CN116438446A - 使用核苷标记进行蛋白质检测和追踪 - Google Patents

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Abstract

提供了使用核苷或核苷类似物作为标记检测多肽的方法和试剂。特别地，使带标记的多肽与特异性结合带标记的多肽的核苷标记部分的结合试剂(例如抗体)接触。然后检测结合试剂与带标记的多肽的核苷标记部分的结合，从而定量或定位带标记的多肽。提供了该技术的多种用途。例如，可以将标记特异性抗体呈现在适合于定量或表征大量液体样品中的大量带标记的蛋白质的阵列中。该技术还可用于在体内追踪大量带标记的蛋白质，例如，通过多路复用免疫组织化学进行。

Description

使用核苷标记进行蛋白质检测和追踪
背景技术
生物学研究和医学诊断经常使用附接在感兴趣的蛋白质上的分子标记。这些标记使得能检测蛋白质或其结合伙伴。已经开发了不同的标记策略，这些策略使用利用可检测标记对蛋白质进行的直接标记或使用特异性结合蛋白质的标记抗体。然而，这些方法有缺点。用荧光团染料直接标记蛋白质或通过使用融合标记将有机荧光团附接到感兴趣的蛋白质上被广泛使用，但这些标记的大尺寸会影响蛋白质功能和定位。此外，荧光分子(如荧光素)的使用可导致背景荧光。其他标记方法已显示出会引起毒性或无法提供足够的灵敏度和特异性。
发明内容
本公开提供了使用核苷或核苷类似物作为标记来检测多肽的方法和试剂。特别地，使带标记的多肽与特异性结合带标记的多肽的核苷标记部分的结合试剂(例如抗体)接触，从而定量或定位标记的多肽。与其他标记蛋白质的方法相比，该技术具有优势。
一般而言，本公开提供了一种确定蛋白质在生物样品中的位置的方法。这是通过以下方式来完成的：将标记附接到蛋白质上以形成带标记的蛋白质，其中标记是核苷或核苷类似物；使生物样品与带标记的蛋白质接触；然后通过将样品与特异性结合标记的结合试剂接触来识别和确定样品中蛋白质的位置。
标记是核苷、核苷类似物、核苷酸、在3'-OH处修饰过的天然存在的核苷或下文描述的其他类似物。结合试剂可以包含或连接到荧光基团，这使得结合试剂发荧光。在这种情况下，通过获取从结合试剂上的荧光基团发射的荧光图像来确定样品中带标记蛋白质的位置。
本公开提出的技术的各种应用包括以下所述：流式细胞术或细胞分选的方法，其中生物样品是细胞样品；免疫组织化学方法，其中生物样品是组织样品；以及酶联免疫测定(ELISA)方法，或产生蛋白质印迹的方法。该方法可以是多路复用的，并且可以用于在体内追踪一种或多种蛋白质。
根据本公开的用于体内跟踪蛋白质的具体方法可以包括以下步骤：获得多种蛋白质；将带标记的蛋白质作为混合物、同时或顺序地施用于受试者；从受试者处获取生物样品；以及通过使生物样品与对带标记的蛋白质上的每个标记具有特异性的结合试剂接触，确定每种带标记的蛋白质在生物样品中的存在、数量和/或位置。受试者可以是任何动物或脊椎动物，例如实验小鼠，或用于诊断和/或治疗目的的人类受试者。生物样品可以是为免疫组织化学制备的组织切片(例如，作为石蜡包埋的组织切片)。在这种情况下，每种对核苷或类似物具有特异性的特异性结合试剂用于确定组织切片中相应标记蛋白质的位置。任选地，这可以作为多路复用方法实施，其中至少一些带标记的蛋白质已经用两种或更多种不同的核苷或核苷类似物标记，其中核苷或核苷类似物的特定组合唯一地识别每种带标记的蛋白质。
体内追踪蛋白质技术的另一种实施方案是重复或顺序多路复用方法。这包括免疫组织化学的多次重复或循环：例如，使组织切片与成组的标记特异性结合试剂接触，所述成组的标记特异性结合试剂共同结合被附接在组织切片中的蛋白质上的不同核苷标记中的一些但不是全部；在带有标记的组织切片中定位带标记的蛋白质，所述成组的标记特异性结合试剂中的结合试剂对所述标记具有特异性；以及从所述组织样品中去除结合试剂。使用不同的成组的结合试剂进行所述接触、所述定位和所述去除的一个或多个附加重复或循环，所述不同的成组的结合试剂包含至少一种对与在先前重复或循环中所述结合试剂对其具有特异性的标记不同的标记具有特异性的结合试剂。
重复或循环的次数可以继续，直到识别和定位可能存在于组织样品中的所有施用于受试者的带标记的蛋白质。可以在下一次重复之前使用含有非生理盐浓度和/或pH和/或一种或多种未附接到蛋白质的核苷或核苷类似物的溶液去除结合试剂。每一成组的结合试剂中用于接触组织切片的结合试剂可以是发荧光的(包含或连接到荧光基团)。在这种情况下，每一成组的结合试剂中的确定包括从结合到组织切片的结合试剂获得发射荧光的图像。可以检测和定位的蛋白质数量可以与每次重复中使用的标记和结合试剂的数量乘以执行的重复次数一样多。
举例来说，在每次重复过程中使用四种荧光结合试剂定位四种不同的蛋白质，所述四种荧光结合试剂对于附接到所述四种不同蛋白质的标记中的每一种是特异性的，其中来自所述结合试剂中的每一种的荧光发射在光学上是能区分的。然后可以计算合并或以其他方式处理来自多次重复的图像，以比较组织样品中一些或所有带标记的蛋白质的位置。
代替组织切片，生物样品可以是液体样品，例如血浆或淋巴液，或已经溶解的固体组织。可以使用固体表面上的结合试剂阵列来确定液体样品中标记蛋白质的存在和/或数量。阵列上的每个位置都包含对不同标记具有特异性的结合试剂。
对于本公开中提出的任何技术，结合试剂可以是抗体或抗体片段、亲和物或以特定方式结合靶抗原的其他分子，如下文所列出的。
样品中带标记的蛋白质的特征、数量和/或位置可以通过以下方式来确认：在通过酶促方式、通过化学方式、通过漂白或通过其他方式修饰标记之前和之后将样品与特异性结合到标记的结合试剂接触。例如，组织样品与样品中定位的带标记的蛋白质的标记有特异性的结合试剂接触。在结合和检测后，去除结合试剂。然后使用合适的酶或其他方式修饰或去除标记。洗涤后，样品再次与对同一标记有特异性的结合试剂接触。如果同一试剂在修改或去除标记后未能结合，则该试剂的第一次结合被确认为真实的。
本发明的其他实施方案、方面和特征在以下描述、附图和所附权利要求中呈现。
附图说明
图1说明了包含3'-O叠氮甲基部分的核苷类似物的氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的合成，从而制备用于与选定蛋白质缀合的类似物。
图2A、2B和2C提供了根据本公开内容在开发该技术的过程中产生的抗体分子的信息，该抗体分子特异性结合各种核苷和核苷类似物。
具体实施方式
介绍
本文公开了通过以下方式来检测多肽的方法和试剂：用核苷和/或核苷类似物中的一种或其组合标记多肽，从而产生标记的多肽。为简单起见，如本文所使用的术语“核苷”将用于描述核苷和核苷类似物(如下文所定义)，除非从上下文中另有明确说明。
选择用于标记特定多肽的核苷标记，以便标记或标记组合的特征识别多肽。该方法还包括使用特异性结合标记的结合试剂检测带标记的多肽。因此，在一种方式中，所述方法涉及使包含多肽部分和核苷标记部分的带标记的多肽与结合带标记的多肽的核苷标记部分的结合试剂接触。多肽的检测通过检测结合试剂与带标记的多肽的核苷标记部分的结合而发生。在一些方式中，所述方法涉及通过将至少一种核苷或核苷类似物与多肽偶联来制备带标记的多肽，并使用特异性结合核苷或核苷类似物的一种或多种结合试剂来检测多肽。
在一些方式中，核苷标记是天然存在的核苷。在一些方式中，结合试剂识别并结合核苷的核碱基。在其他方式中，核苷标记是核苷类似物。核苷类似物可包含相对于天然存在的核苷的一种或多种修饰。例如但不限于，修饰可以在核碱基、糖部分中，或涉及添加磷酸盐部分。在一些实施方案中，核苷类似物与天然存在的(未修饰的)分子的不同之处在于向核糖或脱氧核糖的3'-OH添加了基团。在某些情况下，该基团是可以从脱氧核糖中去除(切割)的3'-OH保护基团(例如，3'-O-叠氮甲基)。
在一些方式中，用于实施该技术**的结合试剂(例如，抗体或适体)与可检测标记结合，从而允许直接检测结合试剂与带标记的多肽的核苷标记部分的结合。在一些方式中，检测可以间接发生，其中标记的二级结合试剂(例如二级抗体)结合一级结合试剂(例如一级抗体)，一级结合试剂结合带标记的多肽的核苷标记部分。
使用核苷作为蛋白质标记的优势
由于几个原因，本公开中提出的使用包含核苷或核苷类似物的标记鉴定和追踪蛋白质的方法优于其他标记方法和其他类型的标记。这些原因包括以下几种：
·大量蛋白质可以通过用其独特的核苷或核苷类似物标记每种蛋白质而在同一个实验中同时追踪
