anticorpo secundário marcado por enzima e incubação, reação de substrato com a enzima para produzir áreas de realce de fluoróforo ou cromóforo da amostra possuindo epítopos que se ligam ao anticorpo, contra coloração, e assim por diante. Cada um destes passos é separado por múltiplos passos de enxaguamento para remover o reagente residual que não reagiu do passo anterior. As incubações são conduzidas a temperaturas elevadas, geralmente em torno de 40 °C, e as amostras tipicamente são continuamente protegidas da desidratação. A análise de DNA in situ utiliza a afinidade de ligação específica de sondas com sequências nucleotídicas únicas em amostras e envolve de forma semelhante uma série de etapas do processo, com uma variedade de reagentes e temperatura do processo. Veja WO 2011139976 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
COLORAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA (IHC)
[0500] A imuno-histoquímica ou a coloração IHC de uma amostra (ou imunocitoquímica, que é a coloração de células), é talvez a técnica de imunomarcação mais comumente aplicada. Enquanto os primeiros casos de coloração IHC usavam corantes fluorescentes (veja imunofluorescência), outros métodos não fluorescentes usando enzimas como peroxidase (veja coloração de imunoperoxidase) e fosfatase alcalina são agora usados. Estas enzimas são capazes de catalisar reações que dão um produto colorido que é facilmente detectável por microscopia de luz. Alternativamente, elementos radioativos podem ser utilizados como marcadores, e a imunorreação pode ser visualizada por autorradiografia. A preparação ou fixação pode contribuir para a preservação da morfologia e arquitetura celular. A fixação inapropriada ou prolongada pode diminuir significativamente a capacidade de ligação do anticorpo. Muitos antígenos podem ser demonstrados com sucesso em amostras fixadas em formalina. A detecção de muitos antígenos pode ser melhorada por métodos de recuperação de antígenos que atuam quebrando algumas das ligações cruzadas de proteínas formadas pela fixação para descobrir sítios antigênicos ocultos. Isto pode ser conseguido por aquecimento durante vários períodos de tempo (recuperação de epítopos induzida pelo calor ou HIER) ou utilizando digestão enzimática (recuperação de epítopos induzida por proteólise ou PIER).
[0501] Imuno-histoquímica (IHQ) refere-se a um método para determinar a presença ou distribuição de um antígeno (como uma proteína) em uma amostra (como uma amostra de câncer pancreático) detectando a interação do antígeno com um agente de ligação específico, como um anticorpo. Uma amostra incluindo um antígeno (tal como um antígeno alvo) é incubada com um anticorpo sob condições que permitem a ligação anticorpo-antígeno. A ligação anticorpo-antígeno pode ser detectada por meio de um marcador detectável conjugado com o anticorpo (detecção direta) ou por meio de um marcador detectável conjugado com um anticorpo secundário, que é criado contra o anticorpo primário (por exemplo, detecção indireta). Etiquetas detectáveis exemplificativos que podem ser usados para IHC incluem, mas não estão limitados a isótopos radioativos, fluorocromos (tais como fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína e rodamina), haptenos, enzimas (como peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) e cromógenos (como 3,3’-diaminobenzidina ou Fast Red). Em alguns exemplos, a IHC é utilizada para detectar a presença ou determinar a quantidade de uma ou mais proteínas em uma amostra, por exemplo, uma amostra de câncer pancreático. Veja WO 2013/019945, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0502] Imuno-histoquímica, ou IHC, refere-se ao processo de localização de antígenos, como uma proteína, em células de uma amostra e usando os antígenos para promover a ligação específica de anticorpos aos antígenos particulares. Essa técnica de detecção tem a vantagem de poder mostrar exatamente onde uma determinada proteína está localizada na amostra. É também uma maneira eficaz de examinar as amostras em si. O uso de pequenas moléculas, como haptenos, para detectar antígenos e ácidos nucléicos tornou-se um método proeminente na IHQ. Haptenos, em combinação com anticorpos anti-hapteno, são úteis para detectar alvos moleculares específicos. Por exemplo, porções de ligação específicas, tais como, anticorpos primários e sondas de ácido nucleico podem ser marcadas com uma ou mais moléculas de hapteno e, uma vez que estas porções de ligação específicas se ligam aos seus alvos moleculares, podem ser detectadas utilizando um conjugado de anticorpo anti-hapteno que inclui uma enzima como parte de um sistema de detecção com base cromogênica ou uma etiqueta detectável, tal como, um marcador fluorescente. A ligação do conjugado de anticorpo anti- hapteno detectável a uma amostra indica a presença do alvo em uma amostra. A digoxigenina, presente exclusivamente em plantas digitálicas como um metabólito secundário, é um exemplo de um hapteno que tem sido utilizado em uma variedade de ensaios moleculares. A Patente U.S. No. 4.469.797 divulga o uso de imunoensaios para determinar as concentrações de digoxina em amostras de sangue com base na ligação específica de anticorpos anti-digoxina ao fármaco na amostra de teste. A Patente U.S. No. 5.198.537 descreve um número de derivados adicionais de digoxigenina que foram utilizados em testes imunológicos, tais como, imunoensaios. Para ensaios in situ, tais como, ensaios imuno-histoquímicos (IHC) e ensaios de hibridização in situ (ISH) de amostras, especialmente ensaios multiplexados de tais amostras, é altamente desejável identificar e desenvolver métodos que forneçam resultados desejáveis sem interferência de fundo. Um desses métodos envolve o uso de amplificação de sinal de Tiramida (TSA), que é baseado no depósito patenteado de repórter catalisado (CARD). A Patente US No. 6.593.100, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade, revela o melhoramento da catálise de uma enzima em um método de amplificação de sinal de CARD ou tiramida (TSA) por reação de um conjugado de fenol marcado com uma enzima, em que a reação é levada a cabo. na presença de um reagente potenciador. Veja WO 2012/003476, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, como são as publicações anteriores.
[0503] Formas de realização de métodos para utilizar os conjugados de hapteno podem ser utilizados. Em geral, o método pode incluir os passos de a) imobilizar uma peroxidase em um alvo em uma amostra, em que a peroxidase é capaz de reagir com uma porção arila ativável por peroxidase, por exemplo, tiramina ou um derivado de tiramina, b) contatar a amostra com uma solução que compreende um conjugado de hapteno, em que o conjugado de hapteno compreende um hapteno ligado a uma porção de arila ativável por peroxidase como descrito acima, e c) colocando a amostra em contato com uma solução que compreende peróxido, em que o conjugado de hapteno reage com a peroxidase e o peróxido, formar uma ligação covalente com a peroxidase imobilizada ou proximal a peroxidase imobilizada; e d) localizar o alvo na amostra detectando o hapteno. Veja WO 2012/003476, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
MICROSCOPIA DE EXPANSÃO
[0504] A microscopia de expansão (ExM) fornece um método para a obtenção de imagens ópticas de amostras biológicas de interesse, incluindo, entre outras, células, tecidos, DNA, RNA ou lipídios, com resolução aumentada em comparação ao limite de difração de microscopia clássica. O ExM permite a ampliação física de amostras biológicas preservadas, em que as amostras biológicas de interesse são infundidas com uma composição (por exemplo, um gel polimérico ou um hidrogel) na medida em que a composição este incorporada nas amostras de interesse. Quando a composição se expande isotropicamente, as amostras biológicas ou um corante (ou fluoróforo) ligado às amostras irão expandir-se, permitindo assim a imagiologia óptica das amostras biológicas ou fluoróforo a uma resolução mais elevada. Sob ExM, a amostra biológica é primeiro colorida com etiqueta utilizando técnicas padrão conhecidas de um especialista na técnica, por exemplo, FISH, coloração imuno-histoquímica. As amostras são então perfundidas com uma ou mais soluções de gelatina, por exemplo, um monómero, um agente de reticulação cruzado ou um iniciador. Em uma forma de realização, as soluções de gelatina compreendem materiais dilatáveis. Uma vez completado o processo de gelificação, as amostras biológicas são então opcionalmente digeridas com proteínases ou outros tratamentos químicos. O gel é expandido após o inchaço, o que pode ser conseguido através do contato com fatores externos, como água ou calor. A expansão do gel aumenta ou expande fisicamente as amostras ou marcadores embutidos no gel. A ampliação e/ ou expansão das amostras ou marcadores permite imagens ópticas em resoluções muito maiores (por exemplo, em nano escala). O ExM é aplicável a um grande número de amostras biológicas, incluindo, mas não se limitando a proteínas, RNA, DNA, lipídios, e aquelas que não são capazes de identificação e localização em alta resolução sob microscopia clássica. Veja-se o pedido US 14/ 627,310, que é incorporado por referência em sua totalidade.
[0505] A presente invenção proporciona um modo de preparação da amostra representativa para microscopia, que compreende, ou alternativamente consistindo essencialmente de, ou ainda consistindo adicionalmente, na integração da amostra representativa (por exemplo, composição homogeneizada) ou uma sua porção em um material dilatável. O termo “material dilatável”, como usado aqui, refere-se a um material que se expande sob influência física, incluindo, mas não limitado a contato com água, temperatura (por exemplo, calor), alongamento físico e umidade. O material dilatável pode se expandir em uma dimensão, ou duas dimensões, ou em três dimensões. Em uma forma de realização, o material dilatável é transparente de tal modo que, após expansão, a luz pode passar através da amostra. Em uma forma de realização, o material dilatável é um polímero ou hidrogel dilatável. Em uma forma de realização, o material dilatável é formado in situ a partir dos seus precursores. Por exemplo, podem ser utilizados um ou mais materiais polimerizáveis, monómeros ou oligômeros, tais como, monómeros selecionados do grupo que consiste em grupos solúveis em água contendo um grupo etilenicamente insaturado polimerizável. Em uma forma de realização preferida, o polímero dilatável é poliacrilato e copolímeros ou copolímeros reticulados dos mesmos. Alternativamente ou adicionalmente, o material dilatável pode ser formado in situ através de oligômeros ou polímeros solúveis em água quimicamente reticuláveis.
[0506] O termo “material polimerizável” refere-se a um material capaz de polimerização, incluindo, mas não limitado a um monómero e oligômero. O termo “reticulador” refere-se a uma molécula que contém duas ou mais extremidades reativas capazes de se ligar quimicamente a grupos funcionais específicos (aminas primárias, sulfidrilas, etc.) em proteínas ou outras moléculas. Em uma forma de realização, um agente de reticulação provoca a polimerização de oligômeros ou monómeros. O termo “iniciador de polimerização” refere-se a um composto, ou seus aníons, que reage com o óxido de etileno de um modo que resulta na sua polimerização. Em certas formas de realização, o iniciador de polimerização é o aníon de um grupo funcional que inicia a polimerização do óxido de etileno.
[0507] Em uma forma de realização, o método compreende ainda, ou consiste alternativamente essencialmente, ou ainda consiste ainda em aumentar a composição homogeneizada inchando o material dilatável. Em outra forma de realização, o processo de incorporação compreende, ou alternativamente consiste essencialmente de, ou ainda consiste ainda em permear o material homogeneizado com uma composição que compreende precursores de um material dilatável e formando um material dilatável in situ, e ancorando a composição homogeneizada ao material dilatável. Em um aspecto, o material dilatável é formado a partir de um precursor do material dilatável, em que o precursor compreende um material polimerizável, um iniciador de polimerização ou um reticulador. Em outro aspecto, o material polimerizável é um monómero ou um oligômero. Em uma outra forma de realização, o monómero ou o oligômero compreende metacrilato, acrilato, acrilamida, metacrilamida, álcool vinílico, vinilamina, alilamina, álcool alílico ou reticulantes divinílicos substituídos ou não substituídos (por exemplo, bisacrilamidas N, N-alquileno).
CITOMETRIA DE FLUXO
[0508] A citometria de fluxo é uma tecnologia biofísica baseada em laser empregada na contagem de células, triagem de células, detecção de biomarcadores e engenharia de proteínas, suspendendo células em um fluxo de fluido e passando-as por um aparato de detecção eletrônica. Permite a análise multiparamétrica simultânea das características físicas e químicas de até milhares de partículas por segundo. A citometria de fluxo é usada rotineiramente no diagnóstico de distúrbios de saúde, especialmente em cânceres do sangue, mas tem muitas outras aplicações em pesquisa básica, prática clínica e ensaios clínicos. Uma variação comum é classificar fisicamente as partículas com base em suas propriedades, de modo a purificar as populações de interesse.
TRIAGEM CELULAR ATIVADA POR FLUORESCÊNCIA (FACS)
[0509] A triagem de células ativada por fluorescência (FACS) é um tipo especializado de citometria de fluxo. Ele fornece um método para classificar uma mistura heterogênea de células em dois ou mais recipientes, uma célula por vez, com base na dispersão de luz específica e características fluorescentes de cada célula. É um instrumento científico útil, pois fornece registro rápido, objetivo e quantitativo de sinais fluorescentes de células únicas, bem como separação física de células de interesse específico. A suspensão de células é arrastada no centro de um fluxo de líquido estreito e de fluxo rápido. O fluxo é organizado de modo que haja uma grande separação entre as células em relação ao seu diâmetro. Um mecanismo de vibração faz com que o fluxo de células se rompa em gotículas individuais. O sistema é ajustado para que haja uma baixa probabilidade de mais de uma célula por gotícula. Imediatamente antes do fluxo se romper em gotículas, o fluxo passa por uma estação de medição de fluorescência onde o caráter fluente de interesse de cada célula é medido. Um anel de carga elétrica é colocado exatamente no ponto em que a corrente se rompe em gotículas. Uma carga é colocada no anel com base na medição de intensidade de fluorescência imediatamente anterior, e a carga oposta é aprisionada na gotícula à medida que ela se separa do fluxo. As gotículas carregadas caem então através de um sistema de deflexão eletrostática que desvia as gotículas para os recipientes com base em sua carga. Em alguns sistemas, a carga é aplicada diretamente ao fluxo e a interrupção da gotícula retém a carga do mesmo sinal do fluxo. O fluxo é então retornado ao neutro depois que a gotícula se rompe.
CLASSIFICAÇÃO DE GOTÍCULAS ATIVADAS POR FLUORESCÊNCIA DE CÉLULAS ÚNICAS
[0510] A compartimentalização de células únicas em gotículas permite a análise de proteínas liberadas ou secretadas pelas células, superando assim uma das principais limitações da citometria de fluxo tradicional e da triagem celular ativada por fluorescência. Um exemplo desta abordagem é um ensaio de ligação para detectar anticorpos secretados a partir de células de hibridoma de camundongo único. Os anticorpos secretados são detectados após apenas 15 min por co-compartimentalização de células de hibridoma de camundongo isoladas, uma sonda fluorescente e esferas individuais revestidas com anticorpos anti- IgG de camundongo em gotículas de 50-pl. As contas capturam os anticorpos secretados e, quando os anticorpos capturados se ligam à sonda, a fluorescência se tornou localizada nas esferas, gerando um sinal fluorescente claramente distinguível que permite a classificação de gotículas em ~ 200 Hz, bem como o enriquecimento celular. O sistema microfluidico descrito é facilmente adaptado para o rastreamento de outras proteínas intracelulares, de superfície celular ou proteínas secretadas e para quantificação de atividades catalíticas ou reguladoras. Para rastrear ~ 1 milhão de células, as operações microfluídicas podem ser concluídas em 2 a 6 horas; todo o processo, incluindo a preparação de dispositivos microfluídicos e células de mamíferos, pode ser concluído em 5 a 7 dias. Veja Mazutis et al. (2013). “Single-cell analysis and sorting using dropletbased microfluidics”. Nat. Protoc. 8: 870- 891, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
ANÁLISE DE IMAGEM
[0511] As amostras podem ser analisadas por sistemas e métodos implementados por computados para detecção automática de células imunes que auxiliam em estudos clínicos de perfil imunológico. O método automático de detecção de células imunes envolve a recuperação de uma pluralidade de canais de imagem a partir de uma imagem multicanal, tal como uma imagem RGB ou uma imagem não misturada biologicamente significativa. Veja WO 2015/177268, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0512] Pode ser utilizado um algoritmo de análise de imagem e/ ou sistema que calcula automaticamente uma pontuação imune a partir de um conjunto de imagens de lâminas IHC multiplexadas e/ ou lâminas fluorescentes coradas. O algoritmo de análise de imagem envolve um método implementado por computador para a contagem de vários tipos de células em uma única amostra que foi corada com ensaio multiplex, compreendendo: imagem da amostra que foi corada com o ensaio multiplex que inclui marcadores de linfócitos CD3, CD8, CD20, FoxP3 e marcadores de detecção de tumores; desmisturar a imagem de amostra única que foi corada com um ensaio multiplex em canais de imagem separados para cada marcador do ensaio multiplex; identificar regiões de interesse em cada canal de imagem com base na informação de intensidade em cada canal, em que regiões de baixa intensidade em cada canal são removidas e regiões de alta intensidade representam sinais de célula; gerar uma única imagem substituta, em que a imagem substituta é uma combinação da informação de canal de imagem de todos os marcadores de linfócitos; aplicação de um algoritmo de detecção de células, em que o algoritmo de detecção de células é um algoritmo de localização de membrana ou um algoritmo de localização de núcleo; identificar características dos linfócitos e combinações de linfócitos em cada canal de imagem ou imagem de canais combinados, ou uma imagem transformada tal como imagem em escala de cinza ou de absorbância, ou uma imagem substituta; treinar um algoritmo de classificação baseado em características de linfócitos conhecidos e combinações de linfócitos; aplicar o algoritmo treinado às características dos linfócitos e combinações de linfócitos em cada canal de imagem ou em cada imagem de canais combinados, ou em uma imagem transformada tal como escala de cinza ou imagem de absorbância, ou em uma imagem substituta, que foram identificadas para classificar o células detectadas como pelo menos uma das células falsa positivas, apenas células T CD3, células T CD3 e CD8, células T FP3; e células B CD20; contar um número de cada tipo diferente de célula classificada; gerando uma pontuação da amostra, em que a pontuação é baseada no número de cada tipo de célula contada. Veja WO 2015/124737, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0513] Formas de realização exemplificativas da presente divulgação podem incluir a utilização de sistemas e métodos que incluem um método de classificação de duas etapas. As operações aqui divulgadas incluem a divisão de uma imagem WS em uma pluralidade de patches e a primeira classificação de cada patch usando uma classificação “leve”, tal como SVM, e gerando uma pontuação de confiança e um rótulo para cada patch. A localização de cada patch, suas características e seu tipo obtido como resultado de classificação e sua pontuação de confiança podem ser armazenadas em um banco de dados. A segunda etapa de classificação inclui comparar os patches de baixa confiabilidade com os patches de alta confiabilidade no banco de dados e usar patches semelhantes para aumentar a coerência espacial dos patches no banco de dados. Em outras palavras, para cada patch de baixa confiabilidade, os patches vizinhos de alta confiabilidade fazem contribuições maiores para o refinamento das etiquetas de cada patch, o que melhora a precisão da segmentação nos patches de baixa confiabilidade. Em contraste com as técnicas existentes de aprendizado adaptativo/ ativo para crescentes bancos de dados em treinamento, as operações divulgadas estão menos preocupadas com o crescimento de um único banco de dados em treinamento e, em vez disso, estão focadas em tratar cada imagem de teste de forma independente, melhorando a precisão da classificação baseada nas informações de confiança de rotulagem para a imagem em análise. Em outras palavras, um banco de dados de patches rotulados confiável é gerado para cada imagem e operações de recuperação de similaridade são executadas dentro da imagem para refinar os resultados de classificação para patches de baixa confiabilidade. Ver WO 2015/113895, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0514] Formas de realização exemplificativas da presente divulgação podem incluir a utilização de métodos de detecção e pontuação da expressão de mesotelina (MSLN), tal como a expressão da proteína MSLN. Em exemplos particulares, os métodos incluem o contato de uma amostra que inclui células tumorais com um agente de ligação específico da proteína MSLN (tal como um anticorpo). Os tumores exemplificativos que expressam MSLN incluem, mas não se limitam a, câncer de ovário, câncer de pulmão (por exemplo, carcinomas do pulmão de células não pequenas, NSCLCs), câncer do pâncreas e mesotelioma. A expressão da proteína MSLN nas células tumorais detectada ou medida, por exemplo, utilizando microscopia e imuno-histoquímica (IHC). A amostra é pontuada em uma escala de 0 a 3+ para expressão da proteína MSLN. Por exemplo, determina-se se pelo menos 10% das células tumorais (tal como pelo menos cerca de 10% das células tumorais) na amostra são coradas com o agente de ligação específico da proteína (por exemplo, têm expressão proteica de MSLN detectável). À amostra é atribuída uma pontuação de zero para a expressão da proteína MSLN se menos de 10%> (tal como menos de cerca de 10%>) das células tumorais forem coradas com o agente de ligação específica. Atribui-se à amostra uma pontuação de 1+ para a expressão da proteína MSLN se pelo menos 10% das células tumorais (tal como pelo menos cerca de 10% das células tumorais) na amostra forem coradas com o agente marcador específico da proteína (por exemplo, têm expressão de proteína MSLN detectável), mas menos de 10%> das células tumorais (tal como menos de cerca de 10%) são coradas com o agente de ligação específico a uma intensidade de 2+ ou superior. À amostra é atribuída uma pontuação de 2+ para a expressão da proteína MSLN se pelo menos 10% das células tumorais (tal como pelo menos cerca de 10% das células tumorais) na amostra forem coradas com o agente de ligação específico da proteína (por exemplo, têm expressão de proteína MSLN detectável) com uma intensidade de 2+ ou superior e uma maioria das células tumorais coradas com intensidade 2+. À amostra é atribuída uma pontuação de 3+ para a expressão da proteína MSLN se pelo menos 10% das células tumorais (tal como pelo menos cerca de 10% das células tumorais) na amostra forem coradas com o agente de ligação específico da proteína (por exemplo, têm expressão de proteína MSLN detectável) com uma intensidade de 2+ ou superior e uma maioria das células tumorais coradas coram com intensidade 3+ e pelo menos 10% das células tumorais (tal como pelo menos cerca de 10% das células tumorais) na amostra é corada com o agente de ligação específico da proteína (por exemplo, tem expressão de proteína MSLN detectável) com intensidade 3+. Uma visão geral é fornecida na Tabela 13 e Figura 20 do WO 2015/032695, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
HIBRIDIZAÇÃO
[0515] A hibridização in situ (ISH) envolve o contato de uma amostra contendo um ácido nucleico alvo, um ácido nucleico alvo genômico) no contexto de uma preparação de cromossomo em metáfase ou intérfase (tal como uma amostra montada em uma lâmina) com uma sonda marcada especificamente hibridizável ou específica para o ácido nucleico alvo (por exemplo, uma ou mais das sondas divulgadas aqui). As lâminas são opcionalmente pré-tratadas, por exemplo, para remover materiais que possam interferir com a hibridação uniforme. A amostra do cromossomo e a sonda são ambas tratadas, por exemplo, por aquecimento para desnaturar os ácidos nucleicos de fita dupla. A sonda (formulada em um tampão de hibridização adequado) e a amostra são combinados, sob condições e durante tempo suficiente para permitir que ocorra hibridização (tipicamente para atingir o equilíbrio). A preparação dos cromossomos é lavada para remover o excesso de sonda e a detecção da marcação específica do alvo é realizada utilizando técnicas padrão. Ver WO 2015/124702, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0516] Outros métodos de detecção de células de câncer utilizam a presença de aberrações cromossômicas em células cancerígenas. Em particular, a deleção ou multiplicação de cópias de cromossomos inteiros ou segmentos cromossômicos e níveis mais altos de amplificações de regiões específicas do genoma são ocorrências comuns no câncer. As aberrações cromossômicas são frequentemente detectadas usando métodos citogenéticos, tais como cromossomos corados por Giemsa (bandeamento G) ou hibridização fluorescente in situ (FISH). Veja WO 2012/152747, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0517] A tecnologia atualmente divulgada fornece métodos aperfeiçoados para maior especificidade na análise dos mecanismos moleculares de um câncer. Assim, em certas formas de realização, a tecnologia refere-se a um método de diagnóstico de câncer multivariado em que o dito método determina a presença de marcadores moleculares e marcadores fenotípicos morfométricos ao nível celular em uma única célula ou uma única amostra contendo células, o dito método compreendendo: a) obtenção de dados de marcadores moleculares a partir de uma única amostra de um indivíduo compreendendo uma única célula ou células; b) obtenção de dados quantitativos de morfologia celular a partir da mesma única célula ou células como utilizadas na etapa (a) para fornecer uma análise multivariada da dita única amostra, o conjunto de dados multivariável compreendendo dados morfológicos quantitativos de células da etapa (b) e dados de marcadores moleculares da etapa (a); e c)comparar o conjunto de dados de análise multivariável obtido na etapa (b) com um conjunto de dados de análise multivariável de referência criado obtendo dados de marcadores moleculares e dados de morfologia celular quantitativos de amostras de células cancerígenas e não cancerígenas retiradas de indivíduos com resultados clínicos conhecidos.
[0518] Os resultados da comparação da etapa (c) fornecem uma previsão de um desfecho clínico do sujeito definido por combinações específicas de características e marcadores estatisticamente associados à progressão do câncer, ocorrência, metástase ou outra característica do desfecho clínico visto no conjunto de dados de análise multivariada de referência. Veja WO 2012/152747, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0519] Formas de realização exemplificativas da presente divulgação podem incluir a utilização de tecnologia que fornece informação para determinar estados de prognóstico patológico de câncer utilizando a marcação de marcadores moleculares por fluorescência em conjunto com abordagens de imagiologia especializadas envolvendo detecção com resolução espectral e pré- processamento de dados. A tecnologia fornece uma abordagem de imagem que pode adquirir e analisar a morfologia nuclear em uma amostra que é preparada para a detecção de sondas específicas de moléculas em uma amostra dentro de um único ciclo de aquisição de dados. Esta abordagem de imagem emprega uma combinação de tecnologias de rotulagem, aquisição, pré-processamento e análise. Uma imagem multidimensional é coletada e analisada para separar e distinguir diferentes canais de analito de interesse por comprimento de onda de emissão. Os canais subsequentes do analito representam diferentes aspectos dos dados que quantificam a morfologia e o rearranjo genético, a expressão genética e/ ou a expressão de proteína da célula. Veja WO 2012/152747, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0520] Formas de realização exemplificativas da presente divulgação podem incluir a utilização de um sistema, método e kit para visualizar um núcleo. Uma amostra pode ser pré-tratada com uma proteínase para permeabilizar o núcleo e depois incubada com um conjugado de de nanopartículas/ porção de ligação ao DNA. A porção de ligação ao DNA inclui pelo menos uma molécula de ligação ao DNA. O conjugado se liga ao DNA dentro do núcleo, e a nanopartícula é visualizada, visualizando assim o núcleo. Técnicas de análise por computador e imagem são usadas para avaliar características nucleares, tais como distribuição cromossômica, ploidia, forma, tamanho, características de texturas e/ ou recursos contextuais. O método pode ser utilizado em combinação com outros testes multiplexados na amostra, incluindo a hibridização in situ por fluorescência. Veja WO 2012/116949, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0521] A hibridização in situ por fluorescência (FISH) é uma técnica que pode ser usada para detectar e localizar a presença ou ausência de sequências específicas de DNA nos cromossomos. A FISH utiliza sondas fluorescentes que se ligam apenas àquelas partes do cromossomo com as quais elas apresentam um alto grau de similaridade de sequência. A FISH também pode ser usada para detectar sequências de RNAm particulares dentro de uma amostra. Veja WO 2012/116949, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0522] Numerosos procedimentos para FISH, CISH e SISH são conhecidos na técnica. Por exemplo, os procedimentos para executar FISH são descritos nas Patentes US Nos. 5,447,841; 5,472,842; e 5,427,932; CISH é descrito na Patente US No. 6,942,970, e métodos de detecção adicionais são fornecidos na Patente US No. 6,280,929, cujas revelações são aqui incorporadas em sua totalidade por referência. Numerosos reagentes e esquemas de detecção podem ser empregados em conjunto com procedimentos FISH, CISH e SISH para melhorar a sensibilidade, resolução ou outras propriedades desejáveis. Como discutido acima, as sondas marcadas com fluoróforos (incluindo corantes fluorescentes e pontos quânticos) podem ser diretamente detectadas opticamente quando se realiza a FISH. Alternativamente, a sonda pode ser marcada com uma molécula não fluorescente, tal como um hapteno [tal como os seguintes exemplos não limitantes: biotina, digoxigenina, DNP e vários oxazóis, pirazoles, tiazóis, nitroarilos, benzofurazanos, triterpenos, ureias, tioureias, rotenonas, cumarina, compostos à base de cumarina, podofilotoxina, compostos à base de podofilotoxina e suas combinações), ligante ou outra porção detectável indiretamente. As sondas marcadas com tais moléculas não fluorescentes (e as sequências de ácido nucleico alvo às quais se ligam) podem então ser detectadas contactando a amostra (por exemplo, a amostra celular à qual a sonda está ligada) com um reagente de detecção marcado, tal como um anticorpo (ou receptor, ou outro parceiro de ligação específico) específico para o hapteno ou ligante escolhido. O reagente de detecção pode ser marcado com um fluoróforo (por exemplo, ponto quântico) ou com outra porção detectável indiretamente, ou pode ser colocado em contato com um ou mais agentes de ligação específica adicionais (por exemplo, anticorpos secundários ou específicos), que podem ser, por sua vez, rotulados com um fluoróforo. Opcionalmente, o marcador detectável é ligado diretamente ao anticorpo, receptor (ou outro agente de ligação específico). Alternativamente, o marcador detectável é ligado ao agente de ligação através de um ligante, tal como um ligante tiol hidrazida, um ligante polietileno glicol ou qualquer outra porção de ligação flexível com reatividades comparáveis. Por exemplo, um agente de ligação específico, tal como um anticorpo, um receptor (ou outro anti-ligante), avidina ou semelhantes, pode ser covalentemente modificado com um fluororo (ou outro marcador) através de um ligante polialquilenoglicol heterobifuncional, tal como um ligante polietilenoglicol heterobifuncional (PEG). Um ligante heterobifuncional combina dois grupos reativos diferentes selecionados, por exemplo, a partir de um grupo reativo de carbonila, um grupo reativo de amina, um grupo reativo de tiol e um grupo foto-reativo, o primeiro dos quais se liga ao marcador e o segundo dos quais anexa ao agente de ligação específica. Em outros exemplos, a sonda, ou agente de ligação específico (tal como um anticorpo, por exemplo, um anticorpo primário, receptor ou outro agente de ligação) é marcado com uma enzima que capaz de converter uma composição fluorogênica ou cromogênica em uma fluorescente detectável, colorida ou sinal detectável de outra forma (por exemplo, como na deposição de partículas metálicas detectáveis em SISH). Como indicado acima, a enzima pode ser ligada direta ou indiretamente através de um ligante à sonda relevante ou ao reagente de detecção. Exemplos de reagentes adequados (por exemplo, reagentes de ligação) e químicas [(por exemplo, ligante e químicas de ligação) são descritos nas Publicações do Pedido de Patente US Nos 2006/0246524; 2006/0246523 e 2007/0117153, cujas divulgações são aqui incorporadas em sua totalidade por referência. Ver WO 2015/124702, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0523] Os métodos da presente divulgação podem permitir a detecção de mais de um (por exemplo, 2, 3, 4, etc.) alvos diferentes. Em algumas formas de realização, diferentes rótulos detectáveis e/ ou sistemas de detecção podem ser usados para cada um dos alvos, de modo que cada um possa ser individualmente detectado em uma única amostra. Qualquer rótulo detectável apropriado e/ ou sistema de detecção pode ser usado. Mais especificamente, a presente divulgação apresenta sistemas para hibridação in situ em campo claro. Em algumas formas de realização, o sistema compreende um conjunto de sondas compreendendo X sondas únicas de RNA 2’-0-metil específicas para um RNA alvo, em que X > 2 (por exemplo, X = 2, X = 3, X = 4, X = 5, etc.), as sondas visam X porções distintas dentro do RNA alvo. Cada sonda de RNA 2’-0-metil pode ser conjugada com pelo menos uma porção detectável. A porção detectável pode ser adaptada para ligar um sistema de conjugado de cromogênio reativo (por exemplo, sistema de conjugado de cromogênio de tiramida) para amplificação de sinal. Em algumas formas de realização, cada uma das sondas de RNA 2’-0-metil compreende entre 15 e 30 nucleotídeos, entre 20 e 50 nucleotídeos, entre 40 e 80 nucleotídeos, entre 20 e 100 nucleotídeos ou entre 20 e 200 nucleotídeos em comprimento. Ver WO 2015/124738, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0524] O espécime pode ser uma amostra de células da mama processada de acordo com um protocolo de hibridização in situ (ISH). O protocolo ISH pode fornecer a visualização de sequências de ácido nucleico específicas (por exemplo, DNA, RNAm, etc.) em preparações de células através da hibridização de fitas complementares de nucleotídeos (por exemplo, sondas) com a sequência de interesse. O protocolo ISH pode incluir, sem limitação, um protocolo dual SISH e Red ISH, um único protocolo Red ISH, um único protocolo SISH ou algo semelhante. Ver WO 2013/113707, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
HIBRIDIZAÇÃO ESPECÍFICA DO ALELO DINÂMICO (DASH)
[0525] A genotipagem de hibridização específica de alelo dinâmico (DASH) aproveita as diferenças na temperatura de fusão no DNA que resulta da instabilidade de pares de bases não combinados. O processo pode ser amplamente automatizado e abrange alguns princípios simples. Na primeira etapa, um segmento gênico é amplificado e ligado a uma esfera através de uma reação por PCR com um iniciador biotinilado. Na segunda etapa, o produto amplificado é ligado a uma coluna de estreptavidina e lavado com NaOH para remover a fita não biotinilada. Um oligonucleotídeo específico de alelo é então adicionado na presença de uma molécula que fluoresce quando ligada ao DNA de cadeia dupla. A intensidade é então medida à medida que a temperatura é aumentada até que a temperatura de fusão (Tm) possa ser determinada. Um SNP resultará em um Tm menor que o esperado. Como a genotipagem DASH está medindo uma mudança quantificável em Tm, ela é capaz de medir todos os tipos de mutações, não apenas SNPs. Outros benefícios do DASH incluem sua capacidade de trabalhar com sondas sem rótulo e seu design simples e condições de desempenho.
BALIZAS (BEACONS) MOLECULARES
[0526] As balizas moleculares utilizam uma sonda de oligonucleotídeo de fita simples especificamente projetada. O oligonucleotídeo é concebido de tal modo que existem regiões complementares em cada extremidade e uma sequência de sonda localizada entre elas. Este projeto permite que a sonda assuma uma estrutura em gancho (hairpin), ou haste-alça ou estrutura em seu estado natural e isolado. Ligado a uma ponta da sonda está um fluoróforo e à outra extremidade um extintor de fluorescência. Por causa da estrutura de haste-alça da sonda, o fluoróforo está próximo ao extintor, evitando assim que a molécula emita qualquer fluorescência. A molécula também é projetada de tal forma que somente a sequência da sonda é complementar ao DNA genômico que será usado no ensaio (Abravaya et al. (Abril de 2003). “Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applications”. Clin. Chem Lab. Med. 41 (4): 468-74). Se a sequência da sonda da baliza molecular encontrar seu DNA genômico alvo durante o ensaio, ele irá se anilhar e hibridizar. Devido ao comprimento da sequência da sonda, o segmento em gancho da sonda será desnaturado em favor da formação de um híbrido sonda-alvo mais longo e estável. Esta mudança conformacional permite que o fluoróforo e o extintor sejam livres de sua proximidade apertada devido à associação de gancho, permitindo que a molécula fluoresça. Se, por outro lado, a sequência da sonda encontrar uma sequência alvo com tão pouco quanto um nucleotídeo não complementar, a baliza molecular ficará preferencialmente no seu estado de gancho natural e não será observada fluorescência, uma vez que o fluoróforo permanece extinto.
EXTENSÃO POR PRIMER
[0527] A extensão do iniciador é um processo de duas etapas que envolve primeiramente a hibridização de uma sonda com as bases imediatamente a montante do nucleotídeo do SNP seguido por uma reação de ‘mini-sequenciamento’, na qual a DNA polimerase expande o iniciador hibridizado adicionando uma base que é complementar ao nucleotídeo SNP. Esta base incorporada é detectada e determina o alelo do SNP (Syvanen, Nat Rev Genet. 2001 Dec; 2 (12): 930-42). Como a extensão do iniciador é baseada na enzima DNA polimerase altamente precisa, o método é geralmente muito confiável. A extensão do iniciador é capaz de genotipar a maioria dos SNPs sob condições de reação muito semelhantes, tornando-o também altamente flexível. O método de extensão do iniciador é usado em vários formatos de ensaio. Esses formatos usam uma ampla variedade de técnicas de detecção que incluem espectrometria de massa MALDI-TOF (consulte Sequenom) e métodos semelhantes a ELISA. Geralmente, existem duas abordagens principais que utilizam a incorporação de dideoxinucleotídeos marcados com fluorescência (ddNTP) ou desoxinucleotídeos marcados com fluorescência (dNTP). Com ddNTPs, as sondas hibridizam com o DNA alvo imediatamente a montante do nucleotídeo SNP, e adiciona-se um único ddNTP complementar ao alelo SNP à extremidade 3’ da sonda (a 3’-hidroxila em falta no didioxinucleotídeo impede que mais nucleotídeos sejam adicionados). Cada ddNTP é rotulado com um sinal fluorescente diferente, permitindo a detecção de todos os quatro alelos na mesma reação. Com dNTPs, as sondas específicas para alelos possuem bases 3’ que são complementares a cada um dos alelos SNP que estão sendo interrogados. Se o DNA alvo contiver um alelo complementar à base 3’ da sonda, o DNA alvo irá hibridizar completamente com a sonda, permitindo que a DNA polimerase se estenda a partir da extremidade 3’ da sonda. Isto é detectado pela incorporação dos dNTPs marcados com fluorescência no final da sonda. Se o DNA alvo não contiver um alelo complementar à base 3’ da sonda, o DNA alvo produzirá um desemparelhamento na extremidade 3’ da sonda e a DNA polimerase não será capaz de se estender a partir da extremidade 3’ da sonda. O benefício da segunda abordagem é que vários dNTPs marcados podem ser incorporados à fita em crescimento, permitindo um aumento do sinal.
MICROARRANJOS (MICROARRAYS)
[0528] O princípio central por trás de microarranjos é a hibridação entre duas cadeias de DNA, a propriedade de sequências de ácido nucleico complementares para emparelhar especificamente umas com as outras, formando ligações de hidrogênio entre os pares de bases complementares de nucleotídeo. Um elevado número de pares de bases complementares em uma sequência nucleotídica resulta em uma ligação não covalente mais apertada entre as duas fitas. Após a lavagem de sequências de ligação não específicas, apenas as cadeias fortemente emparelhadas permanecerão hibridizadas. As sequências alvo marcadas de forma fluorescente que se ligam a uma sequência de sonda geram um sinal que depende das condições de hibridização (tal como temperatura) e lavagem após hibridização. A força total do sinal, de um ponto (característica), depende da quantidade de amostra alvo que se ligou às sondas presentes naquele local. Os microarranjos usam quantificação relativa em que a intensidade de uma característica é comparada à intensidade da mesma característica sob uma condição diferente, e a identidade da característica é conhecida por sua posição.
