CN101120100A - 通过包括转录因子测定的生物标志分析描绘肿瘤的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于与肿瘤发生相关的生物标志的检测和/或定量的方法和试剂盒(或装置)。所述方法方便地用于建议或修改将向受试者施用的抗肿瘤治疗方案。此外，所述方法和试剂盒(或装置)是用于新化合物鉴定的技术平台，其优选地在抗肿瘤治疗方案的特定步骤中使用。

Description

通过包括转录因子测定的生物标志分析描绘肿瘤的方法和试剂盒

发明领域

[0001]本发明涉及用于与肿瘤发生相关的生物标志的检测和/或定量的方法和试剂盒(或装置)。

[0002]所述方法方便地用于建议或修改将向受试者施用的抗肿瘤治疗方案。

[0003]此外，所述方法和试剂盒(或装置)是用于新化合物鉴定的技术平台，其优选地在抗肿瘤治疗方案的特定步骤中使用。

发明背景

[0004]尽管通过科学界、医药界的持续的和联合的抗癌努力，但是西方国家内大部分人将患有并死于该疾病。

[0005]一旦检测出肿瘤，标准的首要治疗通常依靠化疗和放射治疗的结合。不幸地，该治疗方案的成功主要受到开始出现抗性的限制，其对于疾病晚期的患者几乎是不可避免的。

[0006]在过去的十年中已经进行了大量的努力来了解这个几乎普遍问题背后的分子理论基础。它们已导致可能对所观察到的副作用起主要作用的分子靶(肿瘤生物标志)的鉴定。现在将在某些肿瘤中存在这些关键生物标志和肿瘤对特定治疗的反应性联系起来提供了很大的希望，不久可为每个患者建议针对每个肿瘤设计的治疗方法。

[0007]这些预后性和预测性生物标志主要包括癌基因、肿瘤抑制基因、血管生成和抗血管生成因子，以及在增殖级联和凋亡途径中所涉及的蛋白质，并且许多涉及转录因子。这类分子生物标志的鉴定已经使许多制药公司积极研发了许多新的活性剂，其中的几个已进入临床试验。这些治疗剂和预防剂，其中小分子量抑制剂、单克隆抗体、反义寡核苷酸，以及基因治疗工具，有待单独地以及与细胞毒性化疗相结合进行评价。理解肿瘤对治疗的反应程度取决于生物标志的存在，将有助于预测治疗的效果并选择对每个患者最适当的治疗。

[0008]然而，似乎每种癌症，甚至每个肿瘤，都有其自身的生物学特征。因此，显示对特定肿瘤具有预后价值的生物标志可能完全不能预测另一肿瘤的临床结果。靶向生物靶的治疗因此将证明仅在其生存取决于该靶的那些肿瘤中是有效的。

[0009]这用前凋亡的p53，一种称作肿瘤抑制蛋白的转录因子，来充分说明，其活性在许多肿瘤中是缺乏的。肿瘤中p53活化状态具有直接的治疗结果，因为多数首要化疗依赖于细胞毒性分子，其功效附属于功能性凋亡途径。因此已经出现了越来越多的靶向p53的新的治疗分子作为经典治疗的选择方案。然而，p53缺乏可源于其分子生物学的极其不同的方面，因此，每个治疗分子仅靶向特定的缺陷。因此，p53合成的缺乏可暂时地通过相应基因的腺病毒递送得到补偿；由某些肿瘤产生含有修饰的DNA结合位点的突变p53可通过设计的用于改变该转录因子结构并且恢复其DNA结合能力的小分子化合物的递送而避免；由于该因子的鳌合，即，通过Mdm2蛋白，而引起的p53活性的缺乏，可通过使用干扰该蛋白质-蛋白质相互作用的小拮抗剂来阻止，从而释放该因子并恢复其活性。

[0010]在开始任何治疗前获得几条关于激素依赖性肿瘤的状态的信息也可能对该治疗的成功或失败具有高度影响。

[0011]这用乳腺癌来充分说明，对乳腺癌来说，最有效的系统治疗依赖于内分泌治疗如施用他莫西芬(Novaldex^)。然而，有效性依赖于是否存在功能性雌激素受体α(ERα)，其在疾病晚期患者中几乎普遍缺乏。此外，内分泌抗性也可能出现在显示阳性ERα表达的肿瘤中。ErbB2(四种质膜酪氨酸激酶受体家族的成员)的过量表达现在被认为是介导该内分泌抗性的一般参与者。然而，目前，还没有建议在单一测定中同时评估ERα和ErbB2状态以预测内分泌治疗的潜在成效。更重要地，甚至证明了向具有ErbB2阳性肿瘤的患者施用他莫西芬比接受安慰剂的那些情况更糟(Hu，J.C.C.&Mokbel，K.，Eur.J.Surg.Oncol.2001，27：335-337)。因而不应当建议仅在单独表达相应蛋白时使用ERα或ErbB2靶向剂。该情形可能甚至由于其它参与者的介入而变得更复杂：作为一个实例，可能在缺乏ErbB成员过量表达的任何证据时发生内分泌抗性。已暗示ErbB信号级联放大的下游靶的过量表达或更确切地过度活化，其可能与ER途径相交。已建议雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)，一种多重有丝分裂信号传导途径中的关键中间体，作为这种靶。然而，一直没有描述肿瘤中的几个生物标志，如ERα、ErbB2和mTOR的协同分析用于预后和预测值。

[0012]最后，化疗的成功因而不仅仅依赖于是否可利用新的治疗方案，而且依赖于鉴定具有可预测患者对这些活性剂的反应的生物标志的患者的能力。这些生物标志包括蛋白质，包括DNA结合蛋白如转录因子，或者它们的任何修饰，其可能在治疗肿瘤学中具有预测价值。

[0013]转录因子作为生物标志起关键的作用，因为许多证据现在指向作为许多癌症的肿瘤发生过程中的主要参与者的一个或几个转录因子，如上述已用p53和ERα说明。然而，转录因子生物学的几个方面可参与该过程，指向同时评估所有这些的必要性。而且，尽管转录因子的分析对于了解肿瘤发生是必要的，但是由于其必须通过一个或几个(非转录因子)生物标志的分析进行补充，因此似乎是不够的。只有对这些分析进行全面综合才能导致肿瘤状态的成功评估和有利治疗的方向。

[0014]研发能同时检测和/或定量临床样品中包括转录因子的几种预后生物标志的先进测定法以前一直没有描述，但是将会是非常有价值的。

技术发展水平

[0015]在专利申请WO2004/062608中描述了同时检测与患者的肿瘤相关的几种标志。该申请描述了用于医学诊断和治疗的表征癌症肿瘤的测定试剂盒。基于与患者的肿瘤相关的各种生物分子标志(BMM)的检测水平，该试验提供了癌症蛋白模式。该试验适合多孔形式，其中多孔板的每个单孔含有一种对待检测的标志之一特异的捕获蛋白。通过使用检测蛋白，优选地抗体进行检测。

[0016]专利申请US2002/0095073描述了诊断装置的设计和用于确定由患者所显示的一种或多种医学症状的原因的用途。将一系列不同的探针与生物样品接触，其中每个探针都和与症状的不同已知原因相关的靶相互作用，以及同时检测和分析探针与生物样品中存在的靶分子之间的可能的相互作用。

[0017]专利申请WO2002/40716描述了诊断肿瘤疾病的方法。使用一系列特异性试剂检测是否存在肿瘤分子标记物。根据患者的肿瘤分子标记物谱，确定肿瘤亚谱以及开始适当的治疗方案。

[0018]专利申请WO01/73115描述了生物样品中可能存在的一种或多种转录因子的筛选、检测和/或定量方法，通过它们与结合到不溶性固体支持物上的双链DNA序列的结合。

[0019]美国专利6 696 256提供了用于同时鉴定和/或定量生物样品中多重转录因子的方法，通过在可形成DNA探针转录因子复合物的条件下，将双链DNA探针文库与含有转录因子的样品混合。可将已结合到转录因子上的DNA探针与游离探针分离(即，琼脂糖凝聚电泳)并与一系列杂交探针接触。

[0020]然而，该美国专利没有描述用于检测转录因子本身的方法，而是它们的靶DNA序列。同样的DNA序列可结合同一家族的不同转录因子，产生同样的信号，不能报告转录因子的身份。然而，由该方法获得的信号的缺乏不能报告样品中是否缺乏转录因子，或者是否存在无活性的转录因子。

[0021]同样，由该方法所获得的信号的存在不能报告是否存在组成上与DNA结合的转录因子，或者是否存在活性转录因子。

[0022]Magalhaes等人的出版物描述了应激诱导性过早衰老细胞中转录因子的DNA结合活性和基因表达模式的对比。在该出版物中，对于它们的蛋白质水平，没有分析任何一种转录因子的结合能力。

[0023]专利申请WO02/22884描述了用于发现转录因子靶基因的方法，其中将所述基因组织起来形成阵列形式。因此，转录因子的检测仅基于它们的靶基因的检测。

[0024]专利申请WO02/40716描述了诊断肿瘤疾病的方法，包括肿瘤分子标记物的鉴定。通过一系列特异性试剂检测是否存在这些肿瘤分子标记物。基于患者的肿瘤分子标记物谱，确定肿瘤亚谱以及开始适当的治疗方案。

