ES2319039B1 - Procedimiento para el rastreo y diagnostico precoz del cancer colorrectal. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el rastreo y diagnóstico
precoz del cáncer colorrectal, que consiste en el control
cuantitativo o estudio del perfil gráfico de los cambios de número
de ribosomas por célula (o por unidad de volumen), en un período de
tiempo definido, dentro de una media aritmética de las células
exfoliadas de la mucosa colorrectal del paciente; en que los
registros obtenidos forman una curva patrón/media del número de
ribosomas por unidad de volumen, con relación a las células de la
mucosa del colon y recto, aisladas y separadas de las heces. La
información recogida de fracciones subcelulares, puede ser
correlacionada con otros parámetros de mensuración biológica
celular cuantitativa (como por ejemplo, algunos marcadores
tumorales, e.g. CEA.); y porque a partir del conocimiento del
intervalo de valores "cantidad (número) media de ribosomas
libres" considerados dentro de la normalidad se podrán
considerar otros intervalos.
Description
Procedimiento para el rastreo y diagnóstico
precoz del cáncer colorrectal.
La invención, tal como expresa el enunciado, se
refiere a un procedimiento para el rastreo y diagnóstico precoz del
cáncer colorrectal.
De forma más concreta, el objeto de la
invención consiste en un procedimiento basado en el control
cuantitativo o estudio del perfil gráfico de los cambios de número
de ribosomas por célula (o por unidad de volumen), en un período de
tiempo definido, dentro de una media aritmética de las células
exfoliadas de la mucosa colorrectal de un paciente cuyos registros
secuenciales formarán una curva patrón/media del número de
ribosomas por unidad de volumen, con relación a las células de la
mucosa del colon y recto, aisladas y separadas de las heces, lo
cual permitirá el rastreo, control y diagnóstico precoz del cáncer
colorrectal (en adelante cáncer CCR).
Como es sabido, el cáncer CCR es una de las
principales causas de muerte por cáncer en el mundo con estilo de
vida occidental, pero está dentro de los cánceres mejor curables
cuando es identificado en un estadio precoz. Este tipo de cáncer
tiene una fase pre-maligna larga y una progresión
lenta desde la fase de enfermedad confinada a la pared del órgano
hasta las fases de invasión local y de enfermedad metastática
distante. Por eso, hay una amplia oportunidad para identificar a
los pacientes en un estadio curable con la realización de rastreos
vastos.
En un estudio sobre rastreo del CCR se
explicaron las ventajas y desventajas de los varios métodos de
tests o pruebas a 100 pacientes y después se les preguntó cuál de
los métodos conocidos preferían como rastreo. Los resultados
fueron: (a) colonoscopia 38% (más elevado para personas que ya
anteriormente se habían sometido a una colonoscopia, que para las
personas que anteriormente se habían sometido al test de la sangre
oculta en las heces, o no se habían sometido a cualquier test
previo), (b) test de sangre oculto de las heces 31% (los que
rechazan todas las formas de test invasivo, (c) Enema de bario 14%,
(d) sigmoidoscopia flexible 13%. Estos hallazgos sugieren que
muchos pacientes (casi un tercio) declinan cualquier forma de test
invasivo, pero se someterían a una prueba no invasiva.
El rastreo del CCR ha probado ser efectivo,
tanto en la disminución de la mortalidad por CCR, como, más
recientemente, en la disminución de la incidencia. Existe un
desafío mayor, sin embargo, para los clínicos, así como para los
pacientes, para conseguir un beneficio claro en los programas de
rastreo de CCR.
Existen ciertas condiciones que disminuyen las
potencialidades de los resultados de los rastreos, que están
asociadas con algunos factores, incluyendo el número de estrategias
del rastreo, sus esquemas variados de recomendación, manipulación e
inadecuación impropia para los tests de sangre fecal, consumo
excesivo de tiempo y preparación incómoda para el paciente en las
etapas de limpieza intestinal, y la naturaleza invasiva de muchas
modalidades de rastreo riguroso. Más aún, a pesar de su clara
eficiencia, ni todos los médicos utilizan completamente las
potencialidades del CCR y no rastrean "agresivamente"
sus pacientes.
Todos estos factores contribuyen a bajar las
ventajas y disminuyen el valor global del esfuerzo de indagación.
El rastreo de CCR no ha penetrado adecuadamente en la muestra de
población susceptible de ser estudiada y con indicaciones para tal,
como por ejemplo, los mayores de 50 años de edad.
En los Estados Unidos hay cerca de un 20,6% de
pacientes que refieren haber hecho un test de sangre oculta en las
heces dentro del año anterior a esa cuestión, y solamente 33,6% se
refieren a haber hecho una sigmoidoscopia flexible dentro de los
cinco años, previos. La creación de sistemas de recordación clínica
de rastreos de CCR para garantizar que los pacientes mantengan
fidelidad a programas de rastreo apretados es igualmente necesaria,
y condicionada por la complejidad que conlleva la preparación de
los organigramas de rastreos.