[0529] Arranjos de ácido nucleico (também conhecidas como arranjos de oligonucleotídeos, microarranjos de DNA, chips de DNA, chips de genes ou biochips) tornaram-se poderosas ferramentas analíticas. Um arranjo de ácido nucléico é essencialmente uma distribuição sistemática de oligonucleotídeos em uma superfície, por exemplo, em linhas e colunas. Os oligonucleotídeos podem ser aderidos física ou covalentemente a uma superfície. Uma abordagem para oligonucleotídeos fisicamente aderentes a uma superfície envolve secagem de soluções de oligonucleotídeos quando estes entram em contato com a superfície. Depois de secar ou de outro modo fixar, os oligonucleotídeos estão confinados em uma “mancha” na superfície. A abordagem de secagem começou com a produção de arranjos de densidade muito baixa chamadas “dot blots”. Os Dot blots podem ser feitos depositando manualmente gotículas de oligonucleotídeos em uma superfície sólida e secando. A maioria dos dot blots envolve menos do que cerca de 20 pontos de oligonucleotídeos diferentes dispostos em filas e colunas. Dot blots anteriores mais avançados, as abordagens de micropontos (micro-spotting) usavam sistemas mecânicos ou robóticos para criar uma multiplicidade de pontos microscópicos. O tamanho pequeno dos pontos permitia maiores densidades de pontos. Por exemplo, micro-pontos foi usado para depositar dezenas de milhares de pontos em uma lâmina de microscópio. De acordo com uma abordagem diferente, os oligonucleotídeos foram sintetizados diretamente em um substrato ou suporte. Fotolitografia sem máscara e técnicas de química óptica digital são técnicas para sintetizar diretamente ácidos nucléicos em um suporte; estas abordagens têm sido usadas para gerar arranjos de densidade muito elevada (por exemplo, US Pat. No. 7,785,863, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade). Da mesma forma, a fotolitografia sem máscara tem sido utilizada para fabricar arranjos de peptídeos (ver, por exemplo, Singh-Gasson et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nat Biotechnol 1999, 17: 974-978, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). A química óptica digital tem sido usada para criar arranjos com milhões de áreas distintas, cada uma contendo uma população de oligonucleotídeos únicos. Os arranjos de ácido nucleico e peptídeo incluem um arranjo de áreas (aqui referidas como “pontos”) em uma superfície de substrato, cada área designada para um oligonucleotídeo ou peptídeo particular. A “densidade do arranjo” é essencialmente o número de linhas e colunas de pontos distribuídos em uma determinada área. Um arranjo de alta densidade tem um número maior de linhas e colunas em uma determinada área. À medida que os arranjos de de ácido nucléico e de peptídeos da indústria se desenvolveram, a disponibilidade de arranjo de alta densidade também aumentou. À medida que o número de pontos em uma determinada área aumenta, o tamanho de cada ponto é reduzido. Por exemplo, um ponto em um arranjo com milhões de oligonucleotídeos ou peptídeos únicos distribuídos através da área de uma lâmina de microscópio seria de aproximadamente 100 pm2. O pequeno tamanho deste ponto cria desafios técnicos na leitura e compreensão dos resultados do uso do arranjo. Por exemplo, enquanto um ponto de 100 pm2 pode ser observado visualmente em isolamento, os seres humanos não podem visualmente resolver dois ou mais 100 pm2 pontos próximos sem ampliação. Assim, a fabricação e o uso de arranjos de alta densidade avançaram para o estágio em que os usuários não podem mais ler o arranjo visualmente. Como os arranjos incluem vastos números (milhões) de pontos estreitamente dispostos em uma pequena área, dispositivos de imagem sofisticados detectam sinais do arranjo e o software é usado para interpretar os dados. Além disso, métodos de detecção altamente sensíveis podem ser utilizados. A imagem de fluorescência, sendo uma técnica altamente sensível, tornou-se a abordagem padrão para detectar eventos de hibridação. A imagem de fluorescência desses arranjos geralmente usa microscópios equipados com filtros e câmeras. Fluorescência geralmente não pode ser resolvida visualmente sem o auxílio desses dispositivos. As imagens de fluorescência altamente complexas são processadas usando software porque o volume de dados é alto e sua apresentação não é percebida. Por exemplo, Pat. No. 6,090,555 de Fiekowsky, et al. descreve um processo complexo que envolve o alinhamento assistido por computador e a desconvolução de imagens de fluorescência adquiridas de uma matriz de ácido nucleico. Embora a capacidade de realizar investigações genômicas ou proteômicas massivamente paralelas seja de grande valor, os arranjos de ácidos nucleicos e peptídeos têm sido limitados na aplicabilidade pela dificuldade em detectar e decifrar eventos de ligação. Além disso, o uso de fluorescência cria muitos obstáculos para a aplicabilidade geral de arranjos devido a sinais de fluorescência que degradam ao longo do tempo e a complexidade do hardware de detecção de fluorescência associado. A presente divulgação refere-se a um dispositivo e um modo de utilização do dispositivo para detectar moléculas alvo, o dispositivo incluindo um arranjo de oligonucleotídeo ou de peptídeos. O dispositivo inclui uma pluralidade de moléculas de ligação ligadas a uma superfície de substrato. As moléculas de ligação são projetadas para se ligarem a uma molécula alvo. A ligação do alvo e das moléculas de ligação pode ser identificada através do exame do dispositivo. Em algumas formas de realização, o dispositivo permite a detecção de um evento de hibridação entre um ácido nucleico alvo e um oligonucleotídeo imobilizado. Em outras formas de realização, o dispositivo permite a detecção de um evento de ligação entre um polipeptídeo alvo e um peptídeo imobilizado. Em formas de realização ilustrativas, um dispositivo compreende um substrato com pelo menos uma superfície de substrato e uma pluralidade de oligonucleotídeos ou peptídeos imobilizados ligados à superfície do substrato, em que a pluralidade de oligonucleotídeos ou peptídeos imobilizados é padronizada na superfície do substrato para formar pelo menos um padrão opticamente decifrável. Ver WO 2013/110574, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0530] Exemplos de formas de realização da presente divulgação podem incluir a utilização de um dispositivo para a detecção de um ou mais compostos alvo. Um tipo de composto alvo de interesse particular são ácidos nucleicos alvo ou oligonucleotídeos alvo. Outro tipo de composto alvo de particular interesse são os polipeptídeos alvo. Para formas de realização da presente divulgação, incluindo oligonucleotídeos imobilizados, os ácidos nucleicos alvo seriam geralmente entendidos como sendo o tipo de molécula alvo. Contudo, os técnicos no assunto compreendem que os oligonucleotídeos imobilizados fornecem um parceiro de ligação para os conjugados da porção de ligação ao oligonucleotídeo que são capazes de detectar uma variedade de outros compostos alvo. Por exemplo, utilizando o oligonucleotídeo imobilizado, um conjugado de anticorpo-oligonucleotídeo poderia ser imobilizado no dispositivo para transformar o dispositivo em um microarranjo de anticorpo. Um microarranjo de anticorpos poderia ser usado para detectar um alvo proteico de interesse. De modo semelhante, formas de realização que incluem peptídeos imobilizados, o tipo de molécula alvo pode incluir anticorpos, proteínas ou enzimas. Contudo, os peptídeos subjacentes também poderiam ser modificados utilizando conjugados da porção de ligação ao peptídeo e uma porção de direcionamento molecular. Além disso, enquanto a presente divulgação específicamente divulga oligonucleotídeos e peptídeos imobilizados, estes são meramente unidades de detecção imobilizadas exemplificativas. Existem muitas outras porções úteis de detecção imobilizadas que podem ser incorporadas em um dispositivo como aqui descrito, sem se afastar do conceito como aqui divulgado. Por exemplo, as porções de detecção podem incluir aptâmeros, ligantes, quelantes, carboidratos e equivalentes artificiais dos mesmos. Ver WO 2013/110574, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0531] Os métodos de isolamento de CTCs podem incluir o uso de anticorpos específicos para EpCAM, ERG, PSMA ou combinações dos mesmos. As CTCs isoladas são aplicadas a uma lâmina de vidro ou outro substrato e fixadas (por exemplo, utilizando métodos conhecidos na arte). Novos métodos de espalhamento utilizando anticorpos específicos da próstata como aqui discutidos também podem ser utilizados para isolar CTCs e aplica-los a um substrato, tal como uma lâmina de vidro, antes da fixação. As CTCs montadas e fixas são então colocadas em contato com uma ou mais sondas de ácido nucleico específicas para ERG, PTEN e CEN-10, por exemplo sob condições suficientes para as sondas de ácido nucleico se hibridizarem à sua sequência complementar nas CTCs. As sondas de ácido nucleico são marcadas, por exemplo, com um ou mais pontos quânticos. Por exemplo, as sondas de ácido nucleico específicas para ERG, PTEN e CEN-10 podem, cada uma, ser marcadas com um ponto quântico diferente, para permitir distinguir as sondas umas das outras. Depois de permitir que as sondas de ácido nucleico se hibridizem com ERG, PTEN e CEN-10, detectam-se sinais de um ou mais pontos quânticos em uma ou mais sondas de ácido nucleico, por exemplo, utilizando imagiologia espectral. Os sinais são então analisados, para determinar se nas CTCs isoladas, um ou mais ERGs são rearranjados, se um ou mais genes PTEN são deletados, e se o CEN-10 é detectado. Com base no fato de um ou mais ERGs estarem rearranjados, se um ou mais genes PTEN são eliminados e se o CEN-10 é detectado, o câncer da próstata é caracterizado. Veja WO 2013/101989, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU CROMOGÊNICA (GISH)
[0532] A hibridação in situ cromogênica (CISH) é uma técnica citogenética que combina o método de detecção do sinal cromogênico de técnicas de imuno-histoquímica (IHC) com a hibridização in situ. Foi desenvolvido por volta do ano 2000 como uma alternativa à hibridação in situ por fluorescência (FISH) para detecção da amplificação do oncogene HER-2/ neu. O CISH é semelhante ao FISH porque são técnicas de hibridização in situ usadas para detectar a presença ou ausência de regiões específicas do DNA. No entanto, o CISH é muito mais prático em laboratórios de diagnóstico porque usa microscópios de campo claro, em vez dos microscópios de fluorescência mais caros e complicados usados em FISH.
[0533] O design da sonda para CISH pode ser muito semelhante ao da FISH com diferenças na marcação e detecção. As sondas FISH são geralmente marcadas com uma variedade de marcadores fluorescentes diferentes e só podem ser detectados sob um microscópio de fluorescência, enquanto sondas CISH são marcadas com biotina ou digoxigenina e podem ser detectadas usando um microscópio de campo claro após outras etapas de tratamento terem sido aplicadas. As sondas CISH têm aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento e são projetadas para alvos de DNA. Elas são complementares à sequência alvo e se ligam a ela após uma etapa de desnaturação e hibridização. Apenas algumas poucas sondas CISH estão disponíveis comercialmente, portanto, para a maioria das aplicações, elas precisam ser extraídas, amplificadas, sequenciadas, rotuladas e mapeadas a partir de cromossomos artificiais bacterianos (BACs). Os BACs foram desenvolvidos durante o Projeto Genoma Humano, já que era necessário isolar e amplificar fragmentos curtos do DNA humano para fins de sequenciamento. Atualmente, os BACs podem ser selecionados e posicionados no genoma humano usando bancos de dados públicos, como o Navegador do Genoma UCSC. Isto assegura ótima especificidade e a complementaridade de sequência. O DNA é extraído dos clones de BAC e amplificado utilizando uma técnica baseada em polimerase, tal como PCR degenerada iniciada por oligonucleotídeos (DOP). Em seguida, os clones são sequenciados e sua posição no genoma é verificada. A marcação da sonda pode ser realizada utilizando iniciação alélica ou tradução por picada para incorporar biotina ou digoxigenina.
[0534] Preparação de amostras, hibridização de sondas e detecção: A amostra pode incluir cromossomos em intérfase ou metáfase. As amostras estão seguramente presas a uma superfície, como uma lâmina de vidro. A amostra pode sofrer digestão com pepsina para garantir que o alvo esteja acessível. São adicionados 10 a 20 μL de sonda, a amostra é coberta com uma lamínula que é selada com cimento de borracha, e a lâmina é aquecida a 97 °C por 5 a 10 minutos para desnaturar o DNA. A lâmina é então colocada em um forno a 37 °C durante a noite, para que a sonda possa hibridizar. No dia seguinte, a amostra é lavada e é aplicado um bloqueador para sítios de ligação não específicos às proteínas. Se a peroxidase de rábano (HRP) for usada, a amostra deve ser incubada em peróxido de hidrogênio para suprimir a atividade da peroxidase endógena. Se a digoxigenina for usada como um marcador de sonda, um anticorpo primário anti-digoxigenina fluoresceina seguido por um anticorpo secundário anti-fluoresceina conjugado com HRP é então aplicado. Se a biotina for usada como um marcador de sonda, os sítios de ligação não específica devem primeiro ser bloqueados usando albumina sérica bovina (BSA). Em seguida, a estreptavidina conjugada com HRP é usada para detecção. A HRP então converte a diaminobenzidina (DAB) em um produto marrom insolúvel, que pode ser detectado em um microscópio de campo claro com uma ampliação de 40 a 60 vezes. Uma contra-cor, como hematoxilina e eosina, pode ser usada para tornar o produto mais visível.
[0535] Técnicas citogenéticas moleculares, como a hibridização in situ cromogênica (CISH) combinam a avaliação visual de cromossomos (análise cariotípica) com técnicas moleculares. Os métodos de citogenética molecular baseiam-se na hibridação de uma sonda de ácido nucleico ao seu ácido nucleico complementar dentro de uma célula. Uma sonda para uma região cromossômica específica reconhecerá e hibridizará sua sequência complementar em um cromossomo metafásico ou dentro de um núcleo em intérfase (por exemplo, em uma amostra). As sondas foram desenvolvidas para diversos fins de diagnóstico e pesquisa. As sondas de sequência hibridam com sequências de DNA de cópia simples em uma região ou gene cromossômico específica. Estas são as sondas usadas para identificar a região crítica cromossômica ou gene associado a uma síndrome ou condição de interesse. Em cromossomos metafásicos, tais sondas hibridizam para cada cromátide, geralmente dando dois pequenos sinais discretos por cromossomo. A hibridização de sondas de sequência, como sondas depletadas de repetição ou sondas de sequências únicas, tornou possível a detecção de anormalidades cromossômicas associadas a numerosas doenças e síndromes, incluindo anomalias genéticas constitutivas, como síndromes de microdeleção, translocações cromossômicas, amplificação gênica e síndromes de aneuploidias, doenças neoplásicas, bem como infecções por patógenos. Mais comumente, essas técnicas são aplicadas a preparações citogenéticas padrão em lâminas de microscópio. Além disso, esses procedimentos podem ser usados em lâminas de células fixas ou outros isolados nucleares. Por exemplo, essas técnicas são frequentemente usadas para caracterizar células tumorais tanto no diagnóstico como no prognóstico do câncer. Numerosas anormalidades cromossômicas têm sido associadas ao desenvolvimento de câncer (por exemplo, aneuploidias como a trissomia 8 associada a certos distúrbios mieloides; translocações tais como o rearranjo BCR/ ABL na leucemia mieloide crônica e amplificações de sequências específicas de ácidos nucléicos associadas à transformação neoplástica). Técnicas moleculares podem aumentar o teste citogenético padrão na detecção e caracterização de tais anomalias cromossômicas adquiridas. Sistemas para CISH de duas cores foram introduzidos. Estes incluem o sistema Dako DuoCISH™ e o sistema Zyto Vision ZytoDot® 2C. Ambos os sistemas utilizam enzimas separadas (fosfatase alcalina e peroxidase de rábano) para as duas etapas de detecção de cor.
[0536] A presente divulgação refere-se a sistemas e processos para hibridização in situ cromogênica (CISH) e, em particular, a métodos que previnem interferência entre dois ou mais sistemas de detecção de cor em um único ensaio e refere - se ainda a processos para pontuar ensaios utilizando sondas separadas (break-apart). Veja WO 2011/133625, que é aqui incorporado em sua totalidade.
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA (FISH)
[0537] A hibridização in situ com fluorescência (FISH) é uma técnica citogenética que utiliza sondas fluorescentes que se ligam apenas às partes do cromossomo com um alto grau de complementaridade de sequência. Foi desenvolvido por pesquisadores biomédicos no início dos anos 80 e é usado para detectar e localizar a presença ou ausência de sequências específicas de DNA nos cromossomos. A microscopia de fluorescência pode ser usada para descobrir onde a sonda fluorescente está ligada aos cromossomos. A FISH é frequentemente usada para encontrar características específicas no DNA para uso em aconselhamento genético, medicina e identificação de espécies. A FISH também pode ser usada para detectar e localizar alvos de RNA específicos (tais como RNAm, lncRNA e miRNA) em células, células tumorais circulantes e amostras. Nesse contexto, pode ajudar a definir os padrões espaço-temporais de expressão gênica dentro das células.
[0538] Sondas: RNA e DNA: sondas de RNA podem ser projetadas para qualquer gene ou qualquer sequência dentro de um gene para visualização de RNAm, lncRNA e miRNA em células. A FISH é usada examinando o ciclo de reprodução celular, especificamente intérfase dos núcleos para quaisquer anormalidades cromossômicas. Essa técnica [FISH] permite que a análise de uma grande série de casos de arquivamento seja muito mais fácil de identificar o cromossomo identificado, criando uma sonda com uma fundação cromossômica artificial que atrairá cromossomos semelhantes. Os sinais de hibridação para cada sonda quando uma anomalia nucleica é detectada. Cada sonda para a detecção de RNAm e lncRNA é composta de 20 pares de oligonucleotídeos, cada par cobrindo um espaço de 40 a 50 pb. Para detecção de miRNA, as sondas usam química proprietária para detecção específica de miRNA e cobrem toda a sequência de miRNA. As sondas são frequentemente derivadas de fragmentos de DNA que foram isolados, purificados e amplificados para uso no Projeto Genoma Humano. O tamanho do genoma humano é tão grande, comparado ao tamanho que poderia ser sequenciado diretamente, que era necessário dividir o genoma em fragmentos. (Na análise final, esses fragmentos foram colocados em ordem por digestão de uma cópia de cada fragmento em fragmentos ainda menores usando endonucleases específicas de sequência, medindo o tamanho de cada fragmento pequeno usando cromatografia de exclusão de tamanho, e usando essa informação para determinar onde os grandes fragmentos se sobrepunham). Para preservar os fragmentos com suas sequências individuais de DNA, os fragmentos foram adicionados a um sistema de populações de bactérias continuamente replicantes. Populações clonais de bactérias, cada população mantendo um único cromossomo artificial, são armazenadas em vários laboratórios ao redor do mundo. Os cromossomos artificiais (BAC) podem ser cultivados, extraídos e rotulados em qualquer laboratório. Esses fragmentos são da ordem de 100 mil pares de bases e são a base para a maioria das sondas FISH.
[0539] Processo de preparação e hibridização - RNA: As células podem ser permeabilizadas para permitir acessibilidade ao alvo. A FISH também foi feita com sucesso em células não fixadas. Uma sonda alvo específica, composta por 20 pares de oligonucleotídeos, hibrida com o(s) RNA(s) alvo. Sistemas de amplificação de sinal separados mas compatíveis permitem o ensaio multiplex (até dois alvos por ensaio). A amplificação do sinal é conseguida através de uma série de etapas de hibridação sequenciais. No final do ensaio, as amostras são visualizadas sob um microscópio de fluorescência.
[0540] Processo de preparação e hibridação - DNA: Primeiro, uma sonda é construída. A sonda deve ser grande o suficiente para hibridizar especificamente com seu alvo, mas não tão grande a ponto de impedir o processo de hibridação. A sonda é marcada diretamente com fluoróforos, com alvos para anticorpos ou com biotina. A marcação pode ser feita de várias maneiras, como tradução de incisão ou PCR usando nucleotídeos marcados. Então, uma preparação cromossômica em intérfase ou metáfase é produzida. Os cromossomos estão firmemente ligados a um substrato, geralmente de vidro. Sequências repetitivas de DNA devem ser bloqueadas pela adição de pequenos fragmentos de DNA à amostra. A sonda é então aplicada ao DNA do cromossomo e incubada por aproximadamente 12 horas durante a hibridização. Várias etapas de lavagem removem todas as sondas não hibridizadas ou parcialmente hibridizadas. Os resultados são então visualizados e quantificados usando um microscópio que é capaz de excitar o corante e gravar imagens. Se o sinal fluorescente for fraco, a amplificação do sinal pode ser necessária para exceder o limiar de detecção do microscópio. A intensidade do sinal fluorescente depende de muitos fatores, como a eficiência de rotulagem da sonda, o tipo de sonda e o tipo de corante. Anticorpos marcados com fluorescência ou estreptavidina estão ligados à molécula de corante. Esses componentes secundários são selecionados para que tenham um sinal forte.
FIBRA FISH
[0541] Em uma técnica alternativa para preparações de intérfase ou metafase, as fibras FISH, cromossomos de intérfase, são ligados a uma lâmina de tal maneira que eles são esticados em uma linha reta, ao invés de estarem firmemente enrolados, como em FISH convencional, ou adotando um conformação de território de cromossomo, como na intérfase FISH. Isto é conseguido através da aplicação de cisalhamento mecânico ao longo do comprimento da lâmina, ou para as células que foram fixadas à lâmina e então lisadas, ou para uma solução de DNA purificado. Uma técnica conhecida como penteação de cromossomos é cada vez mais usada para essa finalidade. A conformação estendida dos cromossomos permite uma resolução drasticamente maior - até mesmo algumas kilobases.
FISH QUANTITATIVO (Q-FISH)
[0542] A hibridização in situ em fluorescência quantitativa (Q-FISH) é uma técnica citogenética baseada na metodologia tradicional FISH. Na Q- FISH, a técnica usa imitadores de DNA sintéticos (Cy3 ou FITC) marcados chamados oligonucleotídeos de ácido nucléico peptídico (PNA) para quantificar sequências-alvo em DNA cromossômico usando microscopia fluorescente e software de análise.
FISH DE FLUXO
[0543] A Flow-FISH é uma técnica citogenética para quantificar o número de cópias de elementos repetitivos específicos no DNA genômico de populações celulares inteiras por meio da combinação de citometria de fluxo com protocolos citogenéticos de hibridização in situ com fluorescência. A Flow-FISH foi publicada pela primeira vez em 1998 por Rufer et al. como uma modificação de uma outra técnica para a análise do comprimento de telômeros, Q-FISH, que emprega as sondas de ácidos nucleicos de peptídeos de uma sequência 3’- CCCTAACCCTAACCCTAA-5’ marcada com uma fluoresceina fluoróforo para corar repetições teloméricas em metáfase preparadas de células que tenham sido tratado com colcemid, choque hipotôico e fixação a lâminas através de tratamento com metanol/ ácido acético (protocolo disponível online). As imagens dos pontos fluorescentes resultantes podem então ser analisadas através de um programa de computador especializado (método e software disponível a partir da Flintbox Network) para produzir valores de fluorescência quantitativos que podem então ser usados para estimar o comprimento real dos telômeros. A fluorescência produzida pela coloração da sonda é considerada quantitativa porque o PNA se liga preferencialmente ao DNA em baixas concentrações de sais iônicos e na presença de formamida, assim o duplex de DNA pode não se reformar uma vez que tenha sido fundido e anelado à sonda PNA, permitindo a sonda saturar a sua sequência de repetição alvo (tal como não é deslocada do DNA alvo por DNA anti-sense competidor na cadeia complementar), produzindo assim uma leitura fiável e quantificável da frequência do alvo da sonda PNA em um dado sítio cromossômico após a lavagem de sonda não acoplada.
HIBRIDIZAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA
[0544] A hibridização genômica comparativa é um método citogenético molecular para analisar as variações do número de cópias (CNVs) em relação ao nível de ploidia no DNA de uma amostra de teste em comparação com uma amostra de referência, sem a necessidade de cultivar células. O objetivo desta técnica é comparar rápida e eficientemente duas amostras de DNA genômico provenientes de duas fontes, que são mais frequentemente relacionadas, porque se suspeita que elas contêm diferenças em termos de ganhos ou perdas de cromossomos inteiros ou sub regiões cromossômicas (uma porção de um cromossomo inteiro). Esta técnica foi originalmente desenvolvida para a avaliação das diferenças entre os complementos cromossômicos de amostras de tumor sólido e tecido normal, e tem uma resolução melhorada de 5 a 10 megabases em comparação com as técnicas mais tradicionais de análise citogenética de bandas de giemsa (bandas g) e hibridização in situ por fluorescência (FISH) que são limitados pela resolução do microscópio utilizado.
BLOTTING
[0545] Técnicas de blotting exemplificativas que podem ser utilizadas incluem Western, Southern, Eastern, Far-western, Southwestern, Northwestern e Northern blotting, como descrito adicionalmente nas seções seguintes e como conhecido na técnica.
WESTERN BLOTTING
[0546] O western blot (às vezes chamado de immunoblot de proteína) é uma técnica analítica amplamente usada para detectar proteínas específicas em uma amostra de material homogeneizado ou extrato. Utiliza eletroforese em gel para separar proteínas nativas por estrutura 3-D ou proteínas desnaturadas pelo comprimento do polipeptídeo. As proteínas são então transferidas para uma membrana (tipicamente nitrocelulose ou PVDF), onde são coradas com anticorpos específicos para a proteína alvo. A etapa de eletroforese em gel está incluída na análise de western blot para resolver a questão da reatividade cruzada de anticorpos.
SOUTHERN BLOTTING
[0547] O Southern blotting combina a transferência de fragmentos de DNA separados por eletroforese para uma membrana filtrante e subsequente detecção de fragmentos por hibridização da sonda. A hibridação da sonda com um fragmento de DNA específica na membrana de filtro indica que este fragmento contém sequência de DNA que é complementar à sonda. O passo de transferência do DNA do gel de eletroforese para uma membrana permite uma ligeira ligação da sonda de hibridação marcada ao DNA fraccionado por tamanho. Também permite a fixação das sondas híbridas ao alvo, que podem ser utilizados para análise por autorradiografia ou outros métodos de detecção. As Southern blotting realizadas com DNA genômico digerido com enzimas de restrição podem ser utilizadas para determinar o número de sequências (por exemplo, cópias de genes) em um genoma. Uma sonda que hibrida em um único segmento de DNA que não tenha sido cortado pela enzima de restrição produzirá uma única banda em um Southern blot, enquanto bandas múltiplas provavelmente serão observadas quando a sonda hibridizar com várias sequências altamente similares (por exemplo, aquelas que podem ser o resultado da duplicação de sequência). A modificação das condições de hibridização (por exemplo, aumentando a temperatura de hibridização ou diminuindo a concentração de sal) pode ser utilizada para aumentar a especificidade e diminuir a hibridização da sonda para sequências que sejam menos de 100% semelhantes.
EASTERN BLOTTING
[0548] O eastern blotting é uma técnica bioquímica usada para analisar as modificações pós-traducionais da proteína (PTM), tais como lipídios, fosfo-moléculas e glicoconjugados. É mais frequentemente usado para detectar epitopos de carboidratos. Assim, o eastern blotting pode ser considerado uma extensão da técnica bioquímica de western blotting. Múltiplas técnicas foram descritas pelo termo eastern Blotting, sendo a maioria usa das proteínas isoladas do gel SDS-PAGE sobre uma membrana de PVDF ou nitrocelulose. As proteínas transferidas são analisadas quanto a modificações pós-tradução utilizando sondas que podem detectar lipídios, carboidratos, fosforilação ou qualquer outra modificação de proteína. Eastern blotting deve ser usado para se referir a métodos que detectam seus alvos através da interação específica do PTM e da sonda, distinguindo-os de um padrão Far-Western blot. Em princípio, o eastern blotting é semelhante à transferência de lectina (isto é, detecção de epítopos de carboidratos em proteínas ou lipídios).
FAR-WESTERN BLOTTING
[0549] O Far-Western blotting emprega proteínas não-anticorpo para sondar a(s) proteína(s) de interesse no blot. Deste modo, os parceiros de ligação da proteína sonda (ou a mancha) podem ser identificados. A proteína de sonda é frequentemente produzida em E. coli usando um vetor de clonagem de expressão. Proteínas em um lisado celular contendo proteínas presas são primeiramente separadas por SDS ou PAGE nativa, e transferidas para uma membrana, como em um WB padrão. As proteínas na membrana são então desnaturadas e renaturadas. A membrana é então bloqueada e sondada, geralmente com proteína(s) de isca purificada(s). As proteínas de isca são detectadas nos pontos da membrana onde está localizada uma proteína predadora, se as proteínas de isca e a proteína predadora juntas formam um complexo. A proteína sonda pode então ser visualizada através dos métodos usuais - pode ser radiomarcada; pode conter uma marcação de afinidade específica, como His ou FLAG, para os quais existem anticorpos; ou pode haver um anticorpo específico de proteína (para a proteína sonda).
SOUTHWESTERN BLOTTING
[0550] O Southwestern blotting, baseado nas linhas de Southern blotting (que foi criado por Edwin Southern) e descrito pela primeira vez por B. Bowen, J. Steinberg e colegas em 1980, é uma técnica de laboratório que envolve a identificação e caracterização de proteínas de ligação ao DNA (proteínas que se ligam ao DNA) pela sua capacidade de se ligar a sondas oligonucleotídicas específicas. As proteínas são separadas por eletroforese em gel e são posteriormente transferidas para membranas de nitrocelulose semelhantes a outros tipos de blotting. O mapeamento “Southwestern blot” é realizado para uma rápida caracterização das proteínas de ligação ao DNA e seus sítios específicos no DNA genômico. As proteínas são separadas em gel de poliacrilamida (PAGE) contendo dodecil sulfato de sódio (SDS), renaturadas por remoção de SDS na presença de ureia e transferidas para nitrocelulose por difusão. A região de interesse do DNA genômico é digerida por enzimas de restrição selecionadas para produzir fragmentos de tamanhos apropriados mas diferentes, os quais são subsequentemente marcados na extremidade e deixados ligar-se às proteínas separadas. O DNA ligado especificamente é eluído de cada complexo de proteína-DNA individual e analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida. Evidências de que proteínas específicas de ligação ao DNA podem ser detectadas por essa técnica foram apresentadas. Além disso, a sua ligação específica da sequência permite a purificação dos fragmentos de DNA correspondentes ligados seletivamente e pode melhorar a clonagem mediada por proteínas das sequências reguladoras de DNA.
NORTHWESTERN BLOTTING
[0551] A execução de um Northwestern blot envolve a separação das proteínas de ligação ao RNA por gel de eletroforese, que separará as proteínas de ligação ao RNA com base em seu tamanho e carga. Amostras individuais podem ser carregadas no gel de agarose ou poliacrilamida (geralmente um SDS-PAGE) para analisar múltiplas amostras ao mesmo tempo. Uma vez completada a eletroforese em gel, o gel e as proteínas de ligação ao RNA associadas são transferidas para um papel de transferência de nitrocelulose. Os blots transferidos recentemente são então inclusos em uma solução de bloqueio; leite destanado e albumina de soro bovino são tampões bloqueadores comuns. Esta solução de bloqueio auxilia na prevenção da ligação não específica dos anticorpos primários e/ ou secundários à membrana de nitrocelulose. Uma vez que a solução de bloqueio tenha tempo de contato adequado com o blot, um RNA concorrente específico é aplicado e dado tempo para incubar em temperatura ambiente. Durante esse tempo, o RNA competidor se liga às proteínas de ligação ao RNA nas amostras que estão no blot. O tempo de incubação durante este processo pode variar dependendo da concentração do RNA competidor aplicado; embora o tempo de incubação seja tipicamente de uma hora. Após a incubação estar completa, o blot é normalmente lavado pelo menos 3 vezes durante 5 minutos em cada lavagem, para diluir o RNA na solução. Tampões de lavagem comuns incluem fosfato tamponado salino (PBS) ou uma solução Tween 20 a 10%. Lavagens inadequadas ou imprórpias afetarão a clareza do desenvolvimento do blot. Uma vez terminada a lavagem, o blot é então tipicamente desenvolvido por raios X ou por métodos de autorradiografia semelhantes.
NORTHERN BLOTTING
[0552] Um procedimento geral de Northern blotting começa com a extração do RNA total de uma amostra homogeneizada ou de células. O RNAm eucariótico pode então ser isolado através do uso de cromatografia de oligo (dT) celulose para isolar somente aqueles RNAs com uma cauda poli(A). As amostras de RNA são então separadas por eletroforese em gel. Como os géis são frágeis e as sondas não conseguem entrar na matriz, as amostras de RNA, agora separadas por tamanho, são transferidas para uma membrana de nylon através de um sistema capilar ou de transferência a vácuo. Uma membrana de nylon com uma carga positiva é a mais eficaz para utilização no Northern blotting, uma vez que os ácidos nucleicos carregados negativamente têm uma elevada afinidade para eles. O tampão de transferência utilizado para o blotting geralmente contém formamida, pois diminui a temperatura de anilhamento da interação sonda-RNA, eliminando assim a necessidade de altas temperaturas, o que poderia causar a degradação do RNA. Uma vez que o RNA tenha sido transferido para a membrana, ele é imobilizado através de ligação covalente à membrana por luz UV ou calor. Depois de uma sonda ter sido rotulada, ela é hibridizada com o RNA na membrana. As condições experimentais que podem afetar a eficiência e a especificidade da hibridização incluem força iônica, viscosidade, comprimento do duplex, pares de bases não correspondentes e composição de base. A membrana é lavada para garantir que a sonda tenha ligado especificamente e para evitar que surjam sinais de fundo. Os sinais híbridos são então detectados por filme de raios X e podem ser quantificados por densitometria. Para criar controles para comparação em uma amostra de Northern blot, não exibindo o produto gênico de interesse pode ser usado após determinação por microarranjos ou RT-PCR.
ENZIMÁTICO
[0553] É descrito um método de detecção de proximidade que utiliza biotinilação enzimática para detectar alvos em uma amostra potencialmente usando plataformas de coloração automatizadas. Uma forma de realização divulgada compreende o contato da amostra com um primeiro conjugado compreendendo uma biotina ligase e uma primeira porção de ligação específica que se liga proximalmente ao primeiro alvo; colocar em contato a amostra com um segundo conjugado compreendendo um substrato de biotina ligase e uma segunda porção de ligação específica que se liga proximalmente ao segundo alvo; submeter a amostra a condições que permitam a biotinilação do substrato de biotina ligase pela biotina ligase quando o primeiro alvo e o segundo alvo têm uma disposição proximal; e detecção de biotinilação do substrato da biotina ligase. As condições que permitem a biotinilação do substrato incluem adição de biotina e ATP. O método também pode compreender colocar em contato a amostra com um conjugado de enzima- estreptavidina. A amplificação de sinal também pode ser usada. Veja WO 2014/139980, que é incorporado por referência em sua totalidade.
ENSAIO DE IMUNOABSORÇÃO ENZIMÁTICA (ELISA)
[0554] A realização de um ELISA envolve pelo menos um anticorpo com especificidade para um determinado antígeno. A amostra com uma quantidade desconhecida de antígeno é imobilizada em um suporte sólido (geralmente uma placa de microtitulação de poliestireno) tanto não especificamente (via adsorção na superfície) ou especificamente (via captura por outro anticorpo específico para o mesmo antígeno, em um “sanduíche” de ELISA. Depois do antígeno ser imobilizado, é adicionado o anticorpo de detecção, formando um complexo com o antígeno. O anticorpo de detecção pode ser covalentemente ligado a uma enzima, ou pode ele próprio ser detectado por um anticorpo secundário que está ligado a uma enzima através de bioconjugação. Entre cada etapa, a placa é tipicamente lavada com uma solução detergente suave para remover quaisquer proteínas ou anticorpos que não estejam especificamente ligados. Após a etapa final de lavagem, a placa é desenvolvida adicionando um substrato enzimático para produzir um sinal visível, que indica a quantidade de antígeno na amostra.
ENSAIOS DE LIGAÇÃO A LIGANTES
[0555] O método de análise de uma amostra conhecida ou suspeita de conter CTCs circulantes pode incluir uma etapa de imagem. Em um exemplo, a geração de imagens inclui a geração de imagens de imunofluorescência dos reagentes de identificação de CTC (por exemplo, detectando o marcador associado a cada anticorpo utilizado). Em outro exemplo, a geração de imagens inclui o uso de filtros de passagem de banda multiespectrais. A imunofluorescência pode emanar de anticorpos marcados direta ou indiretamente com fluoróforos ou a imunofluorescência pode resultar da excitação dos fluoróforos com luz visível espectralmente filtrada. Em uma forma de realização, a luz visível espectralmente filtrada inclui uma primeira faixa selecionada para excitar um primeiro fluoróforo e uma segunda faixa selecionada para excitar um segundo fluoróforo, em que a primeira faixa selecionada não excita significativamente o segundo fluoróforo e a segunda faixa selecionada não excita significativamente o primeiro fluoróforo. A geração de imagem pode incluir a aquisição de uma primeira imagem de imunofluorescência da amostra excitada pela primeira faixa selecionada e a aquisição de uma segunda imagem de imunofluorescência da amostra excitada pela segunda faixa selecionada (e aquisição de imagens adicionais de imunofluorescência para cada marcador se mais de dois reagentes de identificação de CTC foram utilizados) e localização ou identificação de CTCs pela localização ou visualização dos reagentes de identificação de CTC, que podem incluir comparação ou sobreposição da primeira imagem de imunofluorescência e da segunda imagem de imunofluorescência (e imagens adicionais, se assim for obtido). Por exemplo, a geração de imagens da primeira imagem de imunofluorescência pode identificar células CK+ e a segunda imagem de imunofluorescência pode identificar células CD45+, em que a comparação ou a sobreposição inclui a identificação de células que são CK+ e CD45-. Em outra forma de realização, a localização de CTCs pela localização dos reagentes de identificação de CTC inclui a análise algorítmica da primeira imagem de imunofluorescência e da segunda imagem de imunofluorescência (e imagens de imunofluorescência adicionais se obtidas) utilizando um computador. Em uma forma de realização, a análise por algoritmos inclui interrogar digitalmente as imagens para medir o tamanho das células, a localização dos compartimentos celulares dos marcadores e/ ou a intensidade da expressão dos marcadores. Veja WO 2013/101989, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
IMUNOPRECIPITAÇÃO (IP)
[0556] O ensaio de ligação do ligante de fase líquida de Imunoprecipitação (IP) é um método que é utilizado para purificar ou enriquecer uma proteína específica, ou um grupo de proteínas, utilizando um anticorpo de uma mistura complexa. O extrato de células ou amostras destruídas pode ser misturado com um anticorpo contra o antígeno de interesse, que produz o complexo antígeno-anticorpo. Quando a concentração de antígeno é baixa, a precipitação do complexo antígeno-anticorpo pode levar horas ou mesmo dias e torna-se difícil isolar a pequena quantidade de precipitado formado. O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou o Western blotting são duas formas diferentes do antígeno purificado (ou múltiplos antígenos) de poderem ser obtidos e analisados. Este método envolve a purificação de um antígeno através da ajuda de um anticorpo ligado em um suporte sólido (com pérolas), tal como resina de agarose. O complexo proteico imobilizado pode ser realizado em um única etapa ou sucessivamente. O IP também pode ser usado em conjunto com a marcação de radioisótopos biossintéticos. Usando esta combinação técnica, pode-se determinar se um antígeno específico é sintetizado por uma amostra ou por uma célula.
IMUNOPRECIPITAÇÃO DE CROMATINA (CHIP)
[0557] A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é um tipo de técnica experimental de imunoprecipitação usada para investigar a interação entre proteínas e DNA na célula. Tem como objetivo determinar se proteínas específicas estão associadas a regiões genômicas específicas, tais como fatores de transcrição em promotores ou outros sítios de ligação ao DNA, e possivelmente definir cistromes. A ChIP também visa determinar a localização específica no genoma que várias modificações de histonas estão associadas, indicando o alvo dos modificadores de histonas.
SEQUENCIAMENTO POR IMUNOPRECIPITAÇÃO DE CROMATINA (CHIP-SEQ)
[0558] O sequenciamento de ChIP, também conhecido como ChIP- seq, é um método usado para analisar as interações de proteínas com o DNA. O ChIP-seq combina a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) com sequenciamento de DNA massivamente paralelo para identificar os sítios de ligação das proteínas associadas ao DNA. Ele pode ser usado para mapear sítios de ligação global com precisão para qualquer proteína de interesse. O ChIP-seq é usado principalmente para determinar como os fatores de transcrição e outras proteínas associadas à cromatina influenciam os mecanismos que afetam o fenótipo. Determinar como as proteínas interagem com o DNA para regular a expressão gênica é essencial para entender completamente muitos processos biológicos e estados de doença. Esta informação epigenética é complementar à análise de genótipos e expressão. Atualmente, a tecnologia ChIP-seq é vista principalmente como uma alternativa ao ChIP-chip, que pode utilizar um arranjo de hibridização. Isso necessariamente introduz algum viés, pois um arranjo é restrito a um número fixo de sondas. O sequenciamento, ao contrário, é considerado menos tendencioso, embora o viés de sequenciamento de diferentes tecnologias de sequenciamento ainda não seja totalmente compreendido. Sítios específicos de DNA em interação física direta com fatores de transcrição e outras proteínas podem ser isolados por imunoprecipitação da cromatina. O ChIP produz um limiar de sítios de DNA alvo ligados a uma proteína de interesse in vivo. Análises de sequência maciçamente paralelas são usadas em conjunto com bancos de dados de sequências genômicas completas para analisar o padrão de interação de qualquer proteína com DNA, ou o padrão de quaiquer modificações de cromatina epigenética. Isto pode ser aplicado ao conjunto de proteínas e modificações capazes de ChIP, tais como fatores de transcrição, polimerases e maquinaria de transcrição, proteínas estruturais, modificações de proteínas e modificações de DNA. Como alternativa à dependência de anticorpos específicos, foram desenvolvidos métodos diferentes para encontrar o superconjunto de todas as regiões reguladoras ativas com depleção de nucleossomos ou rompimentos de nucleossomos no genoma, como DNase-Seq e FAIRE-Seq.
CHIP NO CHIP (CHIP-CHIP)
[0559] A ChIP-on-chip (também conhecida como ChIP-chip) é uma tecnologia que combina imunoprecipitação de cromatina (‘ChIP’) com microarranjo de DNA (“chip”). Como o ChIP regular, ChIP-on-chip é usado para investigar interações entre proteínas e DNA in vivo. Especificamente, permite a identificação do cistrome, soma dos sítios de ligação, para proteínas de ligação ao DNA em uma base genômica ampla. A análise do genoma completo pode ser realizada para determinar as localizações dos sítios de ligação para quase qualquer proteínas de interesse. Como o nome da técnica sugere, tais proteínas são geralmente aquelas que operam no contexto da cromatina. Os representantes mais proeminentes desta classe são os fatores de transcrição, proteínas relacionadas à replicação, como a Proteína Complexa de Reconhecimento de Origem (ORC), histonas, suas variantes e modificações de histonas. O objetivo do ChIP-on-chip é localizar os sítios de ligação de proteínas que possam ajudar a identificar elementos funcionais no genoma. Por exemplo, no caso de um fator de transcrição como uma proteína de interesse, pode-se determinar seus sítios de ligação do fator de transcrição em todo o genoma. Outras proteínas permitem a identificação de regiões promotoras, intensificadores, repressores e elementos silenciadores, isolantes, elementos de contorno e sequências que controlam a replicação do DNA. Se as histonas são assunto de interesse, acredita-se que a distribuição de modificações e suas localizações possam oferecer novos insights sobre os mecanismos de regulação. Um dos objetivos de longo prazo do ChIP-on-chip foi o de estabelecer um catálogo de organismos (selecionados) que lista todas as interações proteína-DNA sob várias condições fisiológicas. Esse conhecimento acabaria por ajudar na compreensão do mecanismo por trás da regulação do gene, proliferação celular e progressão da doença. Portanto, ChIP-on-chip oferece não apenas um enorme potencial para complementar nosso conhecimento sobre a orquestração do genoma no nível dos nucleotídeos, mas também sobre níveis mais altos de informação e regulação, como é propiciado pela pesquisa sobre epigenética.
RADIOIMUNOENSAIO
[0560] O radioimunoensaio (RIA) é uma técnica de ensaio in vitro muito sensível usada para medir concentrações de antígenos (por exemplo, níveis de hormônio no sangue) pelo uso de anticorpos. Como tal, pode ser visto como o inverso de um ensaio de ligação radioativa (radiobinding assay), que quantifica um anticorpo pelo uso de antígenos correspondentes. Classicamente, para realizar um radioimunoensaio, uma quantidade conhecida de um antígeno é tornada radioativa, frequentemente marcando-a com isótopos gama- radioativos de iodo, como o 125-I, ligado à tirosina. Este antígeno radiomarcado é então misturado com uma quantidade conhecida de anticorpo para esse antígeno e, como resultado, os dois ligam-se especificamente um ao outro. Então, uma amostra de soro de um paciente contendo uma quantidade desconhecida desse mesmo antígeno é adicionada. Isto faz com que o antígeno não marcado (ou “frio”) do soro compita com o antígeno radiomarcado (“quente”) para sítios de ligação do anticorpo. À medida que a concentração de antígeno “frio” é aumentada, mais se liga ao anticorpo, deslocando a variante marcada radioativamente e reduzindo a proporção de antígeno radiomarcado ligado a anticorpo ao antígeno radiomarcado livre. Os antígenos ligados são então separados dos não ligados e a radioatividade do antígeno ligado remanescente no sobrenadante é medida utilizando um contador gama.
[0561] Este método pode ser usado para qualquer molécula biológica em princípio e não está restrito a antígenos séricos, nem é necessário usar o método indireto de medir o antígeno livre ao invés de medir diretamente o antígeno capturado. Por exemplo, se for indesejável ou não possível marcar radioativamente o antígeno ou molécula alvo de interesse, pode ser feita uma RIA se estiverem disponíveis dois anticorpos diferentes que reconhecem o alvo e o alvo suficientemente é suficientemente grande (por exemplo, uma proteína) para apresentar múltiplos epítopos aos anticorpos. Um anticorpo seria radiomarcado como acima, enquanto o outro permaneceria inalterado. O RIA começaria com o anticorpo “frio” não marcado sendo permitido interagir e se ligar à molécula alvo em solução. De um modo preferido, este anticorpo não marcado é imobilizado de alguma forma, tal como acoplado a uma esfera de agarose, revestido em uma superfície, etc. Em seguida, o anticorpo radiomarcado “quente” é permitido interagir com o primeiro complexo de molécula alvo-anticorpo. Após extensa lavagem, mede-se a quantidade direta de anticorpo radioativo ligado e quantifica-se a quantidade de molécula alvo comparando-a com uma quantidade de referência analisada ao mesmo tempo. Este método é similar em princípio ao método ELISA sanduíche não radioativo.
POLARIZAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA
[0562] A polarização de fluorescência é sinônimo de anisotropia de fluorescência. Este método mede a mudança na velocidade de rotação de um ligante marcado fluorescente, uma vez que está ligado ao receptor. A luz polarizada é usada para excitar o ligante, e a quantidade de luz emitida é medida. A despolarização da luz emitida depende do tamanho do ligante presente. Se um ligante pequeno é usado, ele terá uma grande despolarização, que irá girar rapidamente a luz. Se o ligante utilizado for de tamanho maior, o a despolarização resultante será reduzida. Uma vantagem deste método é que ele pode incluir apenas uma etapa de rotulagem. No entanto, se este método for usado em baixas concentrações nanomolares, os resultados podem ser precisos.
TRANSFERÊNCIA DE ENERGIA DE RESSONÂNCIA DE FORSTER (FRET)
[0563] A Transferência de Energia de Ressonância de Forster (também referida como transferência de energia por ressonância de fluorescência) utiliza energia transferida entre o doador e o receptor de moléculas que estão muito próximas, por exemplo, um fluoróforo doador e receptor, ou um fluoróforo e um extintor. O FRET usa um ligante marcado com fluorescência como FP. A transferência de energia dentro do FRET começa excitando o doador. A interação dipolo-dipolo entre a molécula doadora ou receptora transfere a energia do doador para a molécula receptora. Interações entre ou dentre moléculas às quais o doador e os receptores podem ser monitorados, detectando os espectros de fluorescência associados à transferência de entrada ou a ausência dela. Por exemplo, se um ligante estiver ligado a um complexo receptor-anticorpo, então o receptor emitirá luz. A transferência de energia depende da distância entre o doador e o receptor, de tal forma que a presença ou ausência da transferência indica a distância molecular. Tipicamente, uma distância menor que 10 nm permite a transferência eficiente de energia entre o receptor e o doador, embora distâncias maiores ou menores possam ser usadas dependendo das moléculas envolvidas.
RESSONÂNCIA DE PLASMA DE SUPERFÍCIE (SPR)
[0564] A Ressonância de Plasma de Superfície (SPR) não requer rotulagem do ligante. Em vez disso, ela funciona medindo a mudança no ângulo em que a luz polarizada é refletida de uma superfície (índice refrativo). O ângulo está relacionado à mudança de massa ou camada de espessura, tal como a imobilização de um ligante alterando o ângulo de ressonância, o que aumenta a luz refletida. O dispositivo para o qual o SPR é derivado inclui um chip sensor, uma célula de fluxo, uma fonte de luz, um prisma e um detector de posição de ângulo fixo.
ENSAIOS DE LIGAÇÃO AO FILTRO
[0565] Ensaios de filtro são ensaios de ligação de ligante em fase sólida que usam filtros para medir a afinidade entre duas moléculas. Em um ensaio de ligação ao filtro, os filtros são usados para prender as membranas celulares sugando o meio através deles. Este método rápido ocorre a uma velocidade rápida, na qual a filtração e a recuperação podem ser alcançadas pela fração encontrada. Lavar os filtros com um tampão remove os ligantes residuais não ligados e quaisquer outros ligantes presentes que possam ser lavados dos sítios de ligação. Os complexos receptor-ligante presentes enquanto o filtro está sendo lavado não se dissociarão significativamente porque estarão completamente presos pelos filtros. As características do filtro são importantes para cada trabalho que está sendo feito. Um filtro mais espesso é útil para obter uma recuperação mais completa de pequenos pedaços de membrana, mas pode exigir um tempo de lavagem mais longo. Recomenda-se o pré-tratamento dos filtros para ajudar a prender peças de membrana carregadas negativamente. Embeber o filtro em uma solução que daria ao filtro uma carga superficial positiva atrairia os fragmentos de membrana carregados negativamente.
CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE
[0566] A cromatografia por afinidade é um método de separação de misturas bioquímicas com base em uma interação altamente específica, tal como a existente entre o antígeno e o anticorpo, a enzima e o substrato, ou o receptor e o ligante. A fase estacionária é tipicamente uma matriz de gel, geralmente de agarose; uma molécula de açúcar linear derivada de algas. Normalmente, o ponto de partida é um grupo heterogêneo indefinido de moléculas em solução, tal como um lisado celular, meio de cultura ou soro sanguíneo. A molécula de interesse terá uma propriedade bem conhecida e definida e pode ser explorada durante o processo de purificação por afinidade. O processo em si pode ser entendido como uma armadilha, com a molécula alvo ficando presa em uma fase ou meio sólido ou estacionário. As outras moléculas na fase móvel não ficarão presas, pois não possuem essa propriedade. A fase estacionária pode então ser removida da mistura, lavada e a molécula alvo liberada do aprisionamento em um processo conhecido como eluição. Possivelmente, o uso mais comum de cromatografia por afinidade é para a purificação de proteínas recombinantes.
[0567] Imunoafinidade: Outro uso para o procedimento é a purificação por afinidade de anticorpos do soro sanguíneo. Se sabe-se que o soro contém anticorpos contra um antígeno específico (por exemplo, se o soro provém de um organismo imunizado contra o antígeno em questão), então pode ser utilizado para a purificação por afinidade desse antígeno. Isto também é conhecido como Cromatografia por Imunoafinidade. Por exemplo, se um organismo for imunizado contra uma proteína de fusão com GST, irá produzir anticorpos contra a proteína de fusão e, possivelmente, também anticorpos contra a etiqueta GST. A proteína pode então ser acoplada covalentemente a um suporte sólido, tal como agarose e utilizado como um ligante de afinidade em purificações do anticorpo do soro imune. Para exaustividade, a proteína GST e a proteína de fusão GST podem cada uma ser acoplada separadamente. O soro é inicialmente permitido ligar-se à matriz de afinidade de GST. Isto irá remover os anticorpos contra a parte GST da proteína de fusão. O soro é então separado do suporte sólido e deixado ligar-se à matriz proteica de fusão GST. Isso permite que qualquer anticorpo que reconheça o antígeno seja capturado no suporte sólido. A eluição dos anticorpos de interesse é mais frequentemente conseguida usando um tampão de pH baixo tal como glicina a pH 2,8. O eluato é recolhido em um tampão tris ou fosfato neutro, para neutralizar o tampão de eluição de pH baixo e parar qualquer degradação da atividade do anticorpo. Este é um bom exemplo, de como a purificação por afinidade é utilizada para purificar a proteína de fusão GST inicial, para remover os anticorpos anti-GST indesejáveis do soro e purificar o anticorpo alvo. Uma estratégia simplificada é frequentemente empregada para purificar anticorpos gerados contra antígenos peptídicos. Quando os antígenos peptídicos são produzidos sinteticamente, um resíduo de cisteina terminal é adicionado no N ou C terminal do peptídeo. Este resíduo de cisteina contém um grupo funcional sulfidrila que permite que o peptídeo seja facilmente conjugado a uma proteína transportadora (por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH)). O mesmo peptídeo contendo cisteina é também imobilizado em uma resina de agarose através do resíduo de cisteina e é depois utilizado para purificar o anticorpo. A maioria dos anticorpos monoclonais foi purificada utilizando cromatografia por afinidade com base na Proteína A ou Proteína G específica de imunoglobulina, derivada de bactérias.
IMUNOCITOQUÍMICA (ICC)
[0568] A imuno-citoquímica (ICC) é uma técnica laboratorial comum que é usada para visualizar anatômicamente a localização de uma proteína ou antígeno específico nas células, utilizando um anticorpo primário específico que se liga a ela. O anticorpo primário permite a visualização da proteína sob um microscópio de fluorescência quando é ligado por um anticorpo secundário que possui um fluoróforo conjugado. A ICC permite que os pesquisadores avaliem se as células de uma determinada amostra expressam ou não o antígeno em questão. Nos casos em que um sinal imunopositivo é encontrado, o ICC também permite que os pesquisadores determinem quais compartimentos subcelulares estão expressando o antígeno. Existem muitos métodos para obter detecção imunológica em amostras, incluindo aquelas ligadas diretamente a anticorpos primários ou anti-soros. Um método direto envolve o uso de uma etiqueta (tag) detectável (por exemplo, molécula fluorescente, partículas de ouro, etc.) diretamente no anticorpo que é então permitido se ligar ao antígeno (por exemplo, proteína) em uma célula. Alternativamente, existem muitos métodos indiretos. Em um desses métodos, o antígeno é ligado por um anticorpo primário que é então amplificado pela utilização de um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário. Em seguida, um reagente terciário contendo uma porção enzimática é aplicado e liga-se ao anticorpo secundário. Quando o reagente quaternário, ou substrato, é aplicado, a extremidade enzimática do reagente terciário converte o substrato em um produto de reação de pigmento, que produz uma cor (muitas cores são possíveis; marrom, preto, vermelho, etc.) na mesma localização em que o anticorpo primário original reconheceu o antígeno de interesse. Alguns exemplos de substratos usados (também conhecidos como cromógenos) são AEC (3- Amino-9-EtilCarbazol), ou DAB (3,3’-Diaminobenzidina). A utilização de um destes reagentes após exposição à enzima necessária (por exemplo, peroxidase de rábano conjugada com um reagente de anticorpo) produz um produto de imunorreação positivo. A visualização imuno-citoquímica de antígenos específicos de interesse pode ser usada quando uma coloração menos específica, como H&E (Hematoxilina e Eosina), não puder ser usada para o diagnóstico ou para fornecer informações preditivas adicionais sobre o tratamento (em alguns tipos de câncer, por exemplo). Alternativamente, o anticorpo secundário pode ser covalentemente ligado a um fluoróforo (FITC e Rodamina são os mais comuns) que é detectado em um microscópio de fluorescência ou confocal. A localização da fluorescência irá variar de acordo com a molécula alvo, externa para proteínas de membrana e interna para proteínas citoplasmáticas. Desta forma, a imunofluorescência é uma técnica poderosa quando combinada com microscopia confocal para estudar a localização de proteínas e processos dinâmicos (exocitose, endocitose, etc.).
ENSAIOS ELETROFORÉTICOS
[0569] Ensaios eletroforéticos exemplificativos que podem ser utilizados incluem eletroforese de ácido nucleico, PAGE, métodos de gel nativo, eletroforese de fluxo livre, IEF, EMSA, análise de RFLP e zimografia, como são conhecidos na técnica e como descrito abaixo,
ELETROFORESE DE ÁCIDO NUCLEICO
[0570] Eletroforese de ácido nucleico é uma técnica analítica usada para separar fragmentos de DNA ou RNA por tamanho e reatividade. Moléculas de ácido nucléico que devem ser analisadas são ajustadas sobre um meio viscoso, o gel, onde um campo elétrico induz os ácidos nucléicos a migrar em direção ao ânodo, devido à carga negativa líquida do esqueleto de açúcar-fosfato da cadeia de ácido nucléico. A separação destes fragmentos é conseguida explorando as mobilidades com as quais moléculas de tamanhos diferentes são capazes de passar através do gel. Moléculas mais longas migram mais lentamente porque experimentam mais resistência dentro do gel. Devido ao tamanho da molécula afetar sua mobilidade, fragmentos menores acabam mais próximos do ânodo do que as mais longas em um determinado período. Após algum tempo, a tensão é removida e o gradiente de fragmentação é analisado. Para separações maiores entre fragmentos de tamanho similar, a tensão ou o tempo de operação podem ser aumentados. As operações estendidas, com um gel de baixa voltagem, produzem a resolução mais precisa. A tensão não é, no entanto, o único fator na determinação da eletroforese de ácidos nucleicos.
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
[0571] Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), descreve uma técnica amplamente utilizada em bioquímica, forense, genética, biologia molecular e biotecnologia para separar macromoléculas biológicas, geralmente proteínas ou ácidos nucléicos, de acordo com sua mobilidade eletroforética. A mobilidade é uma função do comprimento, conformação e carga da molécula.
[0572] SDS-PAGE: dodecil sulfato de sódio (SDS) é um detergente aniônico aplicado a amostras de proteína para linearizar proteínas e para transmitir uma carga negativa a proteínas linearizadas. Este procedimento é chamado de SDS-PAGE. Na maioria das proteínas, a ligação do SDS à cadeia polipeptídica confere uma distribuição uniforme da carga por unidade de massa, resultando assim em um fraccionamento por tamanho aproximado durante a eletroforese. Proteínas que têm um maior conteúdo hidrofóbico, por exemplo, muitas proteínas de membrana, e aquelas que interagem com surfactantes em seu ambiente nativo, são intrinsecamente mais difíceis de tratar com precisão usando este método, devido à maior variabilidade na proporção de SDS ligado.
[0573] Eletroforese em gel bidimensional: a eletroforese em 2-D começa com a eletroforese 1-D, mas separa as moléculas por uma segunda propriedade em uma direção de 90 graus em relação à primeira. Na eletroforese 1-D, as proteínas (ou outras moléculas) são separadas em uma dimensão, de modo que todas as proteínas/ moléculas se localizem ao longo de uma pista, mas que as moléculas se espalhem através de um gel 2-D. Como é improvável que duas moléculas sejam semelhantes em duas propriedades distintas, as moléculas são mais efetivamente separadas em eletroforese bidimensional do que em eletroforese 1-D. As duas dimensões em que as proteínas são separadas usando essa técnica podem ser o ponto isoelétrico, a massa do complexo proteico no estado nativo e a massa proteica. O resultado disso é um gel com proteínas espalhadas em sua superfície. Estas proteínas podem então ser detectadas por uma variedade de meios, mas as manchas mais comumente utilizadas são prata e coloração azul brilhante de Coomassie.
MÉTODOS DE GEL NATIVO
[0574] Os géis nativos, também conhecidos como géis não- desnaturantes, analisam as proteínas que ainda estão em seu estado dobrado. Assim, a mobilidade eletroforética depende não apenas da razão carga/ massa, mas também da forma física e tamanho da proteína. Abaixo estão exemplos de diferentes formas de métodos de gel nativos.
[0575] Eletroforese em gel nativo claro: CN-PAGE (comumente referido como PAGE nativo) separa proteínas ácidas solúveis em água e de membrana em um gel de gradiente de poliacrilamida. Não usa corante carregado, então a mobilidade eletroforética de proteínas em CN-PAGE (em contraste com a técnica de troca de carga BN-PAGE) está relacionada à carga intrínseca das proteínas. A distância de migração depende da carga de proteína, seu tamanho e tamanho do poro do gel. Em muitos casos, este método tem resolução mais baixa do que o BN-PAGE, mas o CN-PAGE oferece vantagens sempre que o corante Coomassie interferir com outras técnicas analíticas, por exemplo, foi descrito como uma técnica de separação microescala muito eficiente para análises FRET. Também o CN-PAGE é mais suave que o BN- PAGE, portanto, pode reter conjuntos supramoleculares lábeis de complexos proteicos de membrana que estão dissociados sob as condições de BN-PAGE.
[0576] PAGE nativa azul: BN-PAGE é uma técnica de PAGE nativa, onde o corante Coomassie Brilliant Blue fornece as cargas necessárias aos complexos de proteínas para a separação eletroforética. A desvantagem do Coomassie é que, ao se ligar às proteínas, pode agir como um detergente, fazendo com que os complexos se dissociem. Outra desvantagem é a potencial inibição da quimioluminescência (por exemplo, nos ensaios subsequentes de detecção ou atividade de western blot) ou fluorescência de proteínas com grupos prostéticos (por exemplo, heme ou clorofila) ou marcadas com corantes fluorescentes.
[0577] Preparação quantitativa em gel de poliacrilamida contínuo nativo: QPNC-PAGE, ou eletroforese de preparação quantitativa em gel de poliacrilamida contínuo nativo, é uma técnica de alta resolução aplicado em bioquímica e química bioinorgânica para separar as proteínas por ponto isoelétrico. Esta variante padronizada de eletroforese em gel nativo é usada por biólogos para isolar metaloproteínas ativas ou nativas em amostras biológicas e para resolver proteínas contendo cofatores metálicos adequadamente ou impropriamente dobradas ou isoformas de proteínas em misturas complexas de proteínas. Como plataforma ômica para abordagens biomédicas, o QPNC-PAGE contribui para o desenvolvimento de medicamentos à base de metais para doenças de desdobramento de proteínas e, como tal, para a economia de base biológica.
ELETROFORESE DE FLUXO LIVRE
[0578] A eletroforese de fluxo livre (FFE), também conhecida como eletroforese livre de transportador, é uma técnica de separação eletroforética contínua e à base de líquido. É tipicamente usado para separações quantitativas e semiquantitativas de proteínas, peptídeos, organelas, células, origami de DNA e partículas. A vantagem da FFE é que a separação é conduzida de uma maneira rápida e suave à base de líquido, sem qualquer interação de uma matriz sólida, como a poliacrilamida em eletroforese em gel. Isso garante uma taxa de recuperação muito alta, porque nenhum analito pode se perder. As separações de FFE são contínuas, o que garante um alto rendimento de analitos para aplicações preparativas. Além disso, as separações podem ser conduzidas sob condições nativas ou desnaturantes. Uma película líquida uniforme e laminar é conduzida entre duas placas, dividida em tubos de fracionamento paralelos e coletada em placas de microtitulação. Um campo elétrico de alta tensão é aplicado perpendicularmente ao fluxo laminar. Os analitos no fluxo laminar são separados por densidade de carga e ponto isoelétrico.
FOCAGEM ISOELÉTRICA
[0579] A focagem isoelétrica (IEF), também conhecida como eletrofocagem, é uma técnica para separar diferentes moléculas por diferenças em seu ponto isoelétrico (pI). A IEF envolve a adição de uma solução anfólita em géis de gradiente de pH imobilizado (IPG). Os IPGs são a matriz de gel de acrilamida co-polimerizada com o gradiente de pH, que resulta em gradientes completamente estáveis, exceto os valores de pH mais alcalinos (> 12). O gradiente de pH imobilizado é obtido pela mudança contínua na proporção de imobilinas. Uma imobilina é um ácido ou base fraca, definido pelo seu valor de pK. Uma proteína que está em uma região de pH abaixo de seu ponto isoelétrico (pI) será carregada positivamente e assim migrará em direção ao cátodo (eletrodo carregado negativamente). À medida que migra através de um gradiente de aumento de pH, no entanto, a carga global da proteína diminui até que a proteína atinja a região de pH correspondente ao seu pI. Neste ponto, ela não tem carga líquida e, assim, a migração cessa (já que não há atração elétrica em direção a nenhum eletrodo). Como resultado, as proteínas tornam-se focadas em bandas estacionárias afiadas com cada proteína posicionada em um ponto no gradiente de pH correspondente ao seu pI. A técnica é capaz de resolução extremamente alta com proteínas diferindo por uma única carga sendo fracionada em bandas separadas. As moléculas a serem focalizadas são distribuídas por um meio que possui um gradiente de pH (geralmente criado por anfólitos alifáticos). Uma corrente elétrica é passada através do meio, criando um ânodo “positivo” e uma extremidade do cátodo “negativa”. Moléculas negativamente carregadas migram através do gradiente de pH no meio em direção à extremidade “positiva”, enquanto as moléculas carregadas positivamente se movem em direção à extremidade “negativa”. Quando uma partícula se move em direção ao polo oposto de sua carga, ela se move através da mudança do gradiente de pH até atingir um ponto no qual o pH do ponto isoelétrico das moléculas é atingido. Neste ponto, a molécula não tem mais uma carga elétrica líquida (devido à protonação ou desprotonação dos grupos funcionais associados) e, como tal, não avançará mais dentro do gel. O gradiente é estabelecido antes da adição das partículas de interesse submetendo primeiro uma solução de pequenas moléculas, tais como polianfólitos, com valores de pI variáveis a eletroforese.
IMUNOELETROFORESE
[0580] A imunoeletroforese é um nome geral para vários métodos bioquímicos para separação e caracterização de proteínas baseadas em eletroforese e reação com anticorpos. Variantes de imunoeletroforese tipicamente utilizam imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, reagindo com as proteínas a serem separadas ou caracterizadas. Agarose como lajes em gel a 1% com cerca de 1 mm de espessura tamponada a pH elevado (cerca de 8,6) é tradicionalmente preferida para a eletroforese assim como a reação com anticorpos. A agarose foi escolhida como matriz de gel porque possui poros grandes, permitindo a passagem livre e a separação de proteínas, mas fornece uma âncora para os imunoprecipitados de proteínas e anticorpos específicos. O pH alto foi escolhido porque os anticorpos estão praticamente imóveis em pH alto. O equipamento de eletroforese com uma placa de resfriamento horizontal era normalmente recomendado para a eletroforese. Os imunoprecipitados podem ser observados no gel de agarose úmido, mas são corados com manchas de proteína como Coomassie Brilliant Blue no gel seco. Em contraste com a eletroforese de gel SDS, a eletroforese em agarose permite condições nativas, preservando a estrutura e as atividades nativas das proteínas sob investigação, portanto a imunoeletroforese permite a caracterização de atividades enzimáticas e ligação de ligantes etc. além da separação eletroforética.
[0581] A imunoeletroforese por afinidade é baseada em mudanças no padrão eletroforético de proteínas através de interação específica ou formação de complexos com outras macromoléculas ou ligantes. A imunoeletroforese por afinidade tem sido usada para estimar constantes de ligação, como por exemplo com lectinas ou para caracterização de proteínas com características específicas, como conteúdo de glicano ou ligação de ligante. Algumas variantes de imunoeletroforese por afinidade são semelhantes à cromatografia por afinidade pelo uso de ligantes imobilizados. A estrutura aberta do imunoprecipitado no gel de agarose permitirá a ligação adicional de anticorpos marcados radioativamente para revelar proteínas específicas. Esta variação tem sido utilizada para identificação de alergênicos através da reação com IgE.
ENSAIO DE DESLOCAMENTO DE MOBILIDADE ELETROFORÉTICA (EMSA)
[0582] Um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) ou eletroforese de mobilidade trocada, também referido como ensaio de deslocamento de gel, ensaio de deslocamento de mobilidade em gel, ensaio de deslocamento de banda ou ensaio de retardamento em gel, é uma técnica de eletroforese por afinidade comum usada para estudar interações entre proteína- DNA ou proteína-RNA. Este procedimento pode determinar se a proteína ou mistura de proteínas é capaz de se ligar a uma dada sequência de DNA ou RNA, e pode, às vezes, indicar se mais de uma molécula de proteína está envolvida no complexo de ligação. Os ensaios de deslocamento em gel são frequentemente realizados in vitro concomitantemente com a impressão (footprinting) de DNAase, extensão de iniciador e experimentos com promotor- sonda quando se estuda iniciação de transcrição, replicação de DNA, reparação de DNA ou processamento de RNA e maturação. Embora os precursores possam ser encontrados na literatura anterior, a maioria dos ensaios atuais é baseada nos métodos descritos por GRNAer e Revzin e Fried e Crothers.
ANÁLISE DE POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO
[0583] Análise RFLP. O DNA é coletado das células, tal como uma amostra de sangue, e cortado em pequenos pedaços usando uma enzima de restrição. Isso gera milhares de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes, como consequência de variações entre sequências de DNA de diferentes indivíduos. Os fragmentos são então separados com base no tamanho usando eletroforese em gel. Os fragmentos separados são então transferidos para um filtro de nitrocelulose ou nylon; este procedimento é chamado de Southern Blot. Os fragmentos de DNA dentro do blot são permanentemente fixados ao filtro, e as fitas de DNA são desnaturadas. São então adicionadas moléculas sonda radiomarcadas que são complementares às sequências no genoma que contêm sequências repetidas. Estas sequências repetidas tendem a variar em comprimento entre indivíduos diferentes e são chamadas sequências repetidas em tandem de número variável ou VNTRs. As moléculas sonda hibridizam com fragmentos de DNA contendo as sequências repetidas e o excesso de moléculas de sonda é lavado. O blot é então exposto a um filme de raios X. Fragmentos de DNA que se ligaram às moléculas da sonda aparecem como bandas escuras no filme.
ZIMOGRAFIA
[0584] A zimografia é uma técnica eletroforética para a detecção de enzimas hidrolíticas, baseada no repertório de substrato da enzima. Na zimografia em gel, as amostras são preparadas em um tampão de carga padrão, não redutor, para SDS-PAGE. Nenhum agente redutor ou fervura é necessário, uma vez que estes interfeririam no redobramento da enzima. Um substrato adequado (geralmente gelatina ou caseina) é incorporado no gel de resolução durante a preparação do gel de acrilamida. Após eletroforese, o SDS é removido do gel (ou zimograma) por incubação em Triton X-100 não tamponado, seguido de incubação em um tampão de digestão apropriado, durante um período de tempo a 37 °C. O zimograma é subsequentemente corado (habitualmente com Amido Black ou Coomassie Brilliant Blue), e as áreas de digestão aparecem como bandas claras contra um fundo manchado de escuro onde o substrato foi degradado pela enzima.
PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA
[0585] Exemplos de técnicas de perfil de expressão genica que podem ser utilizadas incluem perfil de DNA com PCR, microarranjos de DNA, SAGE, PCR em tempo real, PCR de exibição diferencial e RNA-seq, como descrito adicionalmente nas seções seguintes e como conhecido na técnica.
PERFIL DE DNA COM PCR
[0586] O processo de reação em cadeia da polimerase (PCR) imita o processo biológico de replicação do DNA, mas limita-se a sequências de DNA específicas de interesse. Com a divulgação da técnica de PCR, o perfil de DNA deu grandes passos adiante, tanto no poder discriminatório quanto na capacidade de recuperar informações de amostras iniciais muito pequenas (ou degradadas). A PCR amplifica grandemente as quantidades de uma região específica do DNA. No processo de PCR, a amostra de DNA é desnaturada nas cadeias polinucleotídicas individuais separadas através de aquecimento. Utilizam-se dois iniciadores de DNA oligonucleotídicos para hibridar para dois sítios vizinhos correspondentes em cadeias de DNA opostas de tal modo que a forma em que a extensão enzimática normal do terminal ativo de cada iniciador (isto é, a extremidade 3’) conduz em direção ao outro iniciador. A PCR utiliza enzimas de replicação que são tolerantes a altas temperaturas, como a Taq polimerase termoestável. Dessa maneira, duas novas cópias da sequência de interesse são geradas. Desnaturação, hibridação e extensão repetidas desta maneira produzem um número exponencialmente crescente de cópias do DNA de interesse. Instrumentos que realizam ciclos térmicos estão agora disponíveis em fontes comerciais. Este processo pode produzir uma amplificação de milhões de vezes ou mais da região desejada em 2 horas ou menos.
MICROARRANJO DE DNA
[0587] O principal princípio por trás do microarranjo é a hibridização entre duas fitas de DNA, a propriedade de sequências de ácido nucleico complementares para emparelhar especificamente umas com as outras, formando ligações de hidrogênio entre pares de bases de nucleotídeos complementares. Um elevado número de pares de bases complementares na sequência de nucleotídeos significa uma ligação não covalente mais apertada entre as duas fitas. Após a lavagem de sequências de ligação não específicas, apenas as cadeias fortemente emparelhadas permanecerão hibridizadas. Sequências alvo marcadas com fluorescência que se ligam a uma sequência de sonda geram um sinal que depende das condições de hibridação (tal como temperatura) e lavagem após hibridação. A força total do sinal, a partir de uma mancha (característica), depende da quantidade de amostra alvo se ligando às sondas presentes naquela mancha. Os microarranjos usam quantificação relativa em que a intensidade de uma característica é comparada à intensidade da mesma característica sob uma condição diferente, e a identidade da característica é conhecida por sua posição.
ANÁLISE SERIAL DA EXPRESSÃO GÊNICA (SAGE)
[0588] A análise serial da expressão gênica (SAGE) é uma técnica usada por biólogos moleculares para produzir um instantâneo da população de RNA mensageiro em uma amostra de interesse na forma de pequenas etiquetas (tags) que correspondem a fragmentos desses transcritos. Resumidamente, os experimentos SAGE procedem da seguinte forma:
[0589] O RNAm de uma amostra de entrada (por exemplo, um tumor) é isolado e uma transcriptase reversa e iniciadores biotinilados são usados para sintetizar o cDNA do RNAm.
[0590] O cDNA liga-se a esferas de estreptavidina através da interacão com a biotina ligada aos iniciadores e é então clivado utilizando uma endonuclease de restrição chamada enzima de ancoragem (AE). A localização do sítio de clivagem e assim o comprimento do cDNA restante ligado à pérola variará para cada cDNA individual (RNAm).
[0591] O cDNA clivado a jusante do sítio de clivagem é então descartado, e os fragmentos de cDNA imóveis restantes a montante dos locais de clivagem são divididos ao meio e expostos a um dos dois oligonucleotídeos adaptadores (A ou B) contendo vários componentes na seguinte ordem a montante do local de ligação: 1) Extremidades pegajosas com o local de corte AE para permitir ligação ao cDNA clivado; 2) Um local de reconhecimento para uma endonuclease de restrição conhecida como enzima de marcação (TE), que corta cerca de 15 nucleotídeos a jusante do seu local de reconhecimento (dentro da sequência original de cDNA/ RNAm); 3) Uma sequência de iniciadores curta única para os adaptadores A ou B, que será utilizada mais tarde para amplificação adicional via PCR.
[0592] Após a ligação do adaptador, o cDNA é clivado usando TE para removê-los das contas, deixando apenas uma “etiqueta” curta de cerca de 11 nucleotídeos do cDNA original (15 nucleotídeos menos o 4 correspondentes ao sítio de reconhecimento da AE).
[0593] As etiquetas de cDNA clivadas são então reparadas com polimerase de DNA para produzir fragmentos de cDNA de extremidade romba.
[0594] Estes fragmentos de etiqueta de cDNA (com iniciadores de adaptador e sítios de reconhecimento de AE e TE ligados) são ligados, intercalando as duas sequências etiquetadas e flanqueando os adaptadores A e B em cada extremidade. Estas novas construções, chamadas dietiquetas (ditags), são então amplificadas por PCR utilizando iniciadores específicos de âncora A e B.
[0595] As dietiquetas são então clivadas utilizando a AE original, e deixadas ligar em conjunto com outras dietiquetas, as quais serão ligadas para criar um concatenador de cDNA sendo cada dietiquetas separada pelo sítio de reconhecimento AE.
[0596] Estes concatâmeros são então transformados em bactérias para amplificação através da replicação bacteriana.
[0597] Os concatâmeros de cDNA podem então ser isolados e sequenciados usando sequenciadores de DNA modernos de alto rendimento, e estas sequências podem ser analisadas com programas de computador que quantificam a recorrência de etiquetas individuais.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM TEMPO REAL
[0598] Uma reação em cadeia de polimerase em tempo real é uma técnica de laboratório de biologia molecular baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR). Ele monitora a amplificação de uma molécula de DNA alvo durante a PCR, ou seja, em tempo real, e não no seu final, como na PCR convencional. A PCR em tempo real pode ser utilizada quantitativamente (PCR quantitativo em tempo real), semi-quantitativamente, ou seja, acima/ abaixo de uma determinada quantidade de moléculas de DNA (PCR semi-quantitativo em tempo real) ou qualitativamente (PCR qualitativo em tempo real). Dois métodos comuns para a detecção de produtos de PCR em PCR em tempo real são: (1) corantes fluorescentes não específicos que se intercalam com qualquer DNA de fita dupla e (2) sondas de DNA específicas para sequência consistindo em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente que permite detectar apenas após hibridação da sonda com a sua sequência complementar.A PCR em tempo real é realizada em um termociclador com a capacidade de iluminar cada amostra com um feixe de luz de pelo menos um comprimento de onda especificado e detectar a fluorescência emitida pelo fluoróforo excitado. O termociclador também é capaz de aquecer e resfriar amostras rapidamente, tirando vantagem das propriedades físico-químicas dos ácidos nucléicos e da DNA polimerase. O processo de PCR geralmente consiste em uma série de mudanças de temperatura que são repetidas 25 a 50 vezes. Esses ciclos normalmente consistem em três etapas: a primeira, em torno de 95 °C, permite a separação da dupla fita; o segundo, a uma temperatura de cerca de 50 a 60 °C, que permite a ligação dos iniciadores com o molde (template) de DNA; o terceiro, entre 68 a 72 °C, facilita a polimerização realizada pela DNA polimerase. Devido ao pequeno tamanho dos fragmentos, a última etapa é geralmente omitida neste tipo de PCR, uma vez que a enzima é capaz de aumentar o seu número durante a mudança entre a fase de alinhamento e a fase de desnaturação. Além disso, em quatro etapas de PCR, a fluorescência é medida durante a fase de temperatura curta com duração de apenas alguns segundos em cada ciclo, com uma temperatura de, por exemplo, 80 °C, para reduzir o sinal causado pela presença de dímeros de iniciadores quando um corante não específico é usado. As temperaturas e os tempos utilizados para cada ciclo dependem de uma ampla variedade de parâmetros, tais como: a enzima usada para sintetizar o DNA, a concentração de íons bivalentes e desoxirribonucleotídeos (dNTPs) na reação e a temperatura de ligação dos iniciadores.
PCR DE EXIBIÇÃO DIFERENCIAL
[0599] A exibição diferencial (também conhecida como DDRT-PCR ou DD-PCR) é a técnica na qual um pesquisador pode comparar e identificar mudanças na expressão gênica no nível de RNAm entre qualquer par de amostras de células eucarióticas. O ensaio pode ser estendido para mais de um par, se necessário. As amostras pareadas terão diferenças morfológicas, genéticas ou outras diferenças experimentais para as quais o pesquisador deseja estudar os padrões de expressão gênica, na esperança de elucidar a causa raiz da diferença particular ou genes específicos que são afetados pelo experimento. O conceito de exibição diferencial é usar um número limitado de iniciadores arbitrários curtos em combinação com os iniciadores oligo-dT ancorados para amplificar e visualizar sistematicamente a maior parte do RNAm em uma célula. Após sua divulgação no início dos anos 90, a exibição diferencial tornou-se uma técnica comum para identificar genes diferencialmente expressos no nível de RNAm. Diferentes protocolos simplificados de DD-PCR foram propostos, incluindo o processo DD fluorescente, bem como a marcação radioativa, que oferece alta precisão e leitura.
SEQUENCIAMENTO DE RNA (RNA-SEQ)
[0600] O sequenciamento de RNA (RNA-seq), também chamado de sequenciamento shotgun de transcriptoma total (WTSS), é uma tecnologia que usa as capacidades do sequenciamento de próxima geração para revelar um instante (snapshot) de presença de RNA e quantidade de um genoma em um dado momento de tempo.
[0601] Biblioteca de RNA ‘Poly (A)’ RNA-seq: A criação de uma biblioteca de sequências pode mudar de plataforma para plataforma em sequências de alto rendimento, onde cada uma possui vários kits projetados para construir diferentes tipos de bibliotecas e adaptar as sequências resultantes aos requisitos específicos de seus instrumentos. No entanto, devido à natureza do modelo que está sendo analisado, há semelhanças entre cada tecnologia. Frequentemente, na análise de RNAm, a cauda 3’ poliadenilada (poli (A)) é direcionada para assegurar que o RNA codificador é separado do RNA não codificante. Isto pode ser realizado simplesmente com oligos poli (T) covalentemente ligados a uma dada taxa de substrato. Atualmente muitos estudos utilizam esferas magnéticas para esta etapa. Estudos que incluíram porções do transcriptoma fora de RNAs poli(A) mostraram que quando se utiliza esferas magnéticas poli(T), o RNA de fluxo contínuo (RNA não poli(A)) pode produzir importantes descobertas de genes de RNA não codificantes que teriam passado desapercebido. Além disso, uma vez que o RNA ribossômico representa mais de 90% do RNA dentro de uma determinada célula, estudos mostraram que sua remoção via hibridização com sonda aumenta a capacidade de recuperar dados da porção remanescente do transcriptoma. A próxima etapa é a transcrição reversa. Devido à polarização 5’ da transcrição reversa aleatoriamente iniciada, bem como às estruturas secundárias que influenciam os sítios de ligação dos iniciadores, a hidrólise do RNA em 200-300 nucleotídeos antes da transcrição reversa reduz ambos os problemas simultaneamente. No entanto, existem trocas com este método onde, embora o corpo geral das transcrições seja eficientemente convertidas em DNA, as extremidades 5’ e 3’ são menos. Dependendo do objetivo do estudo, os pesquisadores podem optar por aplicar ou ignorar essa etapa.
[0602] RNA pequeno/ sequenciamento de RNA não codificador: Ao sequenciar RNA diferente de RNAm, a preparação da biblioteca é modificada. O RNA celular é selecionado com base no intervalo de tamanho desejado. Para pequenos alvos de RNA, como o miRNA, o RNA é isolado através da seleção de tamanho. Isto pode ser realizado com um gel de exclusão de tamanho, através de esferas magnéticas de seleção de tamanho, ou com um kit comercialmente desenvolvido. Uma vez isolados, os ligantes são adicionados às extremidades 3’ e 5’ e depois purificados. A etapa final é a geração de cDNA por meio de transcrição reversa.
[0603] Sequenciamento Direto de RNA: Como a conversão de RNA em cDNA usando transcriptase reversa mostrou introduzir vieses e artefatos que podem interferir na caracterização e quantificação adequada de transcritos, a tecnologia de Sequenciamento Direto de RNA de molécula única (DRSTM) estava sendo desenvolvida pela Helicos (falido). O DRSTM sequencia as moléculas de RNA diretamente de uma maneira massivamente paralela sem a conversão de RNA em cDNA ou outras manipulações de amostra de polarização, como a ligação e a amplificação. Uma vez sintetizado o cDNA, ele pode ser ainda mais fragmentado para alcançar o comprimento de fragmento desejado do sistema de sequenciamento.
ESPECTROMETRIA DE MASSA (PROTEÍNA)
[0604] Espectrometria de massa de proteína refere-se à aplicação de espectrometria de massa para o estudo de proteínas. A espectrometria de massa é um importante método emergente para a caracterização de proteínas. Os dois métodos principais para a ionização de proteínas inteiras são a ionização por eletropulverização (ESI) e a dessorção/ ionização por laser assistida por matriz (MALDI). De acordo com o desempenho e a faixa de massa dos espectrômetros de massa disponíveis, duas abordagens são usadas para caracterizar proteínas. Na primeira, as proteínas intactas são ionizadas por qualquer uma das duas técnicas descritas acima e, em seguida, introduzidas em um analisador de massa. Esta abordagem é referida como estratégia “top-down” de análise de proteínas. Na segunda, as proteínas são enzimaticamente digeridas em peptídeos menores usando uma proteínase como a tripsina. Subsequentemente, estes peptídeos são introduzidos no espectrômetro de massa e identificados por impressão digital de massa de peptídeo ou espectrometria de massa em série. Assim, esta última abordagem (também chamada de proteômica “bottom-up”) usa identificação no nível do peptídeo para inferir a existência de proteínas. A análise da massa proteica total é conduzida principalmente usando MS no tempo de voo (TOF) ou ressonância ciclotrônica de íon da transformada de Fourier (FT-ICR). Esses dois tipos de instrumentos são preferíveis aqui por causa de sua ampla faixa de massa e, no caso do FT- ICR, sua alta precisão de massa. A análise de massa de peptídeos proteolíticos é um método muito mais popular de caracterização de proteínas, já que projetos de instrumentos mais baratos podem ser usados para caracterização. Além disso, a preparação da amostra é mais fácil uma vez que proteínas inteiras tenham sido digeridas em fragmentos peptídicos menores. O instrumento mais utilizado para a análise de massa peptídica são os instrumentos de tempo de voo MALDI, pois permitem a aquisição de impressões digitais de massa peptídica (PMFs) a um ritmo elevado (1 PMF pode ser analisado em aproximadamente 10 segundos). O quadrupolo de tempo de voo de múltiplos estágios e a armadilha de íons de quadrupolo também são usados nesta aplicação.