[0025]肿瘤标记物通过免疫测定或通过基因表达模式进行检测。然而，该文献没有提供关于转录因子的DNA结合能力的任何信息。

[0026]专利申请WO02/42775描述了诊断装置的设计和用于确定患者所显示的一种或多种医学症状的原因的用途。将一系列不同的探针与生物样品接触，其中每个探针都和与症状的不同已知原因相关的靶相互作用。

[0027]然而，上述方法中没有一种提供足够的信息以建立从患者中所获得的生物样品的肿瘤谱。

[0028]特别是，这些文献没有提供关于是否存在和可能修饰同一蛋白质的综合信息，所述蛋白质是肿瘤生物标志，更具体地，是用于肿瘤诊断和用于能够选择或拒绝可利用的或试验的抗肿瘤治疗的转录因子。

[0029]这些方法既没有描述也没有暗示在同一诊断试验中转录因子、其它调控蛋白以及一些它们的特征的综合检测以建立肿瘤谱。

发明目的

[0030]本发明的目的是提供用于从受试者，优选地是人类受试者(患者)中所获得的生物样品的肿瘤诊断(即，获得允许临床医生确定特定肿瘤谱的信息)的方法和试剂盒(或装置)，通过样品中存在的肿瘤生物标志(与肿瘤类型相关的生物标志)的检测和/或定量来进行。

[0031]本发明的另一个目的是提供该肿瘤诊断(建立肿瘤谱)的这种方法和试剂盒(或装置)，其允许选择可利用的抗肿瘤治疗，即，最适合用于治疗(或预防发展)该受试者，优选地是人类受试者(患者)所患肿瘤的化合物，以及允许拒绝任何不利的抗肿瘤治疗，以建立诊断和预后分析，研发和/或检验具有抗肿瘤潜能的新的化合物以及监视可利用的抗肿瘤治疗对受试者(患者)的有效性。

发明概述

[0032]本发明涉及一种用于提供从哺乳动物受试者，包括人类患者的肿瘤组织、肿瘤细胞或者液体中获得的生物样品的肿瘤谱的(诊断)方法，通过对该肿瘤谱特异的且样品中存在的肿瘤生物标志的检测和/或定量来进行。

[0033]本发明方法至少包括下列步骤：

a.将该生物样品与直接或间接地同固体支持物结合的捕获探针接触；

b.检测和/或定量由第一捕获探针与是转录因子并且存在于生物样品中的第一肿瘤生物标志的结合所产生的第一信号；

c.检测和/或定量由第二捕获探针与生物样品中存在的转录因子的结合所产生的第二信号，其中第二捕获探针含有特异性结合所述转录因子的双链DNA序列；

d.检测和/或定量由第三捕获探针与不同于转录因子并且存在于生物样品中的(一种或多种)第二肿瘤生物标志的结合所产生的第三信号；

e.可能地检测和/或定量由第四捕获探针与修饰的转录因子的结合所产生的第四信号，该转录因子的修饰影响其活性；

f.可能地检测和/或定量由第五捕获探针与结合到相互作用配偶体(其也可能是转录因子)上的转录因子的结合所产生的第五信号；和，

g.可能地检测和/或定量由第六捕获探针与转录因子的相互作用配偶体(其也可能是转录因子)的结合所产生的第六信号；

其中连续信号(优选地由步骤b)、c)、d)所产生的)的检测和/或定量以及，可能地，由步骤e)、f)、g)所产生的信号的检测和/或定量对应于哺乳动物受试者的生物样品的特异性肿瘤谱。

[0034]在根据本发明的方法中，步骤a)、b)、c)和d)是连续的步骤或者连续的步骤是d、b和c)。

[0035]在根据本发明的方法和试剂盒中，所获得的肿瘤谱提供选择(能选择或拒绝)向哺乳动物受试者(包括人类患者)施用的并且对所表征的肿瘤谱特异的一种或多种适当的抗肿瘤化合物或疗法，其中生物样品是从该受试者中获得的。因此，根据本发明的诊断方法也是一种提供关于将向患特定肿瘤的哺乳动物受试者(包括人类患者)所施用的治疗的信息的方法。

[0036]根据本发明的试剂盒可包括用于进行根据本发明的方法的手段和/或用法说明书，包括用于获得对应于特定肿瘤谱的信号的手段和/或用法说明书，以及使消费者能够选择或拒绝向哺乳动物受试者(包括人类患者)施用的一种或多种适当的抗肿瘤化合物或疗法的手段和/或用法说明书，其中生物样品是从该哺乳动物受试者中获得的。所述化合物或疗法对样品的所表征的肿瘤谱是特异的。

[0037]本发明还涉及一种诊断、定量和/或筛选试剂盒，包括用于进行根据本发明的方法的手段和介质，并且其包括至少三种类型的直接或间接结合到固体支持物上的捕获探针。这些捕获探针包括与转录因子特异性相互作用的第一捕获探针，包含与是转录因子的第一肿瘤生物标志特异性相互作用的双链DNA序列的第二捕获探针以及与不同于转录因子的(一种或多种)第二肿瘤生物标志特异性相互作用的第三捕获探针。

[0038]在根据本发明的方法和试剂盒中，捕获探针优选地是(单克隆)抗体或者其超可变部分、受体或通过具有至少6.80nm长的间隔区方便地与固体支持物表面结合的双链DNA序列。

[0039]根据本发明，影响其活性的转录因子的修饰是翻译后修饰(如转录因子的磷酸化或乙酰化)、突变或截短、转录因子的构象变化或者辅因子与转录因子的结合。优选地，所述的辅因子是辅激活物或辅阻遏物。

[0040]在根据本发明的方法或试剂盒中，通过使用(可能被标记的)针对肿瘤生物标志、修饰的转录因子或者其与捕获探针结合的相互作用的配偶体第一检测分子获得信号的检测和定量。可选择地，第一检测分子可能与被标记的第二检测分子特异性相互作用。

[0041]因此，检测可能是通过被标记的第一检测分子的直接检测或者是通过与被标记的第二检测分子特异性相互作用的第一检测分子的间接检测。

[0042]优选地，检测分子是(可能被标记的)单克隆抗体或(可能被标记的)其超可变部分。

[0043]在根据本发明的方法和试剂盒中，信号优选地是非放射性信号，如选自荧光信号、比色信号、化学发光信号、生物发光信号、电子信号或磁信号的信号。

[0044]优选地，比色信号是由金属沉积物如固体支持物的表面上的银沉积物产生的(优选地由结合到检测分子(抗体)上的胶体金上的银的催化还原所产生)。

[0045]在根据本发明的方法中，转录因子可能是核受体，一种癌基因或肿瘤抑制基因的产物，而不同于转录因子的第二生物标志优选地是在增殖或凋亡级联中所涉及的蛋白质、激酶、磷酸酶、细胞外蛋白质(如细胞因子或生长因子、血管发生或抗血管发生蛋白(优选地选自VEGF、P1GF、PDGF、bFGF、EGF、HGF、TGFβ、IL-6、IL-8、IL-12、血管生成素(angiopoietin)-1、血管生成素-2，血管生成素(angiogenin)、制管张素、内皮抑制素、血小板反应蛋白-1、基质金属蛋白酶或者它们的混合物)。

[0046]更优选地，肿瘤生物标志选自表1、2、3和/或4。

[0047]在根据本发明的方法和试剂盒中，固体支持物由玻璃、塑料或金属材料构成，优选地是多孔板形式。

[0048]在根据本发明的方法和试剂盒中，捕获探针存在于多孔板的一个孔中，或者至少两种不同捕获探针的混合物存在于多孔板的一个孔内。

[0049]固体支持物可能具有任何形式，如圆盘形式或载玻片形式，将捕获探针以阵列形式排列在固体支持物表面上。

[0050]在根据本发明的方法和试剂盒中，捕获探针由核酸(DNA)捕获探针和蛋白质捕获探针构成，将核酸(DNA)捕获探针和蛋白质捕获探针以两个单独的阵列点在同一固体支持物表面上或者结合到两个不同的固体支持物，或者两个以上不同的固体支持物上。

[0051]在根据本发明的方法和试剂盒中，捕获探针可以是通过具有至少6.8nm(优选地至少20，至少50，至少100或150，但是优选地小于1000，小于500和小于200个核苷酸)长的间隔区结合到固体支持物表面上的双链DNA序列。

[0051]本发明的其它优选的特征描述于所给出的定义和参考附图介绍的实施例中，所述实施例作为本发明的非限制性的优选实施方案。

发明详述

[0053]本发明的肿瘤诊断方法，用于通过(肿瘤)生物标志的检测和/或定量提供生物样品的特定肿瘤谱，是特别适于获得肿瘤谱的信息的分析方法，所述信息是指与所述样品获自的哺乳动物受试者对抗肿瘤治疗的可能的反应性有关的信息(以确立诊断和预后价值)，尤其是用于选择或拒绝将要给从中获得生物样品受试者，优选地是人类患者施用的一种或多种适当的抗肿瘤化合物或疗法。

[0054]根据本发明，生物样品优选地是从可能包括这些肿瘤生物标志的肿瘤样品(其指活组织检查或生物液，如血清、血浆、脑脊液)中获得的蛋白质提取物。在本发明中所使用的生物样品也可指可被当作阴性对照的非肿瘤生物样品。