Investigadores han demostrado que las células
cancerosas con expresión elevada de las proteínas ribosómicas
tienen contenidos más elevados de ribosomas. Las alteraciones
genéticas asociadas con el desarrollo del cáncer implican, muy
frecuentemente, cambios de las vías de señalización que llevan su
efecto hasta el rADN. El panorama anteriormente descrito reitera lo
conocido por los biólogos del cáncer: la biogénesis de los
ribosomas y la oncogénesis están íntimamente ligadas.
El propósito de la invención, con estos
conocimientos básicos de biología molecular, es definir algunos
principios orientadores sobre el valor del número aumentado de
ribosomas libres, como traducción clínica de la dinámica del
proceso bioquímico hacia la malignización de las células en una
comunidad celular específica de un tejido, u órgano, mediante la
verificación y comprobación en el ámbito de observaciones de
microscopia electrónica de las cantidades de ribosomas libres en
tejidos neoplásicos, o pre-malignos y de la
construcción de una curva gráfica de las cantidades de ribosomas
libres de esos tejidos, que pueda definir la tendencia de
malignización de una comunidad celular, bajo ciertas condiciones
que predisponen para el crecimiento de un tejido en la dirección de
la malignización.
En las décadas de 60 y 70 fueron publicados
estudios sobre ribosomas libres y ribosomas ligados a membranas y
sobre su acumulación durante la inducción de crecimiento en muchos
órganos y tejidos. En la secuencia de estas investigaciones se
publicaron estudios que han intentado cuantificar la acumulación
de ribosomas en las zonas interfoliculares de la piel del dorso de
ratones durante la inducción química de crecimiento neoplásico, en
dos fases, mediante iniciación por
7,12-dimetilbenz(a)antraceno y
promoción provocada por
12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato.
La epidermis es un epitelium de superficie y,
como otros epitelios, que están en contacto directo con el medio
externo, tales como los revestimientos de los aparatos respiratorio
y gastrointestinal, muestra una elevada incidencia de neoplasias.
De este modo, la epidermis ha servido como un modelo útil para
constituir un sistema de desarrollo comprensible del papel de la
acumulación de ribosomas durante el crecimiento neoplásico.
Será muy importante la producción de modelos
predictivos mecanísticos (conteo de ribosomas libres) basados en la
dinámica tumoral, con traducción en el fenotipo celular, como, por
ejemplo, con el conteo de ribosomas libres en una célula en proceso
de alteración fenotípica, bajo el estímulo oncogénico. Será más
útil para la práctica clínica concreta que los investigadores
puedan abstraerse del significado de los detalles biológicos más
avanzados relativamente a la oncogénesis y progresión tumoral, que
dependen de incontables factores variables.
La identificación de los cambios de la
estructura del citoplasma, como por ejemplo el aumento acentuado
del número de ribosomas (método cuantitativo) acumulados en el
citoplasma de una comunidad de células de un determinado tejido
puede constituir uno de los aspectos fenotípicos de la expresión de
malignidad de la estructura fina de las células transformadas, lo
que puede ser esencial para caracterizar la evolución del
comportamiento celular. En este sentido, la invención preconiza
estudiar el perfil gráfico de los cambios del número de ribosomas
por célula (o por unidad de volumen), en un período de tiempo
definido, dentro de una media aritmética de las células exfoliadas
de la mucosa colorrectal de un paciente cuyos registros
secuenciales formarán una curva patrón/media del número de
ribosomas por unidad de volumen, con relación a las células de la
mucosa del colon y recto, aisladas y separadas de las
heces.
heces.
Esto puede permitir una fuerte motivación para
integrar diversos campos del conocimiento en la biología del cáncer
e introducir nueva armazón conceptual y teorética que pueda mejorar
la comprensión de los investigadores sobre la dinámica de la
formación tumoral para, así, poder desarrollar mejores métodos
preventivos, diagnósticos y terapéuticos.
Aunque sea cierto que el cáncer es una
enfermedad multifacética con una variedad de desencadenantes o
"triggers" cercanos en diferentes tejidos y en diferentes
pacientes, hay también una fuerte posibilidad de que los cánceres
comparten una funcionalidad central originándose a partir de una
maquinaria celular común de la cual las células dependen para su
proliferación.
El aspecto más visible de los neoplasmas
malignos agresivos es la proliferación celular aumentada, la cual
tiene en su base un acentuado aumento de la síntesis proteica. En
los procesos de la respuesta mitogénica normal hay un aumento
transitorio y cíclico del índice de la síntesis genérica de
proteínas.
El aumento general en la síntesis proteica es
un fenómeno necesario controlado que se observa antes de la
división celular, llevando a la duplicación del contenido y al
aumento del tamaño antes de la mitosis normal. Así, el tamaño medio
de las células es mantenido durante el proceso de respuesta
proliferativa fisiológica.
