CN105807054A - 一种子宫内膜癌特异性检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异检测子宫内膜癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人Cyclophilin A蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的Cyclophilin A蛋白，通过其含量的变化来检测子宫内膜癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于子宫内膜癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的好处。

Description

一种子宫内膜癌特异性检测的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其检测方法。

背景技术

子宫内膜癌作为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20-30％，在某些欧美国家已居女性生殖道恶性肿瘤首位，严重威胁妇女健康。随着社会发展和人类平均寿命的延长，内膜癌发病率逐年上升并伴有年轻化趋势。子宫内膜癌如果能做到早期诊断，合理治疗，其预后一般较好。子宫内膜癌的主要临床表现为不规则阴道流血，与卵巢癌等其他肿瘤不同，临床诊断主要依靠诊断性刮宫，但哺乳期或浸润型子宫内膜癌的患者，其子宫壁薄弱，刮宫时可能会造成穿孔，给患者造成伤害。

CyclophilinA蛋白(CYPA)又称亲环素A(GeneBankNo.NP_066953)，位于胞质及胞核，具有肽酰脯氨酰顺反式异构酶活性，参与蛋白质折叠、装配与运输；在细胞内与环孢素A结合，抑制T细胞活化途径，表现出免疫抑制作用，此外还参与氧化应激诱导及胆固醇代谢过程，并发挥细胞因子的功能。现有技术已经报道，通过检测人亲环素A表达水平来早期诊断子宫内膜癌。因此，检测人亲环素A变得尤为重要。

核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物质的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合CYPA的核酸适体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-14所示的单链DNA。

所述核酸适体与CYPA蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

所述核酸适体可用于制备检测CYPA的试剂盒。

利用本发明的核酸适体，可以捕获中唾液中的中的CYPA，从而用于相关子宫内膜癌筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1CYPA蛋白的获得

将Genbank：NP_066953所示的CYPA基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了相应的目的多肽蛋白。

实施例2核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括个核苷酸的随机核酸文库如下：

5‘-ATCGTCACCATGGATACATG(N39)TTGCACAATTGGACAGTTAC-3’；N39代表39个随机核苷酸。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugCYPA蛋白，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。得到了14个适配子，其序列分别为SEQIDNO:1-14所示。具体序列如下所示：

CYPA-1:ATCGTCACCATGGATACATGACTTAACCACGCTCCATTCTATCAATTAACCCGCACTAATTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-2:ATCGTCACCATGGATACATGATATATTAACCCTCACTAATCTCCTCATCCTACTATAAGTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-3:ATCGTCACCATGGATACATGCACTATATTCACGCTAAACCTTTCTTCCTCGCATACCTATTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-4:ATCGTCACCATGGATACATGCTATTCCCTTTCCGCTACAATCCAATAATCACGCAACACTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-5:ATCGTCACCATGGATACATGTTATTCCTGTCTTCACACCGACTTCACATATATCTTCAATTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-6:ATCGTCACCATGGATACATGCTACCGCTTCCACTCTCCTTATCCATCTTACATTCCCTCTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-7:ATCGTCACCATGGATACATGCATACTACAAACCTCCTATAATCTGTTATCAACACTAATTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-8:ATCGTCACCATGGATACATGTATTTTCTTCCACTCCCATACTTAGAATAAGAATCCACTTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-9:ATCGTCACCATGGATACATGTATGACAATTATTGCCCACTAGATACTTCCACGCAAATCTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-10:ATCGTCACCATGGATACATGACTTATCATATCCACCTTATCACATCATCCCCACTTCCTTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-11:ATCGTCACCATGGATACATGTCGTTCTCACGAATTCACACACTAACTCCCACACATACATTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-12:ATCGTCACCATGGATACATGCACTATATCTTACTATCATTTAATCCTTTCACTCCCAACTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-13:ATCGTCACCATGGATACATGTCACTCCGCCGCACCACTAATTCACGCTAAACTTATCTTTTGCACAATTGGACAGTTAC

CYPA-14:ATCGTCACCATGGATACATGATTCTCTCCGAACTTCTACATATAAAACCAAGAATTCTTTTGCACAATTGGACAGTTAC

实施例3蛋白结合适配子的性能测定

将适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度(1-200nM)的CYPA37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(单位nM)
		CYPA-1	11.3
CYPA-2	12.5
		CYPA-3	13.0
CYPA-4	12.8
		CYPA-5	12.7
CYPA-6	11.9
		CYPA-7	11.4
CYPA-8	12.4
		CYPA-9	12.7
CYPA-10	12.0
		CYPA-11	13.1
CYPA-12	13.0
		CYPA-13	12.6
CYPA-14	12.8
		PBS空白对照	无结合能力

实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pg120蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，COCH蛋白，CYPA蛋白，与14条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与CYPA蛋白结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例5所述适配子疾病的诊断

取8个子宫内膜癌患者和4个正常人的血液，使用生理盐水稀释，获得目标样本。

将14个偶联有标记的适配子分别与8个患者以及4个正常人的分泌物混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的CYPA蛋白的含量，通过分析发现，8个子宫内膜癌患者中CYPA蛋白的含量显著增加，超过了规定的阈值。达到了子宫内膜癌的诊断标准。由此可见，其诊断效果较好。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉李静

〈120〉一种子宫内膜癌特异性检测的试剂盒

〈160〉14

〈210〉1

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-1

ATCGTCACCATGGATACATGACTTAACCACGCTCCATTCTATCAATTAACCCGCACTAATTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉2

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-2

ATCGTCACCATGGATACATGATATATTAACCCTCACTAATCTCCTCATCCTACTATAAGTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉3

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-3

ATCGTCACCATGGATACATGCACTATATTCACGCTAAACCTTTCTTCCTCGCATACCTATTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉4

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-4

ATCGTCACCATGGATACATGCTATTCCCTTTCCGCTACAATCCAATAATCACGCAACACTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉5

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-5

ATCGTCACCATGGATACATGTTATTCCTGTCTTCACACCGACTTCACATATATCTTCAATTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉6

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-6

ATCGTCACCATGGATACATGCTACCGCTTCCACTCTCCTTATCCATCTTACATTCCCTCTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉7

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-7

ATCGTCACCATGGATACATGCATACTACAAACCTCCTATAATCTGTTATCAACACTAATTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉8

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-8

ATCGTCACCATGGATACATGTATTTTCTTCCACTCCCATACTTAGAATAAGAATCCACTTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉9

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-9

ATCGTCACCATGGATACATGTATGACAATTATTGCCCACTAGATACTTCCACGCAAATCTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉10

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-10

ATCGTCACCATGGATACATGACTTATCATATCCACCTTATCACATCATCCCCACTTCCTTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉11

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-11

ATCGTCACCATGGATACATGTCGTTCTCACGAATTCACACACTAACTCCCACACATACATTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉12

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-12

ATCGTCACCATGGATACATGCACTATATCTTACTATCATTTAATCCTTTCACTCCCAACTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉13

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-13

ATCGTCACCATGGATACATGTCACTCCGCCGCACCACTAATTCACGCTAAACTTATCTTTTGCACAATTGGACAGTTAC

〈210〉14

〈211〉79

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉CYPA-14

ATCGTCACCATGGATACATGATTCTCTCCGAACTTCTACATATAAAACCAAGAATTCTTTTGCACAATTGGACAGTTAC

Claims (3)

1.一种用于子宫内膜癌检测的试剂盒，其含有能特异性与CYPA蛋白特异性结合的核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体的序列如SEQIDNo：12所述。

3.一种检测子宫内膜癌的方法，其特征在于利用权利要求1所述的试剂盒。