CN109112176A - 一种微球编码载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微球编码载体及其应用,该编码载体通过已知粒径、荧光种类及荧光强度的、表面具有至少一种可偶联基团的微粒载体与具有至少一种可偶联基团和一段特异性的核酸序列的捕获探针分子结合而成,该捕获探针的特异性核酸序列能够与被检测目标核酸分子形成一定程度的互补配对、可偶联基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用。本发明的微球编码载体可实现1×105种不同微球编码,不同编码微球可根据粒径、荧光颜色、荧光强度区分度明显,显著提高了微球载体编码的通量和可区分度。将该微球编码载体应用于核酸检测,结合本发明的宽场显微成像技术进行成像分析,显著提高分析速度,可同时对数十种已知的核酸分子同时进行定性、定量检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术及核酸检测技术领域,具体涉及一种微球编码载体及其应用。
背景技术
近年来,生物医学研究在功能基因分析、药物筛选和临床诊断等诸方面取得了令人瞩目的成绩。与此同时,随着组合化学、天然产物化学以及基因组学的快速发展,大量需要筛选的化合物不断增加。如何从大规模、复杂的体系中高效快速地筛选出目标物质,以促进生物医学研究的发展,是目前生物分析技术面临的巨大挑战。在传统方法所采用的基于微孔板的筛选技术中,通常采用的方法是减小样品体积、提高集成度和自动化程度等方法,提高筛选样品的通过量。例如,采用以微阵列和微流控技术为基础的芯片实验室(Lab-on-a-chip) 技术,可以大大提高筛选效率(Weigi B H,Bardeii R L,Cabrera C R.AduancedDrug Deliuery Reuiews,2003,55:349~377)。样品体积的减小大大地降低了待筛选物和其它试剂的需求,很大程度上降低了实验成本;另外,自动化程度的提高可以进一步减少工作量,提高重现性,减少人为误差。所以,样品测试体积从早期的毫升发展到了现在的纳升;这些自动化系统的开发与实现对于提高筛选速度和效率有着非常重要的意义(BattersbyB J,Tran M.Trends in Biotechnology,2002,20:l67~l73)。然而,随着样品体积的减小,出现了一些新的问题,例如,微量样品的挥发和毛细渗漏使化合物和靶点的相互作用难以进行,对测试结果造成较大的影响;另外,微量样品溶液的定量加入、操纵和充分的相互作用等问题在实际操作中较难解决,同时也提高了仪器成本(Khandurina J,GuttmanA.Curr.Opin.Chem.Biol.,2002,6:359~366; Hertzberg R P,PopeAJ.Curr.Opin.Chem.Biol.,2004,4:445~45l)。考虑到这些问题,基于微载的筛选分析技术开始得到研究人员的关注。其中,利用聚合物树脂微球作为微载体的筛选技术,发展尤为迅速。
为了解决大规模化合物库的筛选分析问题,Lam等于1991年提出了 OBOC(One-Bead-One-Compound)筛选方法,可以在短时间内合成大量的化合物,而且每一个树脂微球上面都只负载一个待筛选物质。此外,每个树脂微球相当于一个微小的反应单元。由于各种不同物质在空间上相互分离,所以各种不同物质能够独立并且同时被检测。因而,这种树脂微球-待检物的方式可直接用于筛选和检验。而与底物发生反应的微球一旦被鉴定出来,通过微球解码,可以很容易确定微球的身份,从而确定微球上面的负载待筛选物质(Lam K S,Liu R W,Miyamoto S,Lehman AL,tuscano J M.Accounts of Chemical Research,2003,36:370~377)。研究人员将这种基于聚合物微球的筛选技术加以推广,并利用流式细胞仪作为检测手段,发展出悬浮阵列技术(Verpoorte E.Lab.Chip,2003,3:60N~68N)。该技术利用具有唯一编码特征的微球作为反应单元,检测、筛选和分离均在同一个微球上快速完成;另外,根据实际筛选要求,还可以对微球的种类和粒径进行优化。这些特点大大缩短了阵列制备时间、提高了阵列密度。基于以上优点,近年来,基于编码微球的筛选检测技术得到研究人员的广泛关注,并且已经开始应用。
虽然基于编码微球的筛选检测方法可以有效降低仪器成本和检测费用,但目前也面临如何提高编码数量、简化解码过程、提高检测速度和准确性、降低成本等方面问题。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足,本发明的目的提供一种微球编码方法及其应用,本发明可实现1×105种不同微球编码,不同编码微球可根据粒径、荧光颜色、和荧光强度区分度明显,显著提高了微球载体编码的通量和可区分度。将该微球编码方法应用于核酸和微生物的检测,结合本发明的宽场显微成像技术对微球进行分析,可显著提高分析速度,同时对数十种已知的核酸分子进行快速、便捷的定性和定量检测。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明的第一个目的在于提出一种微球编码载体,该微球编码载体是通过以下方法制备的:
1)获得一种已知粒径、荧光种类及荧光强度的微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联基团;所述微粒载体只包被一种荧光标记;
2)获得一种捕获探针分子,该捕获探针分子含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联基团,所述核酸序列能够与被检测的目标核酸分子形成一定程度的互补配对,所述可偶联基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用;
3)在一定条件下,使捕获探针与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合待测目标核酸分子的特异性检测载体。
进一步地,所述微粒载体选自琼脂糖凝胶微粒、葡聚糖凝胶微珠、纤维素微珠、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酸酯脂质体复合微粒、壳聚糖微粒、金磁微粒、玻璃珠、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球。
进一步地,所述微粒载体的直径为0.1μm~100μm。
进一步地,所述微粒载体包被的荧光标记颜色选自红、橙、蓝、绿、紫中的任一种。
进一步地,所述微粒载体表面的可偶联基团选自羟基、巯基、氨基、羧基、醛基。
进一步地,所述捕获探针分子的可偶联基团选自羟基、巯基、氨基、羧基、醛基。
本发明的第二个目的在于提出一种核酸分子的检测方法,包括以下步骤:
1)获得上述任一项所述的一种微球编码载体;
2)提取待测目标核酸样本;
3)对待测目标核酸进行荧光标记;
4)液相杂交:在核酸杂交条件下,使步骤3)获得的被荧光标记的待测目标核酸与步骤1)获得的微球编码载体接触,使待测目标核酸分子与偶联于微球编码载体表面的捕获探针进行杂交,获得待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体;
5)杂交信号分析:对步骤4)中的待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体进行检测,根据微球编码载体的微粒载体直径、荧光颜色、荧光强度来区分微球编码载体的种类,检测待测目标核酸的荧光种类和强度,确定待测目标核酸分子的存在和含量。
进一步地,所述步骤5)中采用宽场显微成像对步骤4)中的待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体进行分析,具体方法为:获得微球载体的杂交荧光图像,对整个划定区域进行多荧光通道成像形成一张多荧光通道的图片,通过分析软件把图片中的所有微球用圆圈圈出,记录每个微球的粒径、荧光颜色、荧光强度从而区分不同类的微球,最后通过反应荧光强度进行待测目标核酸分子定量。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明的微球编码方法可实现1×105种不同微球编码,不同编码微球可根据粒径、荧光颜色、和荧光强度区分度明显,显著提高了微球载体编码的通量和可区分度。
(2)将该微球编码方法应用于核酸和微生物的检测,结合本发明的宽场显微成像技术对微球进行分析,可显著提高分析速度,同时对数十种已知的核酸分子进行快速、便捷的定性和定量检测。
(3)本发明的微球编码方法,可直接由不同类型商品化微球进行组合,而无需对微球进行修饰,降低了微球获取成本。
附图说明
图1为本发明实施例1中微球载体与待测核酸分子的杂交荧光图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图,进一步阐述本发明。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。可以从材料、方法和反应条件等方面对本发明所公开的内容进行改进,所有这些改进,均应落入本发明的范围之内。非特殊说明,本发明实施例所采用的试剂均为市售商品,本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人编著的《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
一种微球编码载体,该微球编码载体是通过以下方法制备的:
1)获得一种已知粒径、荧光种类及荧光强度的微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联基团;所述微粒载体只包被一种荧光标记;
2)获得一种捕获探针分子,该捕获探针分子含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联基团,所述核酸序列能够与被检测的目标核酸分子形成一定程度的互补配对,所述可偶联基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用;
3)在一定条件下,使捕获探针与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合待测目标核酸分子的特异性检测载体。
其中,微粒载体选自琼脂糖凝胶微粒、葡聚糖凝胶微珠、纤维素微珠、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酸酯脂质体复合微粒、壳聚糖微粒、金磁微粒、玻璃珠、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球。所述微粒载体的直径为0.1μm~100μm,所述微粒载体包被的荧光标记颜色选自红、橙、蓝、绿、紫中的任一种,荧光强度分为0-100000(荧光强度为相对值,跟仪器软件算法有关,不同仪器会得出不同荧光值)中的20个梯度,因此排列组合理论上可以实现1×105种不同微球编码,从而使不同编码微球可以很好地区分(粒径,荧光颜色,荧光强度),显著提高了微球载体编码的通量和可区分度。
微粒载体表面的可偶联基团选自羟基、巯基、氨基、羧基、醛基;所述捕获探针分子的可偶联基团用于与微粒载体表面的可偶联基团发生反应,因些捕获探针分子的可偶联基团选自羟基、巯基、氨基、羧基、醛基。
基于上述的微球编码载体,本发明提出了一种核酸分子的检测方法,包括以下步骤:
1)获得上述任一项所述的一种微球编码载体;
2)提取待测目标核酸样本;
3)对待测目标核酸进行荧光标记;
4)液相杂交:在核酸杂交条件下,使步骤3)获得的被荧光标记的待测目标核酸与步骤1)获得的微球编码载体接触,使待测目标核酸分子与偶联于微球编码载体表面的捕获探针进行杂交,获得待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体;
5)杂交信号分析:对步骤4)中的待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体进行检测,根据微球编码载体的微粒载体直径、荧光颜色、荧光强度来区分微球编码载体的种类,检测待测目标核酸的荧光种类和强度,确定待测目标核酸分子的存在和含量。
其中步骤5)中采用宽场显微成像对步骤4)中的待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体进行分析,具体方法为:获得微球载体的杂交荧光图像,对整个划定区域进行多荧光通道成像形成一张多荧光通道的图片,通过分析软件把图片中的所有微球用圆圈圈出,记录每个微球的粒径、荧光颜色、荧光强度从而区分不同类的微球,最后通过反应荧光强度进行待测目标核酸分子定量。
实施例1:食品相关微生物的检测
为了实现食品相关微生物的定量检测,本发明开展了本实施例研究。实验材料和实验过程具体如下:
A、微球载体:天津市倍思乐色谱技术开发中心公司提供的羧基聚苯乙烯微球。
B、病原微生物特异性捕获探针:其序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 2所示:
沙门氏菌Cap-SM:5'-NH2-(CH2)12-gcccggtaaacagatgagtattg-3'
金黄色葡萄球菌Cap-JP:5'-NH2-(CH2)12-gcatataccgcacttaaaaaag-3'
C、样本标记试剂:Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒。
D、图像采集和数据分析:Biotek公司Cytation 1成像系统以及Gen5 3.0 图像数据存储和分析系统。
本发明提供的核酸检测方案包括六个操作步骤:1.微球载体的编码;2.核酸样本提取;3.核酸样本的荧光标记;4.液相杂交;5.杂交信号分析。现以病原微生物的定性检测为例,说明本发明提供的技术方案。
1.微球载体的编码
聚苯乙烯微球购买自天津市倍思乐色谱技术开发中心公司,微球表面带有羧基基团,它们具有不同的粒径、荧光颜色和荧光强度。捕获探针5'加入了氨基修饰,将捕获探针和微球进行混合,经过脱水缩合反应形成一个稳定的酰胺键,这样就把捕获探针包载到指定的微球上。用不同的粒径,荧光颜色和荧光强度的微球可以对不同捕获探针进行包载。本次实验我们用粒径为12μm、带绿色荧光、荧光强度为40000的微球包载沙门氏菌捕获探针,以检测样品中沙门氏菌的含量;用粒径为10μm、带橙色荧光、荧光强度为30000的微球包载金黄色葡萄球菌捕获探针,以检测样品中金黄色葡萄球菌的含量。每种微球载体编码操作步骤如下:
1)吸取5.0×106微球至棕色EP管中,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
2)加入50μL 0.1M的MES(pH4.5),悬摇、超声处理20s;
3)加入2μL 100μM相对应的特异性探针至重悬微球中,振荡以混匀;
4)向每个交联反应中依次加入2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液,振荡混匀,避光、室温放置30min;
5)向微球中加入1mL 0.02%Tween-20,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
6)用1mL 0.1%的SDS重悬微球,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
7)500μL 3mg/mL的BSA溶液和700μL ddH2O,震荡反应20min;
8)用1mL 1×PBS重悬微球,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
9)用100μL TE(pH8.0)悬摇、振荡20s以重悬微球,避光储存于2~8℃冰箱3个月。
2.核酸样本提取
按照国家标准《SNT 1869-2007食品中多种致病菌快速检测方法PCR法》中所描述的技术方案,对食品中的微生物进行增菌并提取其中的核酸成分,用于本实施例研究。
3.核酸样本的荧光标记
利用Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒,对获得的核酸进行荧光标记。按照试剂盒的说明书进行操作,步骤具体如下:
1)取5μg核酸样本,加入DNase/RNase-free去离子水至40μL,加入 10×LabelingBuffer A5μL,Label IT Reagent 5μL,总反应体积为50μL;
2)将反应体系至于37℃条件下孵育1小时;
3)使用G50Microspin纯化柱纯化标记后的样本,用于随后的液相杂交反应。
4.液相杂交
在40μL的液相杂交体系中,加入一定量的组合微球,加入一定量标记的核酸样本。使反应体系在一定的杂交温度下孵育一定的时间,完成杂交反应。
操作步骤:
1)用1.5×TMAC杂交液分别将各组微球稀释至150个/μL;
2)样品反应管、阳性对照管、阴性对照(其中阴性对照中微球不带有核酸探针)管各加入20μL混合微球工作液;
3)向每个阳性对照管加入3μL捕获探针互补寡核苷酸(10pmol/L),向其他每管加入3μL CY5标记的核酸样本,每管补加7μL 1×TE Buffer,混匀;
4)置于PCR仪中,95℃变性5min,52℃杂交25min;
5)8000r/min离心微球1~2min,弃上清液。用1mL 1×PBS重悬微球, 8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
6)用150μL 1×PBS重悬微球,转移至96孔板,上机检测。
5.杂交信号分析
使用Biotek公司Cytation 1成像系统以及Gen5 3.0图像数据存储和分析系统,获得微球载体的杂交荧光图像。分析获得的荧光图像,对目标核酸进行定性分析。分析过程具体如下:
1)调节参数:调节曝光以及焦点等参数,使微球的各个荧光通道均能清晰地显示。
2)成像:对整个小孔或者划定区域进行多荧光通道成像,软件形成一张多荧光通道的图片。
3)圈微球:通过分析软件把图片中的所有微球用圆圈圈出,每个微球的粒径,荧光颜色,荧光强度会被记录下来,通过EXCEL文件导出。
4)数据分析:在本案例中,粒径为12μm,带绿色荧光,荧光强度为40000 的微球被解码为沙门氏菌捕获微球。粒径为10μm,带橙色荧光,荧光强度为 30000的微球被解码为金黄色葡萄球菌捕获微球,获得每个候选群体中间80%的微球个体数据,用于后续分析。
5)结果分析:微球载体与待测核酸分子的杂交荧光图像如图1所示,图中有两种不同颜色和粒径的荧光微球A和B,A微球粒径为12μm,带绿色荧光,荧光强度为40000,B微球粒径为10μm,带橙色荧光,荧光强度为30000。在案例中,如果检测到靶标,两种微球都会带上CY5荧光信号。统计每个候选群体中间80%的微球个体的Cy5荧光平均值,与阴性微球的Cy5荧光值的3倍相比较,如大于则为阳性,小于则为阴性。检测结果中两种微球对应的三种荧光强度如表1所示,因此,本实施例中病原样本中沙门氏菌呈阳性,金黄色葡萄球菌呈阳性。
表1
实施例2:临床病原微生物的检测
为了实现病原微生物的定量检测,本发明开展了本实施例研究。实验材料和实验过程具体如下。