Uno de los mecanismos llave de la pérdida del
control de la síntesis proteica en las células transformadas es la
incapacidad de disminución del número de ribosomas que está
correlacionada con la proliferación celular en medios de cultura
frescos sin adición de factores de crecimiento al suero. Muchos
investigadores han observado, en culturas de tejidos, diferencias
en las propiedades de crecimiento entre células normales y sus
contrapartes malignas, una de las cuales apunta hacia el fallo de
estas en mostrar una variación cíclica de algunos parámetros
celulares y bioquímicos a través del ciclo celular o ciclo de
crecimiento.
Por otra parte, la biogénesis de los ribosomas
y el control de la traducción son procesos celulares esenciales
controlados a muchos niveles. Varios supresores tumorales y
proto-oncogenes han sido responsabilizados por la
alteración de la formación de los ribosomas maduros y por la
regulación de la actividad de proteínas conocidas como factores de
traducción. La perturbación en una o más de las etapas que
controlan la biosíntesis de las proteínas ha sido asociada con
alteraciones en el ciclo celular y en la regulación del crecimiento
de las células. Por eso, ciertos supresores tumorales y
proto-oncogenes pueden regular la progresión
maligna a través de la alteración de la maquinaria de la síntesis
proteica.
La producción de ribosomas maduros, que son
competentes para la traducción celular del mARN necesita de un
proceso "multistep" (de múltiples etapas) que es altamente
coordinado en las células eucariotas. El ribosoma, que es la
fábrica central de síntesis de proteínas, puede ser visto como una
máquina finamente regulada que funciona como un componente
estático de los complejos procesos centrales ordenados a niveles
más superiores.
De hecho, los ribosomas tienen la misión de
producir correcta y eficientemente todas las proteínas de la
célula. Aunque sea conocido el hecho de que en las células
cancerosas los componentes de la maquinaria de traducción están
desarreglados o se expresan mal, su papel en la tumorigénesis ha
sido largamente olvidado. Por ejemplo, en los comienzos de los años
70, los cambios en el nucleolo han sido reconocidos como un
importante marcador de la transformación célula.
Las mutaciones en los genes que codifican las
proteínas que están directamente envueltas en la biogénesis de los
ribosomas están asociadas con el cáncer y otras enfermedades. El
gen DKC1 (Dyskeratosis congénita) está mutado en pacientes
con la dyskeratosis congénita, que es una enfermedad caracterizada
por envejecimiento prematuro y un aumento de la susceptibilidad
para el cáncer. El DKC1 codifica la disquerina, una sintasa
pseudouridina que hace la mediación
post-transcriptional del ARN ribosómico. Se
identificaron mutaciones en el gen que codifica la proteína
ribosómica S19 en otro síndrome que es caracterizado por un aumento
de la susceptibilidad para el cáncer - Anemia de
Diamond-Blackfan.
El crecimiento y proliferación celular están
asociados con cambios en la tasa de producción de los ribosomas.
Durante G1 hay un prerrequisito que es el aumento de la síntesis
del rARN y del montaje de los ribosomas para el aumento de la
síntesis proteica durante la fase S. Más aún, puede ser necesario
la regulación de baja en la actividad de los ribosomas o de su
formación, o ambos durante la fase M para asegurar la salida
adecuada del ciclo celular. Por eso, existe una relación importante
entre el ciclo celular y la producción de los ribosomas.
Este balance es mantenido en la célula a través
de los "checkpoints", que aseguran que la traducción del mARN
ocurra en niveles apropiados y durante una ventana del ciclo
celular. La síntesis del rARN es el primer evento en la biogénesis
del ribosoma. Depende de la regulación del rADN por la ARN
polimerase I (Pol I) en el nucleolus. La síntesis de rARN en la
célula puede ser inducida por estímulos extracelulares en ciertos
momentos cuando una célula necesita crecer y proliferar.
El concepto de la regulación de la síntesis del
rARN ha sido originalmente verificado en las células en que la
privación de un aminoácido resultaba en una rápida terminación de
la síntesis del rARN. Desde entonces, muchos otros artículos han
mostrado que la iniciación de la trascripción de rARN está
íntimamente ligada a la progresión del ciclo celular. La síntesis
del rARN es máxima en las fases S y G2 y reprimida en la mitosis y
aumentada en G1.
Estas fluctuaciones en la síntesis de rARN,
dependientes del ciclo celular, dependen de la actividad de Pol I.
La trascripción del factor UBF (upstream bindig factor) es una
llave reguladora de la síntesis de rARN teniendo la capacidad de
modular la actividad transcripcional de Pol I. Más aún, varios
proto-oncogenes y supresores de tumores regulan
directamente la síntesis de rARN por potenciación o represión de la
actividad del UBF, respectivamente.