[0055]生物样品也由体外培养细胞的蛋白质提取物组成，更具体地是源自转化的或无限增殖细胞系的蛋白质提取物。转化的或无限增殖细胞系显示肿瘤细胞的一些特征并且可作为本发明的一部分。

[0056]生物样品也包括从上述任何生物样品中分离的蛋白质，即，在纯化步骤后。

[0057]根据本发明的(肿瘤)生物标志优选地包括属于核受体家族的转录因子，如雌激素受体(ERα)、孕酮受体(FR)和雄激素受体(AR)，或者与增殖和凋亡级联有关，如癌基因和肿瘤抑制基因的产物，例如cMYC和p53。

[0058]本发明也优选地检测和/或定量不是转录因子的其它生物标志。它们优选地与细胞内的信号级联放大，如增殖和凋亡有关。激酶和磷酸酶的检测也是本发明的优选的实施方案。在本发明的另一个优选的实施方案中，生物标志是细胞外蛋白质，如血管发生和抗血管发生分子，即，VEGF、P1GF、PDGF、bFGF、EGF、HGF、TGFβ、IL-6、IL-8、IL-12、血管生成素-1、血管生成素-2，血管生成素、制管张素、内皮抑制素、血小板反应蛋白-1、基质金属蛋白酶或者它们的混合物，或者细胞因子和生长因子。

[0059]本发明方法包括至少下列步骤：

a.将上述生物样品与捕获探针接触，

b.与第一捕获探针结合后，检测和/或定量生物样品中是转录因子的第一(肿瘤)生物标志，

c.与第二捕获探针结合后，检测和/或定量生物样品中所述转录因子的DNA结合能力，第二捕获探针可能不同于第一捕获探针并且含有特异性结合所述转录因子的双链DNA序列，和，

d.与第三捕获探针结合后，检测和/或定量生物样品中不同于转录因子的第二(肿瘤)生物标志。

[0060]本发明优选地还包括下列步骤中的一个或多个：

e.检测和/或定量影响其活性的所述转录因子的修饰，

f.检测和/或定量所述转录因子与相互作用配偶体的结合能力，和，

g.可能地检测和/或定量生物样品中的这些相互作用配偶体。

[0061]本发明人已经发现只有全面综合在连续步骤(a)-(d)中的每一步所获得的结果，优选地连同步骤(e)(f)和/或(g)的结果，才能提供关于肿瘤谱的必要的和充足的信息，并且对于受试者治疗和对于临床医生选择一种或多种适当的抗肿瘤化合物和/或改进治疗性或预防性抗肿瘤方案具有高度预测价值。

[0062]仅进行步骤(a)-(g)中的一些只能产生有助于拒绝不利的治疗方案的部分信息，但是不足以获得最适当的治疗方案。这将在随后的实施例1和2中充分地说明，其中作者指出如果仅分析一些信号，那么它们可能会使临床医生远离不利的治疗或者使他的选择朝向一种类型的治疗，但是不会有助于选择该治疗种类应当使用的分子。因此，实施例1对信号1和2的分析将预测激素疗法是否是适当的，但是如果表明激素疗法是不适当的，那么将不能获知使用哪种替代治疗，如果表明激素疗法是适当的，那么也将不能有助于选择应该施用的最好的化合物。因此，ERα抑制剂(如他莫西芬)和雌激素剥夺(deprivation)疗法(即，通过施用来曲唑)之间的选择将进一步取决于是否存在功能性ErbB信号级联放大，一种只有通过附加信号的分析才能获得的信息。

[0063]在本发明中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)优选地是连续步骤。如果一种转录因子被怀疑是特定样品中的(肿瘤)生物标志，那么所述样品中其存在的检测和/或定量是其进一步分析的前提。转录因子以活化形式，通过与它们调控的基因启动子中的靶DNA序列的结合发挥它们的生物效应。因此，在本发明的步骤(b)中估计的试验样品中存在转录因子，需要通过步骤(c)进一步分析其DNA结合能力。然后进行可获知生物样品中是否存在第二-非转录因子-(肿瘤)生物标志的步骤(d)，以完成分析。在本发明的另一个优选的实施方案中，连续步骤是(a)、(d)、(b)和(c)。

[0064]在本发明的一个特定实施方案中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)用检测和/或定量影响其活性的转录因子的修饰的步骤(e)来补充。这是很重要的，尤其是对于具有能以无活性形式结合DNA的特殊性的那些转录因子而言。步骤(c)，其监测转录因子的DNA结合能力，因此不足以证明所述转录因子的活性，并且必须用步骤(e)来补充。这用CREB分子来充分说明，CREB分子是一种与许多生理功能，如垂体功能、葡萄糖体内平衡、生长因子依赖性细胞存活、学习和记忆有关的转录因子。CREB分子组成性结合到DNA上，并且其活化需要通过特异性激酶，如促分裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶A和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶在其Ser133残基上的磷酸化。在本发明的优选的实施方案中，将要在步骤(e)中检测的修饰是磷酸化。

[0065]在本发明的另一个优选的实施方案中，该修饰是乙酰化，因为逐渐积累的证据表明蛋白质如CREB-结合蛋白(CBP)、p300和P/CAF的乙酰化是许多活化转录因子的共同特征。在另一个优选的实施方案中，该修饰是突变或缺失。

[0066]在另一个优选的实施方案中，该修饰是构象变化。这对于核受体来说特别重要，因为它们中的一些，包括ERα，组成性结合到DNA上并且需要它们的三维结构的改变以成为功能上有活性的。在本发明的优选的实施方案中，该修饰是转录因子与辅因子，如辅激活物或辅阻遏物的联合。辅激活物和辅阻遏物的实例见于Robyr D.等人(Mol.Endocrinol.2000，14(3)：329-347)。

[0067]在本发明的另一个特定实施方案中，将步骤(a)、(b)、(c)和(d)，可能还有步骤(e)，可能与检测和/或定量生物样品中转录因子与相互作用配偶体的结合能力，以及可能地检测生物样品中的这些相互作用配偶体的步骤(f)和/或步骤(g)相结合。的确，如果所分析的转录因子中的一种或几种存在于生物样品中，而不是存在于与阻止它们具有活性的相互作用配偶体所形成的复合物中，那么这将高度影响可能的治疗化合物的选择。转录因子和相互作用配偶体之间的相互作用的实例是Era与AIB1、p53与Mdm2、p53与Mdmx、p53与COP1、HIFIα与p53。

[0068]进行步骤(e)和/或(f)以及可能地(g)以补充步骤(a)、(b)、(c)和(d)可能高度影响治疗的选择。的确，一些治疗化合物或方案(或者不同治疗化合物的联合)仅对活性转录因子具有有效或更高的抗肿瘤治疗或预防效果。此外，如果转录因子包括其活性的修饰(例如，由其氨基酸的一个或多个突变或缺失所致)，那么所述(肿瘤)生物标志对抗肿瘤化合物的活性谱和结合能力可能因此被改变。同样，如果它们的作用是基于在已被相互作用配偶体占据的同一结合位点上与所述转录因子相关联，那么一些靶向所述转录因子的治疗化合物(或者不同治疗化合物的联合)可能没有治疗效果。因此，将来自步骤(e)和/或(f)以及可能地(g)的信息与已从步骤(a)、(b)、(c)和(d)中获得的信息结合起来可帮助临床医生仅选择一些抗肿瘤化合物，并因此修改应用于受试者的治疗或预防方案。

[0069]因此，同时评估是否存在转录因子(通过步骤b)和其DNA结合能力(通过步骤c)，可能结合评估影响其活性的修饰(通过步骤e)及其对相互作用配偶体的结合能力(通过步骤f)和可能地步骤(g)，可以提供在独立的实验中通过从这些步骤中所获得的结果不能得到的独特的信息。

[0070]来集通过步骤(a)-(d)，可能连同步骤(e)和/或(f)和/或(g)获得的结果以及解释结果的过程是本发明的同一程序的两个部分。这两个部分都能通过不同的实验者，即实验室技术人员和临床医生进行，可能借助于程序控制计算机和修改的软件。

[0071]本发明的核酸(DNA)捕获探针指完全地或部分地含有双链DNA序列的捕获探针。它们优选地含有与至少约6.8nm的间隔区相连的双链DNA的特异性序列，优选至少约20个碱基对，更优选至少约50个碱基对(但是少于约300个碱基对，优选地少于约200个碱基对)的(DNA)间隔区。因此，当该核酸(DNA)捕获探针与固体支持物结合时，为了改善所述转录因子的特异性检测和将其与其它DNA结合蛋白区分开，该双链核酸(DNA)的特异性序列(其允许与相应的转录因子结合)离固体支持物表面有一定距离(至少约6.8nm)。

[0072]优选地将核酸(DNA)捕获探针通过氨基末端基团的共价结合固定到支持物的活化表面上，优选地具有(活性)醛、环氧或丙烯酸酯功能。在另一个优选的实施方案中，将核酸(DNA)捕获探针在一个末端生物素化并且固定到抗生物素蛋白或链霉抗生物素支持物上。

