CN104109667A - 一种核酸片段及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了所述核酸片段在制备诊断乳腺癌和/或子宫内膜癌的试剂中的用途，以及由该诊断试剂组成的试剂盒。本发明还公开了该核酸片段在制备雌激素受体拮抗剂中的用途，可用于制备治疗乳腺癌的药物，具有实际应用价值。

Description

一种核酸片段及其用途

技术领域

本发明涉及一种核酸片段及其用途。

背景技术

自20世纪70年代末开始，乳腺癌的发病在全球范围内一直位居女性肿瘤的首位，我国虽不是乳腺癌的高发国家，但发病率却呈逐年上升的趋势。根据雌激素受体(ER)表达情况，乳腺癌可分为雌激素受体依赖性乳腺癌和非激素受体依赖性乳腺癌。雌激素受体依赖性乳腺癌表达雌激素受体，并依赖雌激素生长，对激素敏感、抗性弱，可以采用抗雌激素药物治疗，而非激素受体依赖性乳腺癌不表达雌激素受体，不依赖雌激素生长，对激素的敏感性差、抗性强，不能采用抗雌激素药物治疗。据研究，约70％的乳腺癌为雌激素受体依赖性乳腺癌，因此，检测乳腺癌组织中的雌激素受体表达情况，确定乳腺癌是否为雌激素受体依赖性乳腺癌，对治疗和预后具有重要意义。

子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤，发病率仅次于子宫颈癌。根据雌激素受体表达情况，子宫内膜癌可分为雌激素受体依赖性子宫内膜癌和非激素受体依赖性子宫内膜癌。雌激素受体依赖性子宫内膜癌的预后较好，而非激素受体依赖性子宫内膜癌的预后较差。据研究，约80％的子宫内膜癌为雌激素受体依赖性子宫内膜癌，因此，检测子宫内膜癌组织中的雌激素受体表达情况，确定乳腺癌是否为雌激素受体依赖性子宫内膜癌，对治疗和预后具有重要意义。

现有的雌激素受体检测方法通常采用雌激素和雌激素受体抗体进行检测，其中，雌激素因分子量太小，不能用于免疫组化检测乳腺癌和子宫内膜癌组织，难以有效定位，雌激素受体抗体可以用于免疫组化检测，但是抗体生产是一个耗费时间的复杂过程，而且需要动物养殖和/或细胞培养的设施。因此，急需一种更容易和更少代价的方法来对乳腺癌中ER进行检测。

雌激素依赖性乳腺癌的治疗方式众多，包括外科治疗、化学治疗、放射治疗和中医中药治疗，其中，抗雌激素药物是最重要的治疗药物之一，其可以通过消除雌激素与雌激素受体的相互作用促使癌细胞凋亡，包括雌激素受体拮抗剂例如它莫西芬，芳香化酶抑制剂如依西美坦等。它莫西芬是目前最为常见的雌激素依赖性乳腺癌治疗药物，它通过竞争性结合雌激素受体，抑制雌激素与雌激素受体结合，治疗乳腺癌。然而，使用它莫西芬存在严重的耐药性，因而需要开发新的抗雌激素药物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明涉及一种核苷酸序列及其用途，具体涉及一种能够与雌激素受体特异性结合的核酸适体，及其在制备诊断乳腺癌和/或子宫内膜癌的试剂中的用途和制备雌激素受体拮抗剂中的用途。

本发明公开的的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述核酸片段是雌激素受体的核酸适体(Aptamer)(即ER-Aptamer)，对雌激素受体有高亲和力。

核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的核酸片段。

本发明还提供了所述核酸片段在制备诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂中的用途。优选地，所述诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂是诊断雌激素受体依赖性乳腺癌或雌激素受体依赖性子宫内膜癌的试剂。

雌激素受体依赖性乳腺癌，是指表达雌激素受体的乳腺癌。

雌激素受体依赖性子宫内膜癌，是指表达雌激素受体的子宫内膜癌。

一种诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂，它是含有标记物的权利要求1所述的核酸片段，所述标记物为生物素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、地高辛或荧光素。

一种检测乳腺癌和/或子宫内膜癌的试剂盒，包括前述诊断试剂。

优选地，它包括生物素标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸片段、链亲和素-辣根过氧化物酶和DAB溶液；