La primera proteína identificada que regula la
actividad de UBF ha sido la CKII - casein kinase II (1092), una
quinase serina treonina que tiene aumentada su expresión en muchos
cánceres, incluyendo leucemias y tumores sólidos. La CKII ha sido
responsable de contribuir a la tumorigénesis a través de la
interacción directa con la maquinaria del ciclo celular. Además,
esta fosforila el UBF en el carboxilo terminal y por eso regula la
trascripción del rADN. Hay estudios subsecuentes que han estudiado
otras quinases de UBF que también están desrreglados en el cáncer y
afectan similarmente la síntesis del rARN. Se sabe, desde hace más
de 25 años, que la tasa de proliferación y crecimiento celular es
proporcional a la tasa de síntesis proteica. Además, la
desregulación aumentada de las quinases UBF en los cánceres puede
estimular la síntesis de rARN y contribuir a sus propiedades
oncogénicas. Por eso, la perturbación del control de
la síntesis proteica puede toARNr las células más susceptibles para desrreglar el crecimiento y proliferación celular.
la síntesis proteica puede toARNr las células más susceptibles para desrreglar el crecimiento y proliferación celular.
La desregulación aumentada de las
r-proteínas en las células cancerosas corresponde
razonablemente a su envolvimiento en la producción de ribosomas.
Similarmente, al aumento de la actividad transcripcional de Pol I
que resulta en un aumento de la síntesis de rARN, las
r-proteínas podrían también reglar el número de
ribosomas funcionales en la célula. En ambos casos las células que
contienen más ribosomas tendrían una tasa de traducción aumentada,
que promovería la transformación celular.
El crecimiento y proliferación celular están
asociados con cambios en la tasa de producción de los ribosomas y
la biogénesis de los ribosomas y puede servir como un sensor para
que las células ultrapasen importantes "checkpoints" durante
el ciclo celular. En las células transformadas, que muestran
producción de ribosomas aumentada el ciclo celular, el número de
ribosomas puede ser alterado como consecuencia de las alteraciones
en la biogénesis de los ribosomas. Este sistema apretado de
autorregulación entre los ribosomas y el ciclo celular podrá
funcionar para mantener la homeostasis celular. Por eso, un aumento
en la cantidad de ribosomas, como consecuencia de algún efecto a
montante, afecta la traducción de las proteínas y puede contribuir
al proceso de transformación. Sin embargo, en el presente, no es
posible saber en concreto si hay algún
"cross-talk" o interferencia entre los
ribosomas y el ciclo celular.
Para complementar la descripción que se está
realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las
características de la invención, se acompaña a la presente memoria
descriptiva, como parte integrante de la misma, de un juego de
planos, en los que con carácter ilustrativo y no limitativo se ha
representado lo siguiente:
La figura número 1.- Muestra un ejemplo de un
esquema en cuyos ejes, que representan las dos coordenadas
cartesianas, se construye una curva gráfica, de los cambios de
número de ribosomas por célula (o por unidad de volumen), en un
período de tiempo definido, dentro de una media aritmética de las
células exfoliadas de la mucosa colorrectal de un paciente.
Así, en el esquema de la comentada figura 1 y
única, están diseñados los dos ejes que representan las dos
coordenadas cartesianas (abscisa o eje horizontal y ordenada o eje
vertical), relativamente a los cuales se construye una curva
gráfica. Esta curva es caracterizada por dos variables relativas a
los ribosomas libres de las células de la comunidad citológica
bajo estudio (las células epiteliales de la mucosa colorrectal o
coloncitos). Esas variables son:
- la "cantidad (número) media de ribosomas
libres" en el citoplasma de cada célula y
- el "tiempo" a lo largo del cual es
observado el comportamiento de ciertas variaciones de esa
"cantidad (número) media de ribosomas libres".
Habrá necesidad de criar experimentalmente
perfiles gráficos de valores numéricos "cantidad (número)
media de ribosomas libres" que puedan ser fijados como
normales, a partir de los cuales se pueda trazar una
curva-mediana-padrón. Así, será
posible hacer estudios comparativos de grandes grupos
poblacionales, en los cuales será posible divisar una multiplicidad
potencial de tendencias de enfermedad maligna (por elevación de la
curva) en una determinada comunidad de células de un tejido bajo
investigación.
En estudios correlacionados de microscopia
electrónica y bioquímica los datos bioquímicos son usualmente
cuantitativos, mientras la información morfológica (de la
microscopia electrónica) es más limitada o semicuantitativa, basada
en descripciones dependientes de criterios subjetivos. Este
criterio subjetivo de abordaje en la microscopia electrónica no
permite una mensuración estadística de los datos, con rigor
matemático, impidiendo una correlación paramétrica de los datos
morfológicos con los correspondientes datos bioquímicos.