·使用核苷标记的蛋白质，然后使用荧光标记的结合试剂放大检测信号
·不同的核苷或核苷类似物尽管很相似，但可以使用特异性抗体或其他结合试剂毫不费力地将它们彼此区分开来
·用于标记不同蛋白质的不同核苷或核苷类似物都会具有相似的物理化学性质，例如大小、电荷和反应性。这有助于确保相应的标记不会以不同的方式影响不同蛋白质的行为
·带标记的蛋白质的变性不会干扰抗体结合，因为变性后核苷标记将仍然完整并与蛋白质缔合
·通过化学修饰核苷标记或使用酶，然后用相同的结合试剂进行第二轮染色，可以容易确认每种蛋白质的测定和追踪
本公开的核苷标记技术的用途
本公开的方法可用于生物研究和诊断医学领域的广泛应用。例如，本文描述的方法可用于研究蛋白质定位、蛋白质功能和蛋白质相互作用。多种检测技术可用于检测标记蛋白质，其包括免疫组织化学(IHC)、流式细胞术(例如，荧光激活细胞分选)、酶联免疫测定(ELISA)和蛋白质印迹。
带标记的蛋白质在组织切片和其他生物样品中的定位
在一些方式中，可以确定样品如组织中感兴趣的蛋白质的存在或定位。例如，在IHC的情况下，样品可以通过福尔马林和石蜡包埋固定，然后切成切片以便在光学显微镜下观察。
例如，蛋白质(例如，干扰素λ3、IFNL3)可以用核苷(例如，脱氧腺苷)标记，并使用识别脱氧腺苷的标记结合剂(例如，与罗丹明染料缀合的抗脱氧腺苷纳米抗体)检测。将带标记的蛋白质注射到受试者(例如小鼠)中。一段时间后处死小鼠，获得组织，固定并切片。使用免疫组织化学和标记的抗腺苷纳米抗体确定组织切片中IFNL3的存在、不存在或位置。
在相关的示例中，生物流体(例如，脑脊液)可从上述小鼠收集，并在使纳米抗体结合带标记的IFNL3(如果存在于流体中)的条件下与标记的抗脱氧腺苷纳米抗体接触。
例如，蛋白质(例如，经过修饰以使其结合IFNL3受体但未被内化的干扰素λ3变体)可以用核苷(例如，脱氧胞嘧啶)标记并且使用识别脱氧胞嘧啶(例如，与荧光素染料缀合的抗脱氧胞嘧啶纳米抗体)的标记的结合剂检测。将带标记的蛋白质注射到受试者(例如小鼠)中。一段时间后，从小鼠收集生物体液(例如淋巴液)，并使用流式细胞仪对细胞进行计数，即计算淋巴液中在细胞表面显示IFNL3的细胞数量。
在下面更详细讨论的相关方式中，可以在同一样品中检测两种不同的带标记的蛋白质。例如，可以将脱氧腺苷标记的IFNL3和脱氧胞嘧啶标记的干扰素λ3变体(均如上所述)注射到小鼠体内。一段时间后，可以得到组织切片，用缀合荧光素的抗脱氧胞嘧啶纳米抗体和缀合罗丹明的抗脱氧腺苷纳米抗体将其染色，并且通过IHC可以确定组织中两种蛋白质的存在、位置或不存在。
多路复用以检测和跟踪样品中的多个带标记的蛋白质
如上所说明的，在一些应用中，多路复用用于跟随多种蛋白质。例如，四种蛋白质(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IFNL3)可以各自用选自A、T、G和C的独特核苷酸标记。
Figure BDA0004173697250000061
可以将蛋白质施用于小鼠并通过使用四种独特标记的抗体(罗丹明标记的抗-IFN-α、荧光素标记的抗-IFN-β、花青标记的抗-IFN-γ和芘标记的抗-IFNL3)的IHC进行检测。在这个示例中，可以使用四种抗体追踪四种蛋白质。尽管该示例提到了天然存在的核苷，但修饰的核苷和核苷酸(例如，3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧鸟嘌呤、3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧腺嘌呤、3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧胞嘧啶或3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧胸腺嘧啶)也可以如下文详细讨论的那样使用。
多路复用以同时检测多个多肽
如上所述，通过选择不同的核苷或核苷类似物作为标记，该方法可用于同时或连续检测样品中的多种不同多肽(“多路复用”)。在一种方式中，每种多肽与不同的核苷或核苷类似物偶联，特异性识别和结合相应核苷标记部分的结合试剂可以被不同地标记。参见表2和3。例如，在荧光标记的情况下，然后可以进行分析，其中不同的可检测标记在不同波长处被激发(和/或发射)。
Figure BDA0004173697250000071
如果每种蛋白质都标记有不同的天然存在的核苷，则可以区分四种蛋白质，但是通过使用修饰的核苷可以检测更多数量的蛋白质，
在相关方式中，每个多肽与至少两种不同核苷和/或核苷类似物的独特组合偶联，并且可以不同地标记特异性识别和结合相应核苷标记部分的结合试剂。
Figure BDA0004173697250000081
通过使用如表3中所示的组合标记，可以仅使用四种结合试剂(例如抗体)来检测八(8)种蛋白质。虽然这个示例提到了天然存在的核苷，但也可以使用修饰的核苷和核苷酸。
尽管本多路复用方法允许在同一样品中检测大量不同的蛋白质，但是将独特的标记分配给每种结合试剂以使得可以同时检测和区分大量结合试剂仍然具有挑战性。例如，在荧光染料的情况下，具有重叠发射光谱的染料组合可能难以区分。当多个标签分配给同一蛋白质时也会出现此问题(如表3所示)，并且可能难以分析相互叠加的两个不同信号。在某些方式中，这通过以下方式解决：使用结合试剂的子集染色，检测来自这些结合试剂的信号，去除结合试剂并进行额外轮次的染色和去除。这些问题将在下面标题为“可去除抗体的制备和使用”的部分中讨论。
使用阵列中的特异性结合试剂对带标记的蛋白质进行定量或表征
本公开提供的技术可用于在体外或体内的各种类型的反应中同时跟踪大量蛋白质。
作为说明，假设用户希望研究多种(比如十种)不同细胞因子与免疫系统细胞的相互作用。十种细胞因子中的每一种都用其自身的核苷或核苷类似物标记，然后组合成单一混合物。出于体外研究的目的，标记的细胞因子与免疫细胞培养物结合，在预期它们会与细胞发生反应的条件下进行。然后回收培养物的上清液以用于定量。为了体内研究的目的，将细胞因子混合物施用于实验动物或其他受试者。液体生物样品(例如血浆、淋巴液或已溶解的固体组织)随后从受试者身上回收用于定量。替代地，不是将细胞因子组合成单一混合物来开始，而是可以将单个带标记的细胞因子或细胞因子亚组在体外与免疫细胞接触或以顺序方式在体内施用。
为了进行定量，将对每个核苷特异的抗体或其他抗原结合试剂分别排列在合适的表面上以检测和/或定量样品中每个带标记的蛋白质。例如，十行微量滴定板可以涂有十种不同的抗体，其分别对十种细胞因子中的每一种细胞因子上的核苷或核苷类似物具有特异性。这将形成一个通用阵列，以用于检测回收样品中的带标记蛋白质。该设置中的多个列可用于量化在不同时间段内回收的连续生物样品，或用于在不同条件下运行的多个重复或反应。
然后将每个回收的样品放置在微量滴定板同一列的每一行中。可以定量测定每个孔中带标记的细胞因子的量，例如，在随后的步骤中使用具有荧光标记的相应核苷特异性抗体的可溶形式进行。在此设置中，对于所有抗体，荧光标记可能相同，因为每个带标记的细胞因子都在不同的行中进行定量。每行中的荧光强度将与相应样品中相应带标记的细胞因子的量成比例。在体外或体内反应中消耗或结合细胞或组织的带标记的细胞因子的量可以通过观察到的强度中的减小来确定。
可以使用类似的方式来确定任何带标记的蛋白质在其与免疫细胞相互作用的过程中是否已经与其他蛋白质结合。例如，带标记的蛋白质是使用对标记具有特异性的抗体阵列从生物样品中捕获的。可以使用对带标记的蛋白质的配体或结合伙伴具有特异性的带标记的抗体，而不是使用对标记具有特异性的第二层抗体来开发阵列。用抗体染色呈阳性的孔表明通过其标记结合到阵列上某个位置的蛋白质已经结合了正在开发的抗体识别的蛋白质。
也可以回收已经通过反应的带标记的蛋白质用于进一步分析。例如，将从体外或体内实验中获得的生物样品的等分试样与表达对每种带标记的蛋白质具有特异性的抗体的亲和珠接触。然后在温和条件下(例如，使用盐溶液中的游离小分子核苷或类似物)从亲和珠中洗脱蛋白质以进行进一步分析。
关于抗体阵列的制备和使用的一般信息由Chaga et al.,2008."Antibodyarrays for determination of relative protein abundances,"Methods in MolecularBiology.441:129–51.doi:10.1007,978-1-60327-047-2_9.ISBN978-1-58829-679-5描述。
