CN109975097A - 一种基于适配体的肿瘤细胞染色探针组合 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及肿瘤细胞染色技术领域，具体涉及一种基于适配体的肿瘤细胞染色探针组合。利用荧光标记适配体对循环肿瘤细胞的原位癌进行鉴定，建立小鼠乳腺癌和肝癌双肿瘤模型，收集被捕获的CTCs利用带有ROX标记的乳腺癌细胞适配体和Cy5标记的肝癌细胞适配体进行特异性染色，优化了适配体染色浓度及时间，且可以同时染色，节约了染色时间，利用荧光显微镜观察染色结果，可判断CTC的来源。本公开提供的肿瘤细胞染色探针，可同时对两种肿瘤细胞进行染色，特异性大大提高，且各荧光适配体之间互不影响，可同时进行染色，大大节约了染色时间，提高了循环肿瘤细胞原位癌判定效率。
Description
技术领域
本公开属于肿瘤细胞染色技术领域，具体涉及一种基于适配体的肿瘤细胞染色探针组合及试剂盒。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了循环肿瘤细胞(Criculating Tumor Cells,CTCs)的概念。CTCs是指从原位癌脱落进入血液循环，并可随血液循环到达身体各处的肿瘤细胞。CTCs在恶性肿瘤转移过程中发挥重要作用。原发瘤不连续释放大量CTCs进入血液循环，但只有不足0.01％的CTCs能够存活下来，故CTCs亦被称为外周血中的“稀有细胞”。CTCs的出现和肿瘤尺寸无关，即在原位癌形成的早期，血液循环中便有CTCs的出现。针对这一发现，研究人员可以通过捕捉外周血中的循环肿瘤细胞，并对其携带的相关信息进行鉴别，例如对原发病灶进行判断。
为了实现对循环肿瘤细胞的捕获及检测，本领域公开了一系列针对外周血中CTCs进行捕捉的方法，包括捕获探针法、特异性肿瘤抗原捕获探针法或微阵列芯片捕获方法。对样品中的CTCs进行采集后，还需要进一步对肿瘤细胞进行检测或鉴别，其中，采用荧光染料对肿瘤细胞进行染色从而实现癌细胞计数或相关信息鉴别是本领域常用的检测方法，可用于肿瘤细胞原位癌鉴定、观察抗肿瘤药物对肿瘤细胞的抑制作用，对其形态的影响等。
核酸适配体(Aptamer)是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，它的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台。将适配体与荧光纳米探针结合应用于蛋白和细胞传感器的研究是一种富有前景的肿瘤细胞识别和检测技术。
发明内容
针对上述研究背景，发明人认为在某些研究情况下，需要从多种肿瘤细胞中进行特定的肿瘤细胞的筛选甚至不同肿瘤细胞的同时染色，因此，需要建立一个能够同时识别多种肿瘤细胞的荧光染色方法。为了实现该技术效果，本公开提供了一种能够对不同来源的进行肿瘤细胞进行特异性筛选的染色探针组合，可实现乳腺癌细胞和肝癌细胞的同时染色，特异性良好；另外，本公开将皮下接种癌细胞的小鼠作为模型捕捉其血液循环中的循环肿瘤细胞对染色探针的能力进行检测，结果表明本公开提供的染色探针可检测到接种第七天血液中的循环肿瘤细胞，具有良好的检测灵敏性。
针对以上技术效果的阐述，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一种用于混合肿瘤细胞染色的探针组合，所述探针组合包括一种乳腺癌细胞染色探针和一种肝癌细胞染色探针，所述乳腺癌细胞染色探针为荧光染料标记的雌激素适配体，所述肝癌细胞染色探针为荧光染料标记的肝癌细胞适配体。
优选的，所述雌激素适配体序列为：
5’-CCCGGCATGGTTGCGGAGCAGGAGTATAACACTACCATTG-3’。
优选的，所述肝癌细胞适配体序列为：
5’-ATGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGTGCGCGCATAGCGCGCTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAACCAT-3’。
优选的，所述乳腺癌细胞染色探针采用ROX染料标记；进一步的，所述雌激素适配体在5’端连接ROX染料。
优选的，所述染色探针采用Cy5荧光染料标记；进一步的，肝癌细胞适配体在5’端连接Cy5染料。
上述雌激素适配体名称为ROX-ER aptamer，肝癌细胞适配体名称为Cy5-ZY1-AAPaptamer。
为了实现对混合样品中不同来源的肿瘤细胞能够实现同时染色，进行特异性区分，发明人设计采用荧光染料标记的适配体作为探针实现同时染色的效果。上述探针组合中的雌激素适配体引用自Arghya Sett等人的研究，肝癌细胞适配体引用周玉的研究，经过发明人的筛选，发现上述适配体在同时染色时具有良好的特异性识别效果，不会出现交叉染色的情形，能够很好的从多种细胞中将相应的肿瘤细胞通过染色的方式筛选出来。采用上述染色探针的组合进行对混合样品中不同来源的肿瘤细胞进行识别具有重要的意义。