En el esquema de la figura 1 hay un registro de
la evaluación cuantitativa de los ribosomas libres, en el sentido
estático y dinámico, como información recogida de fracciones
subcelulares, que puede ser correlacionada con otros parámetros de
mensuración biológica celular cuantitativa (como por ejemplo,
algunos marcadores tumorales, e.g. CEA.). A partir del conocimiento
del intervalo de valores "cantidad (número) media de ribosomas
libres" considerados dentro de la normalidad (intervalo A)
se podrán considerar otros intervalos, que en el esquema de la
figura 1 están representados por B nivel aumentado, C nivel de
alarma,D nivel cínico, -A nivel bajo y 0 nivel inexistente.
En el eje de las abscisas se inscriben los
múltiples de períodos de seis meses, (1, 2, 3,...,10) contados a
partir del inicio de la monitorización de los registros de los
valores de la "cantidad (numero) media de ribosomas
libres" de las células bajo estudio.
El tramo (a-b) es una curva que
comienza en el nivel normal y que llega al nivel aumentado, lo que
implica la atención para un estudio profiláctico sobre las razones
o causas que determinaran su aparecimiento. Las células en este
nivel (aumentado) aún no tienen características seguras de
malignidad, pero si su número aumentado de ribosomas libres
continua creciendo, la célula se transformará en un fenotipo
maligno (nivel de alarme). En este momento es fundamental existir
un estudio alimentario por encuesta, así como la identificación de
posibles mutaciones responsables por el aumento
no-controlado de la biogénesis de los ribosomas, en
un proceso de carcinogénesis;
El tramo (a-c) muestra un
segmento de la curva derivado de la anterior (tramo
a-b), que corresponde ya a las alteraciones
fenotípicas visibles en microscopia óptica, en las cuales las
células ya se presentan con características fenotípicas de
malignidad;
El tramo (a-d) es un segmento de
la curva, en continuación del segmento anterior, que representa ya
el nivel de los signos y síntomas de la enfermedad CCR (nivel
clínico);
El segmento de la curva (a-e)
corresponde a un cambio de sentido de la curva
(a-b) que resultará de una acción preventiva y
terapéutica (medicaciones y dieta específica);
El tramo (a-f) corresponde a una
curva en que las células se desarrollan (se multiplican u
proliferan) dentro de un autocontrol de los mecanismos de
proliferación aumentada, como en el caso de los tubos seminíferos,
u del endometrio. En este nivel aumentado de ribosomas el control
de la biogénesis de los mismos se sitúa dentro de los mecanismos
fisiológicos (no malignos);
El tramo (a-g) muestra una curva
de nivel normal;
Finalmente el tramo (a-h)
muestra una curva de nivel bajo, que todavía servirá para estudiar
condiciones de degeneración e involución de células y tejidos, ya
sea de la mucosa intestinal, o de otro tejido
extra-intestinal.
Las descripciones de mediciones de las células
con características fenotípicas de malignidad varían según el grado
de menor o mayor diferenciación de su textura, o morfología, pero
esas descripciones son subjetivas, dependiendo de cada observador
que hace la investigación. Lo mismo pasa cuando a los ribosomas
libres que sufren una variación progresiva de cantidad, se
desplazan del fondo de una cripta intestinal hasta al vértice de
las vellosidades. Los ribosomas libres pueden ser aritméticamente
contados, o sea su cantidad puede ser mensurable y comparable con
el transcurrir del tiempo. En términos de biología molecular del
cáncer, la transformación maligna de las células normales consiste
en la adquisición progresiva de una serie de cambios genéticos
específicos que actúan desobedeciendo a los fuertes mecanismos
antitumorales que existen en todas las células normales, los cuales
incluyen:
- -
- regulación de la transducción de señales;
- -
- diferenciación celular;
- -
- apoptosis;
- -
- reparación del ADN;
- -
- progresión del ciclo celular;
- -
- angiogénesis;
- -
- adhesión celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Al igual de las descripciones de mediciones,
estos mecanismos de transformación maligna sólo son evaluados a
través de criterios subjetivos, en que las características
descritas no pueden ser cuantificables matemáticamente, como
acontece con las descripciones enumeradas en el cuadro representado
en la figura 1. De igual modo, las propiedades de las células
transformadas malignas, en crecimiento, en cultura de células, o
in vivo, cuando son observadas según técnicas de biología
celular o de biología molecular, no posibilitan una evaluación
cuantitativa rigurosa, porque dependen de criterios subjetivos, sin
limites numéricos, como son las propiedades enumeradas en el
cuadro representado en la figura 1 (propiedades de las células
transformadas malignas creciendo en cultura de células y/o in
vivo). Con los ribosomas libres es posible cuantificarlos a
través de conteo, utilizando técnicas de citometría de flujo.