顺序多路复用免疫细胞化学以跟踪体内大量带标记的蛋白质
本公开中提供的技术可用于检测或定位在相同样品的免疫组织化学和抗体去除的多个循环中施用于实验动物或其他受试者的多种蛋白质。可检测大量蛋白质。
使用传统方法，可在体内追踪的蛋白质的数量受到检测方法的潜在重叠的限制。例如，将用不同荧光染料标记的蛋白质注射到实验动物体内，以此为案例。稍后回收组织切片并准备用于IHC。通过对每个荧光标记进行成像来确定切片中每个蛋白质的位置。由于荧光重叠，跟踪仅限于同一动物中大约四种不同标记的蛋白质。
使用本公开中提出的技术，没有这样的限制。唯一的限制是用于标记感兴趣的蛋白质的可区分标记或标记组合的数量。用户一次只需使用可移除的标记特异性结合试剂来确定蛋白质的子集。然后用户从被评估的样品中去除结合试剂，并在随后的结合、识别和去除的重复中确定同一样品中带标记的蛋白质的其他子集。
例如，从含有20种带标记的蛋白质的组织切片开始，该技术可以如下实施：样品与第一组四种不同的抗体接触，这些不同的抗体对带标记的蛋白质上的四种核苷标记具有特异性，每种抗体具有不同的荧光标记。前四个标记被成像和量化。然后在温和条件下从组织切片中去除抗体，从而保存组织。然后将组织切片与第二组四种标记的抗体接触，这四种标记的抗体对第一组抗体无法识别的四种不同标记具有特异性。通过这种方式，用户可以在五次重复中的每一次重复中一次定位和评估四种带标记的蛋白质，直到检测并定位所有20种带标记的蛋白质。将有五个组织样品图像，其对应于五次重复中的每一次重复。这些图像可以通过计算组合或以其他方式处理，以便确定所有20种带标记的蛋白质。
结果，所有带标记的蛋白质的定位和定量是在从同一动物收获的同一组织切片中完成的。
通过化学修饰核苷标记确认结合反应
本公开中提供的任何蛋白质检测方法可与验证结合反应的特异性的额外程序结合，从而确认样品中带标记的多肽的存在、数量和/或位置。
根据本公开，在用标记特异性结合试剂检测或定量样品中的带标记的蛋白质后，验证如下进行：使样品经历各种已知的化学或酶促反应中的任一种以影响检测到的蛋白上的核苷或核苷类似物的转化，从而产生不被结合试剂识别的其衍生物。
在一个示例中，3'可逆终止基团是邻叠氮基甲基，它可以在55℃下用三(羟丙基)膦(THPP)解封2分钟。在另一示例中，硝基苄基可以用紫外线解封，以将3'保护基团转化回羟基。(Metzker ML,et al.Termination of DNA synthesis by novel 3′-modifieddeoxyribonucleoside triphosphates.Nucleic Acids Res.1994；22:4259–4267)。3'磷酸基团可以通过酶促裂解机制去除，例如用磷酸酶(例如，虾碱性磷酸酶、小牛肠磷酸酶、南极磷酸酶和T4多核苷酸激酶)去除。在这些示例中的每一个中，去除修饰预计会阻止针对经修饰的核苷在修饰前产生的特异性抗体的显著结合。
修饰反应在保持样品的一般特征的条件下进行。然后使用相同的标记特异性抗体对样品进行相同的检测或定量反应。转化后，标记特异性抗体不应再与先前标记的蛋白质结合，从而消除信号。
因此，在转化前用标记特异性抗体检测或定量，然后在转化后不再检测到的带标记的蛋白质被确认为真实的。在第一次染色反应中似乎表明存在带标记的蛋白质但在转化后仍能检测到的信号可能是假阳性。
用于标记蛋白质的方法和材料
本公开的一些方面涉及用于检测样品中的多肽的方法。该方法包括使带标记的多肽与结合试剂接触并检测结合试剂与带标记的多肽的核苷标记部分的结合。带标记的多肽包括多肽部分和核苷标记部分，并且结合试剂识别并结合带标记的多肽的核苷标记部分。在一些方式中，结合试剂不结合带标记的多肽的多肽部分。在一些方式中，在不存在核苷标记部分的情况下，结合试剂不结合带标记的多肽的多肽部分。
带标记的多肽将包含多肽部分和核苷标记部分。在某些实施方案中，带标记的多肽包含多个核苷标记，其可以相同或不同。
带标记的多肽可以包括任何多肽，其存在、位置和/或蛋白质相互作用概况待确定。在该上下文中，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。在一些实施方案中，多肽是哺乳动物多肽，例如人多肽。示例性多肽包括但不限于信号转导蛋白质(例如，细胞表面受体、激酶、接头蛋白质)、核蛋白质(转录因子、组蛋白质)、线粒体蛋白质(细胞色素、转录因子)和激素受体。在一些实施方案中，多肽是抗体或抗体片段。多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任何组合。在某些实施方案中，多肽是治疗性多肽。
多肽可以具有任何大小，只要它允许用户进行该技术即可。例如，多肽的分子量可以在约500Da至15,000Da的范围内。在一些实施方案中，多肽的分子量小于约1500Da，或小于约1000Da。替代地，蛋白质可以是10kDa、25kDa、50kDa或更大；或介于100Da和50k Da之间。
核苷
如本文所使用的，术语“核苷”具有其在本领域中的正常含义。天然存在的核苷包含与五碳糖(例如，核糖或2'-脱氧核糖)的1'碳连接的天然存在的核碱基(例如，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))。包含2'-脱氧核糖的核苷具有下式：
Figure BDA0004173697250000121
其中R1是天然存在的核碱基。可用于标记蛋白质的天然存在的核苷包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷及其核糖对应物腺苷、胞苷、鸟苷和胸苷。
核苷类似物
在一些实施方案中，带标记的多肽的核苷标记部分包含核苷类似物。核苷类似物与天然存在的核苷的不同之处在于核碱基的修饰、五碳糖的修饰和/或磷酸部分的添加。包含在糖部分的3'碳处连接的磷酸盐的核苷类似物称为“核苷酸”。在一些实施方案中，核苷类似物可包含相对于天然存在的核苷的两个或更多个修饰。例如，核苷类似物可包含核碱基修饰和对五碳糖的修饰。可以使用包含修饰的任何合适的核苷类似物。优选地，修饰不干扰或破坏与其偶联的多肽的功能或活性。
核苷类似物在例如以下文献中描述：Scheit(1980),Nucleotide Analogs,JohnWiley&Son；Uhlman et al.(1990),Chemical Reviews 90:543-584,and Fasman(1989),Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology,pp.385-394,CRCPress。核苷修饰也在例如以下文献中描述：Sood et al.(2019),“DNAmod:the DNAmodification database”,J.Cheminformat.23；11(1):30；Cantara et al.(2001),“TheRNA Modification Database,RNAMDB:2011update”,Nucleic Acids Res.；39:D195–D201；Limbach et al.(1994),“Summary:the modified nucleosides of RNA”,Nucleic AcidsRes.；22:2183–2196,Roundtree et al.(2017),“Dynamic RNA modifications in geneexpression regulation”,Cell,169:1187–1200。其他适合使用的核苷类似物在例如RNAMDB、DNAmod、RMBase或MODOMICS之类的数据库中有描述。下文描述的示例性核苷类似物和修饰。
磷酸酯和磷酸酯类似物部分
在一些实施方案中，核苷类似物是包含与五碳糖连接的磷酸酯部分的核苷酸。磷酸酯部分可包含一个或多个磷酸酯。在一些方面，磷酸酯部分可包含1-12个磷酸酯(例如，1、2、3、4、5或多于5个磷酸酯基团)。例如，核苷类似物可以是核苷一磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。