[0605] Espectrometria de massa CMS tem sido cada vez mais utilizada em análises bioanalíticas. A espectrometria de massa é bem adequada para multiplexação porque a diferenciação de massa permite muitos canais de detecção simultâneos. No entanto, biomoléculas complexas, como o DNA, têm espectros de massa complexos e podem ser difíceis de detectar em uma matriz devido à sensibilidade relativamente baixa. A MS é uma técnica analítica que mede a razão massa para carga de espécies carregadas. Pode ser usado para determinar a composição química de uma amostra ou molécula. As amostras analisadas por espectrometria de massa são ionizadas para gerar moléculas ou átomos carregados, separados de acordo com suas razões massa-carga e detectados. A técnica é usada qualitativa e quantitativamente de acordo com várias aplicações. Os plasmas indutivamente acoplados (OCP) são um tipo de fonte de plasma em que a energia é fornecida por correntes elétricas que são produzidas por indução eletromagnética, isto é, por campos magnéticos variáveis no tempo. O ICP pode ser usado como uma fonte de ionização para espectrometria de massa. A combinação de plasma acoplado indutivamente e espectrometria de massa é referida como ICP-MS. A espectrometria de massa com formação de imagem (MSI) é uma aplicação de espectrometria de massa que envolve a análise de informações químicas com informações espaciais, de modo que a informação química possa ser visualizada como uma imagem ou mapa químico. Ao gerar um mapa químico, as diferenças de composição através da superfície da amostra podem ser elucidadas. A ablação a laser é o processo de remoção de material de uma superfície sólida, irradiando-o com um feixe de laser. A ablação a laser tem sido usada como meio de amostragem de materiais para espectrometria de massa, em particular para formação de imagem espectral de massa. De acordo com uma forma de realização, um sistema para a formação de imagem espectral de massa de amostra inclui um amostrador de ablação a laser, um ionizador de plasma indutivamente acoplado, um espectrômetro de massa e um computador. Ilustrativamente, o amostrador de ablação a laser compreende um laser, uma câmara de ablação a laser e uma plataforma de amostra configurada de tal forma que o laser pode irradiar uma amostra posicionada na plataforma de amostra para formar uma amostra ablacionada, onde o laser e a plataforma de amostra são coordenados pelo computador. O amostrador de ablação por laser e o ionizador de plasma indutivamente acoplado estão operativamente conectados para que a amostra ablacionada possa ser transferida do amostrador de ablação a laser para o ionizador de plasma indutivamente acoplado, assim evaporando, vaporizando, atomizando e ionizando a amostra ablacionada para formar uma população de amostra atômica iônica com uma distribuição de razão massa/ carga. O espectrômetro de massa está operacionalmente conectado ao ionizador de plasma acoplado indutivamente para que a população de íons possa ser transferida do ionizador de plasma indutivamente acoplado para o espectrômetro de massa, em que o espectrômetro de massa separa a população de íons de acordo com a distribuição da relação massa-carga, gerando assim dados de relação massa-carga. O computador é configurado para aceitar entradas de localização e se comunicar com o amostrador de ablação a laser para ablastar a amostra de acordo com as entradas de localização e é configurado para relacionar os dados de relação massa-carga a um local na amostra de acordo com a localização entradas. Em outras formas de realização ilustrativas, o sistema compreende ainda um sistema de registo configurado para determinar a posição da amostra, permitindo assim a relação automática das entradas de localização com a localização na amostra sobre a qual o laser está configurado para irradiar. Em formas de realização ilustrativas, uma composição para ensaios de amostra LA-ICP-MS multiplexada inclui uma etiqueta de massa e uma porção de ligação específica conjugada com a etiqueta de massa. A etiqueta de massa inclui uma população de átomos de um primeiro tipo que é detectavelmente distinta de elementos endógenos a uma amostra. Em uma forma de realização, a população de átomos do primeiro tipo é um isótopo estável não endógeno de um elemento. Em outra forma de realização, a população de átomos é configurada como uma partícula coloidal. Ver WO 2014/079802, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0606] Um método para detectar um alvo em uma amostra refere- se ao contato de uma amostra com um conjugado de porção de ligação específica de enzima selecionado para reconhecer o alvo. A amostra é então colocada em contato com um conjugado precursor de etiqueta de massa, compreendendo um precursor de etiqueta de massa e um substrato de enzima, uma porção de tiramina ou um derivado de tiramina e um ligante opcional. O conjugado precursor de etiqueta de massa sofre reação com a enzima ou com o produto da reação enzimática para produzir etiquetas de massa precipitadas, etiquetas de massa ligadas covalentemente ou etiquetas de massa não ligadas covalentemente. A amostra é exposta a uma fonte de energia, que fornece energia suficiente para produzir um código de massa a partir da etiquetas de massa. Após a ionização, o código de massa pode ser detectado usando um método de detecção, como a espectrometria de massa. Em algumas formas de realização, a amostra é exposta a uma primeira solução compreendendo o conjugado de porção de ligação específica de enzima e uma segunda solução compreendendo o conjugado precursor de etiqueta de massa. As porções enzimáticas da porçãp de ligação específica da enzima podem ser selecionadas a partir de enzimas oxido-reductase (por exemplo, peroxidases), fosfatases (por exemplo, fosfatase alcalina), lactamases (por exemplo, β-lactamase) e galactosidases (por exemplo, β-D-galactosidase, β- galactosidase). As porções de ligação específicas podem ser selecionadas a partir de uma proteína, um polipeptídeo, um oligopeptídeo, um peptídeo, um ácido nucleico, DNA, RNA, um oligossacarídeo, um polissacarídeo e seus monômeros. Em forma de realização particularmente divulgadas referem-se à utilização de conjugados de fosfatase alcalina-anticorpo e conjugados de peroxidase de rábano-anticorpo. Em algumas formas de realização divulgadas, uma porção de ligação específica reconhece o alvo. Em outras formas de realização divulgadas, a porção de ligação específica reconhece um anticorpo primário ligado ao alvo. Em algumas formas de realização, depositar uma etiqueta de massa inclui a imobilização de uma enzima em um alvo e o contato da amostra com uma porção de substrato de enzima e um precursor de etiqueta de massa. A porção de substrato da enzima reage com a enzima e o precursor do etiqueta de massa para produzir e depositar uma etiqueta de massa no alvo. Quando dois ou mais alvos estão presentes na amostra, as etiquetas de massa são depositadas sequencialmente em cada alvo, conforme descrito acima. Depois que uma etiqueta de massa é depositada, a enzima correspondente é desativada antes de depositar uma etiqueta de massa subsequente em um alvo subsequente. Em outras formas de realização divulgadas, a enzima reage com um conjugado de etiqueta de massa de precursor-tiramina ou um conjugado de etiqueta derivado de precursor- tiramina para depositar, tipicamente covalentemente, a etiqueta de massa proximal ao alvo. Em algumas formas de realização, imobilizar uma enzima em um alvo inclui o contato da amostra com um conjugado compreendendo uma porção de ligação específica e uma enzima. Em certas formas de realização, a porção de ligação específica é um anticorpo. A porção de ligação específica é capaz de reconhecer e ligar-se diretamente ao alvo ou a outra porção de ligação específica previamente ligada ao alvo. Em formas de realização particulares, a primeira enzima, a segunda enzima e qualquer enzima adicional são as mesmas. Veja WO 2012/003478, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
DETECÇÃO DE METILAÇÃO DO DNA
[0607] Recentemente, métodos para diagnosticar o câncer através da medição da metilação do DNA têm sido sugeridos. A metilação do DNA ocorre principalmente na citosina das ilhas CpG na região promotora de um gene específico para interferir na ligação dos fatores de transcrição, silenciando assim a expressão do gene. Assim, detectar a metilação de ilhas CpG no promotor de genes inibidores de tumores ajuda muito na pesquisa do câncer. Recentemente, tem sido feita uma tentativa para determinar a metilação do promotor, por métodos como a PCR específica para metilação (aqui referida como MSP) ou sequenciamento automático de DNA, para o diagnóstico e rastreamento do câncer. Ver WO 2009/069984A2, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
ENERGIA ACÚSTICA
[0608] Pelo menos algumas formas de realização são direcionadas a métodos e sistemas para analisar um espécime. O espécime pode ser analisado com base em suas propriedades. Essas propriedades incluem propriedades acústicas, propriedades mecânicas, propriedades ópticas ou similares que podem ser estáticas ou dinâmicas durante o processamento. Em algumas formas de realização, as propriedades da amostra são monitoradas contínua ou periodicamente durante o processamento para avaliar o estado e condição do espécime. Com base nas informações obtidas, o processamento pode ser controlado para aumentar a consistência do processamento, reduzir os tempos de processamento, melhorar a qualidade do processamento ou algo semelhante. A acústica pode ser usada para analisar objetos suaves, como amostras. Quando um sinal acústico interage com uma amostra, o sinal transmitido depende de várias propriedades mecânicas da amostra, como elasticidade e firmeza. Como as amostras que foram colocadas no fixador (por exemplo, formalina) tornam-se mais fortemente reticuladas, a velocidade de transmissão irá mudar de acordo com as propriedades da amostra. Em algumas formas de realização, um estado de uma amostra biológica pode ser monitorado com base em um tempo de voo de ondas acústicas. O status pode ser um status de densidade, status de fixação, status de coloração ou algo semelhante. O monitoramento pode incluir, sem limitação, a medição de mudanças na densidade da amostra, reticulação, descalcificação, coloração da mancha ou similares. A amostra biológica pode ser amostras não fluídicas, como osso ou outro tipo de amostra. Em algumas formas de realização, os métodos e sistemas são direcionados para o uso de energia acústica para monitorar uma amostra. Com base na interação entre a energia acústica nos métodos refletido e/ ou de transmissão, informações sobre o espécime podem ser obtidas. Medições acústicas podem ser tomadas. Exemplos de medições incluem amplitude do sinal acústico, atenuação, dispersão, absorção, tempo de voo (TOF) no espécime, variações de fase das ondas acústicas ou combinações das mesmas. O espécime, em algumas forma de realização, possui propriedades que mudam durante o processamento. Em algumas formas de realização, um fixador é aplicado à amostra. À medida que o espécime se torna mais fixo, as propriedades mecânicas (por exemplo, elasticidade, rigidez, etc.) mudam devido à reticulação molecular. Essas alterações podem ser monitoradas usando medições de velocidade de som via TOF. Com base nas medições, um estado de fixação ou outro estado histológico do espécime pode ser determinado. Para evitar a fixação excessiva ou a pouca fixação, as características estáticas da amostra, as características dinâmicas da amostra ou ambas podem ser monitoradas. As características da amostra incluem características de transmissão, características de refletância, características de absorção, características de atenuação ou similares. Em certas formas de realização, um método para avaliar uma amostra inclui a análise da velocidade da onda acústica antes, durante e/ ou após o processamento da amostra. Isto é conseguido estabelecendo primeiro uma medida de linha de base para uma amostra fresca, não fixada, entregando uma onda acústica de um transmissor à amostra retirada de um sujeito. A onda acústica TOF da linha de base é detectada usando um receptor. Após ou durante o processamento da amostra, uma segunda onda acústica é enviada do transmissor para a amostra. A segunda onda acústica de TOF é detectada usando o receptor após a segunda onda acústica ter passado pela amostra. As velocidades de som na amostra são comparadas com base no primeiro TOF e no segundo TOF para determinar uma alteração na velocidade. Essas medidas podem ser únicas para cada amostra analisada e, portanto, usadas para estabelecer uma linha de base para cada amostra. Medições TOF adicionais podem ser usadas para determinar as contribuições de TOF atribuíveis à mídia, canal de medição ou similares. Em algumas formas de realização, o TOF do meio é medido quando nenhuma amostra está presente para determinar um TOF da linha de base do meio. Ver WO 2011/109769, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
ANÁLISE LIPIDÔMICA
[0609] A pesquisa lipidômica envolve a identificação e quantificação de milhares de espécies moleculares lipídicas celulares e suas interações com outros lipídios, proteínas e outros metabólitos. Investigadores em lipidômica examinam as estruturas, funções, interações e dinâmica de lipídios celulares e as mudanças que ocorrem durante a perturbação do sistema. As técnicas de análise lipidômica podem incluir espectrometria de massa (MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia de fluorescência, interferometria de polarização dupla e métodos computacionais. Na pesquisa lipidômica, os dados que descrevem quantitativamente as alterações espaciais e temporais no conteúdo e composição de diferentes espécies moleculares lipídicas são acumulados após a perturbação das células através de mudanças em seu estado fisiológico ou patológico. Informações obtidas a partir desses estudos facilitam insights mecanicistas em mudanças na função celular.
QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES
[0610] A quantificação de células imunes em amostras pode ocorrer através da utilização de contagem de células assistidas por PCR quantitativo em tempo real (qPACC) com base em epigenética. O estado de metilação da estrutura da cromatina de ambos os genes ativamente expressos ou silenciados é a base da tecnologia de identificação e quantificação de células baseadas em epigenética. A descoberta da remoção específica do tipo de célula de grupos metila (desmetilação) do carbono 5’ da base de citosina no dinucleotídeo citosina fosfato guanina permite a quantificação precisa e robusta de células imunes com somente pequenas quantidades de sangue humano ou amostras de tecido. Esses biomarcadores epigenéticos localizados no DNA genômico estão estavelmente associados a células de interesse. Kleen e Yuan (novembro de 2015). “Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue”. J. Imunother. Câncer 46 (3).
DETECÇÃO DE MARCADORES ASSOCIADOS AO CÂNCER
[0611] A detecção de “marcadores tumorais”, incluindo mas não limitados a proteínas, antígenos, enzimas, hormônios, mutações de DNA e carboidratos associados à presença de um câncer, usando técnicas como, mas não se limitando a RNA, DNA ou sequenciamento de proteínas, é de importância para o diagnóstico correto de um tipo de câncer, e para a seleção do método apropriado de tratamento. Tais marcadores incluem, mas não se limitam a alfa foproteína (frequentemente associada com, mas não limitado a, tumores de células germinativas e carcinomas hepatocelulares), CA 15-3 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de mama), CA27-29 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de mama), CA19-9 (frequentemente associado com, mas não se limitando a,, câncer de pâncreas, câncer colorretal e outros tipos de câncer gastrointestinal), CA-125 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de tubo de falópio, câncer de pulmão, câncer de mama e câncer gastrointestinal), calcitonina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, carcinoma de tireoide medular), calretinina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, mesotelioma, tumor estromal gonadal do cordão sexual, carcinoma adrenocortical, sarcoma sinovial), antígeno carcinoembrionário (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer gastrointestinal, câncer do colo do útero, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer do trato urinário), CD34 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, hemangiopericitoma/ tumor fibroso solitário, lipoma pleomórfico, tumor estromal gastrointestinal, dermatofibrossarcoma protuberante), CD99MIC 2 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, sarcoma de Ewing, tumor neuroectodérmico primitivo, hemangiopericitoma/ tumor fibroso solitário, sarcoma sinovial, linfoma, leucemia, tumor estromal gonadal do cordão sexual), CD117 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumor do estroma gastrointestinal, mastocitose, seminoma), cromogranina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumor neuroendócrino), cromossomos 3, 7, 17, e 9p21 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de bexiga), vários tipos de citoqueratina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, muitos tipos de carcinoma e alguns tipos de sarcoma), desmina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, sarcoma de músculo liso, sarcoma do músculo esquelético e sarcoma estromal do endométrio), antígeno da membrana epitelial (frequentemente associado com, mas não se limitando a, vários tipos de carcinoma, meningioma e alguns tipos de sarcoma), Fator VIII/ CD31 FL1 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, sarcoma vascular), proteína ácida fibrilar glial (frequentemente associado com, mas não se limitando a, glioma (astrocitoma, ependimoma)), doença cística grosseira de proteína fluida (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de mama, câncer de ovário e câncer de glândula salivar), HMB-45 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, melanoma, PEComa (por exemplo angiomiolipoma), carcinoma de células claras, carcinoma adrenocortical)), gonadotrofina coriônica humana (frequentemente associado com, mas não se limitando a, doença trofoblástica gestacional, tumor de células germinativas e coriocarcinoma), imunoglobulina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, linfoma, leucemia), inibina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumor estromal gonadal do cordão sexual, carcinoma adrenocortical, hemangioblastoma), vários tipos de queratina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, carcinoma, alguns tipos de sarcoma), vários tipos de marcadores de linfócito (frequentemente associado com, mas não se limitando a, linfoma, leucemia), MART-1 (Melan-A) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, melanoma, tumores produtores de esteróides (carcinoma adrenocortical, tumor gonadal)), Myo D1 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, rabdomiossarcoma, tumor de células azuis pequenas e redondas), actina músculo-específica (MSA) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, miosarcoma (leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma)), neurofilamento (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumor neuroendócrino, carcinoma de pequenas células do pulmão), enolase neuronal específica (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumor neuroendócrino, carcinoma de células pequenas do pulmão, câncer de mama), fosfatase alcalina placentária (PLAP) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, seminoma, disgerminoma, carcinoma embrionário), antígeno específico da próstata (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de próstata), PTPRC (CD45) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, linfoma, leucemia, tumor histiocítico), proteína S100 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, melanoma, sarcoma (neurossarcoma, lipoma, condrossarcoma), astrocitoma, tumor estromal gastrointestinal, câncer da glândula salivar, alguns tipos de adenocarcinoma, tumor histiocítico (célula dendrítica, macrófago)), actina de músculo liso (SMA) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumor estromal gastrointestinal, leiomiossarcoma, PEComa), sinaptofisina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumor neuroendócrino), tireoglobulina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, um marcador pós-operatório de câncer de tireoide), fator-1 de transcrição da tireoide (frequentemente associado com, mas não se limitando a, todos os tipos de câncer de tireoide, câncer de pulmão), tumor M2-PK (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer colorretal, câncer de mama, carcinoma de células renais, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer do colo do útero, câncer de ovário), vimentina (frequentemente associado com, mas não se limitando a, sarcoma, carcinoma de células renais, câncer de endométrio, carcinoma de pulmão, linfoma, leucemia, melanoma), rearranjos do gene ALK (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de pulmão de células não pequenas e linfoma anaplásico de células grandes), Beta-2- microglobulina (B2M) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica e alguns linfomas), beta- gonadotrofina coriônica humana (Beta-hCG) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, coriocarcinoma e tumores de células germinativas), mutações dos genes BRCA1 e BRCA2 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de ovário), Gene de fusão BCR-ABL (cromossomo Philadelphia) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda e leucemia mielogênica aguda), mutações BRAF V600 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, melanoma cutâneo e câncer colorretal), CD20 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, linfoma não-Hodgkin), cromogranina A (CgA) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumores neuroendócrinos), células tumorais circulantes de origem epitelial (CELLSEARCH®) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de mama, próstata e colo-retal metastáticos), fragmento de citoqueratina 21-1 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de pulmão), análise de mutação do gene EGFR (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de pulmão de células não pequenas), receptor de estrogênio (ER)/ receptor de progesterona (PR) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de mama), HE4 (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de ovário), análise de mutação do gene KRAS (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer colorretal e câncer de pulmão de células não pequenas), desidrogenase de lactato (frequentemente associado com, mas não se limitando a, tumores de células germinativas, linfoma, leucemia, melanoma e neuroblastoma), enolase específica de neurônio (NSE) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de pulmão de células pequenas e neuroblastoma), proteína 22 de matriz nuclear (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de bexiga), ligante 1 de morte programada (PD-L1) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de pulmão de células não pequenas), ativador do plasminogênio da uroquinase (uPA) e inibidor do ativador do plasminogênio (PAI-1) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer da mama), assinatura Proteína 5 (OVA1®) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de ovário), Assinatura do gene 21 (Oncotype DX®) (geralmente associada ao câncer de mama), Assinatura do gene 70 (Mammaprint®) (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de mama) e amplificação ou superexpressão do gene HER2/ neu (frequentemente associado com, mas não se limitando a, câncer de mama, câncer de ovário, adenocarcinoma de junção gastroesofágica, câncer de estômago, câncer de pulmão de células não pequenas e câncer uterino). Biomarcadores adicionais associados com tumores podem incluir, mas não estão limitados a uma mutação Pl3KCA, uma amplificação de FGFR2, uma mutação p53, uma mutação BRCA, uma amplificação CCND1, uma mutação MAP2K4, uma mutação ATR, ou qualquer outro biomarcador cuja expressão esteja correlacionada para um câncer específico; pelo menos um de AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/Pr, UGT1A1, CD30,CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT, e TMPRSS2; ou pelo menos um biomarcador selecionado a partir de ABCB5, AFP-L3, alfa-fetoproteína, alfa-metil acil-racemase CoA, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, CA 27-29, CA-125, CA 15-3, CA 19-9, Calcitonina, antígeno Carcinoembrionário, peptídeo-1 de antígeno carcinoembriônico, Desgama carboxi protrombina, Desmin, Antígeno-2 de câncer de próstata precoce, Receptor de estrogênio, Produto de degradação de fibrina, Glicose-6-fosfato isomerase, um antígeno de HPV como vE6, E7, L1, L2 ou p16INK4a,Gonadotrofina coriônica humana, IL-6, Queratina 19, Lactato desidrogenase, Leucil aminopeptidase, Lipotropina, Metanefrinas, Neprilisina, NMP22, Normetanefrina, PCA3, Antígeno prostático específico, Fosfatase de ácido prostático, Sinaptofisina, Tiroglobulina, TNF, um fator de transcrição selecionado a partir de ERG, ETV1 (ER81), FL1, ETS1, ETS2, ELK1, ETV6 (TEL1), ETV7 (TEL2), GABPa, ELF1, ETV4 (E1AF; PEA3), ETV5 (ERM), ERF, PEA3/ E1AF, PU.1, ESE1/ ESX, SAP1 (ELK4), ETV3 (METS), EWS/ FLI1, ESE1, ESE2 (ELF5), ESE3, PDEF, NET (ELK3; SAP2), NERF (ELF2), ou FEV, glicoproteína associada a tumor 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit e vimentina. Alternativamente, ou adicionalmente, o biomarcador de interesse pode ser um inibidor do ponto de verificação imunológico tal como, mas não limitado a, ligantes das famílias CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, TL1A, e B-7 ou uma combinação dos mesmos ou é um ligante de uma proteína de ponto de secagem selecionada do grupo que consiste em ligantes das famílias CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 ou uma combinação dos mesmos. Marcadores adicionais podem incluir, mas não se limitam a, detecção de pelo menos um biomarcador associado à leucemia linfoblástica aguda (etv6, am11, ciclofilina b), linfoma de células B (idiotipo de Ig), glioma (E-caderina, .alfa.-catenina, .beta.-catenina, .gama.-catenina, p120 ctn), câncer de bexiga (p21ras), câncer biliar (p21ras), câncer de mama (família MUC, HER2/ neu, c-erbB-2), carcinoma cervical (p53, p21ras), carcinoma do cólon (p21ras, HER2/ neu, c-erbB-2, família MUC), câncer colorretal (antígeno colorretal associado (CRC)-C017-1A/ GA733, APC), coriocarcinoma (CEA), câncer de células epiteliais (ciclofilina b), câncer gástrico (HER2/ neu, c-erbB-2, glicoproteína ga733), câncer hepatocelular (.alfa.-fetoproteína), linfoma de Hodgkin (Imp-1, EBNA-1), câncer de pulmão (CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), leucemia derivada de células linfoides (ciclofilina b), melanoma (proteína p5, gp75, antígeno oncofetal, gangliosídeos GM2 e GD2, Melan-A/ MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100.sup.Pmel117), mieloma (família MUC, p21ras),carcinoma de pulmão de células não pequenas (HER2/ neu, c-erbB-2), câncer de nasofaringe (Imp-1, EBNA-1), câncer de ovário (família MUC, HER2/ neu, c- erbB-2), câncer de próstata (Antígeno Específico de Próstata (PSA) e seus epitopos antigênicos PSA-1, PSA-2 e PSA-3, PSMA, HER2/ neu, c-erbB-2, glicoproteína ga733), câncer renal (HER2/ neu, c-erbB-2), cânceres de células escamosas do colo do útero e do esófago (produtos virais tais como proteínas do vírus do papiloma humano), câncer testicular (NY-ESO-1) e/ ou leucemia de células T (epitopos do HTLV-1).
[0612] O direcionamento preciso de aspectos específicos das cascatas de quinases é agora conhecido por fornecer descobertas anteriormente inatingíveis para terapias de doenças. A importância da família das proteínas quinases é ressaltada pelos numerosos estados patológicos que surgem devido à desregulação da atividade quinase. A sinalização celular aberrante por muitas destas proteínas e lipídio quinases pode levar a doenças, como o câncer. Sabe- se que várias proteínas serina/ treonina e tirosina quinases são ativadas em células cancerígenas e impulsionam o crescimento e progressão tumoral. A tecnologia aqui descrita proporciona métodos para enriquecer (ou isolar) quinases, por exemplo quinases dependentes de ATP, utilizando um ou mais agentes de captura de quinase. Exemplos de agentes de captura de quinase incluem, mas não estão limitados a, inibidores de proteína-quinase relativamente não-seletivos, substratos ou pseudo-substratos. Os métodos são úteis, por exemplo, para desenhar perfil de quinomas (kinomes) por espectrometria de massa em tandem. Embora muitos inibidores de quinase de molécula pequena altamente seletivos e potentes tenham sido previamente identificados, tal como é descrito acima, foi também identificado um grande número de inibidores de quinase de molécula pequena relativamente não seletivos. Para os métodos aqui descritos, a utilização de inibidores de quinase de molécula pequena relativamente não seletivos reduz a necessidade de adaptar procedimentos de purificação para quinases individuais e amplifica o sinal analítico obtido por enriquecimento de enzimas normalmente presentes em células, tecidos e fluidos corporais a concentrações catalíticas apenas. Contudo, será reconhecido que inibidores de quinases de moléculas pequenas seletivos também podem ser úteis nestes métodos de análise de quinase. Adicionalmente, uma combinação de um inibidor de quinase de molécula pequena não seletivo e seletivo pode ser útil nestes métodos. Além disso, um agente de captura de quinase (ou mais do que um agente de captura de quinase) pode também ser combinado com um agente de captura de fosfatase para enriquecer (ou isolar) quinases e fosfatases concorrentemente. Os métodos aqui descritos também podem ser aplicados a análise multiplexada de proteína quinases e/ ou fosfatases por espectrometria de massa em tandem a partir de um único ou múltiplos espécimes. A tecnologia aqui descrita fornece um método para analisar uma população de quinases, tal como um quinomo. O método envolve a separação de quinases a partir de uma amostra usando um ou mais agentes de captura de quinase, digestão proteolítica de uma amostra de proteína a peptídeos constituintes (por exemplo, com uma proteínase como tripsina), suplementando os peptídeos obtidos com peptídeos calibradores projetados racionalmente relacionados a sequências de peptídeo de proteína quinase particulares que contêm ligações aspartato-prolina (DP) cindíveis e quantificação dos peptídeos nativos derivados da população de quinase por espectrometria de massa em tandem. Estratégias para o perfil da abundância relativa de quinases de proteínas e lipídios em múltiplas amostras usando etiquetas peptídicas isobáricas contendo ligações DP cindíveis também são descritas. Um técnico no assunto reconhecerá que metodologia semelhante pode ser aplicada para analisar fosfatases ou uma combinação de quinases e fosfatases. Ver WO 2007/131191, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE DE TIPOS ESPECÍFICOS DE CÉLULAS
[0613] Células tumorais circulantes putativas foram agora descritas em múltiplos tumores humanos incluindo AML, CML, mieloma múltiplo, tumores cerebrais, tumores da mama, melanoma e câncer da próstata, câncer do cólon e câncer gástrico. Em princípio, as células tumorais circulantes podem ser identificadas por várias estratégias experimentais. Muitas células tumorais circulantes parecem expressar os marcadores da superfície celular que identificam suas contrapartes normais. Esta observação fornece um procedimento de enriquecimento relativamente simples, utilizando a separação de células baseada em citometria de fluxo ou a purificação por afinidade baseada em microesferas das células. Veja Schawb, M. Enciclopédia de Câncer, 3a edição, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2011.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
[0614] Em outras formas de realização exemplificativas, a amostra, ou uma ou mais suas células, podem ser submetidas ao sequencimento de DNA. O sequenciamento de DNA pode ser direcionado, por exemplo, para genes, regiões, sequências reguladoras, íntrons, exons, SNPs, fusões potenciais, etc., por exemplo, para detectar sequências associadas ao câncer ou pertinentes ao diagnóstico das mesmas. O sequenciamento de DNA também pode ser realizado em todo o genoma ou em uma parte significativa do mesmo. Os métodos de sequenciamento exemplificativos que podem ser utilizados incluem, sem limitação, sequenciamento Sanger e sequenciamento terminador de corante, bem como tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) tais como pirosequenciamento, sequenciamento de nanoporos, sequenciamento baseado em micropore, sequenciamento nanoball, MPSS, SOLID, Solexa, Ion Torrent, Starlite, SMRT, tSMS, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação, sequenciamento por espectrometria de massa, sequenciamento por polimerase, sequenciamento de RNA polimerase (RNAP), sequenciamento baseado em microscopia, sequenciamento Sanger microfluídico, sequenciamento baseado em microscopia, sequenciamento RNAP, sequenciamento de DNA de correntes de tunelamento e sequenciamento de vírus in vitro. Ver WO 2014/144478, WO 2015/058093, WO 2014/106076 e WO 2013/068528, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0615] As tecnologias de sequenciamento de DNA avançaram exponencialmente. Mais recentemente, as tecnologias de sequenciamento de alto rendimento (ou sequenciamento de próxima geração) paralelizam o processo de sequenciamento, produzindo milhares ou milhões de sequências ao mesmo tempo. No sequenciamento de ultra-alto rendimento, até 500.000 operações de sequenciamento por síntese podem ser executadas em paralelo. O sequenciamento da próxima geração reduz os custos e aumenta bastante a velocidade em relação aos métodos de terminação de corantes padrão da indústria.
[0616] A pirosequenciamento amplifica o DNA dentro de gotículas de água em uma solução de óleo (PCR em emulsão), com cada gotícula contendo um único molde de DNA ligado a uma única esfera revestida com iniciador que então forma uma colônia clonal. A máquina de sequenciamento contém muitos poços de pico de volume-litros, cada um contendo um único grânulo e enzimas de sequenciamento. pirosequenciamento utiliza luciferase para gerar luz para detecção dos nucleotídeos individuais adicionados ao DNA nascente, e os dados combinados são usados para gerar leituras de sequência. Veja Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. A sequenciamento por pirosequenciamento é uma tecnologia de sequenciamento por síntese que utiliza também o pirosequenciamento. A sequenciamento por pirossequenciamento do DNA envolve duas etapas. Na primeira etapa, o DNA é cortado em fragmentos de aproximadamente 300-800 pares de bases, e os fragmentos têm extremidades cegas. Adaptadores de oligonucleotídeos são então ligados às extremidades dos fragmentos. Os adaptadores servem como iniciadores para amplificação e sequenciamento dos fragmentos. Os fragmentos podem ser ligados a contas de DNA, por exemplo, contas revestidas com estreptavidina utilizando, por exemplo, o adaptador B, que contém a etiqueta 5’-biotina. Os fragmentos ligados às contas são amplificados por PCR dentro de gotículas de uma emulsão de óleo-água. O resultado são múltiplas cópias de fragmentos de DNA amplificados por clonagem em cada conta. Na segunda etapa, as contas são capturadas em poços (tamanho pico-litro). O pirossequenciamento é realizada em cada fragmento de DNA em paralelo. A adição de um ou mais nucleotídeos gera um sinal luminoso que é registrado por uma câmera CCD em um instrumento de sequenciamento. A força do sinal é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados. A pirossequenciamento faz uso de pirofosfato (PPi) que é liberado após a adição de nucleotídeos. O PPi é convertido em ATP pela sulfurilase de ATP na presença de fosfossulfato de adenosina 5’. A luciferase usa o ATP para converter a luciferina em oxiluciferina, e esta reação gera luz que é detectada e analisada. Em outra forma de realização, utiliza-se pirossequenciamento para medir a expressão gênica. Pirossequenciamento de RNA aplica-se de forma semelhante ao pirossequenciamento de DNA, e é realizado anexando aplicações de sequenciamento parcial do gene rRNA a esferas microscópicas e, em seguida, colocando os anexos em poços individuais. A sequência parcial de rRNA anexada é então amplificada para determinar o perfil de expressão gêica. Sharon Marsh, Pyrosequencing® Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 373, 15-23 (2007).
[0617] Outro exemplo de uma técnica de sequenciamento que pode ser utilizada nos métodos da divulgação fornecidos é a de sequenciamento de nanoporos (Soni GV e Meller, AClin Chem 53: 1996-2001, 2007, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade). Um nanoporo é um pequeno orifício, da ordem de 1 nanômetro de diâmetro. A imersão de um nanoporo em um fluido condutor e a aplicação de um potencial através dele resultam em uma leve corrente elétrica devido à condução de íons através do nanoporo. A quantidade de corrente que flui é sensível ao tamanho do nanopore. Quando uma molécula DNA passa por um nanoporo, cada nucleotídeo na molécula de DNA obstrui o nanoporo em um grau diferente. Assim, a mudança na corrente que passa pelo nanoporo à medida que a molécula de DNA passa pelo nanoporo representa uma leitura da sequência de DNA. Veja Bayley, Clin Chem. 2015 jan; 61 (1): 25-31, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0618] Outro exemplo de técnicas de detecção de DNA e RNA que podem ser usadas nos métodos da divulgação fornecidos é a tecnologia SOLiD™ (Applied Biosystems). Os sistemas de tecnologia SOLiD™ são uma tecnologia de sequenciamento baseada em ligação que pode ser utilizada para executar sequenciamento maciçamente paralelo de próxima geração de DNA e RNA. No sequenciamento SOLiD™ de DNA, o DNA genômico é cortado em fragmentos, e os adaptadores são anexados às extremidades 5’ e 3’ dos fragmentos para gerar uma biblioteca de fragmentos. Alternativamente, os adaptadores internos podem ser introduzidos por adaptadores de ligantes às extremidades 5’ e 3’ dos fragmentos, circulando os fragmentos, digerindo o fragmento circulado para gerar um adaptador interno e adaptadores de ligante às extremidades 5’ e 3’ dos fragmentos resultantes para gerar uma biblioteca de pares de parceiros. Em seguida, as populações de grânulos clonais são preparadas em micro-reatores contendo contas, iniciadores, molde e componentes de PCR. Após a PCR, os moldes são desnaturados e as contas são enriquecidas para separar as contas com moldes estendidos. Os moldes nas contas selecionadas são sujeitos a uma modificação 3’ que permite a ligação a uma lâmina de vidro. A sequência pode ser determinada por hibridização sequencial e ligação de oligonucleotídeos parcialmente aleatórios a uma base determinada central (ou pares de bases) que é identificada por um fluoróforo específico. Após uma cor ser registada, o oligonucleotídeo ligado é clivado e removido e o processo é então repetido.
[0619] Em outras formas de realização, a Análise em série de expressão gênica SOLiD™ (SAGE) utilizada para medir a expressão gênica. A análise serial da expressão gênica (SAGE) é um método que permite a análise simultânea e quantitativa de um grande número de transcritos gênicos, sem a necessidade de fornecer uma sonda de hibridação individual para cada transcrito. Em primeiro lugar, é gerada uma etiqueta de sequência curta (cerca de 10-14 pb) que contém informação suficiente para identificar unicamente uma transcrição, desde que a etiqueta seja obtida a partir de uma posição única dentro de cada transcrição. Então, muitas transcrições são interligadas para formar longas moléculas em série, que podem ser sequenciadas, revelando a identidade das múltiplas etiquetas simultaneamente. O padrão de expressão de qualquer população de transcritos pode ser avaliado quantitativamente determinando a abundância de marcadores individuais e identificando o gene correspondente a cada marcador. Para mais detalhes ver, por exemplo Velculescu et al., Science 270: 484-487 (1995); e Velculescu et al., Cell 88: 24351 (1997, os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade).
[0620] Outra técnica de sequenciamento que pode ser usada nos métodos da divulgação fornecidos inclui, por exemplo, Sequenciamento Molecular Único de Helicos verdadeiro (tSMS) (Harris TD et al. (2008) Science 320: 106-109). Na técnica de tSMS, uma amostra de DNA é clivada em filamentos de aproximadamente 100 a 200 nucleotídeos, e uma sequência poliA é adicionada à extremidade 3’ de cada filamento de DNA. Cada cadeia é marcada pela adição de um nucleotídeo de adenosina marcado de forma fluorescente. As cadeias de DNA são então hibridizadas para uma célula de fluxo, que contém milhões de sítios de captura de oligo-T que são imobilizados na superfície da célula de fluxo. Os modelos podem ter uma densidade de cerca de 100 milhões de moldes/ cm. A célula de fluxo é então carregada em um instrumento, por exemplo, o sequenciador HeliScope, e um laser ilumina a superfície da célula de fluxo, revelando a posição de cada modelo. Uma câmera CCD pode mapear a posição dos modelos na superfície da célula de fluxo. A etiqueta fluorescente do molde é então clivada e lavada. A reação de sequenciamento começa pela introdução de uma DNA polimerase e um nucleotídeo marcado fluorescentemente. O ácido nucleico oligo-T serve como um iniciador. A polimerase incorpora os nucleotídeos marcados ao iniciador em um modelo direcionado. A polimerase e os nucleotídeos não incorporados são removidos. Os moldes que dirigiram a incorporação do nucleotídeo marcado por fluorescência são detectados por imagem da superfície da célula de fluxo. Após a obtenção de imagens, uma etapa de clivagem remove o marcador fluorescente, e o processo é repetido com outros nucleotídeos marcados com fluorescência até ser atingido o comprimento de leitura desejado. A informação da sequência é recolhida com cada etapa de adição de nucleotídeos. Uma descrição adicional do tSMS é mostrada, por exemplo, em Lapidus et al. (Patente US número 7,169,560), Lapidus et al. (Pedido de patente US número 2009/0191565), Quake et al. (Patente US número 6,818,395), Harris (Patente US número 7,282,337), Quake et al. (Pedido de patente US número 2002/0164629), e Braslavsky, et al., PNAS (EUA), 100: 3960-3964 (2003), cada um dos quais aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0621] Outro exemplo de uma tecnologia de sequenciamento que pode ser usada nos métodos da divulgação fornecidos inclui a tecnologia de molécula única em tempo real (SMRT) da Pacific Biosciences para sequenciar DNA e RNA. Na SMRT, cada uma das quatro bases do DNA é anexada a um dos quatro diferentes corantes fluorescentes. Estes corantes são fosfo-ligados. Uma DNA polimerase fixa é imobilizada com uma única molécula de molde de DNA de fita simples no fundo de um guia de ondas de modo zero (ZMW). Uma ZMW é uma estrutura de confinamento que permite a observação da incorporação de um único nucleotídeo pela DNA polimerase contra nucleotídeos fluorescentes que se difundem rapidamente para fora da ZMW (em microssegundos). Leva vários milissegundos para incorporar um nucleotídeo em uma fita em crescimento. Durante este tempo, a etiqueta fluorescente é excitada e produz um sinal fluorescente, e a etiqueta fluorescente é removida por clivagem. A detecção da fluorescência correspondente do corante indica qual a base que foi incorporada. O processo é repetido. Para sequenciar o RNA, a DNA polimerase é substituída por uma transcriptase reversa na ZMW, e o processo é seguido de acordo.
[0622] Outro exemplo de uma técnica de sequenciamento que pode ser usada nos métodos da divulgação fornecidos envolve o uso de um arranjo de transistor de efeito de campo sensível a produtos químicos (chemFET) para sequenciar o DNA (por exemplo, como descrito na publicação do pedido de patente US 2009/0026082). Em um exemplo da técnica, as moléculas de DNA podem ser colocadas em câmaras de reação, e as moléculas molde podem ser hibridizadas com um iniciador de sequenciamento ligado a uma polimerase. A incorporação de um ou mais trifosfatos em uma nova cadeia de ácido nucleico na extremidade 3’ do iniciador de sequenciamento pode ser detectada por uma alteração na corrente por um chemFET. Um arranjo pode ter sensores chemFET múltiplos. Em outro exemplo, ácidos nucléicos simples podem ser ligados a esferas, e os ácidos nucléicos podem ser amplificados na esfera, e as contas individuais podem ser transferidas para câmaras de reação individuais em uma matriz chemFET, com cada câmara tendo um sensor chemFET, e os ácidos nucleicos podem ser sequenciados.
[0623] Outro exemplo de uma técnica de sequenciamento que pode ser utilizada nos métodos da divulgação fornecidos envolve a utilização de um microscópio electrônico (Moudrianakis E.N. e Beer M. Proc Natl Acad Sei. 1965 March; 53: 564-71). Em um exemplo da técnica, moléculas de DNA individuais são rotuladas usando rótulos metálicos que são distinguíveis usando um microscópio eletrônico. Estas moléculas são, então, tratadas em uma superfície plana e fotografadas usando um microscópio eletrônico para medir sequências.
[0624] O sequenciamento de nanobolas de DNA é um tipo de tecnologia de sequenciamento de alto rendimento usado para determinar toda a sequência genômica de um organismo. O método usa a replicação de círculos rolantes para amplificar pequenos fragmentos de DNA genômico em nanobolas de DNA. O sequenciamento não ligado por ligação é então utilizado para determinar a sequência de nucleotídeos. Este método de sequenciamento de DNA permite que um grande número de nanobolas de DNA seja sequenciado por corrida. Ver WO 2014/122548 e Drmanac et al., Science. 1 de janeiro de 2010; 327 (5961): 78-81; Porreca, Nat Biotechnol. 2010 Jan; 28 (1): 43-4, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0625] O Sequenciamento de Assinaturas Massivamente Paralelas (MPSS) foi uma das primeiras tecnologias de sequenciamento da próxima geração. O MPSS usa uma abordagem complexa de ligação de adaptador seguida de decodificação de adaptador, lendo a sequência em incrementos de quatro nucleotídeos.
[0626] O sequenciamento de Polônio combina uma biblioteca de etiquetas emparelhadas in vitro com PCR de emulsão, um microscópio automatizado e química de sequenciamento baseada em ligação para sequenciar um genoma de E. coli. A tecnologia também foi incorporada à plataforma SOLiD da Applied Biosystems.
[0627] No sequenciamento de Solexa, moléculas de DNA e iniciadores são primeiramente fixados em uma lâmina e amplificados com polimerase de modo que colônias clonais locais, inicialmente denominadas “colônias de DNA”, são formadas. Para determinar a sequência, são adicionados quatro tipos de bases terminadoras reversíveis (bases RT) e os nucleotídeos não incorporados são lavados. Ao contrário do pirossequenciamento, as cadeias de DNA são estendidas um nucleotídeo de cada vez e a aquisição de imagens pode ser realizada em um momento tardio, permitindo que grandes matrizes de colônias de DNA sejam capturadas por imagens sequenciais tiradas de uma única câmera. A tecnologia SOLiD emprega sequenciamento por ligação. Aqui, um conjunto de todos os oligonucleotídeos possíveis de um comprimento fixo são marcados de acordo com a posição sequenciada.
[0628] Os oligonucleotídeos são anilhados e ligados; a ligação preferencial por DNA ligase para sequências coincidentes resulta em um sinal informativo do nucleotídeo nessa posição. Antes do sequenciamento, o DNA é amplificado por PCR em emulsão. As contas resultantes, cada uma contendo cópias únicas da mesma molécula de DNA, são depositadas em uma lâmina de vidro. O resultado é sequências de quantidades e comprimentos comparáveis ao sequenciamento Solexa.
[0629] No sequenciamento de Ion Torrent™, o DNA é fragmentado em fragmentos de aproximadamente 300-800 pares de bases, e os fragmentos são quebrados. Adaptadores de oligonucleotídeos são então ligados às extremidades dos fragmentos. Os adaptadores servem como iniciadores para amplificação e sequenciamento dos fragmentos. Os fragmentos podem ser ligados a uma superfície e são fixados a uma resolução tal que os fragmentos são individualmente resolvidos. A adição de um ou mais nucleotídeos libera um próton (H+), que é detectado e registrado em um instrumento de sequenciamento. A força do sinal é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados. Os dados do Ion Torrent também podem ser enviados como um arquivo FASTQ. Consulte os números de publicação dos EUA 2009/0026082, 2009/0127589, 2010/0035252, 2010/0137143, 2010/0188073, 2010/0197507, 2010/0282617, 2010/0300559, 2010/0300895, 2010/0301398 e 2010/0304982, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
DETECÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO ASSOCIADAS AO CÂNCER
[0630] Os genes de fusão podem contribuir para a formação de tumores, porque os genes de fusão podem produzir proteínas anormais muito mais ativas do que os genes que não são de fusão. Muitas vezes, genes de fusão são oncogenes que causam câncer; estes incluem BCR-ABL, TEL-AML1 (ALL com t (12; 21)), AML1-ETO (M2 AML com t(8; 21)) e TMPRSS2-ERG com uma deleção intersticial no cromossomo 21, ocorrendo frequentemente no câncer de próstata. No caso do TMPRSS2-ERG, ao interromper a sinalização do receptor de andrógeno (AR) e inibir a expressão de AR pelo fator de transcrição ETS oncogênico, o produto de fusão regula o câncer prostático. A maioria dos genes de fusão é encontrada em cânceres hematológicos, sarcomas e câncer de próstata. Os genes de fusão oncogênica podem levar a um produto gênico com uma função nova ou diferente dos dois parceiros de fusão. Alternativamente, um proto-oncogene é fundido a um promotor forte e, assim, a função oncogênica é definida para funcionar por uma regulação positiva causada pelo promotor forte do parceiro de fusão a montante. Esta última é comum em linfomas, onde os oncogenes são justapostos aos promotores dos genes da imunoglobulina. Transcritos de fusão oncogênica também podem ser causados por eventos de trans-splicing ou de leitura-através (read-through). A presença de certas aberrações cromossômicas e seus genes de fusão resultantes é comumente usada no diagnóstico de câncer, a fim de estabelecer um diagnóstico preciso. Análise de bandeamento cromossômico, hibridização fluorescente in situ (FISH), reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) e sequenciamento de próxima geração (exoma e/ ou transcriptoma) são métodos comuns empregados em laboratórios de diagnóstico para identificação de proteínas de fusão associadas ao câncer.