[0073]本发明的蛋白质捕获探针由蛋白质或肽部分构成或含有蛋白质或肽部分。它们优选地是(单克隆)抗体(或其超可变部分)或者辅因子如辅激活物，其可用于生物标志的直接和特异性结合。

[0074]在根据本发明的方法中，检测生物样品中是否存在转录因子、第二(肿瘤)生物标志和(a)转录因子相互作用配偶体的步骤(b)、(d)以及可能地(f)和/或(g)，优选地通过转录因子、第二(肿瘤)生物标志或相互作用配偶体与蛋白质捕获探针的特异性结合获得。在更优选的实施方案中，蛋白质捕获探针是(单克隆)抗体或其超可变部分或受体。

[0075]在根据本发明的方法中，检测和/或定量转录因子与相互作用配偶体的结合能力的步骤(f)和/或(g)也优选地通过使用DNA捕获探针进行。生物样品与DNA捕获探针的接触将导致转录因子作为与其相互作用配偶体的复合物结合到DNA捕获探针上。

[0076]在根据本发明的方法中，检测和/或定量转录因子的DNA结合能力的步骤(c)优选地根据在此引入作为参考的专利申请WO01/73115中所描述的方法进行。在该优选的实施方案中，DNA捕获探针含有特异性序列，优选地包括在通过具有至少6.8nm长的间隔区结合到固体支持物表面上的双链DNA的15与50个碱基对之间，优选地包括在20与40个碱基对之间。在更优选的实施方案中，间隔区由双链DNA序列(如上所述)构成或者含有双链DNA序列。

[0077]在根据本发明的方法中，检测可能影响其活性的转录因子的修饰或者检测相互作用配偶体的步骤(e)和可能地(g)和/或(f)优选地通过使用特异性结合修饰的转录因子或相互作用配偶体的捕获探针进行。

[0078]在更优选的实施方案中，捕获探针是(单克隆)抗体或其超可变部分。在特定的实施方案中，该抗体或其超可变部分特异性识别修饰的转录因子。在另一个优选的实施方案中，捕获探针是DNA捕获探针，只要转录因子修饰不影响其DNA结合位点。

[0079]优选地，为了获得特异性信号的检测，进行根据本发明的方法，优选地使用非放射性检测手段。更优选地，捕获探针与(肿瘤)生物标志之间的每种结合都导致可检测的信号。在优选的实施方案中，所述可检测的信号是通过使用识别与捕获探针结合的(肿瘤)生物标志的特异性检测分子获得的，更优选地是在DNA捕获探针与转录因子之间或者在蛋白质捕获探针，优选第一(单克隆)抗体或其超可变部分与这些(肿瘤)生物标志，包括转录因子之间所形成的复合物。所述检测分子优选地是被直接或间接标记的第二(单克隆)抗体或其超可变部分。检测分子上存在的所述标记导致可检测的信号，优选地从化学发光、生物发光、荧光、比色、放射性、电子或磁标记中获得。可检测的比色信号也意味着在支持物上形成比色或金属沉积物(沉淀物)，优选地银沉积物。

[0080]该金属沉积物(沉淀物)，由化学或生化还原产生，优选地在与这些检测分子的末端结合的胶体金上，通过本领域技术人员公知的方法在任何类型的固体支持物表面，包括微阵列例如在EP1179180B1中所述的微阵列。使用通过支持物上形成银沉积物的可检测的比色信号是本发明的优选的实施方案，因为其允许在微阵列上检测比色信号以及直观地分析该数据，而不需要扫描仪或者任何其它的检测设备。

[0081]定量是本方法的优选的实施方案，因为生物样品中存在的转录因子的活性水平或者生物标志的量可能影响肿瘤属性并因而影响对是否使用给定的抗肿瘤或预防性化合物的决定。避免副作用也是对治疗方法的一个要求，其完全可以通过(肿瘤)生物标志的存在和/或活性的定量测量来实现。

[0082]优选地在同一(不溶性)固体支持物上进行步骤(a)-(d)，可能连同步骤(e)和/或(f)以及可能地(g)。固体支持物以任何适当的材料制成，诸如任何形式的玻璃、塑料或金属支持物，优选为多孔板、圆盘或载玻片形式，其适于微阵列检测和/或定量以及适于自动操作，尤其适于高流通量筛选自动操作。本发明人已发现在同一固体支持物上进行步骤(a)-(d)，可能与(e)和/或(f)相结合以及可能地(g)可导致由有限量的生物材料建立肿瘤谱，其是大部分临床样品的特征。因此，是人类实体肿瘤的典型来源的活组织检查，通常提供50-100mg组织。当应用速冻组织的经典提取方法时，这相当于约1000μg的总蛋白质提取物或者大约150μg的核提取物。这允许进行几个单独的生物标志的测定，即，通过ELISA检测生物标志，或者通过如专利申请WO01/73115中所述的方法分析转录因子的DNA结合能力。考虑一式三份地进行每个实验和增加必须也含有样品的参考孔的必要性，经典的方法可检测最多5种(肿瘤)生物标志，或者最多四种转录因子的DNA结合能力。这非常有限，因为建立许多肿瘤的图谱可能会需要分析多个(肿瘤)生物标志。

[0083]本发明的方法不面临那些限制。的确，本发明人已发现在同一固体支持物上进行多重测定允许用非常有限量的生物材料，如30μg核提取物或者50μg总蛋白质提取物同时分析多至20种不同的生物标志。因此，本发明的方法有利地允许建立实际上任何肿瘤类型的肿瘤谱。此外，建立如本发明所建议的肿瘤谱需要同时分析多重(肿瘤)生物标志，因为那些(肿瘤)生物标志随时间随肿瘤状态而变动，因此应当在疾病进展的一个确定的时间点上根据同一活组织检查进行分析。

[0084]在本发明的优选的实施方案中，固体支持物包括含有专门用于特异性检测步骤的捕获探针的特异性表面或区域，优选地呈微阵列的形式。在该优选的实施方案中，将DNA捕获探针和蛋白质捕获探针分别集中在固体支持物上的不同位置。这允许在使每种结合类型最优化的结合条件下使它们单独地与它们各自的生物标志接触。这特别有利，因为一方面转录因子与它们的靶DNA捕获探针的最佳结合，以及另一方面蛋白质与蛋白质捕获探针的最佳结合需要特异性的和不同的实验条件。因此，本发明人观察到转录因子-DNA相互作用的最佳结合缓冲液是低盐Hepes缓冲液，补充了甘油、低二硫苏糖醇浓度以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂，而蛋白质-蛋白质相互作用的最佳结合缓冲液是含有去污剂和蛋白酶抑制剂，但不含甘油和不含二硫苏糖醇的MOPSO缓冲液。

[0085]在本发明的优选的实施方案中，将捕获探针以阵列形式排列在固体支持物表面上。微阵列优选地为通过接触或不接触方法获得的斑点状捕获探针的形式。每个斑点优选地占据约1μm²至约10mm²，且更优选地约0.01至约0.3mm²的表面。对于p53突变分析来说典型的微阵列是Affymetrix p53 DNA微阵列，其允许检测影响这种DNA结合蛋白的突变。

[0086]在本发明的一个特定实施方案中，将DNA捕获探针和蛋白质捕获探针以两个单独的微阵列点在同一固体支持物上，用于在它们各自的最佳条件下进行它们各自的生物标志的结合。

[0087]在本发明的一个特定实施方案中，在两个不同的固体支持物上进行该方法，每一个都对一种类型的捕获探针或者一种类型的检测特异。本发明人已发现将仅在两个固体支持物上的DNA和蛋白质捕获探针分类的可能性显示能在同一测定中检测和/或定量大量不同(肿瘤)生物标志的主要优点。

[0088]在另一个实施方案中，固体支持物是珠粒，每一个珠粒都具有用于一个(肿瘤)生物标志的结合的捕获探针。

[0089]多孔板是本发明所用的优选固体支持物之一。它们优选地每孔含有一类捕获探针或者每孔含有两种或多种捕获探针的混合物，其中每种捕获探针专门用于特异性结合待检测的一类(肿瘤)生物标志(转录因子、相互作用配偶体或不是转录因子的另一种(肿瘤)生物标志)。

[0090]捕获探针的固定优选地通过多孔板表面的包被或者通过在多孔板孔的底部或者在玻璃或塑料圆盘或者载玻片的表面上点样获得。固定可以是共价或非共价型的，可直接在支持物的表面上或者在支持物表面上存在的衬底上进行。在优选的实施方案中，衬底由链霉抗生物素或抗生物素蛋白分子构成。在另一个优选的实施方案中，衬底由可与捕获探针的NH₂末端基团反应的活性醛分子构成。

[0091]本发明的另一个方面涉及诊断、定量和/或筛选试剂盒或装置，包括用于进行根据本发明的方法的手段和介质。试剂盒(或装置)方便地用于在24小时内提供生物样品的肿瘤谱，允许临床医生在非常短的时间内选择或调整向患者施用的优选治疗。这特别重要，因为肿瘤迅速发展成疾病，这需要临床医生的快速反应。