或者，它包括辣根过氧化酶标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸片段和DAB溶液。

DAB溶液，即二氨基联苯胺溶液。

所述的核苷酸序列在制备雌激素受体拮抗剂中的用途。

所述雌激素受体拮抗剂是治疗雌激素受体依赖性乳腺癌的药物。

雌激素受体拮抗剂，是指竞争性结合雌激素受体，抑制雌激素与雌激素受体结合的物质。

本发明核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ER-核酸适体，与ER分子的亲和力与雌激素相当，且其分子量大，可以用于免疫组化检测表达雌激素受体的组织和/或细胞，如乳腺癌和子宫内膜癌，同时，其还是一种雌激素受体拮抗剂，可以有效抑制乳腺癌细胞的增殖，是一种新的乳腺癌的治疗药物，同时，本发明核酸片段的制备方法简单，成本低廉。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1表示生物素标记的寡核苷酸与从MCF-7乳腺癌细胞株制备的雌激素受体(ER)结合的饱和曲线。

图2图1所示饱和曲线的斯卡查德(Scatchard)作图，分析寡核苷酸与雌激素受体结合的亲和度和结合量。根据斯卡查德公式，BS＝BT–BN，结果以图形方式表示，其中BT为总结合，BN为非特异性结合，BS为特异性结合。根据曲线的斜率和在横轴上的截距计算出寡核苷酸与雌激素受体结合的解离常数(Kd)和结合量(Bmax)。该图为一个代表性的试验，该实验重复3次。

图3生物素标记核苷酸序列和特异的抗ER单克隆抗体对乳房癌组织的免疫染色比较。乳腺癌入选病例为已经病理学检测确认的癌症病例。第一行是用生物素标记核苷酸序列的乳房癌免疫染色，第二行是用抗ER单克隆抗体的乳腺癌免疫染色。该图显示该寡核苷酸和抗体均识别相同的癌细胞，但不识别相邻的非肿瘤组织。所有的照片都是在光学显微镜×200的放大倍率下拍摄。

图4使用合成的生物素标记寡核苷酸对石蜡包埋的乳腺癌和子宫内膜癌组织切片进行免疫染色。A和E分别是子宫内膜癌和乳腺癌的样本；用生物素标记寡核苷酸+streptoavidin-HRP染色。B和F分别为子宫内膜癌和乳腺癌阴性对照；仅用streptoavidin-HRP染色。C和G分别为子宫内膜癌和乳腺癌阴性对照；将生物素标记寡核苷酸与纯化ER蛋白进行预孵育，然后再应用到切片上。D和H分别为子宫内膜癌和乳腺癌阴性对照；将生物素标记的对照DNA寡核苷酸(与ER-核酸适体的序列长度相同)应用到切片上。入选病例为已经病理学检测确认的癌症病例。该图显示生物素标记的核苷酸序列特异性地定位组织切片中的肿瘤细胞，但不与相邻的非恶性组织发生交叉反应，而乳腺癌和子宫内膜癌的阴性对照切片均未见特异性染色。所有图像均是光学显微镜×200的放大倍率下拍摄。

图5从10到1000μM时，它莫西芬(□)或ER-核酸适体对MCF-7细胞增殖存在剂量依赖性影响。细胞增殖的用MTT法测定。数据取3次重复测量的均数±SE。未处理的对照定义为100％，细胞增殖的百分比与对照比较。*与对照组相比时P<0.05。

图6ER-核酸适体(A)和它莫西芬(B)对雌激素诱导的MCF7细胞增殖的拮抗作用。雌二醇以剂量依赖的方式增加MCF7细胞的增殖(柱形图)，而ER-核酸适体或它莫西芬(○)可抑制雌二醇作用。细胞增殖采用MTT法检测。数据取3次重复测量的均数±SE。未处理的对照定义为100％，细胞增殖的百分比与对照比较。*与雌二醇处理相比时P<0.05。

具体实施方式

实施例1本发明核酸片段(ER-核酸适体)的制备及其与雌激素受体的结合能力鉴定

1、本发明雌激素受体的核酸适体的制备

采用体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选雌激素受体的核酸适体，得到一个与雌激素受体具有高亲和力的核酸片段，其序列(SEQ IDNO.1)如下：