在一些方面，核苷类似物可以包含磷酸酯类似物部分。磷酸酯类似物包括硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、烷基膦酸酯(alkyl-phosphonate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phosphoranilidate)和氨基磷酸酯(phosphoramidate)，或本领域已知的任何其他磷酸酯类似物。
核碱基修饰
在一些实施方案中，使用的核苷类似物包含核碱基修饰。对核碱基的修饰可例如包括向6原子环添加甲基或用碳中的一个取代氮原子。具有修饰的示例性核碱基包括但不限于次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、脱氮嘌呤(例如，7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤)、5-甲基胞嘧啶、7-甲基胞嘧啶。包含核碱基修饰的核苷包括但不限于黄苷、1-甲基腺苷(m1A)、N6-甲基腺苷(m6A)、肌苷(I)、5-甲基胞苷(m5C)、假尿苷(Ψ)、二氢尿苷。在某些情况下，核碱基部分未被修饰。在一些情况下，核苷类似物不是次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、脱氮嘌呤(例如，7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤)、5-甲基胞嘧啶或7-甲基胞嘧啶。在一些情况下，包含核碱基修饰的核苷不是黄苷、1-甲基腺苷(m1A)、N6-甲基腺苷(m6A)、肌苷(I)、5-甲基胞苷(m5C)或假尿苷(Ψ)。
结合试剂可以通过识别具有修饰的核碱基(例如修饰的A)的核苷而特异性结合核苷类似物。特异性识别修饰的结合试剂通常不与具有没有该修饰的核碱基的核苷结合。例如，结合其中第7位的氮被甲基化碳取代的腺苷类似物的结合试剂可能不结合不包含对核碱基的修饰的天然存在且未修饰的腺苷，或者可能不太亲切地结合。
糖修饰
在一些实施方案中，核苷类似物包含在五碳糖处的修饰。在一些实施方案中，修饰包括在糖的3'-O位置、2'-O位置或3'-O位置和2'-O位置两者处添加化学部分。在一些实施方案中，修饰(例如，在2'-O位置或3'-O位置)包含少于10个，例如少于5个碳原子。
示例性的化学部分包括叠氮基甲基、烯丙基、氨基烷氧基、2-氰乙基、烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、顺式-氰基乙烯基、反式-氰基乙烯基、顺式-氰氟乙烯基、反式-氰氟乙烯基、顺式-三氟甲基乙烯基、反式-三氟甲基乙烯基、双氰基乙烯基、双氟乙烯基、顺式-丙烯基、反式-丙烯基、硝基乙烯基、乙酰乙烯基、甲基碳基乙烯基、酰氨基乙烯基、甲基磺基乙烯基、甲基磺基乙基、甲酰亚胺酯、羟基甲酸酯、乙烯基乙烯基(vinyloethenyl)、乙烯醚乙烯基(ethylenoethenyl)、氰基乙烯基、硝基乙烯基、酰胺基乙烯基、氨基、氰基乙烯基、氰基乙基、烷氧基、酰基、甲氧基甲基、氨氧基、羰基、硝基苄基、香豆素基和硝基萘基。本文中使用的烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基或杂炔基分子可以是经取代的或未经取代的。
在一些实施方案中，核苷标记部分包含核苷类似物，其包括在糖的3'-O位置的部分。在一些实施方案中，该部分是叠氮基甲基部分。在一些实施方案中，核苷类似物包含天然存在且未修饰的核碱基(例如，A、G、C、T或U)和在糖的3'-O位置的叠氮基甲基部分。在一些实施方案中，核苷类似物是包含天然存在且未修饰的核碱基(例如，A、G、C、T或U)和在糖的3'-O位置的叠氮基甲基部分的核苷酸。在一些实施方案中，核苷类似物是3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧鸟嘌呤、3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧腺嘌呤、3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧胞嘧啶或3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧胸腺嘧啶。
因此，在一些方式中，结合试剂特异性地识别糖上的修饰，并结合与糖附接的2'-O或3'-O部分。例如，结合试剂可以识别并结合糖的3'-O位置的叠氮基甲基部分。
包含多个修饰的核苷类似物
在一些实施方案中，核苷类似物可包含在一个或多个位置处的修饰。例如，核苷类似物可能具有核碱基修饰和对糖的修饰，或者可能具有2'-O修饰和3'-O修饰。在一个实施方案中，糖修饰是3'-O-叠氮基甲基修饰。
包含两个或更多个修饰的其他示例性核苷类似物包括5,2'-O-二甲基胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷(ac4Cm)、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷(m6t6A)、或N2-2'-O-二甲基鸟苷(m2Gm)。也可以使用包含一种或多种修饰的合成核苷类似物，其包括例如去羟肌苷(ddl)、阿糖腺苷、BCX4430、阿糖胞苷、吉西他滨、恩曲他滨(FTC)、拉米夫定(3TC)、扎西他滨(ddC)、阿巴卡韦、阿昔洛韦、恩替卡韦、司他夫定(d4T)、替比夫定、齐多夫定(叠氮胸苷或AZT)、碘尿苷和曲氟尿苷。
因此，结合试剂可以识别并特异性结合修饰的组合。例如，结合试剂可以识别特定的3'-O部分和/或具有特定修饰的核碱基。在一些方面，可以针对被显示对特定修饰组合的特异性的特异性结合试剂识别的特性使用或选择核苷类似物。使用具有不止一种修饰的核苷类似物可能具有结合试剂更强和更特异性结合的优势，并且提供更灵敏的蛋白质检测。
核苷和核苷类似物的性质
天然存在的核苷的分子量在约227至283的范围内。在某些实施方案中，使用的核苷类似物的分子量小于550，通常小于540，通常小于530，通常小于520，通常小于510，通常小于500，通常小于490，通常小于480，通常小于470，通常小于460，以及有时小于450。
天然存在的核苷通常包含9-10个碳原子。在某些实施方案中，核苷类似物中的碳原子数不超过天然存在的核苷的碳原子数多于1、2、3、4、5或10。
在某些实施方案中，当修饰包括添加部分，例如向糖添加部分时，该部分(包括3'氧原子或2'氧原子)具有的分子量(MW)小于200，通常小于190，通常小于180，通常小于170，通常小于160，通常小于150，通常小于140，通常小于130，通常小于120，通常小于110，以及有时少于100。
天然存在的核碱基的分子量为：腺嘌呤为135；鸟嘌呤为151、胸腺嘧啶为126和胞嘧啶为111。在某些实施方案中，当修饰包括核碱基修饰时，修饰的核碱基的分子量不超过天然存在的核碱基的分子量超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100Da。
将核苷或核苷类似物与多肽偶联
在一些方式中，带标记的多肽通过将核苷或核苷类似物偶联或附接至多肽而获得。可以使用任何合适的方法将核苷或核苷类似物偶联至多肽。例如，核苷或核苷类似物可以附接到交联剂上，该交联剂含有能够与多肽上的特定官能团形成共价键的反应性部分。用于将核苷或核苷类似物偶联至多肽的交联剂和反应性部分在例如Hermanson(2013),“Bioconjugate Techniques”,3rd edition,Academic Press；and Mattson et al.(1993),“A practical approach to crosslinking,Mol.Biol.Rep.,17:167-183中有所描述。可以使用的示例性交联剂包括但不限于胺反应性交联剂、羰基反应性交联剂、羧基反应性交联剂、巯基反应性交联剂和光反应性交联剂。
胺反应性交联剂包含能够与多肽上存在的伯胺形成键的反应性部分，例如通过酰化或烷基化进行。示例性的反应性部分包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或磺基-NHS酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚胺酯、酸酐，碳二亚胺和氟苯酯。在某些方面，核苷或核苷类似物通过胺反应性交联剂通过NHS酯与多肽偶联。