DETECÇÃO DE MARCADORES DE RESISTÊNCIA QUIMIOTERÁPICA
[0631] A resistência aos medicamentos é uma das causas do insucesso da quimioterapia dos tumores malignos, sendo a resistência preexistente (resistência intrínseca) ou induzida pelas drogas (resistência adquirida). A detecção de marcadores resistentes baseia-se, mas não se limita, à identificação de fibroblastos associados a carcinoma através de imuno- histoquímica e citometria de fluxo, aldeido desidrogenase 1, caspase 3 clivada, ciclooxigenase 2, Akt fosforilada, Ki-67 e proteínas H2AX usando coloração imuno-histoquímica, expressão da glicoproteína P, hialuronano (o principal componente glicosaminoglicano da matriz extracelular), ganhos em 3q26.2, e perdas em 6q11.2- 12, 9p22.3, 9p22.2-22.1, 9p22.1-21.3, Xp22.2-22.12,Xp22.11-11.3, e Xp11.23-11.1 como identificados através da hibridização genômica comparativa de matriz de genoma inteiro, superexpressão de LRP como identificado por imunocoloração, HGF e c-MET que são produtos gênicos relacionados ao microRNA MiR-193a-5p usando sequenciamento de RNA, superexpressão de CD44 identificada através de classificação de células e tricostatina A, um potente inibidor de histonas desacilases. Os marcadores de resistência à quimioterapia podem frequentemente tomar a forma de superexpressão de uma proteína, identificação desta sobre-expressão em/ ou o nível de DNA, RNA ou proteína usando técnicas tais como, mas não limitadas a sequenciamento de DNA, sequenciamento de RNA e sequenciamento de proteína. Alguns marcadores de resistência à quimioterapia assumem a forma de alterações epigenéticas, e a identificação dessas alterações através de pirosequenciamento de DNA pode ser de particular uso para a identificação de marcadores de resistência à quimioterapia. Além disso, mutações em genes podem afetar diretamente a expressão do produto gênico, levando potencialmente à formação de células cancerígenas, e a identificação de mutações genéticas por meio de sequenciamento de DNA é de alta utilidade. Atualmente, a resistência é geralmente diagnosticada durante o tratamento após um longo período de administração da droga. Ao longo do tempo, podem ser encontradas mutações específicas que conferem resistência a inibidores da tirosina quinase, por exemplo, inibidores do Receptor do Fator de Crescimento Epitelial (EGFR). A detecção de mutações tais como o T790M no gene EGFR utilizando PCR ou sequenciamento de DNA indica resistência à inibição da tirosina quinase EGFR e eliminaria a possibilidade de tratar pacientes com tais inibidores, especialmente no caso de câncer do pulmão de células não pequenas. Métodos para uma avaliação rápida da resistência a drogas existem atualmente. Três classes de procedimentos de teste são geralmente usadas: testes de cultura de células tumorais frescas, testes de biomarcadores de câncer e testes de tomografia por emissão de pósitrons (PET). A resistência ao fármaco pode ser diagnosticada antes do tratamento in vitro com testes de cultura de células tumorais frescas, e após um curto período de tratamento in vivo com testes de PET. Veja-se Lippert, T. et al. (2011). “Current status of methods to assess cancer drug resistance”. Int. J. Med. Sci. 8 (3): 245-253.
[0632] Além disso, como a presença de células tumorais dentro dos nódulos linfáticos de drenagem é indicativa do potencial metastático do câncer, a determinação do perfil de resistência das células tumorais que já escaparam do tumor primário é de maior importância. A amostragem representativa de nódulo linfáticos extirpados (ou outros tecidos linfáticos) seguida pelos métodos acima para avaliar a resistência terapêutica será de alta utilidade. O sistema linfático inclui nódulo linfáticos (tal como nódulo linfáticos cervicais, nódulo linfáticos lombares, nódulo linfáticos pélvicos, nódulo linfáticos inguinais e nódulo linfáticos auxiliares), bem como outros órgãos compostos de tecido linfático (tal como o baço e o timo), e deve ser entendido como incluindo tecidos linfáticos da glândula mamária, cisterna do quilo, tecidos linfáticos do membro inferior, duto torácico e tecidos linfáticos do membro superior). Atualmente, a análise de marcadores de resistência em nódulo linfáticos e tecidos linfáticos não é prática devido à quantidade limitada de amostra. No entanto, os métodos de amostragem representativos aqui revelados fornecem uma maneira de caracterizar o perfil genômico deste tecido.
USO DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS PARA A PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE TUMOR OU ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE TUMOR E VACINAS ANTITUMORAIS
[0633] Como mencionado supra, outra aplicação das amostras do objeto da presente invenção para o isolamento de células tumorais e antígenos derivados destes que podem ser utilizados na produção de anticorpos específicos para o tumor ou na fabricação de vacinas contra o câncer ou tumorais.
[0634] Uma abordagem para a vacinação contra o câncer é separar as proteínas das células cancerosas e imunizar os pacientes com câncer contra essas proteínas, na esperança de estimular uma reação imunológica que possa matar as células cancerígenas. Vacinas terapêuticas contra o câncer estão sendo desenvolvidas para o tratamento de câncer de mama, pulmão, cólon, pele, rim, próstata e outros. De fato, uma dessas vacinas desenvolvida pela Dendreon Corporation para o tratamento do câncer de próstata recebeu aprovação da Food and Drug Administration (FDA) para uso no tratamento de pacientes com câncer de próstata em 29 de abril de 2010. A aprovação da vacina Provenge® estimulou renovado interesse neste tipo de terapia.
[0635] Por exemplo, as células tumorais ou antígenos de superfície celular clivados proteoliticamente derivados de células tumorais identificadas em amostras tumorais homogeneizadas de acordo com a divulgação podem ser utilizados no desenvolvimento de vacinas terapêuticas ou profiláticas eficazes contra tumores. Estes antígenos podem estar nus ou multimerizados ou conjugados com outras porções, por exemplo, outras proteínas, adjuvantes ou carregados nas células, por exemplo, células dendríticas. Foi demonstrado que o tratamento proteolítico de células cancerosas vivas pode liberar alvos antigênicos que são suficientes para induzir uma resposta imune anti-câncer que excede a de células cancerosas não tratadas in vitro. (Lokhov et al., J Cancer 2010 1: 230-241).
[0636] Em particular, a divulgação contempla vacinas de tumor contendo uma ou uma mistura de diferentes antígenos derivados de células tumorais isoladas de uma amostra particular do paciente, essencialmente a produção de uma “vacina contra o câncer personalizada” de modo que um paciente possa ser tratado com porção de estímulo imunológico específica ao seu tipo particular de tumor. Em geral, estas vacinas compreenderão uma quantidade eficaz de tais antígenos para gerar uma resposta imune eficaz, por exemplo, uma resposta de CTL específica de antígeno contra células tumorais expressando os antígenos particulares. Como mencionado, em alguns casos estes antígenos podem ser carregados em outras porções, por exemplo, células dendríticas. Geralmente, essas vacinas também compreenderão outros adjuvantes imunológicos, por exemplo, citocinas, agonistas de TLR, agonistas ou antagonistas de TNF/ R, agentes que modulam os inibidores de ponto de verificação e similares. Embora, no nível mais básico, a própria amostra representativa possa ser usada diretamente como terapêutica. Por exemplo, um tumor primário removido de um doente pode ser homogeneizado de acordo com os métodos aqui indicados e a amostra representativa reinjetada no doente para gerar uma resposta imune contra os antígenos tumorais contidos na amostra. Espera-se que a amostra representativa em si contenha o perfil de antígeno tumoral mais diverso, pois compreende todos os subclones (por exemplo, majoritário, primário, secundário, baixa prevalência, etc.).
[0637] Além disso, a divulgação contempla ainda a utilização de tais antígenos para a produção de anti-soros e anticorpos monoclonais. Estes anticorpos podem ser utilizados para fins de diagnóstico, isto é, para a detecção de células tumorais ou antígenos em amostras. Alternativamente, tais anticorpos, particularmente anticorpos humanos ou humanizados específicos para tais antígenos tumorais, podem ser utilizados terapeuticamente no tratamento de cânceres que expressam estes antígenos. Os métodos de produção de anticorpos para uso potencial em terapia são bem conhecidos na técnica.
[0638] Além disso, a divulgação contempla ainda a utilização das amostras representativas do sujeito para identificar a população de receptores de células B e/ ou de receptores de células T que, por sua vez, podem ser utilizadas para informar a geração de vacinas estratégicas.
[0639] Além disso, amostras representativas geradas pelos métodos realizados também podem ser usadas para desenvolver sistemas CART.
USO DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS PARA A DETECÇÃO DE NEOANTÍGENOS
[0640] A identificação de neoantígenos de células de câncer isoladas está de suma importância para o tratamento de um sujeito com câncer(es). Como tal, as amostras geradas utilizando a divulgação podem estar sujeitas a quaisquer métodos de diagnóstico relevantes, tais como, mas não limitados àqueles discutidos no presente pedido, para identificação de um biomarcador de neoantígeno com uma amostra de tumor.
[0641] Os neoantígenos resultam de mutações que ocorrem durante o crescimento do tumor e diferem dos antígenos nativos aos quais o sistema imunológico é tolerante. Evidência de montagem sugere que rejeição imunológica de tumores, por exemplo, o que é visto com moduladores de ponto de verificação, pode ser mediada por reconhecimento de neoantígenos. Os neoantígenos têm o potencial de: (1) marcar um tumor de forma única (em relação a células não tumorais) para reconhecimento e destruição, por exemplo, no sistema imunológico (ver Lennerz et al., 2005, Proc Natl Acad Sci EUA. 102 (44) : 16013-8, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade); e (2) evitar tolerância central e, às vezes, periférica, e assim ser reconhecido para tratamento de câncer direcionado (Veja Gotter et al. “Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters.”). Exp. Med. 199.2 (2004): 155166, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Ver US 2011/0293637 A1, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0642] Inovações tecnológicas recentes tornaram possível divulgar a resposta imune a neoantígenos específicos de pacientes que surgem como consequência de mutações específicas do tumor, e dados emergentes sugerem que o reconhecimento desses neoantígenos é um fator importante na atividade de imunoterapias clínicas. Estas observações indicam que a carga neoantígena pode formar um biomarcador na imunoterapia do câncer e fornecer um incentivo para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Veja Schumacher, TN e Schreiber, RD (2015) Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348: 623 0. 69-74, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0643] Com base nos dados obtidos ao longo dos últimos anos, é plausível que a reatividade específica do neoantígeno forme um importante “ingrediente ativo” das imunoterapias bem sucedidas do câncer. Em outras palavras, o dano genético que por um lado leva ao crescimento oncogênico também pode ser alvo do sistema imunológico para controlar malignidades. Com base nesse achado, será importante planejar intervenções terapêuticas pelas quais a reatividade específica de neoantígenos seja seletivamente aprimorada. Por causa da expressão restrita a tumor de antígenos que estão sendo direcionados, essas imunoterapias personalizadas de câncer oferecem a promessa de alta especificidade e segurança. Concebivelmente, o aumento da reatividade específica do neoantígeno que pode ser conseguida com estas imunoterapias personalizadas aumentará ainda mais o espectro de malignidades humanas que respondem à imunoterapia do câncer. Veja Schumacher, TN e Schreiber, RD (2015) Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348: 6230. 69-74, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0644] Os neoantígenos podem compreender mutações pessoais únicas para cada paciente e que mutações de número dramaticamente grande de oncogenes. O subconjunto dessas mutações que alteram as sequências de codificação de proteína também cria novos antígenos pessoais - neoantígenos - que podem fornecer o sinal de “estrangeiro” necessário para a imunoterapia do câncer. Veja Hacohen et al. Getting Personal with Neoantigen- based Therapeutic Cancer Vaccines. Cancer Immunol Res; 1 (1); 11-15. ©2013 AACR.
[0645] Como discutido acima, as vacinas de peptídeo de câncer constituem outra abordagem para induzir e potenciar as respostas imunológicas antitumorais. Uma abordagem que visa antígenos tumor-específicos gerados a partir de mutações genéticas ocorrendo em células tumorais durante a transformação neoplásica ajudariam no tratamento personalizado do paciente. A resposta imune a esses chamados “neoantígenos do câncer” não pode ser atenuada pela tolerância central do hospedeiro no timo e não desencadeia reações autoimunes. Desenvolvimentos recentes em genômica e bioinformática, incluindo sequenciamento massivamente paralelo (MPS) e algoritmos de predição de epiítopo, proporcionaram um grande avanço, permitindo a identificação mais abrangente e eficiente de antígenos alvo. Veja Kitano, I.A. et al. (2015) Cancer Neoantigens: A Promising Source of Immunogens for Cancer Immunotherapy. J Clin Cell Immunol 6: 322, que é aqui incluído por referência em sua totalidade.
[0646] Há um interesse crescente em terapias contra o câncer que visam atingir células cancerígenas com o próprio sistema imunológico do paciente (por exemplo, vacinas contra o câncer), porque tais terapias podem mitigar/ eliminar algumas das desvantagens descritas aqui. As vacinas contra o câncer são tipicamente compostas de antígenos tumorais e moléculas imunoestimuladoras (por exemplo, citocinas ou ligantes TLR) que trabalham em conjunto para induzir células T citotóxicas específicas para o antígeno que visam e destroem as células tumorais. Vacinas contra o câncer atuais tipicamente contêm antígenos tumorais compartilhados, que são proteínas nativas (ou seja - proteínas codificadas pelo DNA de todas as células normais do indivíduo) que são seletivamente expressas ou superexpressas em tumores encontrados em muitos indivíduos. As vacinas que contêm neoantígenos específicos do tumor e específicos do paciente são uma via terapêutica potencialmente útil para tratar um indivíduo que sofre de um câncer. Ver WO 2015/095811 A2, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0647] Consequentemente, amostras representativas preparadas a partir de tecido, por exemplo, tumores ou nódulo linfáticos, obtidas de pacientes com câncer podem ser usadas para identificar a carga de neoantígeno que forma um biomarcador na imunoterapia do câncer e, assim, fornecer o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que aumentam seletivamente reatividade da célula T contra a classe ou classes de antígenos identificadas.
[0648] As técnicas atuais de amostragem no laboratório de patologia diagnóstica concentram-se em tomar amostras prescritas de locais anatômicos específicos em tecidos ressectados cirurgicamente. Como indicado nas caixas tracejadas na Figura 56, a prática padrão histórica é adquirir 5-7 pequenas áreas de um tumor ressectado para cumprir os requisitos do sistema de estadiamento TNM. As amostras ressecadas são posteriormente processadas em blocos de tecido inclusos em parafina, seções histológicas são tomadas e o tumor é colocado em um estágio e opcionalmente analisado por biomarcadores usando técnicas de coloração comuns. Uma vez que todas as informações de diagnóstico tenham sido coletadas e revisadas por um patologista anatômico, o tecido cirúrgico residual, incluindo qualquer tecido tumoral remanescente, é destruído por incineração.
[0649] O aspecto inventivo deste trabalho envolve a utilização do material residual ressectado cirurgicamente, uma fonte de tecido que foi universalmente destruída desde a aceitação mundial do sistema de estadiamento TNM em meados da década de 1950. Em vários pontos dentro do fluxo de trabalho atual, o tecido ressectado cirurgicamente pode ser processado para interrupção por meio de múltiplos métodos de dissociação de tecidos (incluindo, mas não se limitando a, misturar, picar/ fatiar e espremer). Como mostrado na Figura Z, o tecido pode ser desassociado imediatamente após a remoção cirúrgica (tecido fresco), após a fixação do tecido, após a aquisição da amostra TNM, ou após as amostras de tecido terem sido incorporadas em cera de parafina. Uma vez suficientemente homogeneizado, o tecido dissociado é referido como uma “Amostra Representativa”. O atributo único e imprevisto da Amostra Representativa é que ela contém toda a diversidade que existia dentro do tecido ressectado cirurgicamente original, tal como a diversidade de tecidos, células e todas as biomoléculas.
[0650] Outros aspectos inventivos desta aplicação incluem todo o processamento adicional de amostras representativas frescas e fixas, uma vez que tais quantidades elevadas de material cirúrgico residual humano nunca foram amostradas em oncologia de diagnóstico, uma vez que este material foi destruído desde os anos 50. Como indicado na Figura 56, em algumas formas de realização, as biomoléculas podem ser isoladas diretamente a partir de uma amostra representativa utilizando novas técnicas e analisadas adicionalmente utilizando ferramentas de análise atuais e futuras. Biomoléculas como o DNA podem ser isoladas e sequenciadas usando NGS, e os dados resultantes podem ser usados para calcular a porcentagem do tumor que contém uma mutação alvo específica. Além disso, as taxas de mutação podem ainda ser utilizadas para determinar a diversidade de sub-clones tumorais contidos dentro de um tumor ressectado. A análise de proteínas utilizando ELISA, imuno-precipitação ou espectrofotometria de massa pode ser utilizada para determinar a presença de um complexo proteico alvo, ou dos estados de ativação de tirosina-quinases em um tumor.
[0651] Em outra forma de realização, uma porção da amostra representativa, na forma de um material homogeneizado, pode ser processada e embebida exclusivamente em cera de parafina para ser analisada utilizando a metodologia histológica atual. A coloração de amostras representativas incorporadas pode ser lida e interpretada por um patologista anatômico, ou formadas imagens usando um sistema de imagem digital. Uma vez obtida a imagem digital, a heterogeneidade no resultado da coloração pode ser quantificada e usada para representar matematicamente a heterogeneidade espacial da expressão de proteínas, alterações no número de cópias gênicas ou expressão de RNAm.
[0652] Em outra forma de realização, uma porção de uma amostra representativa pode ser processada adicionalmente utilizando novos métodos de dissociação mecânica e enzimática para gerar uma suspensão de núcleos individuais. Núcleos isolados de amostras representativas podem ser corados usando novos métodos de coloração para análise posterior usando citometria FLOW para determinar a porcentagem de células que expressam certos fatores de transcrição nuclear e outros indicadores de alterações fenotípicas. Alternativamente, os núcleos corados podem ser isolados usando FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) ou subtração por afinidade de esferas magnéticas, seguido por isolamento de DNA e análise de NGS ou PCR. Núcleos isolados podem alternativamente ser plaqueados em lâminas de vidro e submetidos a técnicas histológicas como IHC e ISH.
[0653] Ainda em outra forma de realização, uma porção de uma amostra representativa pode ser ainda processada utilizando novos métodos de disassociação mecânica e enzimática para gerar uma população de células únicas. As células geradas a partir de amostras representativas de tecidos ressectados podem ser posteriormente analisadas por citometria FLOW para interrogar a diversidade de tipos de células, fenótipos e outros biomarcadores, como oncogênes e imunomoduladores direcionáveis em células tumorais, e imuno-fenotipagem de células imunes removidas de um tumor. As células podem ainda ser processadas por FACS para isolar células expressando biomarcadores específicos. Podem ser isoladas biomoléculas de células separadas por FACS para testes analíticos adicionais, ou as células podem ser plaqueadas em lâminas de vidro para métodos de detecção histológica, incluindo IHC e ISH.
[0654] Como o tecido cirúrgico residual, especialmente na oncologia do tumor sólido, foi destruído nos últimos 50 anos, dados derivados de novas técnicas representativas de amostragem e análise gerarão dados clínicos oncológicos sem precedentes. Tais “Dados Oncológicos Representativos” (Figura 56) permitirão, pela primeira vez, a capacidade de calcular a diversidade mutacional e fenotípica em células tumorais, bem como o estado da resposta imunitária antitumoral e outros tecidos normais. Novos “Dados de Oncologia Representativa” serão usados para melhorar o prognóstico de pacientes com câncer, prever a recorrência no local da cirurgia ou metástases à distância, detectar todas as alterações “alvo” disponíveis, selecionar para inclusão em um ensaio clínico e determinar combinação de terapias de alvo, dosagem e tempo.
[0655] A presente divulgação foi descrita em detalhe. De modo a ilustrar melhor a presente divulgação e os seus benefícios intrínsecos, os seguintes exemplos discutindo experiências conduzidas pelos inventores são fornecidos.
[0656] Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar, a divulgação reivindicada.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS DE TECIDOS REPRESENTATIVAS
[0657] Amostras de tecido representativas foram derivadas de amostras de tumor fixadas em formalina utilizando a metodologia de homogeneização aqui descrita e representada esquematicamente na Figura 3. Em geral, as amostras de tumor, isto é, amostras de tumor fixadas com formalina foram opcionalmente removidas do tecido normal adjacente envolvente e desassociadas mecanicamente, produzindo uma amostra representativa contendo todos os componentes do tumor ressectado original. A amostra representativa pode então ser processada posteriormente para análise a jusante. Tal processamento incluiu o pré-condicionamento em tampão CC1 a 85 °C, antes de ser transferido para tampão (por exemplo, PBS) contendo 60 mg/ ml de colagenase H e 1 mM de CaCl2. O tecido homogeneizado resultante tratado com enzima foi, em seguida, incubado com colagenase H durante pelo menos cerca de 30 minutos a 40 °C antes de ser devolvido ao tampão de CC1 e aqueceu-se a 85 °C durante cerca de 10 minutos para inativar qualquer enzima colagenase restante. A amostra representativa foi então usada para derivar subamostras que foram então usadas para uma variedade de ensaios de diagnóstico.
MÉTODOS
[0658] Materiais: O cisalhamento mecânico do tecido foi realizado usando um misturador Hamilton Beach Single Serve (Walmart, Tucson, AZ) ou um sistema de controle de moinho de tubo IKA Works (0004180001) da IKA- Works (Staufen em Breisgau, Alemanha) e usando um dissociador GentleMACS da Miltenyi Biotec (Teterow, Alemanha). Observe os vários tamanhos dos fragmentos de tecido após a homogeneização, variando de algumas células até aglomerados contendo dezenas de milhares de células (Figura 15). O condicionamento de calor e pH de células foi realizado em tampão Cell Conditioning 1 (CC1) da Ventana Medical Systems (Tucson, AZ; catálogo # 950124). O AccuMax® foi obtido da Innovative Cell Technologies (San Diego, CA). A colagenase H (11074032001) foi obtida da Roche (Basel, Suíça). Utilizaram- se os seguintes anticorpos da Ventana Medical Systems (Tucson, AZ): anti-PD- L1 de coelho (SP263), anticorpo primário monoclonal (790-4905); anti-Ber-EP4 de camundongo, anticorpo monoclonal (760-4383); anti CD8 de coelho (SP57), anticorpo primário monoclonal (790-4460); anti-HER-2/ neu de coelho (4B5), anticorpo primário monoclonal (790-2991).
[0659] Amostras de tecido: Todas as amostras de tecido e cRNAe foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% durante 24 horas na Ventana Medical Systems. O xenoenxerto positivo para HER2 foi gerado na Ventana Medical Systems. CRNAe de frango e de peixe foram obtidos do Walmart (Tucson, AZ). Amígdalas humanas foram obtidas do Northwest Medical Center (Tucson, AZ).
[0660] Digestão e Análise: A amostra foi pré-condicionada em tampão CC1 a 85 °C e subsequentemente tratada com AccuMax® contendo 1 mg/ ml de colagenase H durante 1 hora à temperatura ambiente, depois incubada durante 1 hora a 40 °C. A digestão bioquímica dos tecidos foi analisada através da execução da amostra digerida através das seguintes malhas mícron em ordem sequencial: 500, 300, 100, 40, 20, 10, 6 e 1 mícron. As frações de fluxo que passou e de retenção foram pesadas para cada malha.
[0661] Coloração com hematoxilina e eosina: Amostras representativas foram plaqueadas em 70 μL de metanol em lâminas VWR plus. A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada usando uma plataforma Ventana Medical Symphony Systems (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) e os correspondentes reagentes H&E Symphony (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ).
[0662] Imuno-histoquímica: Amostras representativas foram plaqueadas em 70 μl de metanol em lâminas VWR plus. A imuno-histoquímica com base em DAB de campo claro (IHC) foi realizada utilizando uma plataforma BenchmarkXT da Ventana Medical Systems (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). A visualização dos biomarcadores foi realizada utilizando o kit de detecção DAB OptiView da Ventana (760-700). Os anticorpos foram incubados durante 4 minutos.
[0663] Isolamento de RNA: O RNA foi isolado a partir de amostras representativas de amígdalas humanas utilizando um método de fenol ácido descrito anteriormente em Chen et al. 2007.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0664] Utilizando os métodos acima descritos, foram criadas amostras representativas de diferentes tipos de amostras, incluindo amostras de espécimes de tecido clínicos de tumores humanos e tecidos fixos de animais.
[0665] O pré-condicionamento celular em tampão CC1 a 85 °C foi acoplado com digestão enzimática da matriz extracelular para criar uma amostra variando em tamanho de células únicas a aglomerados de pequenas células.
[0666] Utilizou-se uma enzima específica para proteínas da matriz extracelular, isto é, colagenase H, em vez de uma proteínase geral, por exemplo, tripsina, para minimizar a perda de biomarcadores associados à membrana durante a digestão bioquímica do tecido.
[0667] A maior parte da amostra foi digerida em fragmentos com tamanho de 100 mícron e menor (Fig. 4). Aqui, o peso percentual da amostra digerida foi utilizado para caracterizar os fragmentos de tamanhos diferentes na amostra representativa bioquimicamente digerida após filtração através de uma série de malhas micrométricas.
[0668] Células não tumorais foram filtradas, passando a amostra através de filtros de malha de 6 mícrons e menores, como é visto na coloração H&E. As Figuras 5A-C mostram coloração H&E das frações de fluxo que passaram e retidas recolhidas após filtração em série da amostra representativa digerida bioquimicamente. A Figura 7A ilustra a coloração de H&E da fração retida na malha (superior) e o fluxo (inferior) de malha de 500, 300, 100 e 40 mícrons. A Figura 7B ilustra a coloração de H&E da fração retida na malha (superior) e o fluxo (inferior) de malha de 30, 20 e 10 mícrons. A Figura 7C ilustra a coloração H&E da fração retida na malha (superior) e o fluxo através (inferior) da malha de 6 e 1 mícron.
[0669] A coloração H&E do fluxo através do filtro de 6 mícrons e 1 mícron (Figura 5C, em particular) não mostrou núcleos aumentados indicativos de células tumorais. Por conseguinte, esta abordagem pode ser utilizada para enriquecer células tumorais na amostra representativa, bem como para isolar plaquetas formadas por tumores e outras células sanguíneas da amostra.
[0670] O método acima descrito foi primeiro testado em uma amostra de ensaio constituída por 300 gramas de vários tecidos fixos de animais, incluindo peito de frango, fígado de galinha e filete de peixe. De modo a modelar um sub-clone de tumor raro, foi adicionado um pequeno xenoenxerto positivo para HER-2 de 0,4 gramas à amostra de tecido. O tecido foi mecanicamente desassociado e filtrado usando uma prensa francesa antes de ser usado neste experimento. A amostra de tecido foi então pré-condicionada em tampão CC1 durante 15 minutos a 85 °C. A amostra de tecido pré-condicionada foi homogeneizada utilizando o Dissociador GentleMACS (Figura 6D) e foi recolhida uma amostra de 1 mL a cada 5 minutos. Cada amostra coletada foi passada através de uma malha de 600pcs para medir a dissociação do tecido. O pré- condicionamento sozinho foi capaz de promover alguma digestão, mas a reação atingiu um patamar após 10 minutos (Figura 6A). Comparando a capacidade da colagenase H isolada versus colagenase H em combinação com o pré- condicionamento CC1 para dissociar a amostra, determinou-se que o pré- condicionamento CC1 foi capaz de promover a digestão com colagenase H. Em particular, o pré-condicionamento de CC1 seguido por digestão com colagenase H durante pelo menos 30 minutos proporcionou a melhor redução no tamanho de partícula como medido pelo filtro 600pcs (Figura 6B). A representatividade da amostra foi testada plaqueando várias alíquotas e analisando cada uma para células positivas para HER-2 utilizando DAB-IHC. As células positivas para HER- 2 foram detectadas em cada lâmina criada (Figura 6C). Considerando as razões em peso (0,4 grama de xenoenxerto positivo para HER-2 a 300 gramas de cRNAe), o método descrito acima gerou uma amostra representativa que permitiu a detecção de sub-clones com uma prevalência de pelo menos 0,1%.
[0671] Em seguida, o protocolo foi testado em tecidos de nódulo linfáticos humanos (amígdala). Uma amígdala ressecada foi mecanicamente dissociada em um moinho de tubo IKA para criar uma amostra representativa de nódulo linfático. O pré-condicionamento com CC1 seguido de uma digestão de 30 minutos com colagenase H desassociou o tecido da amígdala (Figura 7A). O curso temporal da digestão com colagenase H foi prolongado para 90 minutos, e observou-se que a reação enzimática estabilizou em torno de 60 minutos (Figura 7B). Consequentemente, espera-se que a maior parte do tecido humano necessite apenas de ser digerido com Colagenase H durante cerca de 30 a cerca de 60 minutos, mas não mais que cerca de 90 minutos.
[0672] Em seguida, utilizaram-se quatro alíquotas de 500 μL da amostra de tecido de amígdalas humanas dissociadas para isolar ácidos nucleicos. Duas alíquotas de 500 μL foram armazenadas como pellets de células a -20 °C, enquanto as outras duas alíquotas de 500μL foram incluídas em parafina. Isolou-se o RNA de todas as alíquotas, mas o rendimento foi muito superior nas alíquotas não embebidas em parafina (Tabela 1). TABELA 1 - RNA TOTAL ISOLADO A PARTIR DE AMOSTRAS DE TECIDO DE AMÍGDALA HUMANA DISSOCIADA, FIXADO EM FORMALINA (FF) E EMBUTIDO PARAFINA AFIXADA EM FORMALINA (FFPE).
Figure img0001
[0673] Estes resultados indicam que as amostras representativas são adequadas para testes de diagnóstico, tais como sequenciamento genômico e transcriptômico, e, além disso, que as amostras representativas geradas utilizando os métodos aqui descritos são uma melhor fonte de material do que amostras de tecido embebidas em parafina tradicionais.
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS TUMORAIS REPRESENTATIVAS
[0674] Amostras tumorais representativas foram geradas a partir de uma amostra de rim e uma amostra de pulmão.
MÉTODOS
[0675] Materiais: O cisalhamento mecânico de tecido foi realizado usando um Sistema de Controle de Moinhos de Tubos da IKA Works (0004180001) da IKA-Works (Staufen im Breisgau, Alemanha) e usando um Dissociador de GentleMACS da Miltenyi Biotec (Teterow, Alemanha). O condicionamento de calor e pH de células foi realizado em tampão Cell Conditioning 1 (CC1) da Ventana Medical Systems (Tucson, AZ; catálogo # 950124). A colagenase H (11074032001) foi obtida da Roche (Basileia, Suíça). Utilizaram-se os seguintes anticorpos da Ventana Medical Systems (Tucson, AZ): anti-PD-L1 de coelho (SP263), anticorpo primário monoclonal (790-4905); anti-Ber-EP4 de camundongo, anticorpo monoclonal (760-4383); anti CD8 de coelho (SP57), anticorpo primário monoclonal (790-4460); anti-HER-2/ neu de coelho (4B5), anticorpo primário monoclonal (790-2991).
[0676] Amostras clínicas: As amostras de tecido foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% durante 24 a 72 horas no Tucson Medical Center e no Vanderbilt Medical Center. A biopsia do tumor pulmonar foi obtida da Tucson Medical Center (Tucson, AZ). Os fragmentos de biopsia do tumor do rim foram obtidos da Vanderbilt University (Nashville, TN).
[0677] Análise da Digestão: A digestão bioquímica dos tecidos foi analisada executando uma amostra de 1mL através de um filtro 600pcs e pesando o material que foi coletado na malha.
[0678] Coloração com hematoxilina e eosina: Amostras representativas foram plaqueadas em 70 μL de metanol sobre lâminas VWR plus. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada utilizando uma plataforma Ventana Medical Systems Symphony (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) e os correspondentes Reagentes H&E Symphony (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ).
[0679] Imunohistoquímica: Amostras representativas foram plaqueadas em 70 μl de metanol em lâminas VWR plus. A imuno-histoquímica com base em DAB de campo claro (IHC) foi realizada utilizando uma plataforma BenchmarkXT da Ventana Medical Systems (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). A visualização dos biomarcadores foi realizada utilizando o Kit de Detecção OptiView DAB da Ventana (760-700). Os anticorpos foram incubados durante 4 minutos.
[0680] Isolamento de RNA: O RNA foi isolado a partir de amostras representativas de amígdalas humanas usando um método de fenol ácido descrito anteriormente em Chen et al. 2007.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0681] Em particular, uma amostra representativa foi gerada a partir de um tumor do tamanho de uma bola de beisebol de um homem com 61 anos de idade de acordo com a metodologia aqui descrita e mostrada na Figura 3. Utilizou-se coloração padrão de H&E para visualizar os tamanhos dos fragmentos de tecido na amostra de rim após desassociação mecânica, precondicionamento e digestão enzimática (Figura 8A). A amostra foi então submetida a análise por DAB-IHC para três biomarcadores diferentes: PD-L1 (Figura 8B), CD8 (Figura 8C) e Ep-Cam (Figura 8D). Todas as três proteínas foram detectadas na amostra clínica representativa do tumor renal.
[0682] Adicionalmente, uma amostra representativa foi gerada a partir de uma porção de um tumor de pulmão do tamanho de US$ 0,50 de uma mulher de 87 anos de idade (Figura 9A). Uma pequena seçãoo foi cortada da amostra de tecido clínico (Figura 9A) e processada de acordo com as práticas de patologia correntes. O tecido restante foi utilizado para criar uma amostra representativa de acordo com a metodologia aqui descrita e mostrada na Figura 1. Utilizou-se coloração padrão de H&E para visualizar os tamanhos dos fragmentos de tecido na amostra de pulmão após a desassociação mecânica, o précondicionamento e a digestão enzimática (Figura 9B).
[0683] A amostra representativa e as seções de tecido tradicionais (“bloco de tecido”) foram então submetidas a análise de DAB-IHC para três biomarcadores diferentes: PD-L1 (Figura 9C), CD8 (Figura 9D) e Ep-CAM (Figura 9E). Quantidades semelhantes de coloração foram observadas na amostra representativa e nas secções de tecido tradicionais, indicando que não houve perda de sinal para subclones de grande prevalência utilizando os métodos inventivos.
[0684] Estes resultados demonstram que o acoplamento de manipulação mecânica de tecido com digestão bioquímica pode criar uma amostra representativa da heterogeneidade e diversidade em uma variedade de tipos de tumor. Além disso, as amostras representativas são adequadas para uso em vários testes diagnósticos, como coloração de hematoxilina e eosina, análise imuno-histoquímica, isolamento de ácido nucléico e sequenciamento, e facilitam a detecção de sub-clones de tumor raros, melhorando assim o diagnóstico clínico e tratamento personalizado do câncer.
EXEMPLO 3: DETECÇÃO IMUNO-CITOQUÍMICA DE PROTEÍNAS EM AMOSTRAS REPRESENTATIVAS DERIVADAS DE ESPÉCIMES FIXAS INTACTAS EM FORMALINA
[0685] Amostras de tecido e de tumor representativas foram geradas a partir de um tecido fixo ou amostras de tumor utilizando a metodologia de homogeneização aqui descrita e representada esquematicamente na Figura 3, e proteínas de interesse, por exemplo, marcadores prognósticos ou preditivos biologicamente e/ ou medicamente, foram detectados na amostra representativa utilizando imuno-citoquímica (ICC).
[0686] A detecção imuno-histoquímica (IHC) de proteínas de seções histológicas de amostras biológicas fixas é uma prática comum em patologias anatômicas que afetam decisões médicas, particularmente no contexto de oncologia de tumores sólidos. A detecção imuno-citoquímica (ICC) de proteínas de espécimes fixos também afeta as decisões médicas, por exemplo, no exame citológico de derrames pleurais de carcinoma metastático, e difere da IHC, pois a amostra originalmente carece de arquitetura histológica. O CCI é reservado para espécimes citológicas, por exemplo, citologia cervical via Papanicolau (Pap smear) ou preparo de camada fina. As seções histológicas, embora mantendo muitas características importantes para a prática atual de patologia de tumores sólidos, tais como a arquitetura estromal versus a arquitetura do tumor, representam uma fração do conteúdo celular do tumor e, por conteúdo bio- informacional de extensão de um espécime biológico fixo inteiro. A reformatação de espécimes de tumor fixo intacto para produzir uma amostra representativa da totalidade do tumor, e uma que possa fornecer informação estatisticamente alimentada com potencial valor médico, é crítica para o futuro da medicina personalizada estratégica.
MÉTODOS
[0687] Anticorpos: A Tabela 2 lista os anticorpos e os espécimes fixos utilizados neste estudo. Os anticorpos são vendidos pela Ventana Medical Systems, Inc.TABELA 2 : ANTICORPOS UTILIZADOS NA ANÁLISE DO ICC DA AMOSTRA REPRESENTATIVA.
Figure img0002
[0688] Amostras de tecido: Todas as amostras de tecido foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% durante 24 horas em Ventana Medical Systems. Amígdalas humanas foram obtidas do Northwest Medical Center (Tucson, AZ). Os tecidos animais foram adquiridos a partir de fontes comerciais, por exemplo, foi obtido fígado de galinha da loja.
[0689] Materiais: O cisalhamento mecânico do tecido foi realizado usando um Sistema de Controle de Moinhos de Tubos da IKA Works (0004180001) da IKA-Works (Staufen in Breisgau, Alemanha) e usando um Dissociador GentleMACS da Miltenyi Biotec (Teterow, Alemanha). O condicionamento de aquecimento e pH de células foi realizado em tampão Cell Conditioning 1 (CC1) da Ventana Medical Systems (Tucson, AZ; catálogo # 950124).
[0690] Misturando. Foram adicionados 200 μl de óleo mineral a uma vedação de mistura no moinho de tubo IKA (Part # MT 40.100) para evitar fugas durante a homogeneização. 5 gramas de tecido foram adicionados ao moinho juntamente com 1x volume de tecido de PBS. A amostra foi centrifugada a 15000 rpm durante 2 minutos (10 segundos de centrifugação, 2 segundos de pausa entre os spins). A amostra homogeneizada foi removida do moinho e adicionada a um dissociador GentleMACS (Part # 30-093-237) juntamente com o dobro do volume de PBS. A amostra foi misturada utilizando o programa h_tumor_01 (36 segundos de rotação), que foi repetido um total de três vezes antes da amostra ser vertida sobre um tubo cônico de 50 mL e centrifugada a 300 x g durante 3 minutos. A camada aquosa de PBS foi removida para condicionamento.
[0691] Condicionamento celular: foi adicionada solução de condicionamento celular pré-aquecido de 1 volume (CC1). A amostra foi então colocada em um bloco de calor ajustado para 85 graus C por 5 minutos. Em seguida, a amostra foi misturada utilizando o dissociador GentleMACS (3 x programa h_tumor_02). A etapa de aquecimento e a etapa de mistura foram realizados mais duas vezes cada, antes de centrifugar a amostra a 300 x g durante 3 minutos.
[0692] Plaqueamento : Uma alíquota de 100 μl da amostra foi realocada em um epitubo, e 1 volume equivalente de 100% de metanol foi adicionado. Foram utilizados 70 μl de metanol/ amostra por lâmina de superfrost VWR para plaqueamento e inclusão em parafina
[0693] Imuno-citoquímica Automatizada: A imuno-citoquímica com base em DAB (ICC) de campo brilhante foi realizada em amostras representativas depositadas em lâminas de vidro carregadas positivamente utilizando uma plataforma Benchmark XT da Ventana Medical Systems, Inc. (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) com software de pesquisa. A detecção de DAB de cada anticorpo foi realizada utilizando o kit de detecção OptiView DAB (VMSI Cat # 760-700) com e sem o kit OptiView AMP (VMSI Cat # 760-099). A amplificação foi usada para produzir um baixo nível de fundo nos espécimes e para permitir tempos de incubação de anticorpos primários reduzidos. Todas as detecções foram totalmente automatizadas e realizadas em um autorcorante Benchmark XT (VMSI) após o condicionamento celular de amostras em tampão CC1 (VMSI Cat # 950-124) durante dois ciclos de 4 minutos. Todas as incubações de anticorpos primários foram realizadas a 37 °C durante 4 minutos (ver Resultados e Discussão), permitindo que o tempo total de operação permanecesse abaixo de 2 horas e 20 minutos. O único DAB ICC foi realizado utilizando o protocolo mostrado na Figura 10. A Figura 10 fornece um protocolo DAB ICC exemplificativo, apresentado nas passos 1 a 102, para a detecção de proteína em amostras representativas. Neste exemplo particular, o protocolo foi usado para detectar Her2.
[0694] A detecção multiplexada cromogênica foi realizada como descrito na Figura 11, na seguinte ordem: Ki-67 ^ CD20 ^ CD3. A desnaturação por calor das enzimas e os derretimentos de anticorpos primários foram realizados entre Ki-67 e CD20 e CD20 e CD3 através de incubação a 90 °C em tampão Cell Conditioning 2 (CC2) (VMSI Cat # 950-123) durante 12 minutos para prevenir a interferência cruzada de reatividade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0695] Para determinar se amostras representativas depositadas em lâminas de vidro podem ser coradas utilizando CCI automatizada, amostras de uma mistura preparada de tecido animal e espécimes de amígdala foram coradas para o biomarcador único DAB ICC (Figura 12). Figura 12 mostra a detecção de CD20, que demarca as células B, utilizando DAB ICC automatizado em uma amostra representativa preparada a partir de uma mistura de tecido animal e amostras de amígdalas humanas. O CD20 foi detectado em células do tecido das amígdalas humanas contidas na amostra representativa.
[0696] Uma incubação de anticorpos primários de quatro minutos com amplificação foi selecionada para minimizar o tempo de fundo e o tempo de execução (por exemplo, Protocolo Rep Dia- Her2 DAB, Figura 10). Todos os anticorpos testados (ver Tabela 2) foram determinados como compatíveis com este protocolo.
[0697] Foi também desenvolvido um protocolo para testar a viabilidade de detectar marcadores únicos utilizando fluorescência ICC (ver Figura 11). Por exemplo, o Her2 foi detectado utilizando ICC de fluorescência (Figuras 13A e 13B). Aqui, as Figuras 13A e 13B mostram a detecção de células Calu-3 Her2-positivas presentes em uma amostra representativa preparada a partir de tecido da amígdala e um tumor de xenoenxerto Her-2 positivo utilizando fluorescência ICC. A Figura 13A ilustra uma amostra representativa contendo células Calu-3 incubadas apenas com anticorpo secundário (controle negativo). O sinal de fundo em células Calu-3 geradas pelo anticorpo secundário é designado pela seta da linha tracejada. A Figura 13B ilustra uma amostra representativa contendo células Calu-3 que foi incubada com um anticorpo Her2 (4B5) antes da adição do anticorpo secundário. O sinal Her-2 em células Calu-3 é designado pela seta de linha sólida. O sinal de células não específicas menores derivadas da amígdala é observada sem a adição do anticorpo Her2 (4B5) (Figura 13A) e com a adição do anticorpo Her2 (4B5) (Figura 13B).