Así, el procedimiento para el rastreo y
diagnóstico precoz del cáncer colorrectal, que la presenta
invención preconiza, se basa esencialmente en el control
cuantitativo o estudio del perfil gráfico de los cambios de número
de ribosomas por célula (o por unidad de volumen), en un período de
tiempo definido, dentro de una media aritmética de las células
exfoliadas de la mucosa colorrectal de un paciente cuyos registros
secuenciales formarán una curva patrón/media del número de
ribosomas por unidad de volumen, con relación a las células de la
mucosa del colon y recto, aisladas y separadas de las heces, para
lo cual, en primer lugar, se realizará un adecuado aislamiento de
los ribosomas libre mediante las siguientes técnicas:
- Cosecha de heces. Un número significativo de
células permanecen intactas y viables en las heces y pueden ser
aisladas. Ha sido demostrado que estas células son exclusivamente
representantes de todo el colon y que pueden ser muy útiles en
investigación clínica de procesos de enfermedad.
- Células exfoliadas del colon. Colonocitos
exfoliados. Los colonocitos exfoliados en las heces pueden ser
colectados en un medio de transporte, a la temperatura ambiente, en
un colector adecuado para tal función y aislados, obteniéndose,
así, células para detección y estudio de algunos biomarcadores que
pueden tener una correlación y propensión con ciertas
enfermedades.
La aplicación de técnicas de biología molecular
a las células exfoliadas del colon y recto aumenta profundamente la
sensibilidad de la detección del cáncer colorrectal o de su
tendencia para la malignizacion, haciendo posible su utilización en
el diagnostico y en el rastreo. Los tests de heces, con base en la
biología molecular, tienen varias ventajas importantes sobre otros
tests de rastreo, porque no son invasivos y no necesitan de
preparación intestinal, ni enemas de limpieza, ni preparación
desagradable de catárticos. No necesitan de dislocación a una
consultación o a un centro de exámenes médicos. El paciente no
tiene de alterar su ritmo de vida, ni alterar la rutina de sus
actividades diarias o de trabajo.
El epitelium colorrectal normal se renueva cada
3 a 8 días. Está en constante actividad proliferativa, para
compensar las elevadas pérdidas normales, y para mantener la
homeostasis de la mucosa colorrecta. Históricamente, está
demostrado que las células epiteliales de la mucosa colorrectal
migran de la cripta hasta las vellosidades, sufriendo
diferenciación y senescencia, hasta que se liberan en el lumen del
intestino. La renovación epitelial no siempre resulta de
exfoliación, también puede resultar de reciclaje fagocítica a
través de macrófagos subepiteliales en el transcurso de fenómenos
de apoptosis, lo que representa una vía alternativa.
La liberación de colonocitos a partir de
neoplasmas colorrectales es diferente, sea cualitativa, sea
cuantitativamente, de la del epitelium normal. Hay evidencia, desde
hay mucho tiempo, que la liberación de colonocitos a partir de los
cánceres es significativamente mayor que de la mucosa normal.
La densidad celular de eritrocitos, células
inflamatorias, colonocitos y debris celulares es
100-200 veces más abundante en el moco sobre las
superficies de los cánceres de la mucosa que sobre la superficie
normal de la mucosa.
La tasa elevada de exfoliación de colonocitos a
partir de los cánceres puede ser debida a factores tales como
proliferación epitelial aumentada, apoptosis proporcionalmente
menor, reducción de la adhesión célula-célula y
perturbación de la remoción fagocítica. Parece existir una
supervivencia mayor para las células malignas cuando son comparadas
con la de las células de la mucosa normal y la apoptosis está
aumentada en las células normales cuando se separan de la membrana
basal. Este fenómeno es debido a la activación de las caspas y
otras señales de muerte.
En contraste con los colonocitos normales, los
colonocitos malignos adquieren cambios genéticos que les confieren
capacidad de anclaje independiente para crecimiento, lo que les
permite entrar en circulación y eventualmente ocasionar
metastizacion. Aunque los colonocitos malignos puedan escapar a la
apoptosis, estos pueden ser vulnerables a los ácidos biliares y
otros agentes citólíticos en el milieu de las heces.
Hay información suficiente que revela una mayor
concentración de colonocitos sobre la superficie de las heces. Se
conocen múltiplas técnicas para aislar colonocitos intactos.
- Fraccionamiento subcelular. El
fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que
tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un
determinado componente celular, sea éste un orgánulo (mitocondrias,
núcleos, peroxisomas, ribosomas...) una fracción de membrana
(membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio
apical,...), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina,
microtúbulos, poros nucleares, etc..), etc. El fraccionamiento
subcelular es una técnica que consiste en la separación de los
diferentes componentes celulares mediante la centrifugación
diferencial. Para ello, las células se trituran y se centrifugan
varias veces. En cada centrifugación se separa un orgánulo
diferente de la célula (1° el núcleo). Se observa a la velocidad a
la que sedimenta cada orgánulo pudiendo saber el coeficiente de
sedimentación expresado en unidades S (Svedberg) (Ej. Ribosomas
70s). El fraccionamiento celular es usado para investigar la
bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de
la célula intacta.