[0092]在本发明的优选实施方案中，试剂盒(或装置)包括以阵列形式排列的捕获探针。在更优选的实施方案中，将核酸(DNA)捕获探针和蛋白质捕获探针以两个不同的阵列排列在同一支持物上。这是非常有利的，因为其允许用含有蛋白质捕获探针的阵列检测多达20个(肿瘤)生物标志，并且用含有(核酸)DNA捕获探针的阵列分析多达20个转录因子的DNA结合能力。所有那些测定都需要至少约20mg的生物样品，本发明的方法和试剂盒(或装置)因此适合任何类型的肿瘤，甚至对此可获得非常小的活组织检查的那些类型，如脑肿瘤。

[0093]在本发明的一个特定实施方案中，试剂盒方便地用作为研究人员提供信息的技术平台，其通过在该方法的特定步骤中建立新的治疗性和/或预防性化合物的(抗)肿瘤谱以筛选、选择和/或回收更有效的化合物，因此，优选地用于影响肿瘤谱的特异性抗肿瘤方案。在优选的实施方案中，用从培养的细胞中获得的生物样品进行该方法，对该样品实验设置更易于确定并且其提供比复杂的肿瘤样品更小的变异性。在更优选的实施方案中，用无限增殖的或转化的细胞系进行该方法。

[0094]在特定的实施方案中，根据本发明的方法用于筛选优选地与一些(肿瘤)生物标志相互作用并且对应于特异性(抗)肿瘤谱的新的(分离的或合成的)化合物。化合物可施用给受试者(施用可以是局部的，即，通过在肿瘤附近或肿瘤内的注射)。也可将这些化合物与肿瘤组织、肿瘤细胞或液体、提取物或其级分接触。在本发明的特定实施方案中，将化合物添加到培养的细胞或者其提取物中。

[0095]本发明也涉及筛选(或选择)方法，其包括下列步骤：

-使可能的抗肿瘤化合物与第一或第二(肿瘤)生物标志接触，和

-选择和可能地回收抑制所述(肿瘤)生物标志和如在根据本发明的试剂盒(或装置)中所述的固体支持物上存在的其捕获探针之间的结合的潜在的抗肿瘤化合物。

定义

[0096]除非有其它定义，这里所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。

[0097]术语“肿瘤”指细胞过度增殖的症状或疾病，其可能是良性的或恶性的并且能发生转移(Darnell，Lodish & Baltimore，Molecular cell biology)。

[0098]根据本发明的术语“肿瘤谱”是涉及从特定受试者中获得的特定细胞或细胞团的一种或多种(肿瘤)生物标志的存在和活性，以及它们的特征(转录因子被修饰或未被修饰)的综合信息。该肿瘤谱对于癌症的诊断(确定肿瘤是恶性的还是良性的)或者对于抗肿瘤方案后监测受试者的肿瘤的可能的反应性很重要，尤其是对添加一种或多种与这些(肿瘤)生物标志相互作用或靶向这些(肿瘤)生物标志的药物或抗肿瘤化合物的反应。

[0099]“靶向”意思是改变，即活化或抑制。靶向可能直接通过抗肿瘤化合物与(肿瘤)生物标志之间的物理接触发生，或者间接地，即，通过化合物对位于其上游并且能调节-活化或抑制-(肿瘤)生物标志的分子的作用发生。靶向也意味着取代(肿瘤)生物标志，即，通过基因治疗，如果发现(肿瘤)生物标志(即，抗癌基因)缺乏的话。

[0100]“生物样品”包括生物液体或生物组织(或者其提取物)。生物液体的实例包括尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、大便、痰、脑脊液、泪液、粘液、羊水等。生物组织是细胞，通常为特定种类的细胞与它们的细胞间质的聚集体，形成人类或动物受试者的结构材料之一，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物组织的实例也包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单个细胞。生物液体或组织可来自正常的组织或患病的组织。正常组织指无疾病如肿瘤、代谢紊乱或免疫系统功能障碍的组织。患病的组织指生物体由于例如，感染或遗传缺陷所引起的病理状况，以可鉴别的(肿瘤)症状为特征。“生物样品”也包括体外培养的细胞、提取物或其级分。体外培养的细胞包括转化的细胞系或初级细胞。可处理这些细胞，其中处理是物理的、化学的和生理的或药物治疗。“生物样品”也包括从上述生物组织、液体或细胞培养物中分离的蛋白质或蛋白质的混合物，即，在纯化步骤之后。

[0101]如这里所使用的术语“药物”或“抗肿瘤化合物”，应当被广义地理解并且包括，但不限于，具有已知功效和安全性的化合物、从化合物文库中随机挑选的药物或化合物候选物，以及其间每个研究水平的药物。药物包括影响细胞的活化水平的化合物并且包括激酶/磷酸酶活性、转录因子活性、或者任何其它(肿瘤)生物标志的调节剂。

[0102]“抗肿瘤化合物”也指以负面影响肿瘤为目的研发的任何类型的分子。抗肿瘤化合物可以是具有已知功效和安全性的化合物、从化合物文库中随机挑选的药物候选物，或者其间每个研究水平的药物。抗肿瘤化合物可通过杀伤肿瘤细胞、停止或减缓它们的发展、增殖或成熟而发挥其效应。

[0103]“抗肿瘤治疗”指向受试者施用以治疗肿瘤的任何类型的治疗，包括但不限于外科手术、激素治疗、化疗、放射治疗、饮食和基因治疗。

[0104]根据本发明，术语“生物标志”对应于蛋白质，优选地调节蛋白，如转录因子、DNA结合蛋白，以及其它细胞内非DNA结合蛋白，或者细胞外蛋白以及它们的特征。其它类型的(肿瘤)生物标志优选地是与细胞活化、转化和凋亡有关的蛋白质。(肿瘤)生物标志也包括复合物或相关基团或分子，其对于(肿瘤)生物标志的活化状态是需的。所述的相关基团或分子也是获得转录因子与DNA的相互作用所必需的分子。“相关基团或分子”是在它们与核酸或蛋白质捕获探针结合期间或之后与这些(肿瘤)生物标志相互作用的成分。

[0105]如这里所使用的，“检测和/或定量”(肿瘤)生物标志或信号旨在包括在获得样品中存在的(肿瘤)生物标志的量或浓度或活性的绝对值，以及获得表示样品中(肿瘤)生物标志水平的指数、比率、百分率、直观的和/或其它值的意义上的定性和/或定量测定。评估可以是直接的或间接的，实际上所检测的化合物种类当然不需要是(肿瘤)生物标志本身，而可以是例如其衍生物或者一些另外的物质。

[0106]根据本发明，术语“蛋白质”指完全蛋白质或其片段，如多肽、寡肽等。片段意思是至少5个连续氨基酸，优选地至少25个连续氨基酸，更优选地至少50个氨基酸的部分。

[0107]“转录因子”是结合双链DNA分子的特异性序列，并且正向或负向调节或调控DNA的转录的蛋白质。转录因子通过不同机制被活化，如易位、翻译后修饰如磷酸化，以及与辅因子，如辅激活物和辅阻遏物联合，其分别提高或降低转录调控。转录因子的活性指其调节或调控DNA的转录的能力。转录因子的DNA结合能力指其结合双链DNA的特异性序列的能力。

[0108]“蛋白质特征”是蛋白质的任何结构修饰，包括翻译后修饰、突变、截短或者蛋白质序列的任何其它修饰，其导致蛋白质结构、活性或与任何其它蛋白质或化合物的结合能力的改变。

[0109]术语“翻译后修饰”包括蛋白质残基上的磷酸化，其中蛋白残基是酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或组氨酸，例如，这可通过磷酸酪氨酸特异性(单克隆)抗体、磷酸丝氨酸特异性抗体和磷酸苏氨酸抗体进行检测。用于检测这些修饰的(单克隆)抗体也包括对蛋白质的磷酸化残基，或者含有磷酸化残基的蛋白质的片段特异的(单克隆)抗体。

[0110]转录因子的“相互作用配偶体”指能直接或间接地与转录因子在物理上相互作用的任何分子，用于获得其活化或用于允许其与双链DNA序列结合。

[0111]术语“支持物”指由选自聚合物、玻璃、金属或硅的成分所构成的任何材料；所述材料能直接固定或者通过层覆盖能固定对于生物标志相互作用和测定而言所必需的捕获探针。支持物的形式优选地，但不限于，96、384或1536孔的多孔板，具有平坦表面或具有腔的微阵列，其中不同的捕获探针存在于微阵列上的不同斑点中，或者存在于用于在FACS机器中测定它们的或便于通过它们的磁性特性洗涤它们的(可能磁性的)微珠上。

[0112]术语“捕获探针”指分子或者分子的复合物(或组合)，其能特异性结合，直接地或间接地，靶(肿瘤)“生物标志”。捕获探针优选地由DNA或蛋白质构成，或含有DNA或蛋白质。DNA捕获探针优选地包括含有与转录因子或其它DNA结合蛋白特异性结合的位点(特异性序列部分)的双链DNA。这些序列可以是天然存在的或基因工程改造的DNA序列。转录因子或DNA结合蛋白的特异性结合位点可以是天然存在的位点(序列)或共有结合位点(序列)。当与固体支持物结合时，这种特异性结合位点可附着到被认为是间隔区(序列)的分子上或是该分子的一部分。蛋白质捕获探针是能与(肿瘤)生物标志或与结合到(肿瘤)生物标志上的标记相互作用的任何蛋白质分子。它们是蛋白质，如(单克隆或多克隆)抗体或含有该抗体重链和/或轻链各个部分的其超可变部分、肽、转录因子、支架蛋白或受体。