5'-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCA AAGTTAATG-3′。

送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、核酸适体与雌激素受体结合能力的验证

为了测定上述SEQ ID NO.1所示核酸适体与雌激素受体的亲和力，采用基于ELISA的配体-受体结合测定方法测定。

实验步骤：

(1)对合成的SEQ ID NO.1所示ER-核酸适体的5'末端进行生物素标记。

(2)MCF-7细胞匀浆细胞质总受体蛋白从培养的获得：将MCF-7细胞在细胞溶质制备缓冲液(10mM的Tris-HCl，pH值7.5，1mM的EDTA，1mM的二硫苏糖醇(DTT)，10％甘油，150mM的谷氨酸钾和Sigma蛋白酶抑制剂混合物)中匀浆，再采用高速(10,000g)，低温(4℃)离心1h而获得细胞质总受体蛋白。

(3)将步骤(2)的提取物包被在96孔的酶标板(2μg/孔)。加入不同浓度生物素标记的核酸适体或雌二醇，在37℃孵育1小时。所有的浓度均做复孔。未结合的核酸适体通过用PBS-吐温洗液洗涤4次除去。再用Streptavidin-辣根过氧化物酶(HRP)结合物与结合的核酸适体中生物素反应。以TMB作为底物，比色确定核酸适体的结合值。生物素标记的核酸适体与受体的特异性结合值则是将总的结合值(无未标记的核酸适体或雌二醇)减去非特异性结合值(加入100倍未标记的核酸适体或雌二醇)确定。

(4)根据斯卡查德(Scatchard)方程，将得到的数据进行作图。对结合亲和力(Kd)和能力(结合位点的数目)进行计算，得到生物素标记的核酸适体与ER结合得的亲和力和最大结合量。

实验结果：

生物素标记的ER-核酸适体与ER结合的饱和曲线见图1，生物素标记的ER-核酸适体结合的Scatchard作图见图2。

如图1～2所示，生物素标记的ER-核酸适体与ER复合物的解离常数(Kd)为0.34±0.05nM(n＝3；r＝0.989)。该Kd值与已报道的雌激素在乳腺癌MCF-7细胞结合值相吻合(0.35nM+0.05)(Wooge C.H.,Nilsson G.M.,HeiersonA.,McDonnell D.P.,Katzenellenbogen B.S.Structural requirements for highaffinity ligand binding by estrogen receptors:a comparative analysis of truncatedand full length estrogen receptors expressed in bacteria,yeast,and mammaliancells.Mol Endocrinol.1992；6:861-869)

实验结果说明，本发明SEQ ID NO.1所示ER-核酸适体与雌激素受体(ER)结合具有非常强的亲和力，与雌激素相当，是一种检测表达雌激素受体的组织或细胞的诊断试剂。

实施例2本发明检测试剂盒

1、试剂盒一

试剂盒组成(50人份)：

试剂盒使用方法：

(1)制备待见组织样品切片；

(2)用DNA-蛋白结合缓冲液配置生物素标记的ER-核酸适体，与步骤(1)制备的切片在4℃孵育过夜。然后用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)进行洗涤；

(3)再将Streptavidin-辣根过氧化物酶(HRP)结合物(Sigma Chemical Co,St.Louis,Mo,USA)用PBS缓冲液稀释成1：1000，与切片中结合的生物素标记的ER-核酸适体反应。用DAB过氧化物酶底物溶液(Dako,Denmark A/S)显色。

(4)光学显微镜下观察。

2、试剂盒二

试剂盒组成(50人份)：

试剂盒使用方法：

(1)制备待见组织样品切片；

(2)用DNA-蛋白结合缓冲液配置HRP标记的ER-核酸适体，与步骤(1)制备的切片在4℃孵育过夜。然后用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)进行洗涤；

(3)用DAB过氧化物酶底物溶液(Dako,Denmark A/S)显色。

(4)光学显微镜下观察。

3、试剂盒三

试剂盒组成(50人份)：

试剂盒使用方法：

(1)制备待见组织样品切片；

(2)用DNA-蛋白结合缓冲液配置荧光素标记的ER-核酸适体，与步骤(1)制备的切片在37℃孵育1小时。然后用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)进行洗涤；