巯基反应性交联剂包含能够与存在于半胱氨酸侧链中的巯基形成键的反应性部分，通常通过烷基化或二硫化物交换进行。示例性的巯基反应性部分包括但不限于卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和二硫化物还原剂。
羰基反应性交联剂包含能够与存在于多肽(例如糖蛋白质)上的羰基形成键的反应性部分。示例性的反应性部分包括醛和酮反应性部分，如肼、肼衍生物和烷氧基胺。其他羧基反应性交联剂包含能够在羧基和伯胺之间形成键的反应性部分。示例性的反应性部分包括EDC、二环己基碳二亚胺和其他碳二亚胺。
光反应性交联剂包含能够与多肽上存在的任何官能团形成键并且当暴露于紫外光或可见光时变得具有反应性的反应性部分。示例性的光反应性部分包括芳基叠氮化物和双吖丙啶(diazirine)。
抗体和其他结合试剂
本公开中提出的技术使用特异性结合带标记的多肽的核苷标记部分的结合试剂。在一方面，结合试剂结合带标记的多肽的核苷标记部分而不结合带标记的多肽的多肽部分。在一些方式中，在不存在核苷标记部分的情况下，结合试剂不结合带标记的多肽的多肽部分。因此，在一些情况下，结合试剂可以在核苷标记部分存在的情况下与多肽部分的部分结合或相互作用。在一些方面，结合试剂结合带标记的多肽的核苷标记并且不结合没有核苷标记的其他方面相同的多肽。
结合试剂是基于核苷标记部分中包含的核苷或核苷类似物的结构特征来特异性识别和结合核苷标记部分的分子或大分子。例如，结合试剂可以特异性结合核苷类似物(该核苷类似物包含核碱基腺苷和在糖的3'O-位置的叠氮甲基)，但不以高亲和力结合核苷类似物(该核苷类似物包含核碱基腺苷但具有3'羟基而不是叠氮甲基)，并且不以高亲和力结合核苷类似物(该核苷类似物包含核碱基胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶)，每个具有或不具有叠氮甲基可逆保护基团。因此，本文所述方法中使用的结合试剂可通过识别其核碱基(例如，A)特异性结合一个核苷，而不结合包含任何其他核碱基(例如，T、C和G)的核苷。
可以使用的结合试剂的示例包括抗体(包括抗体片段、双特异性抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、纳米抗体、双抗体和它们的多聚体、适配体、打结素(knottins)、亲和体，或以合适的特异性和亲和力结合核苷或核苷类似物的任何其他已知试剂。在一些实施方案中，结合试剂是抗体，例如单克隆抗体。在一些实施方案中，结合试剂是适体。
特异性结合核苷或核苷类似物的抗体可以从许多来源(例如LSBio、BMLlife或Synaptic Systems)获得。另见Feederle and Schepers(2017),“Antibodies specificfor nucleic acid modifications”,RNA Biol.,14:1089–1098。也可产生用作结合试剂的针对核苷或核苷类似物的抗体。产生、纯化和修饰抗体的标准程序可以使用，并且被描述于例如Harlow and Lane(1988),"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,ColdSpring Harbor；and Howard and Bethell(2000),“Basic Methods in AntibodyProduction and Characterization”,CRC Pr.Inc.)中。噬菌体展示方法也可以使用并在例如Ward et al.(1989),Nature,341:544-546,1989；Huse et al.(1989),Science 246:1275,1989；和McCafferty et al.(1990),Nature 348:552-554；以及U.S.Pat.No.5,403,484,US 5,969,108and US 5,885,793中有描述。有用的抗体也可以在无细胞系统中产生。非限制性的示例性的无细胞系统在例如Sitaraman et al.(2009),Methods Mol.Biol.,498:229-44；Spirin(2004),Trends Biotechnol.,22:538-45,2004；以及Endo et al.(2003),Biotechnol.Adv.,21:695-713中有描述。
在公开的国际申请WO 2018/129214(“Drmanac et al.2018”)和WO 2020/097607(“Drmanac et al.2020”)中详述了产生和使用对核苷类似物具有特异性的抗体的具体方法。
在一些实施方案中，结合试剂是适体。核酸适体可以通过反复轮次的体外选择或等效的SELEX(通过指数富集的配体系统进化)来设计，以结合各种靶标(如核苷或核苷类似物)。参见，例如，Jayasena,et al.,Clinical Chemistry 45:1628-1650,1999。可以使用不同的系统进行肽适体选择，包括酵母双杂交系统。肽适体也可以选自通过噬菌体展示和其他表面展示技术(例如mRNA展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示)构建的组合肽文库。这些实验程序也称为生物淘选。参见，例如，Reverdatto et al.,2015,Curr.Top.Med.Chem.15:1082-1101。
在一些方面，结合试剂是亲和体。可以通过使用噬菌体展示文库来选择对核苷或核苷类似物具有特异性的亲和体，这些文库经过筛选以鉴定与目标核苷或核苷类似物具有高特异性结合和高结合亲和力的亲和体蛋白质。参见，例如，美国专利No.8,481,491、美国专利No.8,063,019和WO 2009/136182，其通过引用并入本文。另见Crawford et al.,BriefFunct.Genomic Proteomic,2:72-79,2003。在一些方面，结合试剂是打结素或抑制剂胱氨酸结(ICK)，这是一种包含三个二硫键的蛋白质结构基序。可以使用蛋白质工程将新的结合表位引入天然打结素中。生产对核苷或核苷类似物具有特异性的打结素的一种方式是使用酵母表面展示和荧光激活细胞分选来创建和筛选打结素文库(参见，例如，Kintzing andCochran,Curr.Opin.Chem.Biol.34:143-150,2016；Moore et al.,Drug DiscoveryToday:Technologies 9(1):e3-ell,2012；以及Moore and Cochran,Meth.Enzymol.503:223-51,2012)。
可去除抗体的制备和使用
抗核苷结合试剂的去除在以下文献中有描述：已公开的国际申请WO 2018/129214(“Drmanac et al.2018”)和WO 2020/097607(“Drmanac et al.2020”),两者均通过引用并入本文。参见，例如，Sections 4.6,8.1.2-8.1.3,Examples 11-12of Drmanac 2018(例如但不限于此)和
Figure BDA0004173697250000191
0207,0213-0223,0228-0231of Drmanac et al.2020。Drmanac 2018和2020描述了从掺入引物延伸产物的核苷中去除抗核苷亲和试剂的解离条件。然而，这些条件也会使亲和试剂与带标记的多肽分离。示例性的去除条件可以是高温，例如50℃至75℃的温度，有时是55℃至75℃，例如60℃至70℃。在一些实施方案中，高pH大于7、大于8，例如约9。示例性解离条件包括高pH环境(pH在pH 8至10的范围内)。在优选的实施方案中，解离条件包括高温和高pH。此外，在一些实施方案中，抗体的去除发生在含有浓度小于100mM，例如小于90mM，或小于80mM的盐的反应混合物中。在优选的解离条件下，抗体去除或解离通常可在少于60秒，例如少于40秒或少于30秒内进行。在一些实施方案中，解离条件是使至少约90％、有时至少约95％、有时至少约99％的结合标记抗体在少于5分钟、少于60秒、例如小于40秒、或小于30秒、小于20秒、或小于10秒内与带标记的蛋白质解离的那些条件。相反，结合条件适用于抗体-抗原相互作用。例如，在一些实施方案中，结合发生在30至45℃或35-50℃范围内的温度下。在一些实施方案中，结合发生在pH范围为7至8.5、通常为7至7.5的环境中。在一些实施方案中，进行结合，结合条件包括30-45℃范围内的温度和/或具有7-7.5范围内的pH的环境。应认识到，可移除(可以从中除去)的结合试剂(例如抗体)将部分地基于结合特性进行选择。如下所述，选择可去除的抗体。虽然具有高平衡解离常数(KD)的单克隆抗体在某些应用中是首选，但在要去除抗体的检测程序中，优选亲和力较低的抗体。