[0698] Em seguida, uma amostra representativa preparada a partir de uma amostra de amígdala foi preparada e colocada em uma lâmina de vidro para testar a análise com CCI cromogênico multiplexado. Os espécimes representativos de amígdala foram corados para três marcadores imunes, cada um detectado usando uma cor separada de acordo com o protocolo mostrado na Figura 14. A Figura 14 fornece um protocolo ICC cromogênico multiplex exemplificativo (apresentado nas etapas 1-225) para detecção de múltiplas proteínas em uma amostra representativa. Neste exemplo particular, foram utilizados anticorpos espécie-específicas para Ki-67, CD20 e CD3 e a deposição do cromogênio dirigida por conjugado enzima-espécie para detectar os três marcadores imunológicos.
[0699] Por exemplo, a multiplexação cromogênica foi realizada nas amostras de amígdalas representativas para detectar Ki-67, CD20 e CD3 usando anticorpos secundários espécie-específicos, seguido de deposição de cromogênio controlado por anti-espécies-conjugado enzimático com etapas de desnaturação por calor para eliminar a atividade da enzima. como descrito anteriormente em Wenjun Zang et al., “Quantum dot in situ hybridization”, WO 2014/139979. Detecções e sobreposições de cor biologicamente adequadas foram observadas nos espécimes representativos de amígdala submetidos a multiplex cromogênico (Figura 15).
[0700] Em seguida, o ICC foi realizado em amostras representativas preparadas a partir de amostras clínicas. Em particular, prepararam-se amostras representativas preparadas a partir de tumor de pulmão fixado com formalina ou tumor de rim fixado com formalina e testaram-se para PDL-1 (um marcador produzido por tumores para bloquear a imunidade antitumoral e um alvo para ditar imunoterapia), CD8 (um marcador de célula T crucial para compreender o nível de imunidade antitumoral) e Ep-Cam (um marcador indicativo de cânceres epiteliais). Cada um dos biomarcadores testados (PDL-1, CD8 e Ep-Cam) foi detectado, em níveis variados, nas amostras representativas preparadas a partir dos espécimes clínicos de tumor (ver Figuras 8A-8D e Figuras 9A-9D).
[0701] Estes resultados demonstram a detecção ICC de marcadores isolados e multiplexados totalmente automatizados em amostras representativas derivadas de um espécime de tecido fixo em formalina intacto e, além disso, mostra que uma amostra representativa do espécime de tecido fixo intacto oferece a capacidade de detectar subpopulações raras de células dentro da amostra.
EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS DE NÓDULO LINFÁTICOS E SEU USO PARA DETECTAR SUBCLONES RAROS
[0702] Este exemplo descreve a geração de uma amostra representativa do tecido linfonodal, o que permitiu a detecção sensível de células cancerígenas que podem resultar de metástase tumoral. Amostras de tecido representativas foram derivadas de amostras de tumor fixadas com formalina utilizando a metodologia de homogeneização aqui descrita e representada esquematicamente na Figura 3. Em geral, amostras tumorais, isto é, amostras de tumor fixadas em formalina foram inicialmente desassociadas mecanicamente e, em seguida, pré-condicionadas em tampão CC1 a 85 °C, antes de serem transferidas para tampão 1x tampão PBS.
MÉTODOS
[0703] Anticorpos: O anticorpo monoclonal de camundongo Anti- BRAFV600E (N.° de Catálogo 790-4855, Ventana Medical Systems, Inc.) foi utilizado para detectar b-Raf.
[0704] Amostras de tecido: Todas as amostras de tecido foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% durante 24 horas na Ventana Medical Systems. O xenoenxerto HER2-positivo ou BRAF foi gerado na Ventana Medical Systems. Amígdalas humanas foram obtidas do Northwest Medical Center (Tucson, AZ).
[0705] Materiais: O cisalhamento mecânico do tecido foi realizado usando um Sistema de Controle de Moinhos de Tubos da IKA Works (0004180001) da IKA-Works (Staufen in Breisgau, Alemanha) e usando um Dissociador de gentleMACS da Miltenyi Biotec (Teterow, Alemanha). O condicionamento por aquecimento e pH de células foi realizado em tampão Cell Conditioning 1 (CC1) da Ventana Medical Systems (Tucson, AZ; catálogo # 950124).
[0706] Mistura: Adicionou-se 200 μl de óleo mineral a uma vedação de mistura de tubo IKA (Part # MT 40.100) para evitar fugas durante a homogeneização. 5 gramas de tecido foram adicionados ao moinho juntamente com 1x volume de tecido de PBS. A amostra foi centrifugada a 15000 rpm durante 2 minutos (10 segundos de centrifugação, 2 segundos de pausa entre os spins). A amostra homogeneizada foi removida do moinho e adicionada a um dissociador GentleMACS (Part # 30-093-237) juntamente com o dobro do volume de PBS. A amostra foi misturada utilizando o programa h_tumor_01 (36 segundos de rotação), que foi repetido um total de três vezes antes da amostra ser vertida sobre um tubo cônico de 50 mL e centrifugada a 300 x g durante 3 minutos. A camada aquosa de PBS foi removida para condicionamento.
[0707] Condicionamento celular: foi adicionada solução de condicionamento celular pré-aquecido de 1 volume (CC1). A amostra foi então colocada em um bloco de calor ajustado para 85 graus C por 5 minutos. Em seguida, a amostra foi misturada utilizando o dissociador GentleMACS (3 x programa h_tumor_02). A etapa de aquecimento e a etapa de mistura foram realizadas mais duas vezes cada, antes de centrifugar a amostra a 300 x g durante 3 minutos.
[0708] Plaqueamento: Uma alíquota de 100 μl da amostra foi realocada para um epitubo, e 1 volume equivalente de 100% de metanol foi adicionado. Foram utilizados 70 μl de metanol/ amostra por lâmina de superfrost VWR para plaqueamento.
[0709] Imuno-citoquímica automatizada: A imuno-citoquímica com base em DAB (ICC) de Brightfield foi realizada em amostras representativas depositadas em lâminas de vidro carregadas positivamente utilizando uma plataforma Benchmark XT da Ventana Medical Systems, Inc. (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) com software de pesquisa. A detecção de DAB do anticorpo foi realizada utilizando o kit de detecção OptiView DAB (VMSI Cat # 760-700) com e sem o kit OptiView AMP (VMSI Cat # 760-099). A amplificação foi usada para produzir um baixo nível de fundo nos espécimes e para permitir tempos de incubação de anticorpos primários reduzidos. Todas as detecções foram totalmente automatizadas e realizadas em um autorregulador Benchmark XT (VMSI) após o condicionamento celular de amostras em tampão CC1 (VMSI Cat # 950-124) durante dois ciclos de 4 minutos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0710] Para determinar se os eventos de baixa prevalência dentro de amostras representativas de um nódulo linfático (tal como uma amígdala) poderiam ser detectados, a amostra de nódulo linfático representativa foi depositada em lâminas de vidro e corada utilizando ICC automatizado como estabelecido na Figura 10.
[0711] Para testar a sensibilidade da detecção de uma célula tumoral dentro de uma amostra representativa de um nódulo linfático, uma quantidade decrescente de uma amostra representativa de um xenoenxerto humano positivo para bRaf V600E foi adicionada a uma amostra homogênea de nódulo linfático. Foram utilizadas as seguintes porcentagens celulares (a prevalência das células positivas para BRAFV600E no volume total da amostra): 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,5%, 0,15%, 0,015%, 0,0015% e 0,00015%. As células bRaf positivas foram detectadas com uma prevalência tão baixa quanto 0,015% (Figura 16), demonstrando que o ICC pode ser utilizado em amostras de tecido representativas preparadas a partir de nódulo linfáticos para encontrar subpopulações de células extremamente raras que podem ser terapeuticamente disponíveis (por exemplo, vemurafinib BRAFV600E+).
[0712] Um experimento de série de diluição análoga foi também realizado com células Her2-positivas, que foram adicionadas em proporções decrescentes à amostra representativa de amígdala para produzir as seguintes porcentagens celulares: 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,5%, 0,15%, 0,015%, 0,0015% e 0,00015%. Semelhante às células positivas para b-Raf, as células positivas para Her2 também poderiam ser detectadas em níveis muito baixos, isto é, cerca de 0,015% (dados não mostrados), sugerindo novamente que a análise ICC de amostras representativas pode ser usada para encontrar subpopulações de células extremamente raras que podem ser terapeuticamente acionáveis (por exemplo, Herceptin for Her2+).
EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS DE TUMORES INTEIROS
[0713] Este exemplo descreve amostras representativas criadas a partir de tumores primários ressectados cirurgicamente.
MÉTODOS
[0714] Amostras de tecido representativas foram derivadas de um cólon ressectado cirurgicamente, fixado com formalina, com cerca de oito cm de diâmetro, e uma ressecção parcial de um rim (obtida da GLAS Tissue Consultants, Winston-Salem, NC) (Figuras 18A e 18B). Aqui. A Figura 18A ilustra o material de uma ressecação do cólon que ainda contém um adenocarcinoma do cólon de oito (8) cm enquanto que a Figura 18B ilustra tecido residual de uma nefrectomia parcial de um rim contendo um tumor renal urotelial papilar.
[0715] Amostras do tumor foram adquiridas e processadas para exame histológico (isto é, inclusão em parafina, seção histológica) para imitar o processo de amostragem TNM. O tecido tumoral residual foi dissecado por um patologista utilizando um bisturi, e o tecido tumoral foi homogeneizado utilizando o Sistema de Controle de Fábrica de Tubos IKA Works (0004180001) da IKA- Works (Staufen im Breisgau, Alemanha) ou um Misturador Single Serve Hamilton Beach. As amostras dos materiais homogeneizados foram então desassociados mecanicamente e, em seguida, pré-condicionadas em tampão CC1 a 85 °C, antes de serem transferidas para tampão (por exemplo, PBS) contendo AccuMax® com 1 mg/ mL de colagenase H em tampão AccuMax®. O tecido homogeneizado tratado com enzima resultante foi então incubado com Colagenase H durante pelo menos cerca de 30 minutos a 40 °C antes de ser devolvido ao tampão CC1 e aquecido a 85 °C durante cerca de 10 minutos para inativar qualquer enzima colagenase restante. A amostra representativa foi então usada para derivar sub-amostras que foram então usadas para uma variedade de ensaios de diagnóstico.
[0716] As amostras foram coradas com H&E, bem como ALK IHC em uma plataforma de coloração Ventana.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0717] Para determinar se a diversidade de tipos de células contidos na amostra original, ambas as secções histológicas e amostras representativas foram coradas com H&E (Figuras 19 e 20 e 23). Aqui, a Figura 19A ilustra uma primeira seção obtida a partir do adenocarcinoma do cólon; enquanto a Figura 19B ilustra uma segunda e diferente seção do adenocarcinoma do cólon. Cada uma das secções nas Figuras 19A e 19B foram obtidos por um patologista. A diferença na coloração H&E mostra a variação dentro do mesmo tumor. A Figura 19C ilustra coloração H&E de uma amostra representativa preparada a partir do adenocarcinoma do cólon. As Figuras 20A- 20C mostram coloração H&E de seções histológicas distintas obtidas a partir do tumor renal urotelial papilar. A Figura 20A ilustra uma primeira seção retirada do tumor renal urotelial papilar; a Figura 20B ilustra uma segunda seção diferente tirada do tumor renal urotelial papilar. Cada uma das seções ilustradas nas FIGURAS 10A e 20B foram obtidos por um patologista. A diferença na coloração H&E mostra a variação dentro do mesmo tumor. A Figura 20C ilustra coloração por H&E de uma amostra representativa preparada a partir do tumor renal urotelial papilar.
[0718] Evidente nas Figuras 19 e 20, enquanto as morfologias dos cortes histológicos retiradas de diferentes regiões do tumor ressectado apresentam diferentes aspectos histológicos (A, B), as amostras representativas (C) recapitulam a heterogeneidade nas células que compõem cada tipo de tumor (ou seja, tumor, normal, imune).
[0719] Para determinar se qualquer heterogeneidade na expressão de biomarcadores estava presente nos tecidos histológicos que foram recapitulados na amostra representativa, todas as amostras foram analisadas quanto à expressão de Alk, provavelmente resultante de um rearranjo genômico com EML4. Todas as lâminas foram analisadas por um patologista que determinou expressão positiva vs negativa da coloração Alk DAB. As Figuras 21A-21C e Figuras 22A-22C mostram que, tanto para o rim quanto para o cólon, um corte histológico demonstrou positividade pontuada e infrequente para Alk, enquanto um corte foi negativo. Essa discordância na coloração entre os blocos, embora surpreendente, é indicativa do viés de amostragem inerente ao sistema de estadiamento TNM. A heterogeneidade na positividade de Alk (isto é, a baixa prevalência em relação ao tamanho de todo o tumor) era óbvia nas amostras representativas coradas com Alk IHC, pois havia pequenos grupos ou células únicas que eram positivas para Alk DAB. As Figuras 21A-21C mostram coloração com Alk DAB de cortes histológicos distintos obtidos a partir do adenocarcinoma do cólon. A Figura 21A ilustra uma primeira seção retirada do tumor renal urotelial papilar; A Figura 21B ilustra uma segunda seção diferente tirada do tumor renal urotelial papilar. Cada uma das secções ilustradas nas Figuras 21A e 21B foram obtidas por um patologista. A diferença na coloração de Alk DAB mostra a variação dentro do mesmo tumor. A Figura 21C ilustra a coloração com Alk DAB de uma amostra representativa preparada a partir do adenocarcinoma do cólon.
[0720] A Figura 21C mostra um pequeno aglomerado de três células de adenocarcinoma do cólon que são positivas para Alk (seta) e a Figura 25C mostra um pequeno grupo de seis células cancerígenas do rim papilar urotelial (seta) e um linfócito controle que é positivo (cabeça da seta). As Figuras 22A-C mostram coloração com Alk DAB de cortes histológicos distintos obtidos a partir do rim urotelial papilar. A Figura 22A ilustra uma primeira seção retirada do tumor renal urotelial papilar; A Figura 22B ilustra uma segunda seção diferente tirada do tumor renal urotelial papilar. Cada uma das secções ilustradas nas Figuras 22A e 22B foram obtidas por um patologista. A diferença na coloração de Alk DAB mostra a variação dentro do mesmo tumor. A Figura 22C ilustra a coloração com Alk DAB de uma amostra representativa preparada a partir do tumor renal urotelial papilar.
EXEMPLO 6: DISSOCIAÇÃO MECÂNICA E HOMOGENEIZAÇÃO DE AMOSTRAS DE TECIDOS
[0721] Este exemplo descreve a etapa de dissociação mecânica e homogeneização de amostras de tecido para produzir a amostra representativa. Os métodos incluem cortar e picar a amostra de tecido e a dissociação de célula única.
MÉTODOS
[0722] Os tecidos foram cortados à mão (Figura 25A) ou picados usando um instrumento de processamento de alimentos apropriado, tal como um “espremedor” (Figura 25B). Embora estes métodos utilizem tecido de amígdalas fixadas em formalina (mostrado nas Figura 25A-25B), podem também ser utilizados outros tipos de tecido. As amígdalas foram encomendadas frescas, fixadas em formalina tamponada neutra a 10% durante 24 horas e depois armazenadas em etanol puro. A amígdala foi cortada manualmente usando um bisturi, ou mecanicamente dissociada em um espremedor. Os materiaIs homogeneizados resultantes foram então desidratados e perfundidos com cera de parafina em um processador de tecidos (NOME DO PROCESSADOR). Foram retiradas secções de quatro mícron das amostras, e foi utilizada coloração H&E para visualizar a distribuição de tamanhos dos fragmentos de tecido.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0723] Para determinar se picar, cortar e espremer produziam uma distribuição uniforme de fragmentos de tecido, um nódulo linfático (amígdala) era cortado à mão ou mecanicamente desassociado usando um espremedor. Como se vê na Figura 25A e na Figura 25B, cortando manualmente uma amígdala fixa resulta em uma mistura de fragmentos de tecido com uma distribuição de tamanho muito uniforme. Os fragmentos de tecido contêm dezenas de milhares a centenas de milhares de células e mantêm a estrutura do órgão de maneira histologicamente reconhecível.
[0724] A desassociação do nódulo linfático utilizando um espremedor resultou em fragmentos menores de tecido contendo centenas a milhares de células (Figura 25C e Figura 25D). Os fragmentos de tecido produzidos pelo espremedor apresentam o tecido homogeneizado de tal forma que as interações célula a célula podem ser avaliadas por um patologista anatomista.
[0725] Está contemplado que picar, espremer e misturar podem ser usados independentemente, ou em combinação. Por exemplo, um tumor ressectado pode primeiro ser picado produzindo uma população uniforme de fragmentos de tecido para inclusão em parafina e exame histológico. Uma amostra do material homogeneizado picado pode então ser espremida ou misturada para desassociar ainda mais o tecido em preparação para posterior dissociação enzimática destinada ao isolamento de células isoladas ou núcleos individuais.
EXEMPLO 7: DESASSOCIAÇÃO DE MATERIAIS HOMOGENEIZADOS (OU AMOSTRAS REPRESENTATIVAS) EM CÉLULAS ÚNICAS
[0726] Este exemplo descreve o processamento adicional de amostras representativas derivadas de órgãos, tecidos ou tumores (via mistura, espremer ou moagem) em células únicas para quantificação, isolamento e análise de biomarcadores. Os métodos incluem dissociação mecânica, filtragem, dissociação enzimática e sonicação.
MÉTODOS DE DESASSOCIAÇÃO MECÂNICA E FILTRAÇÃO:
[0727] A amostra de tumor clínico utilizada neste exemplo é o adenocarcinoma do cólon grande mencionado acima, obtido da GLAS Tissue Consultants. Um nódulo linfático (amígdala) e os materiais homogeneizados de adenocarcinoma do cólon foram preparados como descrito acima. Uma amostra de material homogeneizado foi filtrada usando uma peneira de 1 mm (Advantech Manufacturing, New Berlin, WI) e o material que não conseguiu passar através da peneira foi coletado. A amostra de material homogeneizado que passou através da peneira de 1 mm foi então filtrado utilizando um filtro de 20 mícron (Pluriselet, San Diego, CA). O material que não conseguiu passar pelo filtro de 20 mícron foi coletado. O material homogeneizado que foi capaz de passar através do filtro de 20 mícron foi então passado por um filtro de 10 mícron e as células únicas que passaram por elas foram recolhidas. As células únicas que passaram através do filtro de 10 mícron foram centrifugadas durante 5 minutos a 800 g e ressuspensas em PBS com BSA a 3% e azida de sódio a 0,09%, repetindo três vezes e rejeitando o sobrenadante. As células únicas estão prontas para serem armazenadas a 4 °C.
[0728] Utilizou-se um contador Multisizer 4e Coulter (Beckman Coulter, Indianapolis IN) para caracterizar a distribuição de tamanho das células únicas recolhidas das etapas de filtragem. Um citômetro de fluxo com foco Attune (ThermoFisher Scientific) foi usado para caracterizar todas as células únicas e para classificar e coletar as células únicas. Um sonicador foi usado para desassociar mecanicamente os aglomerados multicelulares em células únicas. Em alguns casos, 250 unidades de colagenase (TYPE & COMPANY) foram usadas para desassociar bioquimicamente os aglomerados multicelulares por incubação a 37 °C por 1 hora em tampão salino balanceado de Hanks. Após a incubação, a mistura foi centrifugada a 800 g por 1 min e ressuspensão em PBS.
[0729] O anticorpo EpCam (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) foi utilizado para corar as células epiteliais do filtrado. O anticorpo primário foi incubado com os núcleos de amostras durante 1 h a 37 °C ou durante 24 horas a 4 °C. As amostras de controle receberam nenhum anticorpo primário. Após a incubação, as amostras foram lavadas 6x com tampão de preparação EZ, e, em seguida, ressuspendidas em anticorpo Alexa-488 de cabra anti- camundongo (1 : 500) em tampão de MACS durante 0,5 a 1 h a 37 °C. Algumas amostras foram também coradas com 3 μM de DAPI por 10 min. As amostras coradas foram lavadas 4x com tampão de reação a 4 °C. Uma amostra de 50 μl foi espalhada sobre lâminas VWR plus e imediatamente fotografadas através de uma lamínula de vidro. As imagens de células coradas foram adquiridas em microscópio de epifluorescência Zeiss Axio, controlado por software interno, e as imagens foram analisadas usando ImageJ. Núcleos corados foram armazenadas a 4 °C em MACS-t-STC.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0730] O objetivo das etapas de filtração sequencial foi determinar a composição das várias partículas dimensionadas que compreende o homogeneizado. Em cada etapa, o tecido que foi incapaz de passar através do filtro foi cuidadosamente analisado por microscopia de luz (Figura 29). Como mostrado na Figura 26A, o material que foi incapaz de passar através da peneira de 1 mm era principalmente composto de tecido conjuntivo e fibras musculares. Este material não tinha celularidade e, portanto, foi descartado. O material que foi incapaz de passar através do filtro de 20 mícron foi principalmente composto por grandes aglomerados multicelulares (Figura 26B). O material incapaz de passar através do filtro de 10 mícron era principalmente composto por pequenos aglomerados multicelulares de células tumorais (Figura 26C), enquanto o material que passava através do filtro de 10 mícron eram as células únicas que foram libertadas durante o processo de homogeneização (Figura 26D). Assim, a homogeneização de tumores humanos para criar amostras representativas gera uma distribuição de tamanhos dos fragmentos de tecido que variam desde grandes aglomerados multicelulares, a células únicas.
[0731] Utilizou-se um contador Multisizer 4e Coulter (Beckman Coulter, Indianapolis IN) para medir o rendimento (número de células únicas por grama de tecido homogeneizado) bem como o tamanho das células únicas dissociadas isoladas do adenocarcinoma do cólon. Partículas entre 4 e 10 μm foram contadas e consideradas como células únicas. O rendimento por grama de material homogeneizado do tumor utilizando o método de filtração foi de aproximadamente 320.106 células/ grama. As células isoladas do homogeneizado tumoral distribuem-se em duas populações distintas; células que variam de 4 a 5,5 mícron de diâmetro e células entre 5,5 a 9,3 mícron de diâmetro (Figura 27A). A mesma análise foi feita para as células purificadas a partir da amígdala homogeneizada, e a maioria das células isoladas da amígdala tinham entre 4 a 5,5 mícrones de diâmetro (Figura 27B).
[0732] As distribuições de tamanho nas células únicas isoladas do tumor de cólon e da amígdala sugerem que as células que têm entre 4 e 5,5 mícron de diâmetro são células imunes, enquanto as células entre 5,5 e 9,3 mícron são células tumorais. Para corroborar este achado, células tumorais individuais isoladas do tumor de cólon foram coradas fluorescentemente para EpCam para determinar o tamanho do componente da célula tumoral. As células coradas com fluorescência foram primeiro plaqueadas em uma lâmina de microscópio e fotografadas utilizando um microscópio fluorescente para avaliar o procedimento de coloração (Figura 28). Após a classificação em um instrumento Attune Flow Sorting, o tamanho das células positivas EpCam classificadas foi reavaliado usando o Contador Coulter. Por conseguinte, a distribuição de tamanho das células tumorais positivas para EpCam correlaciona-se com uma população celular que está ausente das amígdalas não tumorais, mas presente nas células únicas do tumor de cólon homogeneizado.
[0733] Estes dados sugerem que as células mecanicamente dissociadas e filtradas do tumor de cólon homogeneizado são compostas por duas populações distintas: células imunes normais e células tumorais. Estas duas populações podem ser facilmente distinguidas usando um analisador de tamanho de partícula e as células isoladas podem ser analisadas adicionalmente usando citometria de fluxo e classificação. Os dados sugerem ainda que os métodos de separação com base no tamanho (colunas de exclusão por tamanho, dispositivo microfluídico, centrifugação de densidade, etc.) podem ser adotados para separar as duas populações produzindo amostras enriquecidas de células tumorais ou imunitárias.
DESASSOCIAÇÃO DE FRAGMENTOS MULTICELULARES
[0734] Os fragmentos multicelulares (ou agrupamentos) que não passaram pelos filtros de 20 e 10 mícron foram posteriormente processados para gerar células únicas. A sonicação utilizando um sonicador de sonda foi utilizado na tentativa de dissociar fisicamente os fragmentos multicelulares em células únicas. Os fragmentos multicelulares foram expostos a quantidades crescentes de energia sônica e a libertação de células tumorais foi avaliada através da análise do tamanho das partículas utilizando um Contador Coulter. Como mostrado na Figura 35, quantidades crescentes de energia sônica levam a uma liberação de partículas que possuem entre 5,5 e 9,3 mícron de diâmetro (seta no painel 245J). As células fisicamente liberadas correlacionam-se com as células tumorais isoladas do material homogeneizado do exemplo acima, sugerindo que os fragmentos multicelulares são compostos, primariamente, por células tumorais.
[0735] Para aumentar ainda mais a dissociação de fragmentos multicelulares em células únicas, uma amostra de fragmentos multicelulares foi incubada com colagenase. Depois de uma Incubação de 72 horas em colagenase tipo 1, a distribuição de tamanho dos fragmentos multicelulares tratados com colagenase foi analisada. Como mostrado nas Figuras 33A e 33C, a colagenase sozinha não resulta na libertação de células isoladas a partir de fragmentos multicelulares. Quando a sonicação foi adicionada após tratamento com colagenase, a maioria dos fragmentos multicelulares foi desassociada em partículas individuais dentro do intervalo de tamanho das células imunes normais (4 a 5,5 mícron em diâmetro) e células tumorais (5,5 a 9,3 mícron em diâmetro). Estes dados demonstram que amostras representativas derivadas de órgãos humanos, tecidos e tumores podem ser posteriormente processadas em células únicas usando métodos mecânicos, físicos e bioquímicos.
CARACTERIZAÇÃO DE BIOMARCADORES DE CÉLULAS ÚNICAS DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS
[0736] As células únicas da amostra representativa do tumor de cólon são ainda caracterizadas para expressão de biomarcadores através de coloração fluorescente e análise de citometria FLOW. A citometria FLOW é um método de análise diagnóstica comum para células vivas retiradas de amostras de biópsia. Milhares a centenas de milhares de células podem ser interrogadas quanto à presença ou ausência de biomarcadores, quantificando simultaneamente o número de células e o nível de expressão do biomarcador para cada célula. Um técnico no assunto reconhecerá que amostras de tecido fixadas em formalina derivadas de órgãos, tecidos ou tumores ressectados não são passíveis de citometria FLOW, uma vez que os métodos de análise atuais para amostras fixadas com formalina envolvem inclusão em parafina e seccionamento histológico, em vez de dissociação em células únicas. O exemplo a seguir teve como objetivo determinar se as células processadas produzidas a partir do tumor de cólon poderiam ser analisadas por citometria FLOW.
MÉTODOS:
[0737] As células foram coradas com anticorpos CD3, CD8, CD45, CK8/ 18, EGFR e PD-L1 da Ventana Medical Systems, Inc. Em alguns casos, foi utilizada amplificação do sinal da tiramida para melhorar a coloração fluorescente. As células (aproximadamente 3 x 107 células por tubo) foram centrifugadas a 300 x g durante 2 min antes da ressuspensão em 0,3 ml de H2O2 a 3%. Após 15 min de incubação, as células foram lavadas 3 vezes com Tween 20 a 0,1%, BSA a 0,1% em PBS. O tampão de bloqueio TSA (0,3 ml) foi adicionado durante 5 min, seguido por incubação em 0,2 ml de anticorpo primário durante 30 min a 37 °C. As células foram então lavadas 3 vezes com 0,1% de Tween 20, 0,1% de BSA em PBS e em seguida ressuspensas em 0,2 mL de anticorpo conjugado com peroxidase de rábano de cabra anti-espécie por 30 min a 37 °C. As células foram diluídas em 1,2 mL de Tiramida-Rodamina a 101 μM e incubadas por 5 min, seguidas de 1,2 ml de TSA H2O2 por 30 min. As células foram lavadas 3x com dextrano a 0,5%, Tween 20 a 0,1%, BSA a 0,1% em PBS e ressuspensas em MACS-T-STC para armazenamento. Antes da obtenção de imagens ou citometria de fluxo, as células foram coradas com 3 μM de DAPI durante 10 min.
ANÁLISE DE BIOMARCADORES POR CITOMETRIA DE FLUXO
[0738] Um sistema Attune FLOW Cytometry (ThermoFisher Scientific) foi usado para quantificar as porcentagens de células expressando vários biomarcadores. O deslocamento da intensidade de fluorescência entre o controle (células coradas sem Ab primário) e amostras (coradas com Ab primário) é proporcional à abundância das células alvo dentro da população de células inteiras e foi usado para calcular a porcentagem de células positivas na população. Como mostrado nas Figuras 29A-29E, sinais fluorescentes acima do fundo foram detectados para todos os biomarcadores testados. Componentes do sistema imunológico e do tumor foram detectados a partir da mesma amostra; CD45 e CD8, comparados com CK8/ 18 e EGFR (Figura 29A-29C). Em alguns casos, tanto as células imunes como as células tumorais podem ser simultaneamente estabilizadas (PD-L1 nas Figura 29 E). Além disso, a porcentagem de células marcadas positivamente na análise de citometria FLOW é similar à coloração IHC da amostra representativa incorporada do mesmo caso clínico (Figura 29A-29E).
[0739] Com estes dados, os inventores demonstram os métodos e o fluxo de trabalho necessários para desassociar ainda mais os materiais homogeneizados derivados de órgãos, tecidos e tumores em células únicas para análise de biomarcadores através de citometria FLOW. Um técnico no assunto reconhecerá a natureza quantitativa dos dados gerados pela citometria FLOW. Com estes dados, é agora possível calcular as percentagens dos componentes celulares de tumores ressectados, avaliando a abundância relativa de cada tipo de célula. Por exemplo, a partir dos dados acima, 33% das células do tumor de cólon analisadas neste exemplo são células tumorais. Além disso, aproximadamente 33% das células tumorais são positivas para PD-L1 (desvio de DAPI na análise PD-L1 FLOW, Figura 29E) e uma percentagem ainda menor das células são positivas para EGFR (células positivas para EGFR, Figura 29F). Do tumor do cólon, 20% das células são células imunes (células CD45 positivas, Figuras 29C-), e apenas uma fração dessas células são CD8 positivas (Figura 29D).
ISOLAMENTO E CAPTURA DE CÉLULAS ÚNICAS
[0740] As células únicas da amostra representativa do tumor de cólon foram isoladas e capturadas para permitir a análise de biomoléculas de populações celulares específicas. Neste exemplo, dois tipos de isolamento e captura foram usados, triagem de FLOW e triagem de afinidade via esferas magnéticas.
[0741] Para identificar e capturar células tumorais a partir das células únicas dissociadas da amostra representativa do adenocarcinoma do cólon, as células foram coradas para EpCAM (Molécula de Adesão Celular Epitelial) utilizando o método de coloração de tiramida anteriormente descrito, para depositar a rodamina 101 e corar o DNA com DAPI. Quando analisadas em um classificador de células SH800 da Sony, as células tumorais EPCAM positivas (população verde na Figura 30A) mostram um teor de DNA mais elevado quando comparadas com o gráfico de intensidade DAPI (Figura 30B). As células negativas para EpCAM com uma intensidade diploide DAPI são as células normais. Neste exemplo, as células que são positivas para EpCAM e contêm altos níveis de DAPI foram classificadas. Quando as células separadas são depois analisadas quanto ao tamanho em um Contador de Coulter, o intervalo de tamanho está entre 5,5 e 9,3 mícron de diâmetro (Figura 27C). Um técnico no assunto reconhecerá que as células negativas para EpCAM com coloração diploide DAPI também podem ser separadas. Estes dados demonstram a capacidade de isolar e capturar populações distintas de células a partir de amostras representativas derivadas de órgãos, tecidos e tumores usando um classificador FLOW.
[0742] Um método separado de isolamento e captura de populações de células específicas é a remoção de populações de células que expressam marcadores de superfície celular específicos por meio de seleção por afinidade usando esferas magnéticas. Neste exemplo, as células únicas do nódulo linfático foram incubadas com esferas magnéticas (Dynabeads, ThermoFisher Scientific), acopladas a anticorpos primários CD3 ou CD8. As células são incubadas com as esferas magnéticas conjugadas com o anticorpo de acordo com o protocolo do fabricante. Após a incubação, as esferas magnéticas são trazidas para o fundo do tubo através de magnetismo, e o líquido contendo as células não ligadas é removido do tubo. Utilizou-se citometria FLOW para demonstrar a depleção de células CD3 ou CD8 positivas da amostra, semelhante à análise na Figura 31A. A depleção dos tipos celulares específicos pode ser observada na Figura 34B, em que a percentagem de células que expressam o CD3 ou CD8 é diminuída após a incubação com as esferas magnéticas conjugadas de anticorpo correspondentes.
[0743] Com estes dados, os inventores demonstram que células únicas geradas a partir de amostras representativas derivadas de órgãos, tecidos e tumores podem ser isoladas e capturadas para investigação diagnóstica adicional. Um especialista na técnica entende que qualquer número de métodos de diagnóstico pode ser utilizado para analisar as populações de células purificadas, tais como PCR, NGS, citometria FLOW, sequenciamento de células únicas ou transcriptômicas, análise proteica baseada em espectrometria de massa e outros métodos de diagnóstico.
EXEMPLO 8: ESTUDOS DE VIABILIDADE E ESTABILIDADE DA AMOSTRA DE TECIDO VIABILIDADE DE TECIDOS FRESCOS
[0744] Amígdalas frescas foram misturadas em um liquidificador IKA em DPBS 1 : 1 (w : v) sem magnésio e sem cálcio a 3000 rpm por dois minutos (Rep) e comparadas à amígdala preparada no método tradicional de picotar o tecido com um bisturi e digestão com colagenase para a cultura primária de células (Trad) (Donnenberg, et al., Methods Mol Biol, 568: 261-279, 2009).
[0745] Os danos nos tecidos foram avaliados medindo a libertação de RNA (lesão citoplasmática) e DNA (dano nuclear) no sobrenadante (Figura 34). A homogeneização do tecido da amígdala é muito mais rápida que o método tradicional de picar seguido de digestão por colagenase, já que a homogeneização não requer nenhum tratamento enzimático. Como indicado na Figura 37, a homogeneização de amígdalas frescas gera menos danos do que o método tradicional, como medido pela liberação de DNA e RNA no sobrenadante. Barras de erro representam o erro padrão de dois experimentos.
ESTUDOS DE ESTABILIDADE DE ÁCIDOS NUCLEICOS, PROTEÍNA E CÉLULAS A PARTIR DE TECIDOS FIXOS EM FORMALINA
[0746] Os tecidos de uma neoplasia neuroendócrina pancreática bem diferenciada, um carcinoma urotelial papilar e um adenocarcinoma do cólon (Figuras 35A, 35B e 35C, respectivamente) foram incubados em soluções padrão de armazenamento celular (20% de glicerol, 10% de DMSO, 5% de MeOH, e 100% de MeOH) nas temperaturas indicadas durante 6 meses. O RNA foi isolado e analisado em um bioanalisador Agilent. Como indicado nas Figuras 35A, 35B e 35C, todos os métodos de armazenamento preservaram a integridade do RNA, embora a níveis diferentes, como indicado pelas diferenças sutis nas intensidades dos picos de RNA do 18S nos vestígios do bio-analisador (ver 20% de amostra de Glicerol na Figura 38A). Estes dados indicam que vários métodos de armazenamento para amostras representativas fixadas em formalina preservam a integridade do RNA ao longo do tempo.
[0747] A proteína, medida por coloração IHC para c-Met, é razoavelmente estável tanto no carcinoma urotelial papilar como no adenocarcinoma do cólon (Figuras 36A e 36B, respectivamente) com todas as condições de armazenamento e todas as temperaturas ao longo do período de teste de 6 meses. Após um período de armazenamento de seis meses, as amostras foram plaqueadas em lâminas de vidro, coradas para c-Met e fotografadas utilizando um microscópio de campo claro. Embora ocorra alguma agregação da amostra e a morfologia das células possa deteriorar-se ao longo do tempo, tanto as células positivas como as negativas podem ser detectadas ao longo do curso do tempo de estabilidade em todas as composições de tampão.
[0748] O armazenamento de amostras representativas foi investigado pela avaliação do “flash freezing” em PBS. Trinta mililitros da amostra representativa do adenocarcinoma do cólon foram rapidamente congelados em PB em um banho de gelo seco/ álcool e armazenados a -80 °C. Eles foram então descongelados a 37 °C e uma alíquota foi tomada em 10 ciclos subsequentes de congelamento e descongelamento. Todas as amostras tomadas após o ciclo de congelamento-descongelamento foram plaqueadas em lâminas de vidro onde a coloração H&E foi usada para avaliar a estabilidade da morfologia celular, e o c-Met IHC foi usado para avaliar a estabilidade da proteína. Como mostrado na Figura 37A, a morfologia celular é muito estável em todos os ciclos de congelamento-descongelamento quando as amostras são congeladas instantaneamente e armazenadas a -80 °C, tal como os biomarcadores baseados em proteínas (Figura 37B).
[0749] A estabilidade do RNA e do DNA foi avaliada nas mesmas amostras nos 10 ciclos de congelamento e descongelamento. DNA e RNA totais foram extraídos das amostras usando métodos padrão de fenol/ clorofórmio e analisados usando um bioanalisador Agilent. Tanto o DNA como o RNA eram estáveis ao longo dos ciclos de congelamento-descongelamento, sendo o DNA mais resiliente que o RNA (Figura 38).
[0750] Com estes dados, os inventores demonstraram múltiplos métodos de armazenamento para amostras representativas feitas a partir de órgãos, tecidos e tumores.
EXEMPLO 9: ENRIQUECIMENTO DE NÚCLEOS TUMORAIS DE UMA AMOSTRA REPRESENTATIVA
[0751] Este exemplo descreve o processamento adicional de amostras representativas fixadas com formalina derivadas de órgãos, tecidos ou tumores (misturando, espremendo ou picando) em núcleos individuais para quantificação, isolamento e análise de biomarcadores. Os métodos incluem dissociação mecânica, filtragem e dissociação enzimática. Os aspectos únicos dos métodos incluem: 1) o estabelecimento de um método para extrair e desagregar partículas individuais contendo núcleos de amostras representativas fixadas em formol; 2) avaliação da reprodutibilidade do isolamento de partículas de diferentes alíquotas da mesma amostra representativa; 3) estabelecimento de uma abordagem para monitorar a extensão da destruição celular infligida à amostra pelos métodos de dissociação mecânica e extração nuclear; 4) a identificação de marcadores que permanecem associados a núcleos extraídos de amostras representativas que servirão para distinguir subpopulações tumorais e normais; 5) o estabelecimento de metodologia para analisar material extraído, corado de amostras representativas fixas por citometria de fluxo; 6) O estabelecimento do número de partículas tumorais que serão necessárias para: a) obter DNA suficiente para o sequenciamento e b) reter a sensibilidade analítica para os subclones de baixa prevalência.
MÉTODOS E MATERIAIS
[0752] A dissociação mecânica foi realizada com um sistema IKA Works Tube Mill Control da IKA-Works (0004180001; Staufen im Breisgau, Alemanha) e o dissociador gentleMACS da Miltenyi Biotech (Teterow, Alemanha). Todos os filtros utilizados foram da Pluriselect (San Diego, CA). Os tampões utilizados foram das seguintes empresas: CC1 (950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), EZ prep (950-102; Ventana Medical Systems), Tampão de reação (950-300; Ventana Medical Systems), tampão autoMACS (130-091-221, Miltenyi Biotech), dPBS (14190, Fisher Scientific, EUA). O Tween 20 foi adquirido à Fisher Scientific, USA (AC233362500). Os seguintes reagentes foram adquiridos da Sigma, EUA: NP40 (74385), DNAse (AMPD1), espermina tetracloreto (S2876), DAPI (D9542), tripsina (59427C), Pepsina (P7012), Pronase (P5147). Outras enzimas foram das seguintes empresas: Proteínase K (0706, VWR, EUA), Accumax (AM105, Innovative Cell Technologies, San Diego, CA), Colagenase H (11074032001, Roche, Basileia, Suíça). Tiramida-Rodamin 101 foi sintetizada internamente usando produtos químicos comprados da Sigma. O anticorpo anti-citoqueratina 8/18 de camundongo (760-4344), o anticorpo anti-CD45 de camundongo (760-2505) e o anticorpo conjugado com HRP de cabra anti-camundongo (760-4310) eram da Ventana Medical Systems. O conjugado com Alexa 488 de cabra anti-camundongo foi adquirido da Invitrogen (A-11001).
MODELOS DE TECIDOS E AMOSTRAS CLÍNICAS
[0753] Amígdalas humanas foram obtidas do Northwest Medical Center (Tucson, AZ) e fixadas em formalina tamponada neutra a 10% por 24 horas na Ventana Medical Systems. Amostras de tumor foram obtidas de GLAS/ (Winston-Salem, NC http://glaswpcopy.wpengine.com/) e foram previamente fixadas em formalina.
COLORAÇÃO COM HEMATOXILINA E EOSINA
[0754] Amostras representativas foram plaqueadas em tampão autoMACS em lâminas VWR plus. A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada utilizando uma plataforma Symphony da Ventana Medical Systems (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) e os correspondentes Reagentes da H&E Symphony (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ).
IMUNO-HISTOQUÍMICA
[0755] As seções de tecido ou amostras representativas incluídas em parafina foram sujeitas a imuno-histoquímica baseada em DAB (IHC) de campo claro, utilizando uma plataforma arkXT da Ventana Medical Systems BenchmarkXT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). A visualização dos biomarcadores foi realizada utilizando o Kit de Detecção OptiView DAB da Ventana (760-700). Os anticorpos foram incubados durante 4 minutos. As imagens foram adquiridas em um microscópio de campo claro Zeiss Axio.
CITOMETRIA DE FLUXO
[0756] Para análise de agregação, as amostras foram filtradas através de um filtro de 40 μm antes da análise em um citômetro de fluxo Attune Acoustic Focusing (Thermo Fisher Scientific, EUA). As partículas foram colocadas em cubos com DAPI (3) durante 10 min antes da filtraçãoo. Se a taxa de fluxo fosse maior que 4.000 eventos por minuto, a amostra era diluída.
[0757] Para triagem de fluxo, as amostras foram filtradas através de um filtro de 40 μm antes da coloração (veja abaixo) e analisadas em um classificador de células SH800 da Sony. A discriminação do doublet foi realizada utilizando largura e altura de pulso DAPI.