(3)再用伊文氏蓝液衬染1-3分钟；最后用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)进行洗涤。

(4)荧光显微镜下观察。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1乳腺癌和子宫内膜癌的检测实验

ER-核酸适体：本发明实施例1制备的核酸片段。

1、实验步骤：

(1)切片制备：将4μm厚的石蜡包埋组织块的切片固定在聚赖氨酸包被的载玻片上；经过二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；然后在10nmol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中120℃(高压灭菌锅)5分钟进行抗原修复处理；内源性过氧化物酶活性阻断用含有叠氮钠的0.03％过氧化氢溶液，室温下放置30分钟。

(2)将生物素标记的ER-核酸适体用DNA-蛋白结合缓冲液(0.01MTris-盐酸，pH7.5，1mM的氯化镁，0.5mM的DTT，0.5mM的EDTA和50nMNaCl)配制(1：50),即取10μl的生物素标记的ER-核酸适体加入到490μl的DNA-蛋白结合缓冲液中，混匀。与步骤(1)制备的切片在4℃孵育过夜。然后用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)进行洗涤。

(3)再将Streptavidin-辣根过氧化物酶(HRP)结合物(Sigma Chemical Co,St.Louis,Mo,USA)用PBS缓冲液稀释成1：1000，与切片中结合的生物素标记的ER-核酸适体反应。用DAB过氧化物酶底物溶液(Dako,Denmark A/S)显色。

(4)切片最后用稀苏木素复染，并装入甘油明胶保存。

(5)将切片在光学显微镜下检测ER-核酸适体的结合位点和结合强度。

为了验证分析，将购自Dako公司(Dako,Copenhagen,Denmark)的单克隆小鼠抗人ER特异性抗体的免疫染色作为标准对照。

此外，将生物素标记的ER-核酸适体与纯化ER蛋白进行预孵育，然后再应用到切片上，以及将生物素标记的对照DNA寡核苷酸(与ER配体相同的序列长度)应用到切片上已证明生物素标记的ER-核酸适体结合的特异性。

在上述两种实验中，乳腺癌和子宫内膜癌的切片均未见特异性染色(图2)。

所有患者的石蜡包埋组织切片标本和临床文件均由病理科获得，根据四川省人民医院审查委员会批准协议。总样本包括乳腺癌(N＝5)，子宫内膜癌(N＝5)，及不同的正常组织。

2、实验结果：

如图3所示，本发明ER-核酸适体的检测结果与阳性检测药物——单克隆小鼠抗人ER特异性抗体的结果一致，说明本发明ER-核酸适体可以用于免疫有效检测表达雌激素受体(ER)的组织，准确定位雌激素受体依赖性乳腺癌和子宫内膜癌。

如图4所示，采用本发明ER-核酸适体可以有效检测出乳腺癌和子宫内膜癌，而不采用本发明ER-核酸适体或者采用其他相同长度的核酸片段，则难以有效检出，采用雌激素受体(ER)与本发明ER-核酸适体结合后，也难以有效检出，说明本发明ER-核酸适体是通过结合雌激素受体来标记乳腺癌和子宫内膜癌，达到检测的目的。

实验结果说明：本发明ER-核酸适体可以有效标记雌激素受体(ER)，检测表达雌激素受体的组织或细胞，可制备成为雌激素受体依赖性乳腺癌和子宫内膜癌的检测试剂。

实验例2本发明ER-核酸适体对乳腺癌细胞的拮抗作用

ER-核酸适体：本发明实施例1制备的核酸片段。

1、实验步骤：

(1)将MCF-7细胞用RPMI-1640培养基(含10％FCS和50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素)在,37℃、5％CO₂以及饱和湿度环境下培养。

(2)该ER-核酸适体和为确定该ER-核酸适体是否对细胞增殖产生影响，将细胞用含有不同剂量的ER-核酸适体进行处理，同时，将临床上常用的雌激素受体拮抗剂“它莫西芬”(Sigma,St Louis,MI,USA)作为阳性对照，将无血清的培养基培养的细胞作为阴性对照。

a.剂量依赖性的研究：用不同浓度的ER-核酸适体或它莫西芬处理72小时后，测定细胞存活率。

b.时间-进程研究：用ER-核酸适体或它莫西芬处理24,48和72h小时后，分别测定细胞存活率。

c.竞争性实验：对含有100μM ER-核酸适体或100μM它莫西芬细胞培养液中同时加入不同浓度的雌激素，培养72h后，测定分别测定细胞存活率。

以上实验至少重复三次。

(3)采用3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)方法测定细胞存活率。检测根据MTT试剂盒(Promega,2800 WoodsHollow Road Madison,WI 53711,USA)制造商的说明书进行。即：