多路复用免疫化学和该技术的其他用途可包括去除步骤，其中从生物样品中去除第一染色反应中使用的成组的标记特异性抗体，从而允许样品进行第二轮染色。选择第一染色反应中的抗体，以便它们可以在温和条件下从样品中去除，从而保存组织。
为了使用杂交瘤技术获得合适的可去除抗体，用户以通常的方式将载体蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白质(KLH))上的核苷或核苷类似物(“表位”)注射到小鼠或兔子，回收淋巴细胞，并制造杂交瘤。通常以通常的方式进行杂交瘤的初始筛选以获得对相应表位特异的杂交瘤克隆。通过将每个克隆与相应的表位接触，进行第二轮筛选以获得可去除的抗体。结合表位后，克隆在与将用于去除的条件(例如，在中等盐溶液中含有核苷或核苷类似物的溶液)相同或相似的条件下进行处理。
在第一次筛选中呈阳性但在暴露于去除溶液后呈阴性的克隆被选为具有带有低至中等亲和力的所需表位特异性的适合于去除的候选物。
在解离条件下从细胞上或组织样品中的带标记的蛋白质中去除低亲和力抗体，其中结合的、标记的抗体从带标记的蛋白质上解离。示例性的解离条件包括高温，例如50℃至75℃范围内的温度，有时为55℃至75℃，例如60℃至70℃的温度。在一些实施方案中，高pH大于7、大于8，例如约9。示例性的解离条件包括高pH环境(pH在pH8至10的范围内)。解离条件可包括相同核苷或核苷类似物(抗体以游离形式对其具有特异性)的浓度，以帮助通过结合位点竞争去除抗体。可以设置解离条件使得至少约80％、90％或95％的结合抗体在少于5分钟内从样品解离。
特异性结合3'-叠氮甲基核苷的示例性单克隆抗体在Drmanac2020(WO2020/097607)中有所描述，包括但不限于针对3'叠氮甲基-dA(N3A)具有特异性的单克隆抗体：mAb 2C5、3B12、17H7和18B7；针对3'-叠氮甲基-dC(N3C)具有特异性的单克隆抗体：mAb1B8、2B9、4C8、1A10和3B7；针对3'-叠氮甲基-dG(N3G)具有特异性的单克隆抗体：mAb 3G6、5F6、4B8、4G8和7C8；和针对3'-叠氮甲基-dT(N3T)具有特异性的单克隆抗体：mAb 2D4、2D10、1F9和3B7。已经制成示例性的多克隆和单克隆抗体，其特异性结合天然(无3'保护基团)核苷和核苷。这包括类似物3'-硝基苄氧基或3'-硝基甲基苄氧基，如下文实施例2所述。结合特异性在使用与生物素或蛋白质如牛血清白蛋白质缀合的相应核苷或核苷类似物的测定中得到证实。
可检测标记
在一些方式中，结合试剂缀合至可检测标记。可以使用本领域已知的任何方法标记结合试剂。将抗体和其他结合试剂与可检测标记连接的方法是本领域众所周知的，该可检测标记例如包含酶和荧光/发光蛋白质的信号生成蛋白质(Wild,The ImmunoassayHandbook,4.sup.th ed.；Elsevier:Amsterdam,the Netherlands,2013；Kobayashi andOyama,Analyst 136:642-651,2011)。可以使用产生信号并且可检测的任何合适的标记。在一些实施方案中，可检测标记是荧光染料或荧光团。
将荧光标记物与结合试剂和多种荧光分子缀合的方法及其光学特性描述于例如Haugland(2005),Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes,Eugene)。示例性的荧光染料包括但不限于吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、恶嗪染料、菲啶染料和罗丹明染料，例如荧光素、FITC、德克萨斯红、ROX、花青3(Cy3)、花青5(Cy5))、Alexa Fluor染料(例如Alexa Fluor 647或488)、ATTO染料(例如ATTO532或655)。
在一些方式中，可检测标记是化学发光(例如，生物发光)标记。在一些实施方案中，化学发光标记是酶，其在存在底物的情况下产生可检测信号。可用作标记物的示例性酶包括但不限于萤光素酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。例如，在Rashidianet al.(2013),Bioconjugate Chem.24:1277-1294中描述了基于酶的标记。
直接和间接标记方法
在一些方式中，结合试剂被直接标记，例如结合试剂缀合至可检测标记，例如通过共价键缀合。在一些方式中，间接标记方法用于检测结合试剂与带标记的多肽的核苷部分的结合。因此，在一些实施方案中，结合试剂是初级结合试剂并且直接结合带标记的多肽的核苷部分。初级结合试剂可以是未标记的，例如初级结合试剂未与可检测标记缀合。通过结合初级结合试剂的次级结合试剂进行初级结合试剂与多肽的核苷标记部分的结合的检测。在某些实施方案中，二抗包含特异性结合一抗的抗原结合区，例如一抗的恒定区。次级结合试剂可以与可检测标记缀合。因此，检测初级结合试剂与带标记的多肽的核苷标记部分的结合包括：(i)使初级结合试剂与次级结合试剂接触，其中次级结合试剂缀合至可检测标记，并且其中次级结合试剂与初级结合试剂结合；以及(ii)检测次级结合试剂与第一结合试剂的结合，包括检测来自与次级结合试剂缀合的可检测标记物的信号。在一些方面，初级结合试剂是一抗。在一些方面，次级结合试剂是二抗。
检测方法
检测结合试剂与带标记的蛋白质的核苷标记部分的结合可以通过检测来自附接到结合试剂的可检测标记的信号来进行。可以通过多种方法检测来自可检测标记物的信号，并且可以根据标记物(例如，荧光团、化学发光剂等)的性质选择合适的检测方法。例如，可以使用例如光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、分光光度法在视觉上检测信号。
包含结合试剂和带标记的多肽的复合物
该技术的方面进一步涉及结合试剂和带标记的多肽的复合物，其中带标记的多肽包括多肽部分和核苷标记部分，并且结合试剂结合到带标记的多肽的核苷标记部分。在一些实施方案中，结合试剂不与带标记的多肽的多肽部分结合。在一些实施方案中，与带标记的多肽的核苷标记部分结合的结合试剂是抗体或适体。在一些实施方案中，结合试剂是初级结合试剂(例如，一抗)。在一些实施方案中，结合试剂标记的多肽复合物通过被缀合至可检测标记物的次级结合试剂(例如，二抗)来识别和结合。在一些方面，次级结合试剂结合初级结合试剂。
在一些方式中，本文描述的方法用于检测样品中的一种或多种多肽。样品可以是例如从动物、植物、细菌、酵母、原生动物或变形虫获得的任何固体或液体样品。例如，样品可以是从任何器官或组织获得的生物样品(包括活检或尸检标本，例如肿瘤活检)或可以包括细胞(无论是原代细胞还是培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。在一些实施方案中，生物样品是组织样品。样品也可以是生物流体，例如尿液、脑脊髓液、血液、淋巴液、组织匀浆、间质液、细胞提取物、粘液、唾液、痰、粪便、生理分泌物或其他类似的流体。在一些实施方案中，样品包含细胞培养物来源的细胞。
试剂盒
在一些方面，该技术提供了被配置用于实施本文描述的方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：(a)包含多肽部分和核苷标记部分的带标记的多肽，和(b)特异性结合带标记的多肽的核苷标记部分的结合试剂。该试剂盒可以包含2、3、5或多个这样的带标记的多肽与相应结合试剂的组合。在一些实施方案中，结合试剂是抗体。在一些实施方案中，结合试剂缀合至可检测标记物。在一些实施方案中，可检测标记物是荧光或化学发光标记物。在一些实施方案中，结合试剂是初级结合试剂并且试剂盒还包含特异性结合初级结合试剂的次级结合试剂。在一些实施方案中，次级结合试剂缀合至可检测标记物。在一些实施方案中，可检测标记是荧光或化学发光标记物。