- Homogenización. Para preparar los tejidos
para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un
medio apropiado (una solución amortiguadora, salina ó azúcar
isotónica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas
durante el procedimiento de la fraccionación, todas las soluciones
y cristalería deben mantenerse frías. Después de rebanar las hojas,
el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que
rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin
dañar el medio en suspensión. La suspensión de células
constituyentes se llama homogenizado. Todo proceso de
fraccionamiento subcelular tiene dos etapas:
- \bullet
- rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
- \bullet
- separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presencia de algún antígeno, etc.
- Técnicas de rotura de células y tejidos. El
primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y
estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las
células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el
complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en
condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando
procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como
homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas
celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
Los procedimientos de homogenización más comunes son:
- \bullet
- Sonicación. Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frío para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas.
- \bullet
- Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares.
- \bullet
- Pasar las células a través de orificios de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares.
- \bullet
- Homogenizadores. Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado.
- Centrífuga. Las centrífugas son instrumentos
que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen
la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una
densidad mayor que la del medio que las rodea. En general se
diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten
a las muestras en: centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 x g),
supercentrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 x
g a 20000 x g) y ultracentrífugas (de 15000 x g a 600000 x g). En
las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara
para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción.
En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm),
hace que sea necesario hacer un intenso vacío en la cámara de la
centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra. En una
centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que
gira y en el que se colocan los tubos. Los parámetros a tener
presentes en cualquier centrifugación, que determinarán las
condiciones son:
- \bullet
- volumen de solución a centrifugar, que determinará el tipo de tubos y rotores a emplear.
- \bullet
- naturaleza química de la solución, que determinará la naturaleza del tubo a emplear
- \bullet
- diferencial de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará. Cuando el diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.
- Centrifugación. Debido a las diferencias en
tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza
centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como
fuerza centrífuga relativa (RCF) en unidades de g. La RCF es una
función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos
(rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación.
- Velocidad de sedimentación. Alternativamente
es posible aprovechar la diferencia de la velocidad necesaria para
sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un
medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la
parte superior y mayor en la inferior. Después de un tiempo las
diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes
profundidades del tubo. Haciendo un pequeño orificio en el fondo
del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a
las distintas poblaciones separadas. Este es el fundamento de la
ultra-centrifugación preparativa, que permite
determinar la velocidad de sedimentación de una partícula (medida
en unidades Svedverg, S).
Una vez obtenido el lisado u homogeneizado
celular se ha de proceder a su fraccionamiento. Una de las técnicas
más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo
a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el
fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener
una densidad mayor que la del medio en que se encuentran. Así,
después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá
separado en dos fracciones: sobrenadante ("supeARNtant"),
fracción homogénea que no ha sedimentado y el sedimento
("pellet") que ha quedado adherida al fondo del tubo.
- Centrifugación diferencial. En la
centrifugación diferencial, el homogeneizado es centrifugado
repetidas veces a altas velocidades, sedimentándolo progresivamente
en pequeñas partículas. La primera centrifugación es a 600 g por 10
minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este "pellet"
o bola contiene el núcleo, células intactas y tejido. La próxima
separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas
en líquido sobre el "pellet" nuclear, el cual es transferido a
otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos
en una centrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce
como fracción mitocondrial; éste contiene mitocondria y micro
cuerpos.
La centrifugación diferencial se basa en la
existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren
en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones
suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las
partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la
primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de
más tiempo y más fuerza de aceleración, se sedimentan de nuevo las
partículas más densas presentes y así sucesivamente. Se pueden
aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y
obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente
a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.
- Equilibrio de sedimentación. Es un sistema
que se suele realizar empleando la ultracentrífuga. Consiste en la
separación de las partículas en función de su densidad de
flotación. La muestra se dispone por encima o se mezcla con un
gradiente de densidad más pronunciado que el del caso anterior, y
que contiene una concentración muy elevada de sacarosa o de cloruro
de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará
hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que
su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad
neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán
una serie de bandas discretas, las más próximas 1 fondo del tubo
contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este
método también se conoce como equilibrio en gradiente de
densidad.
Se emplean diferentes sustancias para conseguir
los gradientes de densidad, como son sacarosa, percol, cloruro de
cesio,... Los gradientes pueden ser autogenerados como es el caso
de los basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio
proceso de centrifugación, o preformados como es el caso de la
sacarosa o del percol. En este último caso la preparación se
realiza antes de la centrifugación mediante un formador de
gradientes, dispositivo que consiste en dos cubetas conectadas por
la base y con agitación en las que se colocan las soluciones con
los dos extremos de concentración. A medida que se va sacando de
una de ellas la otra reemplaza el líquido extraído y modifica
linealmente la concentración.