在培养后除去培养基。每孔加入200μl MTT溶液，孵育4小时。然后将MTT溶液除去，加入100μl/孔二甲亚砜(Sigma)，室温下孵化0.5小时。用酶标仪(Dynatech,Chantilly,VA,USA)在A570吸光度读数。取3孔取其平均值。未处理的对照组O.D值作为100％的存活率。抑制百分比可以计算为细胞存活率(％)＝100(T-B)/(U-B)，其中T(已处理)是药物处理的细胞吸光度，U(未处理)是未经处理的细胞吸光度，B(空白)是在不存在药物和MTT的吸光度。

(4)数据统计分析

使用SPSS软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。由于数据没有违反方差齐性和正态分布的假设，在剂量依赖性，时间依赖性和雌二醇竞争实验中均使用方差分析。如果差异显著，数据再进行组与组比较。P<0.05被认为统计学上显著差异。

2、实验结果：

培养72小时后，与未处理细胞相比，ER-核酸适体对MCF-7细胞的增殖存在剂量依赖性的抑制影响(图5，P<0.0001)。与未处理组比较，10，100和1000μM剂量的ER-核酸适体能够分别抑制6％，13％和38％癌细胞生长。同时，他莫昔芬(TAM)也能抑制起细胞增殖。与未处理组比较，10，100和1000μM剂量的他莫昔芬分别抑制19％，35％和36％癌细胞生长(P<0.0001，图5)。此外，他莫昔芬在10和100μM剂量时，与相同的剂量的ER-核酸适体相比，具有更强的抑制效果(10μM他莫昔芬与10μMER-核酸适体相比：p＝0.049，100μM他莫昔芬与100μMER-核酸适体相比：P＝0.002)。在1000μM剂量时，他莫昔芬和ER-核酸适体对MCF-7细胞增殖抑制无显著差异。实验结果说明，本发明ER-核酸适体可以有效抑制乳腺癌细胞的增殖，且在高剂量下，抑制效果还略优于阳性药物他莫昔芬。

为了确定ER-核酸适体对MCF-7细胞增殖的抑制效应是否是针对ER选择性拮抗作用，进行了雌二醇竞争实验。如图6，雌二醇以剂量依赖的方式增加了MCF-7细胞增殖率；加入100μM ER-核酸适体或它莫西芬后，能明显抑制由雌二醇引起的细胞增殖，ER-核酸适体与它莫西芬的拮抗活性无显著差异。实验结果说明，本发明ER-核酸适体是一种雌激素受体拮抗剂。

实验结果说明，本发明ER-核酸适体是一种雌激素受体拮抗剂，通过竞争性结合雌激素受体，阻止雌激素与雌激素受体结合，抑制乳腺癌细胞增殖，是一种潜在的乳腺癌辅助治疗药物。

综上，本发明核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸片段为ER-核酸适体，与ER分子具有很高的亲和力，可以检测表达雌激素受体的组织和/或细胞，如乳腺癌和子宫内膜癌，其还是一种雌激素受体拮抗剂，可以通过竞争性结合雌激素受体，阻止雌激素与雌激素受体结合，抑制乳腺癌细胞的增殖，为临床提供了一种新的治疗乳腺癌的药物，同时，ER-核酸适体的制备方法简单，成本低廉。

Claims (8)

1.一种核酸片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的核酸片段在制备诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂是诊断雌激素受体依赖性乳腺癌或雌激素受体依赖性子宫内膜癌的试剂。

4.一种诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂，其特征在于：它是含有标记物的权利要求1所述的核酸片段，所述标记物为生物素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、地高辛或荧光素。

5.一种检测表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求4所述的试剂。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：它包括生物素标记的权利要求1所述的核酸片段、链亲和素-辣根过氧化物酶和DAB溶液；

或者，它包括辣根过氧化酶标记的权利要求1所述的核酸片段和DAB溶液。

7.权利要求1所述的核酸片段在制备雌激素受体拮抗剂中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述雌激素受体拮抗剂是治疗雌激素受体依赖性乳腺癌的药物。