在一些方面，该技术提供了包含结合试剂标记的多肽复合物的试剂盒。在一些实施方案中，结合试剂是初级结合试剂。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含次级结合试剂，其特异性结合结合试剂标记的多肽复合物的初级结合试剂。
定义
在以上描述的一些部分中，结合试剂被称为对靶核苷或核苷类似物具有特异性的抗体。在这个意义上，术语“抗体”用作结合试剂的非限制性说明。在每个图示中，除非另有说明或要求，否则术语“抗体”可作为更一般的类别与术语“结合试剂”互换。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸的聚合物。如本文所使用的，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所使用的，“核苷”通常是指天然存在的核苷，其包含与五碳糖连接的天然存在的核碱基(或含氮碱基)。如本文所使用的，“天然存在的核碱基”是指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)。五碳糖包括核糖和2'-脱氧核糖。如本文所使用的，“天然存在的核苷”是指脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、腺苷、胞苷、鸟苷和胸苷。
如本文所使用的，“核苷类似物”是指其核心结构与核苷的核心结构相同或非常相似但通常与核苷的区别在于核碱基的修饰、糖的修饰、和/或向糖中添加磷酸部分的化合物或分子。修饰可以包括取代或添加化学部分。
如本文所使用的，“核苷酸”是指包含一个或多个磷酸酯(例如，分别由一个、两个或三个连接的磷酸酯组成的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯)的磷酸酯部分的核苷。磷酸酯部分通常附接到糖的5-碳。
如本文所用的，术语“结合试剂”是指以所需亲和力或特异性结合核苷或核苷类似物的分子。在某些实施方案中，结合试剂是直接结合核苷或核苷类似物的第一结合试剂。在某些实施方案中，结合试剂是结合第一结合试剂的次级结合试剂。
如本文使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白质分子或组合物(例如，单克隆抗体和多克隆抗体)，以及基因工程形式，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。抗体可以来自重组来源和/或在动物中产生，动物包括但不限于转基因动物。如本文使用的，术语“抗体”包括“抗体片段”，其包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、纳米抗体、双抗体及其多聚体和双特异性抗体片段。抗体可以是任何有用的同种型，包括IgM和IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，抗体是特异性结合核苷或核苷类似物的一抗。在一些实施方案中，该抗体是特异性结合一抗的二抗。
如本文所使用的，术语“适体”是指可以特异性结合另一分子(例如，核苷或核苷类似物)的小分子。适体通常是基于多核苷酸或基于肽的分子。多核苷酸适体是一种DNA或RNA分子，通常包含一条(通常很短的)寡核苷酸链。包含一个(或多个)短可变肽结构域的肽适配体，其两端都连接到蛋白质支架上。多核苷酸适配体通常通过反复轮次的体外选择或等效的SELEX(通过指数富集的配体系统进化)来设计以结合靶标。
如本文所使用的，术语“可检测标记物”是指可用于提供可检测和/或可量化信号的任何原子或分子。合适的标记包括荧光团、发射化学发光的分子、酶、酶底物、生色团、放射性同位素、质量标记物、电子致密粒子、磁性粒子、自旋标记物、电化学活性分子和辅因子。可检测标记物可直接或间接缀合至另一分子(例如，结合试剂)以促进该分子的检测。
如本文所使用的，术语“偶联(coupling)”或其任何语法变体(例如偶联(couple)、偶联的(coupled)等)是指两个分子之间的任何化学缔合并且包括共价和非共价缔合。在一个实施方案中，术语偶联是指多肽与核苷或核苷类似物之间的共价缔合。
如本文所使用的，术语“反应性部分”是指可以与另一分子反应以形成一个或多个键的分子的部件或部分。例如，反应性基团可以是胺反应基团，例如NHS酯，其中酯与多肽上存在的胺反应。
如本文所使用的，术语“样品”可以是从任何活生物体获得、排泄或分泌的任何固体或液体样品，该活生物体包括但不限于动物、植物、细菌、酵母、原生动物和变形虫。例如，样品可以是从任何器官或组织(包括活检或尸检标本，例如肿瘤活检)获得的生物样品或可以包括细胞(无论是原代细胞还是培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。样品也可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊髓液或任何其他身体分泌物中获得的生物流体。
如本文所使用的，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链和支链单价取代基。示例包括甲基、乙基、异丁基、3-丁炔基等。“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”与烷基、烯基和炔基类似地定义，但可以在主链内包含O、S或N杂原子或其组合。
如本文所使用的，术语“经取代的”包括将烷氧基、芳氧基、氨基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基、环烷基或杂环烷基加成到附接至烷氧基、芳氧基、氨基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基、环烷基或杂环烷基的主链的位置，例如，氢被这些分子中的一者取代。取代基的示例包括但不限于羟基、卤素(例如F、Br、Cl或I)和羧基。相反，如本文所使用的，术语“未经取代的”表示烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基或杂炔基具有完整的氢补充，即与其饱和水平相当，没有取代，例如直链丁烷(--(CH2)3--CH3)。
本发明的实践
除非另有说明或要求，否则本公开中要求保护的所有产品和方法可以不受限制地用于任何合适的目的。虽然本发明已参考具体示例和说明进行了描述，但可以进行更改并且可以替换等同物以使技术适应特定背景或预期用途作为常规开发和优化的问题并且在本领域普通技术人员的预见范围内，从而在不脱离权利要求及其等同物的范围的情况下实现本发明的益处。
实施例
实施例1：包含N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)反应性部分的核苷或核苷类似
物的合成
包含3'-O叠氮甲基部分的核苷类似物的氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的合成如图1所示。这为该类似物配备了离去基团，因此核苷类似物可以与选定的蛋白质缀合。
使用这种化学方法，可以通过蛋白质上可用的游离胺与NHS酯激活的核苷反应来标记蛋白质。NHS酯修饰的核苷在无水DMSO中稀释，并在提供足够标记而不会对蛋白质功能产生不利影响的浓度下与蛋白质反应。将相对低浓度的蛋白质在碳酸氢盐缓冲液中调节至pH8.0，然后与NHS酯核苷反应。在将带标记的蛋白质与未使用的标记试剂和副产物分离之前，温育通常在室温或更低温度下持续60分钟。
实施例2：抗体的生产和表征
已经产生了针对各种核苷和核苷类似物的特异性抗体以供根据本公开使用。
针对KLH缀合的3'-叠氮甲基dA(N3A)、3'-叠氮甲基dC(N3C)、3'-叠氮甲基dG(N3G)或3'-叠氮甲基dT(N3T)(Yurogen Biosystems,Worcester,MA)以培养兔单克隆抗体。简而言之，用四种不同的与钥孔血蓝蛋白质(KLH)缀合的核苷类似物对兔子进行免疫。使用每个NLRT通过ELISA进行出血分析。在免疫后第63天，处死兔子并分离外周血单核细胞(PBMC)或脾细胞。选择兔用于细胞分选和培养分泌抗体的B细胞。使用用于免疫的核苷类似物筛选共培养上清液。培养选择的克隆，从培养物上清液中收获抗体，并根据标准方案进行纯化。