MÉTODO PARA EXTRAIR PARTÍCULAS CONTENDO UM ÚNICO NÚCLEO DE UMA AMOSTRA REPRESENTATIVA
[0758] Utilizando amígdala fixada em formalina como um sistema modelo, vários métodos enzimáticos foram investigados para desassociar alíquotas de uma amostra representativa em partículas individuais. Antes das etapas enzimáticas, o material das amígdalas foi primeiro mecanicamente dissociado em um misturador IKA em tampão autoMACS, diluído 1 : 1 em tampão de CC1 que tinha sido aquecida a 85 °C, e adicionalmente misturada em tubos gentleMACS usando um Dissociator gentleMACS. A amostra foi submetida a dois ciclos de aquecimento a 85 °C durante 5 min, seguido por mistura. Subsequente à dissociação mecânica, diferentes condições enzimáticas foram avaliadas qualitativamente monitorando visualmente o material corado com H&E que havia sido digerido e filtrado através de um filtro de 100 μm. A enzima de inativação foi testada por incubação do material a 4 °C durante 24 h depois de qualquer fase de inativação, o material de plaqueamento em lâminas VWR plus, a coloração com H&E, e o controle da morfologia das células, ou a integridade do núcleo. As condições testadas estão resumidas na Tabela 3.Tabela 3 - Diferentes condições testadas para métodos de digestão mecânica e enzimática
Figure img0003
Figure img0004
COMPARANDO O RENDIMENTO DAS PARTÍCULAS DE CADA MÉTODO DE DISSOCIAÇÃO
[0759] Os diferentes métodos de dissociação enzimática e mecânica foram comparados lado-a-lado a partir de alíquotas sequenciais de uma amostra representativa de amígdala. Os métodos comparados são resumidos na Tabela 6. A eficácia de cada método foi avaliada pela contagem do número de partículas libertadas por cada método por grama de material de partida utilizando um hemacitômetro. As amostras biológicas em triplicata foram analisadas onde indicado.
MEDINDO A DESTRUIÇÃO CELULAR
[0760] Os sobrenadantes de cada etapa durante as preparações de dissociação foram retidos e analisados quanto ao DNA liberado na solução, como um indicador da destruição nuclear. Os supernadantes foram divididos em três para réplicas técnicas. Quando necessário, as amostras foram concentradas usando um GeneVac (SP Scientific). O DNA foi extraído do resíduo remanescente usando um kit FFPE puro da Roche High de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi também extraído de uma alíquota de 0,1 g, juntamente com líquidos de processamento reservados, retirados do material homogeneizado estoque para servir como amostra de referência. Os rendimentos de DNA foram avaliados utilizando um espectrofotômetro Nanodrop-1000 (Thermo Scientific). O DNA extraído dos líquidos de processamento foi expresso como uma porcentagem do DNA extraído da amostra de referência para servir como um substituto para danos nos núcleos celulares, com a suposição de que a porcentagem de DNA liberado é proporcional à porcentagem de danos no núcleo.
MINIMIZAÇÃO DA AGREGAÇÃO DE PARTÍCULAS
[0761] As partículas isoladas de amostras representativas de amígdalas utilizando o método da proteínase K-pepsina foram coradas utilizando DAPI (3 μM, 10 min) para visualizar o teor de DNA e analisadas por citometria de fluxo. A agregação foi evidenciada por partículas contendo os níveis de DNA dupleto, tripleto e >tripleto. As seguintes condições foram testadas para determinar aditivos que auxiliam a desagregação das partículas: 1% de Tween 20, 1% de NP40, DNAse, 1,5 mM Tetracloreto de espermidina, 5 mM de CaCl2. Utilizou-se citometria de fluxo para avaliar as percentagens dos níveis de DNA de singleto, dupleto e >tripleto utilizando histogramas de DAPI de preparações normais de amígdala na presença de cada aditivo.
ISOLANDO NÚCLEOS DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS USANDO O MÉTODO DE DIGESTÃO OTIMIZADA DA PROTEÍNASE K-PEPSINA
[0762] Amostras representativas preparadas a partir de tecido das amígdalas foram submetidas a dissociação mecânica utilizando tampão CC1 como descrito acima. Para o tecido tumoral, a dissociação mecânica em massa foi primeiro realizada em tampão MACS em um misturador IKA a uma proporção de 1 : 1 de tumor : MACS, e depois foram recolhidas alíquotas do material homogeneizado total e misturadas em um misturador IKA em um 1 g de tecido tumoral : 5 ml de razão de solução. O material misturado diluído foi filtrado através de uma peneira de metal de 1 mm x 1 mm e o material filtrado foi condicionado a CC1 em um 1 g de tecido de tumor : 5 mL de razão de tampão CC1 como descrito acima. Para ambas amostras de amígdalas e tumores, o tampão CC1 foi trocado por dPBS (1 : 1) por centrifugação a 300 x g por 1 min em uma microcentrífuga de bancada (Eppendorf); todas as trocas líquidas subsequentes foram realizadas da mesma maneira. Após centrifugação, o sedimento foi ressuspendido 1 : 1 em DPBS contendo 1 mg/ ml de proteínase K e incubou-se a 50 °C durante 10 min. Para extinguir a proteínase K e para posterior dissociação, a amostra foi trocada em 5 mg/ ml de pepsina em NaCl a 150 mM, pH 1,5. O pH da solução foi testado com tiras de pH e reajustado para 1,5-2 usando HCl 5 M conforme necessário. A amostra foi incubada durante 30 min a 37 °C, com agitação suave a cada 10 min.
[0763] Para o tecido tumoral, os rendimentos foram melhorados pela agitação do tubo a 600 rpm em um ThermoMixer F1.5 (Eppendorf) durante ambas as etapas de digestão enzimática. A pepsina foi inativada pelo ajuste do pH acima de 8 com NaOH a 5M, e então a solução contendo a pepsina foi trocada por tampão autoMACS, Tween 20 a 1% e tetracloreto de espermidina 1,5 mM (MACS-T-STC). A amostra digerida foi filtrada através de um filtro de 40 mícron utilizando 10 ml de MACS-T-STC, recolhida por centrifugação e ressuspensa em 500 μl de MACS-T-STC para armazenamento antes das aplicações posteriores. A reprodutibilidade dos núcleos dos tumores foi avaliada através do monitoramento dos rendimentos das partículas na faixa de 3 a 30 mícron, medida em um Multisizer 4e (Beckman Coulter), normalizado para o peso inicial “seco” do tecido de tumor, através de várias preparações para o mesmo tumor. A reprodutibilidade foi ainda avaliada por monitoramento da distribuição de tamanho das partículas de diferentes preparações para o mesmo tumor.
MATERIAL DE COLORAÇÃO ISOLADO DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS IMUNOFLUORESCÊNCIA PADRÃO
[0764] Os núcleos preparados a partir de 1 g de uma amostra de tumor representativa utilizando o modo da proteínase K-pepsina foram recolhidos por centrifugação a 300 xg durante 1 min antes da ressuspensão em 200 μl de anticorpo primário anti-citoqueratina 8/18 de camundongo. O anticorpo primário foi incubado com os núcleos de amostras durante 1 h a 37 °C ou durante 24 horas a 4 °C. As amostras de controle receberam nenhum anticorpo primário. Após a incubação, as amostras foram lavadas 6x com tampão de preparação EZ, e, em seguida, foram ressuspendidas em anticorpo de cabra Alexa- anticorpo-488 anti-camundongo (1 : 500) em tampão de MACS durante 0,5 a 1 h a 37 °C. Algumas amostras foram também coradas com 3 μM DAPI por 10 min. As amostras coradas foram lavadas 4x com tampão de reação a 4 °C. Uma amostra de 50 μl foi espalhada sobre lâminas VWR plus e imediatamente fotografadas através de uma lamínula de vidro. Imagens de células coradas foram adquiridas em microscópio de epifluorescência Zeiss Axio, controlado por software interno, e as imagens foram analisadas usando ImageJ. Núcleos corados foram armazenadas a 4 °C em MACS-t-STC.
COLORAÇÃO USANDO AMPLIFICAÇÃO DE SINAL DE TIRAMIDA (TSA)
[0765] Partículas de núcleos isolados por homogeneização mecânica ou pelo método K-proteínase pepsina (3 x 107 de partículas por tubo) foram centrifugadas a 300 x g durante 2 min antes da ressuspensão em 0,3 ml de 3% de H2O2. Após 15 min de incubação, os núcleos foram lavados três vezes com Tween 20 a 0,1%, BSA a 0,1% em PBS. Tampão de bloqueio TSA (0,3 ml) foi adicionado durante cinco minutos, seguido por incubação em 0,2 ml de anticorpo primário durante 30 minutos a 37 °C. Os núcleos foram lavados 3 vezes com 0,1% de Tween 20, 0,1% de BSA em PBS e em seguida ressuspensos em 0,2 ml de anticorpo de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre anti- espécie durante 30 minutos a 37 °C. Os núcleos foram diluídos em 1,2 ml de 20 μM de tiramida-rodamina 101 e incubou-se durante 5 min, seguido por 1,2 mL de TSA H2O2 durante 30 min. Os núleos foram lavados com dextrano a 0,5%, Tween 20 a 0,1%, BSA a 0,1% em PBS 3x e ressuspensos em MACS-T-STC para armazenamento. Antes da obtenção de imagens ou citometria de fluxo, os núcleos foram corados com 3 μM de DAPI durante 10 min. Imagens de núcleos corados foram adquiridas em um microscópio de epifluorescência Olympus BX63 e analisadas usando ImageJ.
CALIBRANDO O RENDIMENTO DE DNA POR NÚMERO DE PARTÍCULAS ISOLADAS POR MÉTODOS MECÂNICOS E ENZIMÁTICOS
[0766] Os núcleos foram isolados da amígdala usando o método da proteínase K-pepsina como descrito acima. As partículas foram contadas usando um hemacitômetro. O DNA foi preparado a partir de 105, 106 e 107 partículas utilizando um kit Roche High pure FFPE de acordo com as instruções do fabricante. Os rendimentos de DNA foram avaliados utilizando um espectrofotômetro Nanodrop-1000 (Thermo Scientific).
RESULTADOS PROCESSAMENTO ADICIONAL DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS EM NÚCLEOS INDIVIDUAIS
[0767] O processamento adicional de amostras representativas em núcleos individuais requer a remoção da membrana celular. Os atuais métodos de isolamento nuclear para células frescas não requerem enzimas para liberar núcleos, e o isolamento nuclear a partir de amostras fixadas em formalina não é um método comum. Para isolar eficientemente os núcleos individuais, mantendo os marcadores do citoesqueleto que permitiriam a diferenciação entre os núcleos normal e tumoral, foi desenvolvido um método enzimático para revelar núcleos sem danos indevidos que liberariam o DNA dos núcleos tratados.
[0768] Múltiplas enzimas foram avaliadas quanto à capacidade de digerir a membrana celular do núcleo, incluindo pronase, proteínase K, pepsina, tripsina, Accumax, colagenase H. A Figura 43 mostra exemplos de amostras que foram digeridas por pepsina ou tripsina sob diferentes condições. Os núcleos inchados e fragmentados presentes no painel inferior direito são indicativos de digestão excessiva.
[0769] Após determinação das condições e repressão para cada enzima, uma comparação lado a lado de cada método foi realizada em alíquotas paralelas de uma amostra representativa de tecido de amígdala fixada em formol. Consulte a Tabela 3. Cada método também foi comparado com a homogeneização mecânica sozinha, conforme descrito na seção de métodos. A Figura 43 mostra que o tratamento com proteínase K, seguido por digestão com pepsina, liberta a maior parte das partículas de uma amostra representativa. Embora este experimento mostre pouca diferença entre 0,1 mg/ ml e 1 mg/ ml de proteínase K, outros experimentos com amostras de tumor demonstraram que 1 mg/ ml de proteínase K produz os resultados mais consistentes (não mostrados).
A DISSOCIAÇÃO ENZIMÁTICA AUMENTA O RENDIMENTO DE PARTÍCULAS EM COMPARAÇÃO COM A DISSOCIAÇÃO MECÂNICA
[0770] O método de dissociação da proteínase K-pepsina foi comparado com a dissociação mecânica isolada para três amostras independentes de amígdala. As Figuras 44A-44C mostram que o método da proteínase K-pepsina melhora significativamente o número de partículas libertadas a partir de uma amostra representativa. Curiosamente, os resultados da coloração H&E mostram que muitas das partículas liberadas pelo método da proteínase K-pepsina consistem em núcleos com ou sem fragmentos citoplasmáticos ligados, enquanto a amostra dissociada mecanicamente contém material celular mais intacto (Figura 48, painéis inferiores).
PREPARAÇÕES NUCLEARES DE TUMORES SÃO REPRODUTÍVEIS NO RENDIMENTO E DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO
[0771] Para determinar a reprodutibilidade de preparações nucleares da mesma amostra de tumor representativa, a consistência dos métodos e consistência das populações presentes nas alíquotas individuais foram avaliadas. De diferentes alíquotas (~1 grama) retiradas do material homogeneizado total, os núcleos foram preparados utilizando o método da Proteínase K-pepsina como descrito acima. A Figura 45A mostra que o rendimento de núcleos preparados a partir de dois tumores diferentes (cólon e pulmão) é altamente consistente através de múltiplas alíquotas retiradas da mesma amostra representativa. A distribuição de tamanho das partículas isoladas do tumor de cólon foi ainda analisada para identificar uma distribuição de tamanho muito reprodutível e característica ao longo de três preparações diferentes (Figura 45B). Notavelmente, os núcleos se distribuem em duas populações de tamanhos característicos (Fig. 45B). Estes dados sustentam que alíquotas diferentes da mesma amostra representativa contêm uma composição celular consistente, e que os métodos desenvolvidos para extrair núcleos produzem rendimentos consistentes de duas populações nucleares diferentes.
ESTIMATIVA DO DANO CELULAR DEVIDO À DISSOCIAÇÃO
[0772] O processamento adicional de amostras representativas em núcleos individuais pode resultar na liberação de DNA do compartimento nuclear. A liberação de DNA no sobrenadante é uma possível reação de dano aos núcleos. A Figura 46 mostra que cerca de 4% do DNA total é liberado durante o processamento do material da amígdala por métodos mecânicos ou de Proteínase K-Pepsina. O processamento de três tumores diferentes resulta em menos de 10% do DNA liberado (Figura 46). Curiosamente, percentuais semelhantes de danos nucleares ocorrem com os métodos mecânico e enzimático, suportando que o método Proteínase K-Pepsin isola os núcleos intactos sem danificá-los.
DIMINUIÇÃO DA AGREGAÇÃO DE NÚCLEOS
[0773] Experimentos iniciais de citometria de fluxo revelaram que ~ 35% das partículas existiam em um estado agregado, como evidenciado pela presença de partículas em picos de maior intensidade de coloração DAPI (Figura 47, painel (ii), R2 (verde) e R3 (rosa)). Quando por trás (back-gated) no gráfico de pontos de dispersão lateral vs. dispersão direta (painel (i), populações verde e rosa), estas partículas caindo em picos de maior intensidade DAPI mapeiam para regiões com maior dispersão frontal e lateral, indicando um tamanho maior. Embora a discriminação por duplicação de rotina possa permitir analisar especificamente os núcleos singuleto (R1, vermelho), o número de núcleos singulares presentes na amostra foi aumentado. Vários aditivos (ver métodos) foram adicionados para diminuir a agregação dos núcleos isolados. Descobriu-se que a adição de Tween 20 a 1% reduziu o número de partículas agregadas de ~35% para ~23% (compare R2 + R3 dos gráficos em B com as mesmas regiões de gráficos em A). Outros aditivos foram ineficazes na redução do número de partículas agregadas; no entanto, a adição de 1,5 mM de tetracloreto de espermina manteve a integridade dos núcleos ao longo do tempo (não mostrado). Notavelmente, ao contrário do tecido fresco, a DNAse não pode ser usada para desagregar o tecido fixo, pois não há células funcionais ou membranas nucleares para impedir que a DNAse tenha acesso ao DNA nuclear na célula e destrua-o (dados não mostrados).
AS CITOQUERATINAS PERMANECEM ASSOCIADAS A NÚCLEOS ISOLADOS DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS DE TUMORES
[0774] Para classificar os núcleos isolados da amostra representativa, os marcadores que permanecem associados aos núcleos foram identificados para distinguir o tumor do normal. Filamentos intermediários (citoqueratinas, vimentina) estão frequentemente intimamente associados com o núcleo, e eles também são frequentemente usados para identificar carcinomas do estroma normal circundante. Hipotetizou-se que estes podem ser marcadores específicos de linhagem que poderiam ser corados nas partículas nucleares isoladas que foram coletadas usando o método da proteínase K-pepsina. A Figura 48A mostra uma seção de um adenocarcinoma do cólon com uma coloração imuno-histoquímica forte característica para a citoqueratina 8/18 e uma seção retirada de uma amostra representativa do mesmo tumor fixo embebido em cera de parafina mostra uma coloração semelhante (Figura 52B). A Figura 48C mostra material isolado a partir da amostra representativa deste tumor utilizando o método da proteínase K-pepsina, corado para CK8/ 18 e visualizado com um anticorpo secundário conjugado com fluorescência. Notavelmente, este marcador é retomado quando a amostra é desassociada com o método da proteínase K-pepsina, e uma amostra de controle negativo incubada sem anticorpo primário mostra pouca coloração de fundo (Figura 48D). A vimentina permanece associada a muitos núcleos isolados da amígdala. No entanto, o marcador de superfície CD45, que cora positivo na amostra mecanicamente dissociada, é perdido com o tratamento com proteínase K- pepsina (não mostrado). Assim, citoqueratinas e vimentina servirão como marcadores associados a núcleos específicos de linhagem para análise de citometria de fluxo e triagem celular, mesmo quando os marcadores de superfície forem destruídos. Outros marcadores nucleares, como fatores de transcrição linhagem-específicos, também podem ser corados para tipos específicos de tumores. Esta é uma característica única do isolamento nuclear de amostras fixadas em formalina.
MELHORIA NA COLORAÇÃO DO MARCADOR UTILIZANDO AMPLIFICAÇÃO DO SINAL DE TIRAMIDA
[0775] A coloração com imunofluorescência convencional (IF) (Figura 48C) não forneceu um sinal suficientemente brilhante e estável para consistentemente originar populações coradas positivamente por citometria de fluxo (não mostrado). A análise de amostras coradas por citometria de fluxo geralmente requer o uso de anticorpos que são diretamente conjugados a fluoróforos para obter um sinal mais estável. O desafio para o material isolado de amostras representativas é que ele é derivado de tumores que são frequentemente fortemente fixados em formol. Para permitir a análise de rotina de amostras representativas fixas por citometria de fluxo, a amplificação do sinal da tiramida (TSA) foi utilizada para a coloração do anticorpo utilizando anticorpos utilizados em tecidos fixados em formalina. Para TSA, os fluoróforos conjugados com tiramida são ativados por HRP conjugado com um anticorpo secundário que se liga a um anticorpo primário específico de marcador. Os corantes fluorescentes ativados ligam-se covalentemente a proteínas na vizinhança do marcador reconhecido pelo anticorpo primário, o que produz um sinal brilhante e estável. A Figura 53A mostra uma comparação da amígdala dissociada mecanicamente corada para CD45 utilizando imunofluorescência convencional vs. TSA. A Figura 53B mostra a coloração com citoqueratina para dois tipos diferentes de tumores, amplificados por TSA. Observe a presença de células negativas para citoqueratina coradas com DAPI dentro da amostra corada com citoqueratina, mostrando a especificidade da TSA em solução.
A COLORAÇÃO COM CITOQUERATINA PERMITE A DISTINÇÃO DE NÚCLEOS TUMORAIS E NORMAIS POR CITOMETRIA DE FLUXO
[0776] Em seguida, os núcleos corados com citoqueratina (CK) e DAPI de amostras representativas de tumores de cólon e pulmão usando citometria de fluxo foram analisados (Figura 50). Em ambos os casos, as populações CK positivas (verde-azuladas) e CK-negativas (rosa) foram discernidas (Figura 50, painel i). As populações negativas para CK foram associadas a um teor de DNA diploide (Figura 50, painel ii), confirmando que estes são núcleos provenientes de uma população de células normais (provavelmente células imunes) que residem no tumor. Para as populações positivas para CK, a coloração com DAPI revelou uma fração de núcleos com DNA aneuploide (Figura 50, painel iii), sustentando que estes são provavelmente derivados de células tumorais. Para cada amostra, os núcleos foram classificados com sucesso em fracções que foram enriquecidas para núcleos normais (Fig. 50, painel iv) ou núcleos tumorais (painel v). O DNA foi extraído com sucesso destas populações colecionadas e pode ser analisado por sequenciamento de próxima geração (NGS), PCR, hibridização in situ ou outra análise a jusante.
[0777] Além disso, as Figuras 51A e 51B mostram que a percentagem de núcleos tumorais e normais de diferentes tumores varia. Para a amostra de tumor de cólon, o tumor inteiro foi atribuído a diferentes caixas. A fração indefinida (cinza) corresponde à porcentagem em peso do material que foi removido por filtração (ver métodos). A percentagem de glóbulos vermelhos foi estimada subtraindo a contagem total de partículas após a digestão enzimática, que destrói os glóbulos vermelhos, da contagem total de partículas antes da digestão enzimática. A fração restante foi designada como tumor e normal de acordo com a análise de citometria de fluxo dos núcleos tumorais. A análise da composição do tumor ao nível celular pode ser relevante para o diagnóstico, particularmente quando se tenta identificar populações de células imunológicas que estão presentes no material homogeneizado do tumor.
ESTABELECIMENTO DO RENDIMENTO DE DNA A PARTIR DE PARTÍCULAS ISOLADAS DA AMOSTRA REPRESENTATIVA
[0778] Um número definido de partículas com características específicas foi coletado usando a triagem FLOW. A calibração do rendimento de DNA a partir de diferentes números de partículas determinará quanto material coletar das amostras representativas para análise específica posterior, como NGS. A Figura 52 mostra o rendimento de DNA a partir de partículas dissociadas mecanicamente e dissociadas por proteínase K-pepsina de amostras representativas de amígdalas. É importante notar que estes dados mostram que partículas isoladas do método da proteínase K-pepsina proporcionam um rendimento de DNA similar ao das partículas isoladas da dissociação mecânica, indicando que o método enzimático mantém a integridade do DNA. Além disso, o número de partículas foi calculado para determinar o número necessário para detectar um clone presente na prevalência de 5% (Tabela 8). Esses resultados guiarão os esforços para coletar um número suficiente de partículas de populações específicas da amostra representativa para a detecção de variantes de energia em aplicações de sequenciamento posterior.TABELA 4 CÁLCULO DO NÚMERO DE PARTÍCULAS NECESSÁRIAS PARA IDENTIFICAR UM SUBCLONE DE PREVALÊNCIA DE 5%
Figure img0005
EXEMPLO 10 - HIBRIDIZAÇÃO IN SITU EM NÚCLEOS ISOLADOS ANTECEDENTES
[0779] O isolamento de núcleos a partir de uma amostra representativa permite a oportunidade de realizar a hibridização in situ (ISH) em uma amostra de tumor que é representativa da diversidade do tumor total, de maneira automatizada em uma plataforma automatizada de colorações VENTANA BenchMark. A interpretação da coloração de ISH de núcleos isolados é provavelmente mais fácil, com menos antecedentes não específicos devido à falta de tecido incluído em parafina.
MATERIAIS
[0780] A dissociação mecânica foi realizada como descrito no Exemplo 9.
AMOSTRAS CLÍNICAS
[0781] As amostras clínicas foram descritas no Exemplo 9.
COLORAÇÃO COM HEMATOXILINA E EOSINA
[0782] Amostras representativas foram plaqueadas em tampão autoMACS em lâminas VWR plus. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada utilizando uma plataforma Symphony da Ventana Medical Systems (Ventana Medical System, Tucson, AZ) e os correspondentes Reagentes da Symphony da H&E (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ).
HIBRIDIZAÇÃO IN-SITU
[0783] Os núcleos isolados foram preparados como no Exemplo 8, plaqueados em lâminas a 2 x 107 partículas por mL e deixados a secar ao ar durante a noite. As amostras foram ensaiadas utilizando o protocolo Her2/ Chr17 Dual in-situ hybridization (ISH) utilizando uma plataforma Benchmark XT da Ventana Medical Systems (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). A visualização dos biomarcadores foi realizada utilizando a detecção de HRP de prata e a detecção de fosfatase alcalina (AP), respectivamente. Anticorpos coqueteados foram incubados por 8 minutos. As imagens foram adquiridas em um microscópio de campo claro Zeiss Axio.
RESULTADOS
[0784] O isolamento dos núcleos a partir de um tumor de cólon e do pulmão cria uma nova amostra para análise de ISH de amostras de tecido fixadas em formalina. O isolamento dos núcleos permite a avaliação rápida do número de cópias dos genes, uma vez que o tecido circundante não permite aquisição e interpretação de sinais compensados, o esquema de detecção é mostrado na Figura 39. Como mostrado na Figura 39, quando sondas de DNA oligo Her2/ Chr17 são hibridizadas para núcleos isolados de uma amostra representativa derivada de um tumor de cólon, dois genes Her2 e duas regiões satélites alfa do cromossomo 17 (Her2 SISH preto e sinais da fosfatase alcalina Chr17 vermelha, seta e flecha tracejadas, respectivamente) são facilmente detectáveis. Curiosamente, uma fração dos núcleos isolados de uma amostra representativa derivada de um tumor de pulmão tem amplificação do locus Her2, como evidenciado pelo amplo sinal SISH em uma porcentagem dos núcleos (Figura 40, sinal Her2 SISH na seta tracejada).
[0785] Com estes dados, os inventores demonstram a capacidade de interrogar núcleos individuais derivados de amostras representativas de tumores humanos fixados com formalina utilizando ISH. Núcleos isolados fornecem um substrato melhorado para ISH, pois não há cera parafínica residual no tecido, uma razão comum para coloração de fundo em procedimentos de ISH.
EXEMPLO 11: ANÁLISE DE SEQUENCIAMENTO DE PRÓXIMA GERAÇÃO DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS ANTECEDENTES
[0786] O Sequenciamento de Próxima Geração (Next Generation Sequencing - NGS) é uma tecnologia de sequenciamento de DNA de alto rendimento que permite a análise simultânea de milhões a bilhões de fragmentos de DNA. Na década passada, avanços significativos na tecnologia NGS permitiram que pesquisadores e médicos ligassem as mutações de DNA à heterogeneidade do tumor, à resistência a terapia direcionada e à eficácia da imuno-terapia de câncer. No entanto, as amostras de tumores usadas para NGS na clínica são exclusivamente tecidos FFPE que são enviesados como descrito acima. A análise por NGS de amostras representativas de tumores irá melhorar significativamente a relevância clínica dos dados do NGS.
MATERIAIS E MÉTODOS
[0787] A dissociação mecânica dos tumores foi realizada utilizando um misturador Hamilton Beach Single Serve comprado na Walmart (Tucson, AZ) ou utilizando um sistema de controle de moinho tubular IKA Works (0004180001) da IKA-Works (Staufen im Breisgau, Alemanha). Toda a preparação da biblioteca (TruSeq Amplicon Cancer Panel) e kits de reagentes MiSeq (MiSeq Reagent Kit V2) foram comprados na Illumina Inc. (San Diego, CA). O sequenciamento foi realizado em um MiSeq (Illumina, San Diego, CA).
[0788] As amostras de tecido de cólon, pulmão e carcinoma papilar urotelial foram obtidas de GLAS (Winston-Salem, NC), o carcinoma renal de células claras foi obtido do Northwest Hospital (Tucson, AZ) e a amostra de carcinoma renal de translocação foi obtida da Chandler Regional. Hospital (Chandler, AZ). Todos os tecidos chegaram à Ventana Medical Systems em 10% de formalina tamponada neutra.
[0789] Todos os tecidos foram removidos do material de embalagem e examinados por um patologista. O tecido foi ressectado para separar o tumor do normal e os blocos foram retirados para exames histológicos tradicionais. As amostras tumorais e normais para cada amostra clínica foram desassociadas mecanicamente, primeiro pesando o tecido e depois misturando em uma solução 1 : 1 ou 1 : 1,25 (peso : volume) de MACS PBS (Miltenyi Biotec; Teterow, Alemanha). Amostras representativas foram armazenadas em PBS MACS a 4 °C.
[0790] O TRIzol (Thermo-Fisher; Waltham, MA) foi utilizado para isolar o DNA das amostras representativas de acordo com o protocolo padrão com uma modificação. As amostras foram incubadas durante a noite a 60 °C em TRIzol com 2 mg/ ml de Proteínase K (VWR; Radnor, PA). Em alguns casos, cortes histológicos retirados dos blocos FFPE foram usados para comparar a metodologia de amostragem atual com a amostragem representativa. Para os casos em que foram produzidos blocos de tecido FFPE, foram cortadas cinco secções de 10 μM dos blocos dos espécimes do cólon, pulmão e rins de translocação, juntamente com uma seção única de 4 μM que foi corada em hematoxilina e eosina (H&E). A lâmina corada com H&E foi revisada por um patologista que identificou regiões tumorais. As regiões do tumor foram isoladas das restantes lâminas usando um instrumento de mesodisseção Millisect (Roche; Basel, Suíça). O DNA foi então isolado utilizando um estojo de isolamento High Pure FFPET DNA (Roche; Basel, Suíça).
[0791] A concentração de DNA foi determinada usando um kit de dsDNA Quant-iT PicoGreen (Thermo-Fisher; Waltham, MA). A qualidade do DNA foi avaliada usando o kit QC da Biblioteca de DNA Illumina TruSeq FFPE (San Diego, CA). Para cada amostra, 400 ng de DNA foram utilizados como molde para o kit de preparação da Biblioteca TruSeq Amplicon-Cancer Panel, de acordo com o protocolo do fabricante (Illumina; San Diego, CA). Após amplificação, as reações por PCR foram limpas utilizando um kit de purificação de PCR Qiaquick (Qiagen; Duesseldorf, Alemanha). As concentrações de DNA foram então medidas usando um kit de dsDNA Quant-iT PicoGreen (Thermo-Fisher; Waltham, MA). As bibliotecas foram misturadas em quantidades iguais para criar uma biblioteca agrupada de 4 nM. As bibliotecas foram então desnaturadas utilizando uma quantidade igual de NaOH a 0,2 N e depois diluídas para 20 pM em tampão HT1 (Illumina; San Diego, CA). Cada biblioteca foi então adicionalmente diluída para 15 pM em tampão HT1 antes de ser carregada no cartucho de sequenciamento.
[0792] O sequenciamento foi realizado em um instrumento MiSeq usando kits de reagentes MiSeq V2 (Illumina; San Diego, CA) e carregando 600μL de uma biblioteca agrupada de 15pM. Sequenciamento final emparelhado foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante.
[0793] Os dados de sequenciamento brutos foram analisados usando o aplicativo TruSeq Amplicon da Illumina (San Diego, CA) e por meio de um banco de dados CAVA modificado (Anotação Clínica de Variantes) (The Wellcome Trust Center for Human Genetics; Oxford, Reino Unido). Apenas variantes acima de 5% de prevalência foram incluídas no conjunto de dados, já que a frequência do alelo mutante de 5% é o ponto de corte comum para relatar os dados do NGS.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0794] Utilizou-se um pequeno painel genético direcionado de 48 genes de câncer conhecidos para amostras representativas de sequências profundas derivadas de tumores humanos fixados com formalina. Para demonstrar a melhoria significativa na detecção de mutações de tecidos cancerígenos, amostras representativas foram comparadas com seções histológicas retiradas dos mesmos tumores. Em todos os casos, as amostras representativas entregaram significativamente mais mutações tumorais do que o método de amostragem atual e histórico de aquisição de pequenos blocos FFPE. TABELA 5: LISTA DE AMOSTRAS TUMORAIS
Figure img0006
[0795] A Tabela 5 resume as amostras clínicas que foram usadas para gerar amostras representativas para análise de NGS neste exemplo. Os dados do NGS foram analisados pela primeira vez usando o aplicativo TRUSeq Amplicon da Illumina para identificar variantes. Este programa alinha as leituras de sequenciamento com o genoma de referência homo sapiens hg19 para identificar mutações pontuais e deleções que estão presentes em ou acima de um limiar de prevalência de 5%. Após esta análise inicial dos dados, todas as mutações identificadas nas amostras representativas que não foram encontradas em quaisquer blocos FFPE retirados do mesmo tumor foram anotadas como únicas para a amostra representativa e estão listadas nas tabelas 6 a 11 para cada tumor testado. Para todos os tumores testados, as amostras representativas continham muito mais mutações do que os blocos de FFPE retirados dos mesmos tumores. TABELA 6 : MUTAÇÕES ÚNICAS NA AMOSTRA REPRESENTATIVA DO ADENOCARCINOMA DO CÓLON
Figure img0007
Figure img0008
Figure img0009
Figure img0010
Tabela 7: Mutações Únicas na Amostra Representativa do Carcinoma Renal de Translocação
Figure img0011
Figure img0012
Figure img0013
TABELA 8: MUTAÇÕES ÚNICAS NA AMOSTRA REPRESENTATIVA DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS PULMONARES
Figure img0014
Figure img0015
[0796] As mutações foram encontrados nos blocos de FFPE que não foram encontradas nas amostras representativas, no entanto foram muito menos mutações únicas para os blocos em comparação com as amostras representativas (Tabelas 9-12). TABELA 9: MUTAÇÕES DE APENAS BLOQUEIO NO ADENOCARCINOMA DO CÓLON
Figure img0016
TABELA 10: MUTAÇÕES DE APENAS BLOQUEIO NO CARCINOMA DE CÉLULAS RENAIS DE TRANSLOCAÇÃO
Figure img0017
TABELA 11: MUTAÇÃO ÚNICA DOS BLOCOS FFPE NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS PULMONARES
Figure img0018
TABELA 12: NÚMERO DE MUTAÇÕES ÚNICAS POR TIPO DE AMOSTRA
Figure img0019
[0797] Os dados de NGS foram ainda analisados para o adenocarcinoma do cólon, carcinoma de células renais de translocação e carcinoma de células escamosas do pulmão utilizando uma base de dados CAVA para determinar o número de mutações resultando em alterações na região codificadora (por exemplo, mutação missense resultando em uma mudança de aminoácidos). As Tabelas 13 a 15 mostram as mutações que resultam em alterações de codificação, sugerindo que essas mutações podem ser de importância para pesquisa e/ ou de clínica. TABELA 13: MUTAÇÕES PATOGÊNICAS NA AMOSTRA REPRESENTATIVA DO ADENOCARCINOMA DO CÓLON
Figure img0020
Figure img0021
TABELA 14: MUTAÇÕES PATOGÊNICAS NA AMOSTRA REPRESENTATIVA DO CARCINOMA RENAL DE TRANSLOCAÇÃO
Figure img0022
Figure img0023
TABELA 15: MUTAÇÕES PATOGÊNICAS NA AMOSTRA REPRESENTATIVA DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS PULMONARES
Figure img0024
Figure img0025
[0798] Com estes dados, os inventores demonstraram que amostras representativas são superiores às atuais técnicas de amostragem em patologia clínica e oncologia. Além disso, demonstraram que as taxas de prevalência das mutações variam, demonstraram que a análise NGS a partir de amostras representativas de tumores permite a detecção de mutações clonais e subclonais em tumores humanos. Juntos, esses dados demonstram que amostras representativas de tumores humanos ressectados podem ser usadas para interrogar a diversidade genômica do câncer.
EXEMPLO 12: INCORPORAÇÃO DE AMOSTRAS REPRESENTATIVAS EM CERA DE PARAFINA E ANÁLISE HISTOLÓGICA ANTECEDENTES:
[0799] Amostras representativas derivadas de órgãos, tecidos ou tumores podem ser inclusas em cera de parafina para gerar um tipo de amostra que contém fragmentos celulares de tecido, preservando assim as relações anatômicas entre as estruturas contidas no órgão, tecido ou tumor original. As seções histológicas retiradas de amostras representativas inclusas podem ser analisadas por um patologista anatómico, ou utilizando um sistema de varredura digital por microscópio. Os dados dos sistemas de varredura digital podem ser ainda mais investigados para quantificar o nível de heterogeneidade entre os biomarcadores, ou entre pacientes. Além disso, a saída dos sistemas de varredura pode ser usada como entrada para uma análise matemática da heterogeneidade como ilustrado abaixo.
MATERIAIS E MÉTODOS:
[0800] As amígdalas frescas foram adquiridas no Northwest Hospital (Oro Valley, AZ) e foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% à chegada. Algumas amostras de amígdalas foram processadas em blocos de FFPE, colocando a amígdala inteira em uma cassete de tecido, seguida de desidratação e perfusão em parafina. Amostras representativas de amígdalas foram feitas como descrito nos exemplos anteriores. As amostras representativas derivadas de um pulmão humano e tumor de cólon foram as mesmas amostras como descrito no Exemplo 11. Uma amostra das amostras representativas da amígdala, tumor de cólon e tumor do pulmão foram embrulhadas em papel de lentes de microscópio e colocadas em um cassete de tecido. O cassete de tecido foi colocado em xileno e desidratado em um processador de tecidos (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha) e depois inclusa em cera. Quatro seções de mícron foram retiradas de todos os blocos analisados.
[0801] Para IHC, as lâminas foram coradas usando o protocolo OptiView DAB IHC usando uma plataforma Benchmark XT da Ventana Medical Systems (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). A visualização dos anticorpos foi realizada utilizando o kit OptiView DAB Detection. Os anticorpos foram incubados por instruções de inseridas na embalagem.
[0802] Para a análise digital de imagens, varreduras completas de lâminas foram adquiridas em um scanner Aperio AT2 e a análise de imagens foi realizada usando o algoritmo Aperio ImageScope ‘Positive Pixel Count v9’.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0803] A interpretação de muitas colorações histológicas exigem a preservação da arquitetura dos tecidos, por exemplo, a orientação das células imunes para as células tumorais. Portanto, a dissociação de tumores em células únicas pode não funcionar em todos os ensaios histológicos. Para determinar se as amostras representativas desassociadas mecanicamente derivadas de um órgão intacto poderiam ser incorporadas em cera, histologicamente seccionadas e avaliadas quanto a características arquitetônicas específicas, amígdalas inteiras foram mecanicamente dissociadas em um moinho de tubo IKA. Uma amostra do material homogeneizado de amígdala foi desidratada e embebida em cera, quatro seções de mícron foram retiradas e colocadas em lâminas de vidro, e coradas para vários biomarcadores em um Ventana BenchMark XT.
[0804] As Figuras 53 A e 53 B são imagens inteiras em lâmina de um corte histológico retirado de uma amígdala intacta corada com um anticorpo de pan-queratina. A Figura 53 A descreve um corte histológico tradicional de uma amígdala normal detectado por DAB para Pan-Queratina. A Figura 53 B é uma seção de uma amostra representativa de amígdala detectada por DAB para Pan- Queratina. A organização e estrutura da amígdala é ainda mais destacada na caixa da Figura 53A, onde o tecido epitelial em marrom é adjacente a vários centros germinais contendo os muitos tipos diferentes de linfócitos. Esta organização de tecido é preservada quando uma amostra de amígdala homogeneizada é embebida em parafina e seccionada (Figuras 54A e 54B). A Figura 54 A descreve um corte histológico tradicional de uma amígdala normal detectada por DAB para CD8. A Figura 54B descreve uma seção de uma amostra representativa de amígdala detectada por DAB para CD8. Quando coradas para a presença de células CD8 positivas, tanto a seção da amígdala como a amígdala homogeneizada demonstram células CD8 positivas circundando os centros germinais circulares. Estes dados demonstram a capacidade de amostras representativas incluídas em parafina derivadas de órgãos, tecidos e tumores em gerar uma amostra histológica que preserva a arquitetura anatômica e tecidual para posterior análise.
[0805] Duas amostras representativas derivadas do cólon e um tumor do pulmão do exemplo 9 foram inclusas em cera de parafina para análise histológica. Cortes finos de quatro mícron foram cortados e corados para múltiplos biomarcadores tumorais e imunológicos específicos (Met, Alk, bRaf, EGFR, PD-L1, CD8 e CK 8/18. As lâminas foram lidas e os pontos de intensidade foram analisados por um estudo anatômico. Blocos FFPE padrão feitos de amostras tomadas para imitar o atual sistema de estadiamento TNM foram incluídos nesta análise (blocos na Tabela 1 6). Como mostrado na Tabela 16, o patologista anatomista pode ler e interpretar a coloração de blocos FFPE e amostras representativas. TABELA 16. PONTUAÇÃO DO PATOLOGISTA AO IHC
Figure img0026
[0806] A interpretação da amostra representativa pelo patologista não pareceu abordar a heterogeneidade na intensidade do sinal e a coloração ao longo de toda a lâmina. Para gerar uma representação matemática da heterogeneidade na coloração IHC de amostras representativas, as lâminas coradas IHC foram analisadas usando um scanner de slides digital. Após a varredura inteira da lâmina, a intensidade DAB foi quantificada usando o algoritmo Aperio ImageScope ‘Positive Pixel Count v9’. Para todos os blocos e amostras representativas, a intensidade do sinal CD8, PD-L1, EGFR e MET foi dividida pela intensidade do sinal de CK 8/18 para expressar matematicamente a heterogeneidade do sinal do biomarcador, em relação ao conteúdo do tumor. Como mostrado nas Tabelas 16-23, enquanto as médias do CD8 em relação a CK 8/18 para os blocos histológicos do cólon e do tumor de pulmão são iguais às da amostra representativa, há diferenças significativas nas médias das intensidades de sinal relativas entre as amostras coradas com PD-L1, EGFR e MET. Estes dados sugerem que a coloração IHC das seções histológicas feitas a partir de amostras de amostras representativas representa melhor a heterogeneidade nos sinais de biomarcadores e diminui a variação nos resultados de IHC, uma vez que os blocos variaram significativamente entre si. TABELA 17. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE CD8 IHC DE AMOSTRAS DE CÓLON
Figure img0027
TABELA 18. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE PD-L1 IHC DE AMOSTRAS DE CÓLON
Figure img0028
TABELA 19. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE EGFR IHC DE AMOSTRAS DE CÓLON
Figure img0029
TABELA 20. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE MET IHC DE AMOSTRAS DE CÓLON
Figure img0030
Figure img0031
TABELA 21. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE CD8 IHC DE AMOSTRAS DE PULMÃO
Figure img0032
TABELA 22. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE PD-L1 IHC DE AMOSTRAS DE PULMÃO
Figure img0033
TABELA 23. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE EGFR IHC DE AMOSTRAS DE PULMÃO
Figure img0034
TABELA 24. IMAGEM DIGITAL E ANÁLISE DE MET IHC DE AMOSTRAS DE PULMÃO
Figure img0035
[0807] Todas as referências patentes e não patenteadas aqui citadas são incorporadas por referência em sua totalidade.
[0808] Deve ser entendido que, embora a descrição tenha sido descrita em conjunto com as formas de realização acima, a descrição e os exemplos anteriores destinam-se a ilustrar e não limitar o escopo da divulgação. Outros aspectos, vantagens e modificações no escopo da divulgação seriam evidentes para os técnicos no assunto aos quais a divulgação pertence.
[0809] As descrições ilustrativamente aqui descritas podem ser adequadamente praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente divulgadas aqui. Assim, por exemplo, os termos “compreendendo”, “incluindo”, contendo”, etc. devem ser lidos de forma expansiva e sem limitação. Além disso, os termos e expressões aqui empregados foram utilizados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de exclusão de quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou de suas partes, mas é reconheceu que várias modificações são possíveis dentro do escopo da divulgação reivindicada.