本公开第二方面，提供第一方面所述的探针组合在混合样品中肿瘤细胞筛选方面的应用。
优选的，所述肿瘤细胞筛选为对乳腺癌细胞和肝癌细胞的筛选。
本公开第三方面，提供一种癌症早期诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述所述探针组合。
本公开提供的探针应用于肿瘤早期诊断具有重要的应用意义，发病早期，病人血液循环系统中肿瘤细胞数量较低，且在不明确是何种癌细胞的前提下，本公开提供的检测试剂盒可以同时检测两种癌症，并且经试验验证，本公开提供的染色探针能够检测并对接种七天小鼠血液循环系统中的肿瘤细胞进行染色，证明该探针应用于人体早期癌症的检测有望在癌症早期检测到血液循环中的癌细胞并对原发病灶的鉴定提供信息。
优选的，所述试剂盒中还包括酶标板、洗脱液、免疫荧光染色试剂。
进一步优选的，所述免疫荧光染色试剂包括固定液、透膜液、清洗液及DAPI染料。
本公开第四方面，提供一种对肿瘤细胞染色方法，该染色方法采用第一方面所述所述探针组合对样品中肿瘤细胞进行染色。
优选的，所述染色时间为1～2h。
优选的，所述雌激素适配体染色浓度为0.03～0.08μM。
优选的，所述肝癌细胞适配体染色浓度为0.2～0.35μM。
发明人在研究过程中，针对上述探针组合的染色条件做了进一步的优化，采用上述染色条件对混合样品中的肿瘤细胞进行染色，可以很好的实现样品中乳腺癌细胞与肝癌细胞的完全染色及同时染色，节约实验的时间和试剂。并且本公开优化了染色浓度，比现有技术中采用的染色浓度更低，可以节约适配体的用量。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.本公开提供的肿瘤细胞染色探针采用了高特异性的荧光修饰适配体，突破了传统抗体染色亲和力底的技术难点，荧光适配体可进行同时染色，节约了染色时间，可同时捕捉样本中的多种肿瘤细胞，实现快速检测。
2.采用皮下接种肿瘤细胞的小鼠作为动物模型对本公开的捕获探针进行检验，实验结果证明该捕获探针具有良好的灵敏度，小鼠接种肿瘤细胞后七天即可在血液循环系统中捕捉到循环肿瘤细胞。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中采用捕获探针对肿瘤细胞进行特异性捕获及鉴别的流程图；
图2为实施例1中不同种类适配体染色效果图；
图3为实施例1中不同浓度的适配体染色效果图；
图4为实施例1中DAPI、ROX、MERGE不同染色时间的染色效果图；
图5为实施例1中DAPI、Cy5、MERGE不同染色时间的染色效果图；
图6为实施例1中为染色顺序优化效果图；
图7为实施例1中体外共染色效果图；
图8为实施例1中的在体捕获效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，及时发觉原位癌阶段的肿瘤病灶有利于及早开展对肿瘤的治疗，以免错失最佳治疗时机。而原位癌肿瘤往往体积较小，难以被病患察觉，血液中游离的肿瘤细胞数目较少，为肿瘤的早期诊断带来了技术难度。为了解决该问题，本公开提供了一种能够实现不同来源的肿瘤细胞同时染色的探针组合，并对肿瘤细胞同时染色的条件进行了优化，可同时捕获两种癌细胞并对原发病灶进行定位，应用于肿瘤早期诊断具有重要意义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一、实验步骤
1.小鼠乳腺癌，肝癌双肿瘤模型的构建
本实施例中采用8周以上的雌性Balb/c裸鼠，于小鼠右腋下皮下接种小鼠MCF-7乳腺癌细胞悬液100mL，左后肢皮下接种小鼠SMMC-7721肝癌细胞悬液100mL。
小鼠饲养环境稳定，无菌环境，室温温度维持在25℃，通风，垫料隔天换一次，饲喂标准灭菌鼠粮，保持饮水充足。每一组的小鼠体重、体型、动物活力均保持一致。
2.荧光探针的优化
对乳腺癌荧光探针进行了种类和浓度的优化，选出了最优探针和最适浓度。对荧光探针的染色时间和染色顺序进行了优化。
3.小鼠肿瘤模型外周血中循环肿瘤细胞的在体捕获
将小鼠置于小鼠固定器中，尾巴露出，用留置针穿刺小鼠尾部的任意一条尾源静脉，保持留置针软管全部在血管中。静置捕获2h后取出。使用200μL PBS冲洗留置针软管，将吸附在软管上的细胞冲洗到酶标板中，静置30min后进行免疫荧光染色。
4.循环肿瘤细胞免疫荧光染色鉴别
①轻轻吸净酶标板孔中液体。
②加入固定液，室温固定15min。
③吸除固定液，加入透膜液，室温下透膜25min。
④吸除透膜液，使用清洗液冲洗三遍。
⑤吸除清洗液，30μL anti-CD45-FITC溶液，37℃避光孵育2h。