[0113]如这里所使用的，“抗体”包括由通过二硫键连接的两条轻链和两条重链构成的免疫球蛋白，也包括其超可变部分，如Fab、(Fab)2、Fv或单可变区片段(scFv)。

[0114]如这里所使用的，术语“受体”指对给定的配体具有亲和力的分子。受体可以是天然存在的或合成的分子。

[0115]捕获探针与肿瘤生物标志之间结合产生的信号是本领域技术人员通过公知的适当的手段和介质可检测到的由所述特异性结合所产生的任何信号。

[0116]“微(阵列)”意指为了能结合到给定的特异性靶(肿瘤)生物标志上，将捕获探针固定到其上的固体支持物或衬底。阵列优选地由在支持物表面上或其内或者在覆盖支持物的衬底上的给定(和先前选择的)位置上沉积的捕获探针的斑点构成。在本发明的一个具体应用中，为了能检测和/或定量特异性结合的(肿瘤)生物标志，也提供了在不同支持物上的捕获探针阵列，只要不同支持物含有特异性捕获探针并可相互区别。为了定量结合的(肿瘤)生物标志，这可通过使用具有特定特征并能彼此间被识别的珠粒的混合物完成。

[0117]“捕获探针中存在的间隔区”意指任何分子(包括核酸序列)，其包含在固体支持物表面与特异性结合转录因子的特异性序列之间。

[0118]间隔区分子可以是化学间隔区如聚乙二醇链或具有至少20个核苷酸，优选地至少50个核苷酸，更优选地至少100或150个核苷酸，但是小于1000个核苷酸，优选地小于500个核苷酸的核酸序列。

附图和表的简述

[0119]表1显示在本发明中可被认为是(肿瘤)生物标志的蛋白质的实例。

[0120]表2显示可被本发明认为是乳腺肿瘤的生物标志的蛋白质的实例。

[0121]表3显示本发明中与p53状态相关的生物标志的实例。

[0122]表4显示含有可被本发明认为是生物标志的蛋白质的信号传导途径。

[0123]图1描述分等级分析如在实施例1中所进行的方法的结果的过程。

[0124]图2描述根据如在实施例2中所进行的方法，基于其p53状态确定肿瘤的适当治疗的过程。

[0125]图3是本发明中所述方法的图示。附着到固体支持物(8)上的不同捕获探针(1、2、3、4、5、6)可结合肿瘤生物标志(10、11、12、13)。使用第一(可能被标记的)检测分子(14)，和可能地被标记的并针对第一检测分子(14)的第二检测分子(15)检测结合的肿瘤生物标志，产生信号(#1、#2、#3、#4、#5、#6)。显示了不同的检测分子(14)，可将在左图组1上显示的那些(以产生信号#1、#2和#3)充分地应用到右组上。

实施例

提供下列实施例仅用于说明的目的，不打算限制本发明的范围。

1.一般程序：

A.捕获探针在固体支持物上的固定

[0126]在实施例中使用功能化载玻片(Diaglass，EAT，Namur，Belgium)或96孔平板。使用两类捕获探针：用于结合转录因子的双链DNA捕获探针，和用于结合转录因子和其它蛋白质两者的蛋白质捕获探针(抗体)。捕获探针含有胺基并能结合到含有醛基的固体支持物上，除了结合到多孔板上的DNA捕获探针，其含有生物素基团并结合到含有链霉抗生物素基团的孔。

[0127]根据下列方法将捕获探针一式三份点在玻璃载玻片表面上：将DNA捕获探针溶于补充了盐和去污剂的柠檬酸盐缓冲液。将蛋白质捕获探针溶于补充了去污剂和用于保持该捕获探针活性的分子(如甘油和/或糖分子，即海藻糖)的硼酸盐缓冲液。点样的浓度范围分别是：对DNA捕获探针而言为5-3000nM，对蛋白质捕获探针而言为0.1-1mg/ml。在湿度和温度受控的条件下进行点样，使用开尾销或大头针和环或平别针。将DNA捕获探针的斑点和蛋白质捕获探针的斑点分别聚集到载玻片上的空间不同的位置上。点样后，将载玻片洗涤、干燥并将8孔SecureSeal杂交室(Grace-Biolabs)置于载玻片上以便使DNA捕获探针与蛋白质捕获探针物理分离，并允许随后各自的孵育。

[0128]当使用多孔板时，将DNA和蛋白质捕获探针溶于补充了盐的磷酸盐缓冲液中。将DNA捕获探针生物素化，并包被在用链霉抗生物素包被的多孔上。包被的浓度范围通常分别是：对于DNA捕获探针为10-100pmoles/ml，对于蛋白质捕获探针为0.1-10ng/μl。对于DNA捕获探针来说，通过将平板在37℃孵育1小时，对于蛋白质捕获探针来说，将平板在4℃孵育过夜进行包被，随后进行洗涤。

B.封闭

[0129]封闭是在含有盐和封闭性蛋白(如BSA或奶粉)的磷酸盐缓冲液中进行。当蛋白质捕获探针结合到多孔板上时，向封闭溶液中补充蔗糖。封闭在室温下进行1小时，随后进行洗涤。

C.向室/孔中添加样品

[0130]对于每个样品类型来说必须使样品制备最优化。向含有DNA捕获探针的支持物上添加待分析的样品的核蛋白提取物，而向含有蛋白质捕获探针的支持物上添加胞浆或总蛋白提取物，或者细胞外来源的蛋白质。孵育在适当的结合缓冲液(EAT，Namur，Belgium)中进行，其不同于转录因子和蛋白质结合，在温和搅动下孵育1-16小时。将孔倒空并洗涤。

D.用抗体检测

[0131]将对待检测的每种生物标志特异的一抗添加到含有补充了盐和封闭性蛋白的磷酸盐缓冲液的对应的室/孔中。在室温下孵育1小时，随后进行洗涤。然后添加标记的二抗，室温下孵育1小时，随后进行洗涤。如果使用载玻片，那么使用荧光标记的二抗；如果使用多孔板，那么使用与HRP缀合的二抗。

[0132]如果使用载玻片，那么除去杂交室，并将载玻片洗涤和干燥。使用10μm分辨率的激光共聚焦扫描仪“ScanArray”(Packard，USA)，通过扫描载玻片进行信号的荧光检测。如果使用多孔板，那么通过在阴暗处添加100μl/孔四甲基联苯胺(Biosource，Belglum)孵育10分钟以及100μl/孔终止液(Biosource，Belgium)，随后通过在450nm处测量OD值来进行信号测量。

2.实施例1：分新乳腺肿瘤对不同药物的反应性的方法

[0133]将两个微阵列点在玻璃载玻片上：第一个微阵列由含有对ERα特异的结合位点的双链DNA捕获探针的一式三份的斑点构成。有义链的序列如下：5′-CAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTT-3′。第二个微阵列由与分别对Erα、ErbB1、ErbB2和mTOR特异的抗体相对应的蛋白质捕获探针的一式三份的斑点构成。将杂交室附着到玻璃载玻片上以物理分离这两个微阵列。

[0134]将第一个微阵列与在结合缓冲液中稀释的乳腺肿瘤样品的蛋白质提取物接触，其中结合缓冲液由补充了盐、EDTA、甘油、蛋白酶和磷酸酶抑制剂的Hepes缓冲液组成。将第二微阵列与在补充了盐、去污剂和蛋白酶抑制剂的MOPSO缓冲液中稀释的同样的乳腺肿瘤样品的蛋白质提取物接触。在Thermomixer(Eppendorf，Germany)中，21℃温和搅动下孵育1小时。除去样品并洗涤微阵列。

[0135]使特异性识别活化型ERα的抗体与第一微阵列接触。使抗体的混合物，其中每种抗体特异性识别蛋白质ERα、ErbB1、ErbB2和mTOR之一，与第二微阵列接触，随后进行洗涤。然后在间接光下使每个微阵列与Cy3标记的二抗接触，随后进行洗涤。除去杂交室；将载玻片在水中漂洗两次，干燥并扫描。

[0136]求与一式三份的斑点对应的信号的平均值。然后获得5个值，报告下列信息：

a：存在ERα(第二微阵列；ERα特异性斑点)：信号#1

b：ERαDNA结合活性(第一微阵列；ERα特异性斑点)：信号#2

c：存在ErbB1(第二微阵列；ErbB1特异性斑点)：信号#3

d：存在ErbB2(第二微阵列；ErbB2特异性斑点)：信号#3

e：存在mTOR(第二微阵列；mTOR特异性斑点)：信号#3。

[0137]然后将在图1中描述的下列过程用于分等级地分析数据。在分析过程的不同步骤中建议一些分子仅用于说明的目的。它们决不旨在指导临床医生的选择，或者旨在排除其它分子，因此应当被理解为仅仅是实例。

[0138]信号#1和2分别告知ERα的存在和活性。活性雌激素受体是成功应用内分泌治疗的前提。这两个信号必须都是阳性的。如果观察到阳性信号#1，那么必须分析信号#2。阳性信号#2表示内分泌治疗是适当的，如他莫西芬或来曲唑，而阴性信号#2表示内分泌治疗将可能是无效的。