图2A、2B和2C提供了表征此类抗体的结合特异性的数据。从分离的B细胞上清液中获得多克隆抗体。抗体制剂在表中由实验室名称(“克隆ID”)标识。示出了结合到引物上的3'-硝基苄氧基或3'-硝基甲基苄氧基修饰的核苷酸的抗体结合强度。未修饰的末端核苷酸用于检测天然C结合抗体。在本文中，“结合强度”是指一抗结合水平，如使用读板器的荧光模式测量的荧光标记的抗兔IgG二抗水平所反映的那样。使用了四种不同的引物，其掺入了四种不同的末端修饰的核苷酸(A、T、C和G)，然后针对各自的抗体进行测试。用荧光标记的抗兔IgG二抗检测一抗。与靶标和脱靶碱基的特异性结合是通过非竞争性结合事件来确定的。
测定如下进行：将3'生物素化寡核苷酸附接到市售的链霉亲和素包被的96孔微量滴定板上。然后将引物与附接在板孔上的生物素化模板链杂交。然后按照正对面模板链位置的指示，将3'修饰的可逆终止子核苷酸掺入引物的3'末端后的第一个位置。选择四种引物，使得掺入的第一个碱基导致所有4个核碱基(A、C、G、T)掺入板的不同孔中。掺入核苷酸后，将免疫兔B细胞克隆的培养物上清液在板孔中于37℃温育5分钟，以使阳性抗体与引物的末端碱基结合。用缓冲盐溶液洗涤后，使用市售的荧光标记的二级山羊抗兔IgG抗体(AATbiosciences)检测是否存在B细胞上清液来源的兔IgG的结合。
通过引用并入
出于所有目的，本公开中引用的每份出版物和专利文件均出于所有目的通过引用整体并入本文，其程度如同每份此类出版物或文件被具体且单独地指示通过引用并入本文一样。

Claims (27)

1.一种确定蛋白质在生物样品中的位置的方法，其包括：
将标记附接到蛋白质上以形成带标记的蛋白质，其中所述标记是核苷或核苷类似物；
使所述生物样品与所述带标记的蛋白质接触；然后
通过使所述样品与特异性结合所述标记的结合试剂接触来识别和确定所述蛋白质在所述样品中的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记是核苷。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记是核苷类似物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核苷类似物是核苷酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述核苷类似物是与下式核苷相比包含至少一处修饰的核苷：
Figure FDA0004173697230000011
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述核苷类似物是在所述核苷的3'-OH处修饰的天然存在的核苷。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述结合试剂包含荧光基团。
8.根据权利要求7所述的方法，其中通过获得从所述荧光基团发射的荧光图像来确定所述样品中的所述带标记的蛋白质的位置。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其为流式细胞术或细胞分选的方法，其中所述生物样品为细胞样品。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其为免疫组织化学方法，其中所述生物样品为组织样品。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其为酶联免疫测定(ELISA)的方法，或产生蛋白质印迹的方法。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其是多路复用方法。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其是用于在体内追踪多种蛋白质的方法。
14.一种在体内追踪多种蛋白质的方法，该方法包括：
获得多种蛋白质，每种蛋白质被标记有不同的核苷或核苷类似物；
将带标记的所述蛋白质作为混合物、同时或顺序地施用于受试者；然后从所述受试者处获取生物样品；以及
通过使所述生物样品与对带标记的所述蛋白质上的所述标记中的每一种具有特异性的结合试剂接触，确定带标记的所述蛋白质中的每一种在所述生物样品中的存在、数量和/或位置。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述生物样品是组织切片，并且所述特异性结合试剂中的每一种用于确定所述组织切片中相应的带标记的所述蛋白质的位置。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述确定是多路复用方法，其中带标记的所述蛋白质中的至少一些已经用两种或更多种不同的核苷或核苷类似物标记，其中所述核苷或核苷类似物的特定组合唯一地识别带标记的所述蛋白质中的每一种。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述确定是包括若干次重复的多路复用方法，其中所述方法包括：
将所述组织切片与成组的标记特异性结合试剂接触，所述标记特异性结合试剂共同结合被附接在所述组织切片中的蛋白质上的所述不同核苷标记中的一些但不是全部；
在带有标记的所述组织切片中定位带标记的蛋白质，所述成组的标记特异性结合试剂中的所述结合试剂对所述标记具有特异性；
从所述组织样品中去除所述结合试剂；以及
使用不同的成组的结合试剂进行所述接触、所述定位和所述去除的一个或多个附加重复，所述不同的成组的结合试剂包含至少一种对与在先前重复中所述结合试剂对其具有特异性的标记不同的标记具有特异性的结合试剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中使用含有非生理盐浓度和/或pH以及未附接至蛋白质的一种或多种核苷或核苷类似物的溶液去除所述结合试剂。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中每一成组的结合试剂中用于接触组织切片的所述结合试剂是发荧光的，并且每一成组的结合试剂中的所述确定包括从结合到所述组织切片的结合试剂获得发射荧光的图像。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在每次重复过程中使用四种荧光结合试剂定位四种不同的蛋白质，所述四种荧光结合试剂对于附接到所述四种不同的蛋白质的标记中的每一种是特异性的，其中来自所述结合试剂中的每一种的荧光发射在光学上能与来自其他结合试剂的荧光发射区分。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其还包括计算合并从所述重复中的每次重复获得的图像。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物样品是液体样品，并且使用固体表面上的结合试剂阵列确定所述样品中的带标记的蛋白质的存在和/或数量，其中所述阵列上的单独的位置各自包含对不同标记具有特异性的结合试剂。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述结合试剂是抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体是纳米抗体。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体是抗体片段。
26.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述结合试剂是亲和体。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过以下方式确认所述样品中的带标记的蛋白质的特征、数量和/或位置：在对标记进行化学或酶促处理以从所述蛋白质中去除所述标记或将所述标记修饰为所述结合试剂无法识别的形式之前和之后都将所述样品与特异性结合到带标记的所述蛋白质上的其相应标记的结合试剂接触。
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