⑥吸除抗体溶液，同时加入等量的肝癌适配体和乳腺癌适配体，4℃避光孵育1.5h。
⑦加入DAPI溶液，室温避光孵育10min。
⑧将酶标板置于荧光倒置显微镜下观察计数
5.循环肿瘤细胞的鉴别
在本实施例中，CTC的鉴别：SMMC-7721细胞被连有Cy5的适配体标记，在波长649nm的激光激发下发射红光；MCF-7细胞被连有ROX的适配体标记，在波长575nm的激光激发下发射黄光；白细胞特异性抗体：CD45抗体被FITC标记，在波长488nm的激光激发下发射绿光。采用DAPI染色CTCs和白细胞的细胞核，在340nm激光激发下发射蓝光。
二、结果
1.荧光探针种类优化
利用ROX修饰的雌激素受体的抗体、muc-1适配体和雌激素受体的适配体进行染色探针的选择，发现雌激素受体的适配体的染色效果比较均匀，特异性强，故选择雌激素受体的适配体作为乳腺癌细胞特异性染色探针。(图2)
2.荧光探针浓度优化
肝癌适配体采用了文献中给出的最优浓度，乳腺癌适配体文献中没有给出最优浓度，根据所查文献，设置了0.01μM，0.05μM，0.1μM几个浓度，0.05μM的适配体浓度即可获得较好的染色效果，因此选择0.05μM的浓度作为乳腺癌细胞染色浓度。(图3)
3.染色时间优化
根据文献所给时间，设置了0.5h,1h,1.5h,2h四个时间，1.5h的适配体染色时间即可获得较好的染色效果，因此选择乳腺癌细胞的染色时间为1.5h。(图4)
4.染色顺序优化
两种适配体的加入顺序不影响染色结果，为节约时间，采用同时加入的方法进行染色。(图5)
5.乳腺癌、肝癌细胞体外共染色
采用雌激素受体适配体0.05μM，SMMC-7721适配体0.25μM对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞SMMC-7721进行染色1.5h,获得了良好的染色结果。(图6)
6.在体捕获染色结果
七天为一个时期，利用留置针对乳腺癌肝癌双肿瘤小鼠进行CTC细胞捕获，可成功实现对乳腺癌CTC和肝癌CTC的捕获。利用共染色的方法，可成功实现不同CTC来源的特异性染色。(图7)
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于混合肿瘤细胞染色的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括一种乳腺癌细胞染色探针和一种肝癌细胞染色探针，所述乳腺癌细胞染色探针为荧光染料标记的雌激素适配体，所述肝癌细胞染色探针为荧光染料标记的肝癌细胞适配体。
2.如权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述雌激素适配体序列为：
5’-CCCGGCATGGTTGCGGAGCAGGAGTATAACACTACCATTG-3’。
3.如权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述肝癌细胞适配体序列为：
5’-ATGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGTGCGCGCATAGCGCGCTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAACCAT-3’。
4.如权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述乳腺癌细胞染色探针采用ROX染料标记；优选的，所述雌激素适配体在5’端连接ROX染料。
5.如权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述染色探针采用Cy5荧光染料标记；优选的，肝癌细胞适配体在5’端连接Cy5染料。
6.权利要求1-5任一项所述的探针组合在混合样品中肿瘤细胞筛选方面的应用；优选的，所述肿瘤细胞筛选为对乳腺癌细胞和肝癌细胞的筛选。
7.一种癌症早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-5任一项所述的探针组合。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶标板、洗脱液、免疫荧光染色试剂；优选的，所述免疫荧光染色试剂包括固定液、透膜液、清洗液及DAPI染料。
9.一种对肿瘤细胞染色方法，其特征在于，所述方法权利要求1-5任一项所述的探针组合对样品中的肿瘤细胞进行染色。
10.如权利要求9所述的染色方法，其特征在于，所述染色时间为1～2h；或所述雌激素适配体染色浓度为0.03～0.08μM；或所述肝癌细胞适配体染色浓度为0.2～0.35μM。
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