[0810] Assim, deve ser entendido que, embora a presente divulgação tenha sido especificamente divulgada por formas de realização preferidas e características opcionais, a modificação, melhoria e variação das descrições s aqui incorporadas podem ser utilizadas pelos peritos na arte, e que tais modificações, melhorias e variações são consideradas dentro do escopo desta divulgação. Os materiais, métodos e exemplos aqui fornecidos são representativos de formas de realização preferidas, são exemplificativos e não pretendem ser limitações do escopo da divulgação.
[0811] A divulgação foi descrita ampla e genericamente aqui. Cada uma das espécies mais estreitas e agrupamentos subgenéricos abrangidos pela divulgação genérica também fazem parte da divulgação. Isto inclui a descrição genérica da divulgação com uma condição ou limitação negativa, removendo qualquer assunto do gênero, independentemente do material excisado ser ou não especificamente aqui descrito.
[0812] Adicionalmente, quando as características ou aspectos da divulgação são descritos em termos de grupos Markush, os técnicos no assunto reconhecem que a divulgação também desse modo descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush. OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO 1. Um método para preparar uma amostra representativa para análise, compreendendo: a) obter uma amostra de tecido de ressecção cirúrgica de pelo menos um sujeito; e, b) homogeneizar a amostra de tecido de ressecção cirúrgica para obter uma amostra homogeneizada; 2. O método, de acordo com a forma de realização 1, compreendendo ainda a fixação de pelo menos uma porção da amostra de tecido de ressecção cirúrgica; 3. O método, de acordo com a forma de realização 1, compreendendo ainda o processamento de uma primeira porção da amostra de ressecção cirúrgica e a geração de um ou mais blocos de tecido inclusos fixos; 4. O método, de acordo com a forma de realização 3, compreendendo ainda a homogeneização de uma segunda porção da amostra de ressecção de tecido cirúrgico restante; 5. O método, de acordo com a forma de realização 3 ou 4, compreendendo ainda o processamento de pelo menos uma porção de um ou mais blocos de tecido inclusos fixos por micrototomia para produzir uma ou mais seções finas de tecido para análise morfológica; 6. O método, de acordo com a forma de realização 5, compreende ainda desparafinar pelo menos um dos um ou mais blocos de tecido inclusos fixos e homogeneizar o tecido a partir de um ou mais blocos de tecido inclusos fixos desparafinados; 7. O método, de acordo com a forma de realização 1, em que a amostra de tecido de ressecção cirúrgica inclui uma ou mais peças separadas de tecido; 8. O método, de acordo com a forma de realização 7, em que a uma ou mais peças de tecido separadas compreendem pelo menos uma porção de uma ou mais massas de tecido tumoral sólidas primárias ressecadas de um sujeito para obter a amostra de ressecção cirúrgica; 9. O método, de acordo com a forma de realização 8, em que a uma ou mais peças separadas de tecido compreende pelo menos uma parte de um ou mais nódulo linfáticos removidos do indivíduo; 10. O método, de acordo com a forma de realização 7, 8 ou 9, compreendendo adicionalmente homogeneizar pelo menos uma porção das partes separadas de tecido para produzir amostras homogeneizadas separadas; 11. O método, de acordo com a forma de realização 1, em que a amostra de tecido de ressecção cirúrgica compreende uma única massa de tecido; 12. O método, de acordo com a forma de realização 11, em que a massa de tecido único é ainda dividida em duas ou mais partes da massa de tecido único; 13. O método, de acordo com a forma de realização 12, compreendendo ainda a homogeneização de pelo menos um dos dois ou mais pedaços da massa de tecido único e preservando pelo menos uma das duas ou mais peças restantes da massa de tecido único; 14. O método, de acordo com a forma de realização 1, em que a homogeneização compreende a separação física; 15. O método, de acordo com a forma de realização 14, em que a separação física é por corte, fatiamento ou picando-o; 16. O método, de acordo com a forma de realização 1, em que a homogeneização compreende dissociação mecânica; 17. O método, de acordo com a forma de realização 16, em que a dissociação mecânica é por mistura ou espremendo-a; 18. O método, de acordo com a forma de realização 1, em que a homogeneização é por dissociação bioquímica; 19. O método, de acordo com a forma de realização 18, em que a dissociação bioquímica é por uma proteínase; 20. O método, de acordo com a forma de realização 1, compreendendo ainda a purificação de uma ou mais biomoléculas de pelo menos uma porção do material homogeneizado; 21. O método, de acordo com a forma de realização 20, em que a uma ou mais biomoléculas são selecionadas a partir do grupo que consiste em DNA, RNA, proteínas, lipídeos e metabólitos; 22. O método, de acordo com a forma de realização 21, compreendendo ainda a análise de uma ou mais biomoléculas; 23. O método, de acordo com a forma de realização 22, em que a análise de uma ou mais biomoléculas é por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de próxima geração ou ELISA; 24. O método, de acordo com a forma de realização 22, em que a análise produz pelo menos um conjunto de dados; 25. O método, de acordo com a forma de realização 1, compreendendo ainda a incorporação de pelo menos uma porção da amostra homogeneizada em parafina; 26. O método, de acordo com a forma de realização 25, compreendendo ainda preparar uma ou mais seções finas da amostra homogeneizada inclusa em parafina; 27. O método, de acordo com a forma de realização 26, compreende ainda a realização de análise histológica em seções finas da amostra homogeneizada embebida em parafina; 28. O método, de acordo com a forma de realização 27, em que a análise histológica é por coloração com H&E, coloração IHC, coloração ISH e coloração FISH; 29. O método, de acordo com a forma de realização 27, em que a análise histológica em seções finas da amostra homogeneizada com inclusão em parafina é interpretada por um humano; 30. O método, de acordo com a forma de realização 27, em que a análise histológica em seções finas da amostra homogeneizada com inclusão em parafina é quantificada por um dispositivo automatizado; 31. O método, de acordo com a forma de realização 29, em que a interpretação produz pelo menos um conjunto de dados; 32. O método, de acordo com a forma de realização 30, em que a quantificação produz pelo menos um conjunto de dados; 33. O método, de acordo com a forma de realização 1, compreende ainda processamento adicional de pelo menos uma porção do homogeneizado para gerar fragmentos celulares; 34. O método, de acordo com a forma de realização 32, em que o processamento de pelo menos uma porção do homogeneizado é por métodos físicos, mecânicos, químicos ou enzimáticos; 35. O método, de acordo com a forma de realização 33, em que os fragmentos celulares são selecionados a partir do grupo que consiste em núcleos, membranas celulares e organelas celulares; 36. O método, de acordo com a forma de realização 33, em que pelo menos uma porção dos fragmentos celulares está afixada a pelo menos uma lâmina de vidro; 37. O método, de acordo com a forma de realização 36, em que a pelo menos uma porção dos fragmentos celulares afixados a pelo menos uma lâmina de vidro é submetida a análise histológica; 38. O método, de acordo com a forma de realização 37, em que a análise histológica é por coloração com H&E, coloração com IHC, coloração com ISH ou coloração com FISH; 39. O método, de acordo com a forma de realização 36, em que a análise histológica em pelo menos uma porção dos fragmentos celulares afixados a pelo menos uma lâmina de vidro é interpretada por um humano; 40. O método, de acordo com a forma de realização 36, em que a análise histológica em pelo menos uma porção dos fragmentos celulares afixados a pelo menos uma lâmina de vidro é quantificada por um dispositivo automático; 41. O método, de acordo com a forma de realização 39, em que a interpretação produz pelo menos um conjunto de dados; 42. O método, de acordo com a forma de realização 40, em que a quantificação produz pelo menos um conjunto de dados; 43. O método, de acordo com a forma de realização 33, em que pelo menos uma parte dos fragmentos celulares é analisada por citometria de fluxo, FACS ou analisador de partículas; 44. O método, de acordo com a forma de realização 43, em que a análise produz um conjunto de dados; 45. O método, de acordo com a forma de realização 33, compreendendo ainda a purificação de pelo menos um fragmento celular a partir de pelo menos uma porção dos fragmentos celulares; 46. O método, de acordo com a forma de realização 45, em que a purificação é por FACS, purificação por afinidade, centrifugação diferencial por exclusão de tamanho, filtração ou eletroforese; 47. O método, de acordo com a forma de realização 45, compreendendo adicionalmente isolar biomoléculas de pelo menos um fragmento purificado celular da pelo menos uma porção dos fragmentos celulares; 48. O método, de acordo com a forma de realização 47, compreendendo ainda a análise das biomoléculas do fragmento purificado de pelo menos um fragmento celular a partir de pelo menos uma porção dos fragmentos celulares; 49. O método, de acordo com a forma de realização 48, em que a análise compreende PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de próxima geração ou ELISA; 50. O método, de acordo com a forma de realização 49, em que a análise produz pelo menos um conjunto de dados; 51. O método, de acordo com a forma de realização 1, compreendendo ainda o processamento adicional de pelo menos uma porção do homogeneizado para gerar pelo menos uma célula desassociada; 52. O método, de acordo com a forma de realização 51, em que o processamento de pelo menos uma porção do homogeneizado é físico, mecânico, químico ou enzimático; 53. O método, de acordo com a forma de realização 51, em que a pelo menos uma célula desassociada é uma célula normal, uma célula cancerígena ou uma célula bacteriana; 54. O método, de acordo com a forma de realização 51, em que a pelo menos uma célula desassociada é afixada a pelo menos uma lâmina de vidro; 55. O método, de acordo com a forma de realização 54, em que a pelo menos uma célula desassociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é submetida a análise histológica; 56. O método, de acordo com a forma de realização 55, em que a análise histológica é por coloração H&E, coloração IHC, coloração FISH ou coloração FISH; 57. O método, de acordo com a forma de realização 55, em que a análise histológica na pelo menos uma célula desassociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é interpretada por um humano; 58. O método, de acordo com a forma de realização 55, em que a análise histológica na pelo menos uma célula dissociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é quantificada por um dispositivo automatizado; 59. O método, de acordo com a forma de realização 57, em que a interpretação produz pelo menos um conjunto de dados; 60. O método, de acordo com a forma de realização 58, em que a quantificação produz pelo menos um conjunto de dados; 61. O método, de acordo com a forma de realização 51, em que a pelo menos uma célula desassociada é analisada por citometria de fluxo, FACS ou analisador de partículas; 62. O método, de acordo com a forma de realização 61, em que a análise produz um conjunto de dados; 63. O método, de acordo com a forma de realização 51, compreendendo ainda a purificação de pelo menos uma célula da pelo menos uma célula dissociada; 64. O método, de acordo com a forma de realização 63, em que a purificação é por FACS, purificação por afinidade, centrifugação diferencial por exclusão de tamanhos, filtração ou eletroforese; 65. O método, de acordo com a forma de realização 63, compreendendo ainda isolar biomoléculas da pelo menos uma célula purificada a partir de pelo menos uma célula dissociada; 66. O método da forma de realização 65, compreendendo ainda a análise das biomoléculas da célula purificada de pelo menos uma célula da pelo menos uma célula desassociada; 67. O método, de acordo com a forma de realização 66, em que a análise é PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de próxima geração ou ELISA; 68. O método, de acordo com a forma de realização 67, em que a análise produz pelo menos um conjunto de dados; 69. O método, de acordo com a forma de realização 63, em que a pelo menos uma célula purificada da pelo menos uma célula dissociada é fixada a pelo menos uma lâmina de vidro; 70. O método, de acordo com a forma de realização 69, em que a pelo menos uma célula purificada da pelo menos uma célula dissociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é submetida a análise histológica; 71. O método, de acordo com a forma de realização 70, em que a análise histológica é por coloração H&E, coloração IHC, coloração ISH ou coloração FISH; 72. O método, de acordo com a forma de realização 70, em que a análise histológica na pelo menos uma célula purificada a partir de pelo menos uma célula desassociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é interpretada por um humano; 73. O método, de acordo com a forma de realização 70, em que a análise histológica na pelo menos uma célula purificada a partir de pelo menos uma célula desassociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é quantificada por um dispositivo automatizado; 74. O método, de acordo com a forma de realização 72, em que a interpretação produz pelo menos um conjunto de dados; 75. O método, de acordo com a forma de realização 73, em que a quantificação produz pelo menos um conjunto de dados; 76. O método, de acordo com de qualquer uma das formas de realização 24, 31, 32, 41, 42, 44, 50, 59, 60, 62, 68, 74 e 75, compreende ainda a análise do pelo menos um conjunto de dados de pelo menos um sujeito; 77. O método, de acordo com a forma de realização 76, em que a análise compreende a determinação de um conjunto de dados de diversidade de biomarcadores ou diversidade fenotípica; 78. O método, de acordo com a forma de realização 76, em que a análise compreende a determinação da prevalência de pelo menos um biomarcador ou fenótipo distinto; 79. O método, de acordo com a forma de realização 76, em que a análise compreende a determinação de pelo menos uma decisão clínica; e 80. O método, de acordo com a forma de realização 79, em que a decisão clínica é determinar o prognóstico da doença, prever a recorrência da doença, prever metas de terapia da doença, inclusão de indivíduos de ensaios clínicos ou estratégia de tratamento terapêutico para pelo menos um indivíduo.

Claims (21)

1. MÉTODO IN VITRO PARA PREPARAR UMA AMOSTRA REPRESENTATIVA PARA ANÁLISE, caracterizado por compreender: (a) separadamente ou em combinação, homogeneizar amostra de tecido de ressecção cirúrgica para obter uma amostra homogeneizada; e (b) opcionalmente, fixar ou processar dita amostra de tecido de ressecção cirúrgica antes ou depois da etapa (a); em que a homogeneização compreende a separação física por corte, fatiamento ou picada, ou em que a homogeneização compreende dissociação mecânica por mistura ou sumo, ou em que a homogeneização é por dissociação bioquímica por uma proteínase; e em que cada de dita amostra de tecido de ressecção cirúrgica compreende a heterogeneidade contida em uma porção, porções substanciais ou um tumor inteiro, nódulo linfático, órgão ou metástases, e a referida amostra homogeneizada contém a maior parte das células que estão dissociadas ou não lisadas.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (b) compreender ainda a fixação de pelo menos uma porção de amostra de tecido de ressecção cirúrgica.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (b) compreender ainda o processamento de uma primeira porção da amostra de ressecção cirúrgica e a geração de um ou mais blocos de tecido inclusos fixos, opcionalmente ainda compreende a homogeneização de uma segunda porção do restante de amostra de ressecção de tecido cirúrgico.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender ainda o processamento de pelo menos uma porção de um ou mais blocos de tecido inclusos fixos por micrototomia para produzir uma ou mais seções finas de tecido para análise morfológica.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda a desparafinagem de pelo menos um dos um ou mais blocos de tecido inclusos fixos e homogeneização do tecido a partir dos um ou mais blocos de tecido inclusos fixos desparafinados.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (a) compreender ainda homogeneizar separadamente amostra de ressecção cirúrgica para produzir amostras homogeneizadas separadas.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela amostra de tecido de ressecção cirúrgica compreender uma massa de tecido única, em que a massa de tecido única é ainda dividida em duas ou mais peças da massa de tecido única, e pelo menos uma das duas ou mais peças da massa de tecido única é homogeneizada e pelo menos uma das duas ou mais peças restantes da massa de tecido única são preservadas.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a purificação e análise de uma ou mais biomoléculas a partir de pelo menos uma porção da amostra homogeneizada, em que a uma ou mais biomoléculas são selecionadas a partir do grupo que consiste em DNA, RNA, proteínas, lipídeos e metabólitos, em que a análise de uma ou mais biomoléculas é por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de próxima geração, ou ELISA, e em que a análise produz pelo menos um conjunto de dados.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a inclusão de pelo menos uma porção da amostra homogeneizada em parafina, a preparação de uma ou mais seções finas da amostra homogeneizada incluída em parafina, e a realização de análise histológica nas seções finas da amostra homogeneizada com inclusão em parafina por coloração H&E, coloração IHC, coloração ISH, ou coloração FISH, em que a análise histológica em seções finas da amostra homogeneizada com inclusão em parafina é interpretada por um humano, ou em que a análise histológica em seções finas da amostra homogeneizada com inclusão em parafina é quantificada por um dispositivo automatizado.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda o processamento adicional de pelo menos uma porção da amostra homogeneizada por métodos físicos, mecânicos, químicos, ou enzimáticos para gerar fragmentos celulares, em que os fragmentos celulares são selecionados a partir do grupo que consiste em núcleos, membranas celulares e organelas celulares.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por pelo menos uma porção dos fragmentos celulares estar afixada a pelo menos uma lâmina de vidro e sujeitas a análise histológica por coloração H&E, coloração IHC, coloração ISH, ou coloração FISH, em que a análise histológica em pelo menos uma porção dos fragmentos celulares fixados a pelo menos uma lâmina de vidro é interpretada por um humano, ou em que a análise histológica em pelo menos uma porção dos fragmentos celulares fixados a pelo menos uma lâmina de vidro é quantificada por um dispositivo automatizado.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por pelo menos uma porção dos fragmentos celulares ser analisada por citometria de fluxo, FACS ou analisador de partículas, em que a análise produz um conjunto de dados.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender ainda a purificação de pelo menos um fragmento celular a partir de pelo menos uma porção dos fragmentos celulares por FACS, purificação por afinidade, centrifugação diferencial por exclusão de tamanhos, filtração ou eletroforese, o isolamento de biomoléculas do pelo menos um fragmento celular purificado de pelo menos uma porção dos fragmentos celulares, a análise das biomoléculas por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de próxima geração, ou ELISA, em que a análise produz pelo menos um conjunto de dados.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda o processamento adicional de pelo menos uma porção da amostra homogeneizada para gerar pelo menos uma célula desassociada, em que o processamento de pelo menos uma porção da amostra homogeneizada é física, mecânica, química ou enzimática, e em que a pelo menos uma célula desassociada é uma célula normal, uma célula cancerígena ou uma célula bacteriana.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por pelo menos uma célula dissociada ser afixada a pelo menos uma lâmina de vidro e submetida a análise histológica por coloração H&E, coloração IHC, coloração ISH ou coloração FISH, em que a análise histológica na pelo menos uma célula dissociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é interpretada por um humano, ou em que a análise histológica na pelo menos uma célula dissociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é quantificada por um dispositivo automatizado.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por pelo menos uma célula dissociada ser analisada por citometria de fluxo, FACS ou analisador de partículas, e em que a análise produz um conjunto de dados.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender ainda a purificação de pelo menos uma célula da pelo menos uma célula dissociada por FACS, purificação por afinidade, centrifugação diferencial por exclusão de tamanhos, filtração ou eletroforese.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender ainda o isolamento das biomoléculas da pelo menos uma célula purificada da pelo menos uma célula dissociada e a análise das biomoléculas por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de próxima geração ou ELISA, em que a análise produz pelo menos um conjunto de dados.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por pelo menos uma célula purificada da pelo menos uma célula dissociada ser afixada a pelo menos uma lâmina de vidro e submetida a análise histológica por coloração H&E, coloração IHC, coloração ISH ou coloração FISH, em que a análise histológica na pelo menos uma célula purificada da pelo menos uma célula dissociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é interpretada por um humano, ou em que a análise histológica na pelo menos uma célula purificada da pelo menos uma célula dissociada afixada a pelo menos uma lâmina de vidro é quantificada por um dispositivo automatizado.
20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 12, 16 e 20, caracterizado pela interpretação por um humano produzir pelo menos um conjunto de dados, ou em que a quantificação por um dispositivo automatizado produz pelo menos um conjunto de dados.
21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações, 9, 13, 14, 17, 19 e 21, caracterizado por compreender ainda a análise do pelo menos um conjunto de dados de pelo menos um sujeito, em que a análise compreende a determinação de um conjunto de dados de diversidade de biomarcadores ou de diversidade fenotípica, ou a determinação da prevalência de pelo menos um biomarcador ou fenótipo distinto, ou a determinação de pelo menos uma decisão clínica, em que a decisão clínica é determinar o prognóstico da doença, prever a recorrência da doença, prever alvos de terapia da doença, inclusão de sujeitos de ensaios clínicos ou estratégia de tratamento terapêutico para pelo menos um sujeito.
BR112018009071-9A 2015-11-06 2016-11-07 Método in vitro para preparar uma amostra representativa para análise BR112018009071B1 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562252153P 2015-11-06 2015-11-06
US62/252,153 2015-11-06
US201662279405P 2016-01-15 2016-01-15
US62/279,405 2016-01-15
US201662354622P 2016-06-24 2016-06-24
US62/354,622 2016-06-24
US201662418146P 2016-11-04 2016-11-04
US62/418,146 2016-11-04
PCT/US2016/060861 WO2017079763A1 (en) 2015-11-06 2016-11-07 Representative diagnostics

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BR112018009071A2 BR112018009071A2 (pt) 2018-10-30
BR112018009071A8 BR112018009071A8 (pt) 2019-02-26
BR112018009071B1 true BR112018009071B1 (pt) 2021-12-14

Family

ID=57406344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112018009071-9A BR112018009071B1 (pt) 2015-11-06 2016-11-07 Método in vitro para preparar uma amostra representativa para análise

Country Status (14)

Country Link
US (1) US11959838B2 (pt)
EP (1) EP3371594A1 (pt)
JP (4) JP7094880B2 (pt)
KR (1) KR20180081561A (pt)
CN (2) CN108449995B (pt)
AU (2) AU2016349644B2 (pt)
BR (1) BR112018009071B1 (pt)
CA (1) CA3004504A1 (pt)
IL (3) IL290309B2 (pt)
MX (2) MX2018004838A (pt)
NZ (1) NZ741539A (pt)
RU (1) RU2743169C2 (pt)
WO (1) WO2017079763A1 (pt)
ZA (1) ZA201802493B (pt)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113186256A (zh) 2015-04-10 2021-07-30 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
CN108449995B (zh) 2015-11-06 2022-02-01 文塔纳医疗系统公司 代表性诊断
GB201615532D0 (en) * 2016-09-13 2016-10-26 Univ Swansea Computer-Implemented apparatus and method for performing a genetic toxicity assay
WO2018157074A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Methods for diagnosing neoplastic lesions
WO2018157048A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Methods for examining podocyte foot processes in human renal samples using conventional optical microscopy
WO2018189040A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 Ventana Medical Systems, Inc. Size-based separation of dissociated fixed tissues
CN111095352B (zh) * 2017-08-04 2023-12-29 文塔纳医疗系统公司 用于检测被染色样本图像中的细胞的自动化方法和系统
WO2019156957A1 (en) 2018-02-06 2019-08-15 Massachusetts Institute Of Technology Swellable and structurally homogenous hydrogels and methods of use thereof
CN108610409B (zh) * 2018-04-09 2021-08-24 深圳大学 Etv5在制备预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾病药物中的应用
CN108593380B (zh) * 2018-04-25 2021-05-18 复旦大学附属中山医院 一种组织芯片量产制作方法
WO2020023213A1 (en) * 2018-07-27 2020-01-30 Ventana Medical Systems, Inc. Systems for automated in situ hybridization analysis
EP3853610A1 (en) * 2018-09-20 2021-07-28 Ventana Medical Systems, Inc. Size-based gating to analyze flow cytometry data
JP2022513316A (ja) * 2018-10-01 2022-02-07 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． Ｐｄ－１軸指向型治療薬に対する応答を予測するための方法およびシステム
CN109298730A (zh) * 2018-11-07 2019-02-01 上海坤爱生物科技股份有限公司 一种组织样品恒温消化过程的可控制装置
CN109406789A (zh) * 2018-11-23 2019-03-01 李翀 一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒及应用
US11592657B2 (en) 2018-12-18 2023-02-28 Hemotech Cognition, LLC Method and system for identifying objects in a blood sample
US11714088B2 (en) * 2019-02-19 2023-08-01 Univerisy of South Carolina Early detection of colorectal cancer
US20230159995A1 (en) * 2019-02-28 2023-05-25 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
CN109884163B (zh) * 2019-03-10 2021-09-17 复旦大学 一种外膜蛋白酶t酶解组蛋白并进行质谱分析的方法
RU2718284C1 (ru) * 2019-04-12 2020-04-01 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет) (ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Се Способ скринингового определения вероятности наличия рака мочевого пузыря
CN109975097A (zh) * 2019-04-18 2019-07-05 山东师范大学 一种基于适配体的肿瘤细胞染色探针组合
WO2021030460A1 (en) * 2019-08-12 2021-02-18 Baylor College Of Medicine Proteogenomic methods for diagnosing cancer
CN110387419B (zh) * 2019-08-20 2023-06-13 裕策医疗器械江苏有限公司 实体瘤多基因检测基因芯片及其制备方法和检测装置
CN110927387B (zh) * 2019-11-08 2022-05-20 江苏大学 一种brca2蛋白酶联免疫双抗夹心试剂盒及其应用
WO2021113505A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Massachusetts Institute Of Technology Method for preparing a specimen for expansion microscopy
US20210270703A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 10X Genomics, Inc. Method for isolating nuclei and cells from tissues
US11238583B2 (en) * 2020-03-25 2022-02-01 City University Of Hong Kong System and method for generating a stained image
EP4147054A1 (en) * 2020-05-07 2023-03-15 Ventana Medical Systems, Inc. Histochemical systems and methods for evaluating egfr and egfr ligand expression in tumor samples
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
CN111849918A (zh) * 2020-07-24 2020-10-30 扬州大学 一种研究鸡SSCs中受组蛋白甲基化调控的靶基因的方法
CN112052813B (zh) * 2020-09-15 2023-12-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 染色体间易位识别方法、装置、电子设备及可读存储介质
CN116438446A (zh) * 2020-10-12 2023-07-14 深圳华大智造科技股份有限公司 使用核苷标记进行蛋白质检测和追踪
CN112284850B (zh) * 2020-10-22 2021-05-18 四川大学华西医院 一种消化内科活体取样后的智能分析前端处理设备
CN112326539A (zh) * 2020-10-28 2021-02-05 中国科学院生态环境研究中心 一种全器官细胞增殖定量检测方法
US20220206002A1 (en) * 2020-12-30 2022-06-30 Uttam K. Sinha Systems and methods for detecting substances in a fluid using tapered fibers
CN116916812A (zh) * 2020-12-31 2023-10-20 奥卢森特公司 用于评估组织重塑的系统和方法
JP2022131579A (ja) 2021-02-26 2022-09-07 キオクシア株式会社 分析装置および分析方法
EP4338172A1 (en) * 2021-05-14 2024-03-20 Genentech, Inc. Predicting actionable mutations from digital pathology images
CN113281441A (zh) * 2021-05-19 2021-08-20 中国科学技术大学 单细胞器质谱检测方法、检测装置
EP4124622A1 (en) * 2021-07-29 2023-02-01 Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori Rapid histological diagnosis for oncology therapy
WO2023023064A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Gopath Laboratories, Llc Methods and materials for predicting the progression of prostate cancer and treating same
WO2023177707A1 (en) * 2022-03-16 2023-09-21 The Regents Of The University Of California Methods and systems for microbial tumor hypoxia diagnostics and theranostics
CN115938490B (zh) * 2023-03-07 2023-06-06 之江实验室 一种基于图表示学习算法的代谢物鉴定方法、系统和设备
CN116769975B (zh) * 2023-08-15 2023-11-24 江苏美克医学技术有限公司 Hpv检测引物组、试剂盒及其应用

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3130101A (en) 1961-08-11 1964-04-21 William G Gittins Manufacture of plastic covered panels for use in building construction
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4616658A (en) 1985-02-27 1986-10-14 William Shell Non-radioactively labeled microspheres and use of same to measure blood flow
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4774339A (en) 1987-08-10 1988-09-27 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes
DE3836656A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung
US5132432A (en) 1989-09-22 1992-07-21 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive pyrenyloxy sulfonic acid dyes
US5433896A (en) 1994-05-20 1995-07-18 Molecular Probes, Inc. Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes
US5274113A (en) 1991-11-01 1993-12-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates
US5248782A (en) 1990-12-18 1993-09-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength heteroaryl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes
US5338854A (en) 1991-02-13 1994-08-16 Molecular Probes, Inc. Fluorescent fatty acids derived from dipyrrometheneboron difluoride dyes
EP0585367A4 (en) 1991-05-17 1994-12-21 Park Pharmaceuticals Inc ATP EXTRACTION REAGENT CONTAINING AMMONIUM VANADATE.
US5187288A (en) 1991-05-22 1993-02-16 Molecular Probes, Inc. Ethenyl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes and their synthesis
US5262357A (en) 1991-11-22 1993-11-16 The Regents Of The University Of California Low temperature thin films formed from nanocrystal precursors
US5505928A (en) 1991-11-22 1996-04-09 The Regents Of University Of California Preparation of III-V semiconductor nanocrystals
US6048616A (en) 1993-04-21 2000-04-11 Philips Electronics N.A. Corp. Encapsulated quantum sized doped semiconductor particles and method of manufacturing same
US5843644A (en) 1994-03-01 1998-12-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Isolation of cellular material under microscopic visualization using an adhesive/extraction reagent tipped probe
WO1996000283A1 (en) 1994-06-24 1996-01-04 Boehringer Mannheim Corporation A purified mixture of collagenases and two other proteases obtained from clostridium histolyticum
US5571018A (en) 1994-11-23 1996-11-05 Motorola, Inc. Arrangement for simulating indirect fire in combat training
US5690807A (en) 1995-08-03 1997-11-25 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing semiconductor particles
US5800996A (en) 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US5696157A (en) 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
US5830912A (en) 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
US5866366A (en) 1997-07-01 1999-02-02 Smithkline Beecham Corporation gidB
US6130101A (en) 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US6322901B1 (en) 1997-11-13 2001-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials
US6207392B1 (en) 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US5990479A (en) 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6617583B1 (en) 1998-09-18 2003-09-09 Massachusetts Institute Of Technology Inventory control
US6372937B1 (en) 1998-11-09 2002-04-16 Mark Norman Bobrow Enhanced catalyzed reporter deposition
US6114038A (en) 1998-11-10 2000-09-05 Biocrystal Ltd. Functionalized nanocrystals and their use in detection systems
US6855202B2 (en) 2001-11-30 2005-02-15 The Regents Of The University Of California Shaped nanocrystal particles and methods for making the same
US6238922B1 (en) 1999-02-26 2001-05-29 Stemcells, Inc. Use of collagenase in the preparation of neural stem cell cultures
AU4701200A (en) 1999-05-07 2000-11-21 Quantum Dot Corporation A method of detecting an analyte using semiconductor nanocrystals
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US20050112141A1 (en) 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
US6225198B1 (en) 2000-02-04 2001-05-01 The Regents Of The University Of California Process for forming shaped group II-VI semiconductor nanocrystals, and product formed using process
US6306736B1 (en) 2000-02-04 2001-10-23 The Regents Of The University Of California Process for forming shaped group III-V semiconductor nanocrystals, and product formed using process
JP2004500109A (ja) 2000-03-22 2004-01-08 クァンタム・ドット・コーポレイション ビーズベースの核酸アッセイにおける半導体ナノクリスタルの使用方法
JP2003535063A (ja) 2000-06-01 2003-11-25 ザ・ボード・オブ・リージェンツ・フォー・オクラホマ・ステート・ユニバーシティー 放射線医薬としてのナノ粒子のバイオコンジュゲート
DE60136719D1 (de) 2000-08-04 2009-01-08 Molecular Probes Inc Kondensierte ringe enthaltende 1,2-dihydro-7-hydroxychinolinderivate
US6649138B2 (en) 2000-10-13 2003-11-18 Quantum Dot Corporation Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media
US20020083888A1 (en) 2000-12-28 2002-07-04 Zehnder Donald A. Flow synthesis of quantum dot nanocrystals
EP1368497A4 (en) 2001-03-12 2007-08-15 California Inst Of Techn METHOD AND DEVICE FOR ANALYZING POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ASYNCHRONOUS BASE EXTENSION
US6709929B2 (en) 2001-06-25 2004-03-23 North Carolina State University Methods of forming nano-scale electronic and optoelectronic devices using non-photolithographically defined nano-channel templates
ATE556845T1 (de) 2001-07-20 2012-05-15 Life Technologies Corp Lumineszierende nanopartikel und ihre herstellung
WO2003063802A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Thomas Jefferson University Mixed haptenized tumor cells and extracts and methods of treating or screening for cancer
WO2003087766A2 (en) 2002-04-05 2003-10-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods of diagnosing potential for metastasis or developing hepatocellular carcinoma and of identifying therapeutic targets
CN1488639A (zh) * 2002-10-09 2004-04-14 上海市刑事科学技术研究所 从组织样品中分离rna的方法
DE10261529A1 (de) 2002-12-23 2004-07-08 Indivumed Gmbh Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von biologischem Probenmaterial und Probensammlung
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
JPWO2005094887A1 (ja) 2004-03-31 2008-02-14 第一製薬株式会社 ｓＦＲＰ発現増強剤
US7588890B2 (en) * 2004-04-16 2009-09-15 Wei-Sing Chu Device for extracting biological molecules from tissue specimens and methods for preparing the same
JP5368798B2 (ja) * 2005-10-31 2013-12-18 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 癌を診断し処置するための組成物および方法
EP2007904A4 (en) 2006-03-13 2009-06-10 Veridex Llc PROPAGATION OF PRIMARY CELLS
CA2858359C (en) 2006-11-01 2018-04-03 Ventana Medical Systems, Inc. Haptens, hapten conjugates, compositions thereof and method for their preparation and use
CA2672315A1 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
ES2319039B1 (es) 2007-05-07 2010-03-03 Alvaro Martins-Ferreira Alemao Procedimiento para el rastreo y diagnostico precoz del cancer colorrectal.
WO2008150001A1 (ja) 2007-06-08 2008-12-11 Biomaster, Inc. アディポクラスタ－
EP2027922A1 (de) 2007-08-02 2009-02-25 Qiagen GmbH Verfahren und Vorrichtung für das Fixieren/Stabilisieren einer Probe
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
WO2009099602A1 (en) 2008-02-04 2009-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Selection of nucleic acids by solution hybridization to oligonucleotide baits
US20100035252A1 (en) 2008-08-08 2010-02-11 Ion Torrent Systems Incorporated Methods for sequencing individual nucleic acids under tension
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8546128B2 (en) 2008-10-22 2013-10-01 Life Technologies Corporation Fluidics system for sequential delivery of reagents
NZ601862A (en) * 2008-11-12 2014-07-25 Tengion Inc Isolated renal cells and uses thereof
EP3301446B1 (en) 2009-02-11 2020-04-15 Caris MPI, Inc. Molecular profiling of tumors
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
RU2567803C2 (ru) * 2009-07-31 2015-11-10 Дженентек, Инк. ИНГИБИРОВАНИЕ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ОПУХОЛИ ПРИ ПОМОЩИ АНТАГОНИСТОВ Bv8 ИЛИ G-CSF
CN101955541B (zh) * 2010-05-06 2012-10-03 北京维德维康生物技术有限公司 一种检测克伦特罗的免疫试剂盒及其专用抗体
US9115402B2 (en) 2010-05-14 2015-08-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods of identifying tumor specific neoantigens
AU2011274369A1 (en) 2010-07-02 2012-12-06 Ventana Medical Systems, Inc. Hapten conjugates for target detection
AU2011295722B2 (en) * 2010-09-03 2016-04-21 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
US20150045232A1 (en) * 2010-12-28 2015-02-12 Bexmart Integrated and versatile methods for systems diagnosis of diseases
EP2663852A1 (en) 2011-01-10 2013-11-20 Ventana Medical Systems, Inc. Hematoxylin staining method
CA2742342A1 (en) 2011-02-12 2012-08-12 Baylor Research Institute Msh3 expression status determines the responsiveness of cancer cells to the chemotherapeutic treatment with parp inhibitors and platinum drugs
US9448231B2 (en) 2011-02-28 2016-09-20 Ventana Medical Systems, Inc. Application of quantum dots for nuclear staining
CN103562719B (zh) 2011-03-16 2016-01-13 国立大学法人东北大学 生物体组织分析用探针及其使用方法
EP2686451A4 (en) 2011-03-18 2014-12-24 Baylor Res Inst LINE-1 HYPOMETHYLATION AS A BIOMARKER FOR EARLY BREAKING COLORECTAL CANCER
WO2012154552A1 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Phylonix Pharmaceuticals, Inc. Method and device for removing particles from liquid and placing them into a holding device
DK2707505T3 (en) 2011-05-09 2016-07-25 Ventana Med Syst Inc SPECTRAL IMAGE FOR MEASUREMENT OF NUCLEAR PATHOLOGICAL FEATURES IN CANCER CELLS PREPARED FOR IN SITU ANALYSIS
FR2976076B1 (fr) 2011-05-31 2015-02-27 Imabiotech Procede de detection et de quantification d'une molecule cible dans un tissu
FR2977674B1 (fr) 2011-07-06 2015-08-14 Cisbio Bioassays Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule
WO2013019945A2 (en) 2011-08-02 2013-02-07 Clovis Oncology, Inc.. Method for selection of chemotherapeutic agents for adenocarcinoma cancer
CN103045467B (zh) * 2011-10-13 2014-05-14 徐仰德 生物医学均质装置
GB2497510A (en) 2011-11-10 2013-06-19 Harry Cuppens Methods for determining mononucleotide sequence repeats
WO2013079606A1 (en) 2011-12-01 2013-06-06 Ventana Medical Systems, Inc. Automated dual stain of mirna and protein targets
WO2013139555A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Ventana Medical Systems, Inc. Cryoembedded cell concentrates, methods for making, and methods for using
CA2884555C (en) 2012-10-08 2023-01-03 Ventana Medical Systems, Inc. Methods, kits, and systems for clarifying pigmented samples
EP2738557A1 (en) 2012-12-03 2014-06-04 Université Libre de Bruxelles Organized immune response in cancer
DE102012023929B4 (de) 2012-12-06 2014-12-31 Maria Rogmans Verfahren zum Betrieb einer aquatischen Pflanzenkultureinrichtung für Futtermittel, sowie Pflanzenkultureinrichtung selbst
US10138519B2 (en) 2012-12-28 2018-11-27 Quest Diagnostics Investments Incorporated Universal sanger sequencing from next-gen sequencing amplicons
RU2521239C1 (ru) 2013-02-26 2014-06-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук (ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН) Способ интраоперационной диагностики рака щитовидной железы
WO2014139979A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Ventana Medical Systems, Inc. Quantum dot in situ hybridization
US20140278461A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center System and method for integrating a medical sequencing apparatus and laboratory system into a medical facility
EP2815773B1 (en) 2013-06-17 2017-08-30 Hans U. Baer Matrix and implant for tissue engineering
KR20160089356A (ko) * 2013-09-27 2016-07-27 백시노젠 인터내셔널 파트너스, 엘피 자가 종양 백신 및 방법
JP2016541039A (ja) 2013-10-07 2016-12-28 ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド 包括的なマルチアッセイ組織分析のためのシステムおよび方法
WO2015058093A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Seven Bridges Genomics Inc. Methods and systems for genotyping genetic samples
US20170173180A1 (en) 2014-03-27 2017-06-22 The Regents Of The University Of Michigan Cancer immunotherapy compositions and methods
JP6603237B2 (ja) 2014-03-31 2019-11-06 ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド 自動標本処理システム及び顕微鏡スライドのマルチステップ処理
CA2944829C (en) 2014-05-23 2022-10-25 Ting Chen Systems and methods for detection of biological structures and/or patterns in images
JP6475759B2 (ja) 2014-06-27 2019-02-27 ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド 標本担持顕微鏡用スライドガラスを検出する自動標本処理システムおよび方法
CN108449995B (zh) 2015-11-06 2022-02-01 文塔纳医疗系统公司 代表性诊断

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201802493B (en) 2019-01-30
WO2017079763A1 (en) 2017-05-11
RU2743169C2 (ru) 2021-02-15
JP2022191274A (ja) 2022-12-27
CA3004504A1 (en) 2017-05-11
RU2018118958A3 (pt) 2020-03-11
IL258418A (en) 2018-05-31
CN114480574A (zh) 2022-05-13
IL290309B2 (en) 2024-04-01
KR20180081561A (ko) 2018-07-16
RU2018118958A (ru) 2019-12-06
IL290309A (en) 2022-04-01
IL258418B (en) 2022-03-01
US20200049599A1 (en) 2020-02-13
BR112018009071A8 (pt) 2019-02-26
AU2022268299A1 (en) 2022-12-15
JP2021060405A (ja) 2021-04-15
JP2024037825A (ja) 2024-03-19
BR112018009071A2 (pt) 2018-10-30
IL290309B1 (en) 2023-12-01
CN108449995A (zh) 2018-08-24
US11959838B2 (en) 2024-04-16
AU2016349644A1 (en) 2018-04-19
EP3371594A1 (en) 2018-09-12
JP7094880B2 (ja) 2022-07-04
MX2018004838A (es) 2019-07-18
JP7212024B2 (ja) 2023-01-24
JP2019503474A (ja) 2019-02-07
AU2016349644B2 (en) 2022-11-24
JP7402289B2 (ja) 2023-12-20
IL298356A (en) 2023-01-01
MX2022001954A (es) 2022-05-11
CN108449995B (zh) 2022-02-01
NZ741539A (en) 2024-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7402289B2 (ja) 代表診断法
JP7038209B2 (ja) エピタコ電気泳動を使用する試料分析のための装置
Zhang et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer
Yoshida et al. Proteomic analysis of differential protein expression by brain metastases of gynecological malignancies
Visan et al. In vitro comparative models for canine and human breast cancers
Sutton et al. Quantitative proteomic profiling of matched normal and tumor breast tissues
Rutgers Update on pathology, staging and molecular pathology of endometrial (uterine corpus) adenocarcinoma
JP2022532607A (ja) 試料分析のための装置および方法
WO2012060760A1 (en) Molecular marker for cancer
Da Cruz Paula et al. Molecular characterization of CD44+/CD24−/Ck+/CD45− cells in benign and malignant breast lesions
Ambrosini-Spaltro et al. The role of next-generation sequencing in detecting gene fusions with known and unknown partners: A single-center experience with methodologies’ integration
Burrai et al. A first immunohistochemistry study of transketolase and transketolase-like 1 expression in canine hyperplastic and neoplastic mammary lesions
Nielsen et al. A novel double staining strategy for improved detection of testicular carcinoma in situ cells in human semen samples
AU2018249596B2 (en) High precision micropurification system and methods of use
Jain et al. Biomarkers of cancer
Sun et al. Multi-omics characterization of cellular state diversity and bidirectional tumor-stroma/immune interactions in cervical squamous cell carcinoma
Tchrakian et al. Pathology and Molecular Pathology of Prostate Cancer
Flatley et al. Distribution analysis of the putative cancer marker S100A4 across invasive squamous cell carcinoma penile tissue
Cornish-Bowden et al. Abstracts from the 3rd Conference on Aneuploidy and Cancer: Clinical and Experimental Aspects: Berkeley, CA, USA. 26-29 January 2017

Legal Events

Date Code Title Description
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/11/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.