[0139]在内分泌治疗中最适合开处方的分子取决于肿瘤对ErbB成员的过量表达。对于ERα和ErbB的同时存在使用来曲唑(Femara^)治疗的效果比使用他莫西芬更好。这个信息可通过信号#3和3′的分析得到。因此，如果信号#3和3′中至少一个是阳性的，那么可建议用来曲唑替代他莫西芬。此外，一些分子对灭活ErbB1和ErbB2两者比其它分子更有效。因此，使用抑制剂如Lapatinib(GlaxoSmithKline)治疗两种受体同时存在的效果更好，而Trastuzumab(Herceptin^)被证明是不完全有效的抗ErbB靶向剂。因此，如果信号#3和3′两者都是阳性的，那么可推荐使用如Lapatinib这样的分子。

[0140]抗性常常发生在缺乏ErbB成员表达的任何证据的情况下。信号#3″可分析是否存在该信号级联放大的下游靶：mTOR。如果信号#3和3′是阴性的，表示没有ErbB介导的抗性的证据，那么分析下游靶mTOR是否存在：阳性信号3″指向使用雷帕霉素类似物。

3.实施例2：分析肿瘤用于特制的p53治疗的方法

[0141]将96孔平板的各个孔用不同的捕获分子包被：第一组5个孔用p53的单克隆抗体包被；第二组的5个链霉抗生物素包被的孔用含有p53特异性结合位点的生物素化双链DNA捕获探针包被。有义链的序列如下：5′-CTTGGACATGCCCGGGCATGTCCCTC-3′；第三组的5个孔用Mdm2的单克隆抗体包被；第四组的5个孔用如在第一组中所使用的p53的抗体包被。

[0142]使每组的两个孔仅与结合缓冲液接触(“空白”)以及使每组剩下的3个孔与用结合缓冲液稀释的试验样品的蛋白质提取物接触(“试验”)。用于第1、3和4组的结合缓冲液由含有盐、去污剂、蛋白质和蛋白酶抑制剂的MOPSO缓冲液组成。用于第2组的结合缓冲液是含有盐、甘油、EDTA、DTT、蛋白酶和磷酸酶抑制剂的Hepes缓冲液。在21℃温和搅动下孵育1小时。除去样品并洗涤孔。

[0143]使特异性识别p53(第1和2组)或Mdm2(第3和4组)的多克隆抗体与相应的孔接触，随后进行洗涤。

[0144]然后使每个孔与对前面步骤中所使用的多克隆抗体特异的与HRP缀合的二抗接触，随后进行洗涤并进行比色检测。

0145]对于每组的孔，求与“空白”对应的信号的平均值并根据“试验”的平均值来推断。

然后获得四个值，报告下列信息：

a：存在p53：信号#1

b：p53的DNA结合活性：信号#2

c：存在Mdm2(或Mdmx)：信号#3

d：p53和Mdm2(或Mdmx)的相互作用：信号#5。

[0146]然后将图2中所描述的下列过程用于分等级地分析数据。在分析过程的不同步骤中建议一些分子仅用于说明的目的。它们决不旨在指导临床医生的选择，或者旨在排除其它分子，因此应当被理解为仅仅是实例。

[0147]信号#1的缺乏表示生物样品中不存在p53。于是可设想使用基因治疗策略，即通过野生型p53基因的腺病毒递送(ex：Advexin^)。

[0148]信号#1和2分别告知p53的存在和DNA结合活性。活性凋亡级联是成功地应用细胞毒性治疗，使用象阿霉素(Adriamycin^)这样的药物的前提。这两个信号必须都是阳性的。如果观察到阳性信号#1，那么必须分析信号#2。阳性信号#2表示使用细胞毒性药物，而阴性信号#2表示p53蛋白存在但有缺陷。这需要进一步分析剩下的2个信号。

[0149]信号#3告知存在Mdm2，已知其鳌合p53，阻止其活性。如果信号#3是阳性的，那么必须分析信号#5。阳性信号#5表示p53与Mdm2或Mdmx之间的相互作用。这指示使用该p53-Mdm2或p53-Mdmx相互作用的小拮抗剂作为治疗分子。

4.实施例3：其它肿瘤概况分析

[0150]发明人基于根据本发明的方法也已获得了其它肿瘤概况分析，其允许特定癌症的治疗。

a)血管发生：

[0151]从先前存在的血管中生长出新血管被认为是肿瘤生存和生长必不可少的重要事件。因而发展了抗血管发生治疗，其靶向血管发生肿瘤生物标志，如转录因子HIF1α。HIF1α的存在和DNA结合活性(通过本发明的信号#1和#2监测)将指示使用抗血管发生分子，如特异性HIF1α抑制剂抑拓扑酶素。然而，p53与HIF1α的结合导致HIF1α的失活。因此通过信号#3监测是否存在p53和通过信号#5监测p53-HIF1α相互作用可能不能帮助给予任何关于抗血管发生(anti-angiogen)(即，使用的分子)的精确信息，但是能使临床医生放弃该治疗方案，并指向经典的联合放疗和化疗。

b)前列腺癌

[0152]在前列腺癌中，活性雄激素受体(AR；通过信号#1和#2监测)的存在指向使用雄激素剥夺疗法。然而，由于其它细胞内途径的活化，大部分晚期前列腺癌变得对雄激素切除不起反应。监测相关的肿瘤生物标志可帮助发现适当的抗肿瘤化合物，bcl-2是前列腺癌中常常过度活化的抗凋亡分子。其通过信号#3的检测可表示多西他赛(Docetaxel)，一种抑制bcl-2的紫杉类化合物(taxoid)，作为治疗剂。

[0153]黑素瘤呈现对化疗和对放射疗法的细胞毒性效应的几乎普遍的抗性。p53的失活(通过信号#1和#2监测)有助于该抗性。因此，阴性信号#1和/或#2将表示细胞毒性治疗的无效，但是将不会告诉可能的治疗。监测另一种生物标志(NFκB，通过信号#3)的存在可能使临床医生找到治疗方案。NFκB通常被IκB灭活，但是可能由于IκB被蛋白酶体降解而在许多肿瘤中成为组成性活化的。阳性信号#3因此可以表示蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)是适当的抗肿瘤化合物。

在所附的表中，本发明人提供了其检测可在根据本发明的方法和试剂盒中使用的肿瘤生物标志的实例。

表

表1一个特征的检测和/或测量在本发明中可被认为是(肿瘤)生物标志的蛋白质的实例

转录因子：	其它调控蛋白：
		p53，cMyc，ER，PR，AR，SMAD4，HIF1α，NFκB，Forkhead，ets-1	ErbB1，ErbB2，mTOR，KAI1/CD82，cKit，AIB-1，p21，Ki67，GSTP1-1，Ras，p14/ARF，Mdm2，Mdmx，COP1，Pirh2，E6AP，CBP，p300，BRCA1，BRCA2，ATM，CHK2，VEGF，bFGF，uPA，Bcl-2，MDR-1，EGFR，PTEN，bcl-2

表2：一个特征的检测和/或测量可被本发明认为是乳腺肿瘤的生物标志的蛋白质的实例

转录因子和其它调控蛋白	靶向这些分子的药物
		ERαPRStat3，Stat5HIF1αErbB2ErbB1(EGFR)AIB1G蛋白mTORBRCA1BRCA2HDAC6NCoR	他莫西芬，来曲唑PX-478TrastuzumabZD1839，lapatinib法尼基转移酶抑制剂雷帕霉素类似物

表3：本发明中与p53状态有关的(肿瘤)生物标志的实例

将要检测的p53的特征	生物标志	治疗作用的实例	药物实例
				缺乏p53存在p53p53DNA结合能力缺乏p53DNA结合能力DNA结合位点内的p53突变p53与Mdm2相互作用p53与MdmX相互作用p53与Pirh2相互作用p53与Cop1相互作用	p53p53结合DNA的p53结合DNA的p53突变的p53Mdm2；结合p53的Mdm2Mdmx；结合p53的MdmxPirh2；结合p53的Pirh2Cop1；结合p53的Cop-1	基因治疗不同选项使用细胞毒性药物疫苗，反义寡核苷酸修饰p53构象的分子p53-Mdm2相互作用的拮抗剂p53-MdmX相互作用的拮抗剂p53-Pirh2相互作用的拮抗剂p53-Cop1相互作用的拮抗剂	Ad-p53(Advexin，RHC58500)阿霉素，顺铂紫杉醇EL625CP31398Prima-1Nutlins

表4：含有在本发明内可被认为是(肿瘤)生物标志的蛋白质的信号传导途径

信号传导途径	所涉及的主要蛋白质
		PI3K/Akt途径细胞周期途径凋亡途径EGFR(ErbB1)途径ErbB2途径MAPK途径NFκB途径血管发生	Akt，Forkhead，FOXOBcl-2，Bcl-xLBad，Bcl-2，p53，Mdm2ErbB1，mTORErbB2，mTORRas，Raf，cMycNFκB，Bcl-xLVEGF，PDGF，TSP-1，EGFR，bFGF，EGF，P1GF，HGF，IL-6，IL-8，IL-12，Ang1，Ang2，血管生成素，制管张素，内皮抑制素，TSP1，MMPs，Ets-1，HIF1α