Una alternativa es la centrifugación en
gradiente discontinuo, en la que se crea un gradiente por etapas en
el interior de un tubo al apilar sucesivamente volúmenes homogéneos
de soluciones de diferente densidad. En las interfases de las
diferentes capas se acumularán las partículas que flotan (son
menos densas) en la capa inferior pero que se hunden (son más
densas) en la capa superior.
- Marcación de ribosomas. Finalmente, cabe
señalar que la traducción de la información genética en
polipéptidos por el ribosoma es un proceso celular universal y
fundamental. La evidencia estructural y bioquímica del ribosoma
soporta fuertemente la dinámica de su importancia funcional durante
la síntesis proteica. Están descritas técnicas clásicas de biología
molecular celular que permiten separar los ribosomas (libres y
ligados a membranas) de otros organelos subcelulares. Hay varios
estudios que describen distintos modos de marcación de ribosomas.
La preparación de ribosomas, según el tejido en estudio, se puede
hacer a través de algunas modificaciones de adaptación, publicadas
en estudios previos. La preparación de ribosomas puede ser
utilizada para muchos objetivos, como por ejemplo, para el estudio
del crecimiento y desarrollo de tejidos inducidos por acción
hormonal, estudio de la expresión de los genes, incluyendo la
síntesis de las proteínas ribosómicas que están bajo control
translacional, estudio del "assembling" de los ribosomas,
estudio de la expresión diferencial de las proteínas ribosómicas de
la mucosa del colon y recto normal y neoplásica, de entre muchas
otras potencialidades.
Claims (4)
1. Procedimiento para el rastreo y diagnóstico
precoz del cáncer colorrectal, caracterizado por el hecho de
consistir en el control cuantitativo o estudio del perfil gráfico
de los cambios de número de ribosomas por célula (o por unidad de
volumen), en un período de tiempo definido, dentro de una media
aritmética de las células exfoliadas de la mucosa colorrectal del
paciente.
2. Procedimiento para el rastreo y diagnóstico
precoz del cáncer colorrectal, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que los registros secuenciales
obtenidos a partir dicho control cuantitativo forman una curva
patrón/media del número de ribosomas por unidad de volumen, con
relación a las células de la mucosa del colon y recto, aisladas y
separadas de las heces.
3. Procedimiento para el rastreo y diagnóstico
precoz del cáncer colorrectal, según las reivindicaciones 1 y 2,
caracterizado por el hecho de que se realiza un registro de
la evaluación cuantitativa de los ribosomas libres, en el sentido
estático y dinámico, como información recogida de fracciones
subcelulares, que puede ser correlacionada con otros parámetros de
mensuración biológica celular cuantitativa (como por ejemplo,
algunos marcadores tumorales, e.g. CEA.); y porque a partir del
conocimiento del intervalo de valores "cantidad (número) media
de ribosomas libres" considerados dentro de la normalidad se
podrán considerar otros intervalos.
4. Procedimiento para el rastreo y diagnóstico
precoz del cáncer colorrectal, según las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado por el hecho de que para la consecución del
control cuantitativo o cuenteo de ribosomas libres en la unidad de
volumen a estudio se utilizarán las siguientes técnicas y/o
fases:
- -
- Cosecha de heces
- -
- Colecta de colonocitos exfoliados
- -
- Fraccionamiento subcelular
- -
- Homogeneización
- -
- Rotura de tejidos y células
- -
- Centrifugación
- -
- Sedimentación
- -
- Centrifugación diferencial
- -
- Equilibrio de sedimentación
- -
- Marcación y preparación de ribosomas.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200701216A ES2319039B1 (es) | 2007-05-07 | 2007-05-07 | Procedimiento para el rastreo y diagnostico precoz del cancer colorrectal. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200701216A ES2319039B1 (es) | 2007-05-07 | 2007-05-07 | Procedimiento para el rastreo y diagnostico precoz del cancer colorrectal. |
Publications (2)
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|---|---|
| ES2319039A1 ES2319039A1 (es) | 2009-05-01 |
| ES2319039B1 true ES2319039B1 (es) | 2010-03-03 |
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ID=40560390
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR102696044B1 (ko) | 2015-11-06 | 2024-08-16 | 벤타나 메디컬 시스템즈, 인코포레이티드 | 대표 진단법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2007
- 2007-05-07 ES ES200701216A patent/ES2319039B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MARTÍNS-FERREIRA ALEMAO, A.: "{}Ribograma: Concepto y Aplicaciones en la Clínica Oncológica del Colon y Recto"{}, Tesis Doctoral, Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía, leída el 15/03/2007; dirigida por J.L. Balibrea Cantero. Todo el documento; en particular, pp.: 136-146. * |
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|---|---|
| ES2319039A1 (es) | 2009-05-01 |
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| EC2A | Search report published |
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