序列表

<110>Eppendorf Array Technologies SA

<120>通过包括转录因子测定的生物标志分析描绘肿瘤的方法和试剂盒

<130>BP.EATE.005A/EP

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ERalαDNA捕获探针(正义链，5’-3’)

<400>1

caggtcacag tgacctgatc aaagtt    26

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>p53DNA捕获探针(正义链，5’-3’)

<400>2

cttggacatg cccgggcatg tccctc    26

Claims (45)

1.一种用于提供从哺乳动物受试者，包括人类患者的肿瘤组织、肿瘤细胞或液体中获得的生物样品的肿瘤谱的诊断方法，通过样品中存在的且对所述肿瘤谱特异的肿瘤生物标志的检测和/或定量来进行，所述方法包括步骤：

(a)将所述生物样品与直接或间接地同固体支持物(8)结合的捕获探针(1、2、3、4、5、6)接触；

(b)检测和/或定量由第一捕获探针(1)与是转录因子(10)并且存在于生物样品中的第一肿瘤生物标志的结合所产生的第一信号(#1)；

(c)检测和/或定量由第二捕获探针(2)与生物样品中存在的所述转录因子(10)的结合所产生的第二信号(#2)，其中第二捕获探针(2)含有特异性结合所述转录因子(10)的双链DNA序列(7)；

(d)检测和/或定量由第三捕获探针(3)与不同于转录因子并存在于生物样品中的第二肿瘤生物标志(11)的结合所产生的第三信号(#3)；

(e)可能地检测和/或定量由第四捕获探针(4)与修饰的转录因子(12)的结合所产生的第四信号(#4)，所述转录因子(10)的修饰影响其活性；

(f)可能地检测和/或定量由第五捕获探针(5)与结合到相互作用配偶体(13)上的转录因子(10)的结合所产生的第五信号(#5)；和

(g)可能地检测和/或定量由第六捕获探针(6)与转录因子(10)的相互作用配偶体(13)的结合所产生的第六信号(#6)；

其中连续信号(#1、#2、#3)的检测和/或定量以及，可能地，信号(#4、#5、#6)的检测和/或定量对应于哺乳动物受试者的生物样品的特异性肿瘤谱。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)和(d)是连续的步骤。

3.根据权利要求1的方法，其中连接的步骤是步骤(a)、(d)、(b)和(c)。

4.根据权利要求1的方法，其中肿瘤谱提供对可向从中获得生物样品的哺乳动物施用的并对肿瘤谱特异的一种或多种适当的抗肿瘤化合物或疗法的选择。

5.根据前面权利要求1-4中任何一项的方法，其中捕获探针(1、3、4、5、6)中的一种或多种是(单克隆)抗体或其超可变部分。

6.根据前面权利要求1-4中任何一项的方法，其中捕获探针(1、3、4、5、6)中的一种或多种是受体。

7.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中第二捕获探针(2)，和可能地捕获探针(4、5、6)含有通过具有至少6.8nm长的间隔区(9)与固体支持物(8)表面结合的双链DNA序列(7)。

8.根据前面权利要求1-7中任何一项的方法，其中影响其活性的转录因子(10)的修饰是翻译后修饰。

9.权利要求8的方法，其中翻译后修饰是转录因子的磷酸化或乙酰化。

10.根据前面权利要求1-6中任何一项的方法，其中影响其活性的转录因子(10)的修饰是突变或截短。

11.根据前面权利要求1-6中任何一项的方法，其中影响其活性的转录因子的修饰是转录因子的构象变化。

12.根据前面权利要求1-6中任何一项的方法，其中影响其活性的转录因子的修饰是其与辅因子的结合。

13.根据权利要求12的方法，其中辅因子是辅激活物或辅阻遏物。

14.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中检测的和/或定量的信号(#1、#2、#3、#4、#5、#6)中的一种或多种是通过针对肿瘤生物标志(10、11)、修饰的转录因子(1 2)或其与捕获探针(1、2、3、4、5、6)结合的相互作用配偶体(13)的(可能被标记的)第一检测分子(14)获得的，其中所述的第一检测分子(14)可能地与被标记的第二检测分子(15)特异性相互作用。

15.根据权利要求14的方法，其中(可能被标记的)检测分子(14)和第二检测分子(15)是(单克隆)抗体或其超可变部分。

16.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中信号(#1、#2、#3、#4、#5、#6)是非放射性信号。

17.根据权利要求16的方法，其中信号选自荧光信号、比色信号、化学发光信号、生物发光信号、电子信号和/或磁信号。

18.根据权利要求17的方法，其中比色信号由金属沉积物产生。

19.根据权利要求18的方法，其中金属沉积物是固体支持物(8)表面上的银沉积物。

20.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中转录因子(10)选自核受体、癌基因和肿瘤抑制基因的产物。

21.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中与转录因子不同的第二肿瘤生物标志(11)是增殖或凋亡级联中所涉及的蛋白质。

22.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中与转录因子不同的第二肿瘤生物标志(11)是激酶或磷酸酶。

23.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中与转录因子不同的第二肿瘤生物标志(11)是细胞外蛋白质。

24.权利要求23的方法，其中细胞外蛋白质是细胞因子或生长因子。

25.权利要求23的方法，其中细胞外蛋白质是血管发生或抗血管发生蛋白。

26.根据权利要求25的方法，其中血管发生或抗血管发生蛋白选自VEGF、PlGF、PDGF、bFGF、EGF、HGF、TGFβ、IL-6、IL-8、IL-12、血管生成素-1、血管生成素-2、血管生成素、制管张素、内皮抑制素、血小板反应蛋白-1、基质金属蛋白酶或者它们的混合物。

27.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中肿瘤生物标志选自表1、表2、表3和/或表4中所列的那些。

28.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中固体支持物(8)由玻璃、塑料或金属材料构成。

29.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中固体支持物(8)具有多孔板形式。

30.根据权利要求29的方法，其中捕获探针存在于多孔板的一个孔中或者至少两种不同捕获探针的混合物存在于多孔板的一个孔内。

31.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中固体支持物(8)具有圆盘形式或载玻片形式。

32.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中将捕获探针以阵列形式排列在固体支持物(8)表面上。

33.权利要求32的方法，其中捕获探针由核酸(DNA)捕获探针和蛋白质捕获探针构成，其中将核酸(DNA)捕获探针和蛋白质捕获探针以两个单独的阵列点在同一固体支持物(8)表面上。

34.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中使不同的捕获探针结合到不同的固体支持物上。

35.权利要求34的方法，其中捕获探针是与第一固体支持物结合的核酸(DNA)捕获探针和与第二固体支持物结合的蛋白捕获探针。

36.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中使捕获探针结合到两个以上的固体支持物上。

37.一种治疗方法，其包括步骤：

-在哺乳动物受试者(包括人类患者)上应用根据前面权利要求1-36中任何一项的诊断方法，其允许选择可向哺乳动物受试者施用的一种或多种适当的抗肿瘤化合物或疗法，和，

-用所选择的适当的抗肿瘤化合物或疗法治疗哺乳动物受试者。

38.一种诊断、定量和/或筛选试剂盒，包括用于进行根据前面权利要求中任何一项的方法的手段和介质，并且其包括至少三种类型的直接或间接地结合到固体支持物(8)上的捕获探针，所述捕获探针包括与转录因子(10)特异性相互作用的第一捕获探针(1)，包含与是转录因子(10)的第一肿瘤生物标志特异性相互作用的双链DNA序列(7)的第二捕获探针(2、4、5)以及与不同于转录因子的第二肿瘤生物标志(11)特异性相互作用的第三捕获探针(3)。

39.根据权利要求38的诊断、定量和/或筛选试剂盒，其进一步包括与转录因子(10)的相互作用配偶体(13)特异性相互作用的第六捕获探针(6)。

40.根据权利要求38或39的试剂盒，其中不同类型的捕获探针结合到固体支持物(8)表面的空间不同的位置上。

41.根据前面权利要求38-40中任何一项的试剂盒，其中捕获探针以阵列形式结合到固体支持物(8)表面上。

42.根据前面权利要求38-41中任何一项的试剂盒，其进一步包括用于检测、定量和/或记录由捕获探针(1、2、3、4、5、6)和肿瘤生物标志(10、11)或转录因子(10)的相互作用配偶体(13)之间的结合所产生的信号(#1、#2、#3、#4、#5、#6)的手段和/或介质。

43.根据权利要求4 2的试剂盒，其中所述手段是与它们对应的捕获探针(1、2、3、4、5、6)结合的针对肿瘤生物标志(10、11)，或针对修饰的转录因子(12)、或针对转录因子(10)的相互作用配偶体(13)的(可能被标记的)第一检测分子(14)，以及可能地被标记的并针对第一检测分子(14)的第二检测分子。

44.根据权利要求43的试剂盒，其中第一可能被标记的检测分子(14)和/或第二检测分子(15)是(单克隆)抗体或其超可变部分。

45.根据前面权利要求38-44中任何一项的试剂盒，其中捕获探针(2)和可能地捕获探针(4)和/或(5)的双链DNA序列(7)通过具有至少6.8nm长的间隔区(9)结合到固体支持物(8)表面上。

根据前面权利要求38-45中任何一项的试剂盒，其中捕获探针(1、3、4、5、6)中的一种或多种选自(单克隆)抗体、其超可变部分或受体。

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