A、微球载体:天津市倍思乐色谱技术开发中心公司提供的醛基二氧化硅微球。
B、病原微生物特异性捕获探针,其序列如SEQ ID NO:3~SEQ ID NO: 6所示:
乙肝病毒Cap-HBV-1:
5'-NH2-(CH2)12-aaaaaaaaaaccggaaagcttgactttattcacc-3'
乙肝病毒Cap-HBV-2:
5'-NH2-(CH2)12-aaaaaaaaaaccggaaagcttgtcaataaagtt-3'
丙肝病毒Cap-HCV-1:
5'-NH2-(CH2)12-aaaaaaaaaaacccaacactactctggctag-3'
丙肝病毒Cap-HCV-2:
5'-NH2-(CH2)12-aaaaaaaaaaatcactcccctgtggaaggaac-3'
C、样本标记试剂:Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒。
D、图像采集和数据分析:Biotek公司Cytation 1成像系统以及Gen5 3.0 图像数据存储和分析系统。
1.微球载体的编码
二氧化硅微球购买自天津市倍思乐色谱技术开发中心公司,微球表面带有醛基,它们具有不同的粒径、荧光颜色和荧光强度。捕获探针5'加入了氨基修饰,将捕获探针和微球进行混合,经过脱水缩合反应形成一个稳定的酰胺键,这样就把捕获探针包载到指定的微球上。用不同的粒径,荧光颜色和荧光强度的微球可以对不同捕获探针进行包载。本次实验我们用粒径为50μm、带蓝色荧光、荧光强度为25000的微球包载乙肝病毒Cap-HBV-1捕获探针,以检测样品中乙肝病毒Cap-HBV-1的含量;用粒径为70μm、带绿色荧光、荧光强度为50000的微球包载乙肝病毒Cap-HBV-2捕获探针,以检测样品中乙肝病毒 Cap-HBV-2的含量;用粒径为90μm、带红色荧光、荧光强度为20000的微球包载丙肝病毒Cap-HCV-1捕获探针,以检测样品中丙肝病毒Cap-HCV-1的含量;用粒径为110μm、带橙色荧光、荧光强度为30000的微球包载丙肝病毒 Cap-HCV-2捕获探针,以检测样品中丙肝病毒Cap-HCV-2的含量。
微球载体编码操作步骤如下:
1)吸取5.0×106微球至棕色EP管中,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
2)加入50μL 0.1M的MES(pH4.5),悬摇、超声处理20s;
3)加入2μL 100μM相对应的特异性探针至重悬微球中,振荡以混匀;
4)向每个交联反应中依次加入2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液,振荡混匀,避光、室温放置30min;
5)向微球中加入1mL 0.02%Tween-20,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
6)用1mL 0.1%的SDS重悬微球,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
7)500μL 3mg/mL的BSA溶液和700μL ddH2O,震荡反应20min;
8)用1mL 1×PBS重悬微球,8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
9)用100μL TE(pH8.0)悬摇、振荡20s以重悬微球,避光储存于2~8℃冰箱3个月。
2.核酸样本提取
获得来源于乙型肝炎患者、丙型肝炎患者来源的组织样本,按照常规的技术方案,提取其中的核酸成分。
3.核酸样本的荧光标记
利用Mirus公司的Label IT Cy5试剂盒,对获得的核酸进行荧光标记。按照试剂盒的说明书进行操作,步骤具体如下:
1)取5μg核酸样本,加入DNase/RNase-free去离子水至40μL,加入 10 LabelingBuffer A 5μL,Label IT Reagent 5μL,总反应体积为50μL;
2)将反应体系至于37℃条件下孵育1小时;
3)使用G50Microspin纯化柱纯化标记后的样本,用于随后的液相杂交反应。
4.液相杂交
在40μL的液相杂交体系中,加入一定量的组合微球,加入一定量标记的核酸样本。使反应体系在一定的杂交温度下孵育一定的时间,完成杂交反应。
操作步骤:
1)用1.5×TMAC杂交液分别将各组微球稀释至150个/μL;
2)样品反应管、阳性对照管、阴性对照(其中阴性对照中微球不带有核酸探针)管各加入20μL混合微球工作液;
3)向每个阳性对照管加入3μL捕获探针互补寡核苷酸(10pmol/L),向其他每管加入3μL CY5标记的核酸样本,每管补加7μL 1×TE Buffer,混匀;
4)置于PCR仪中,95℃变性5min,52℃杂交25min;
5)8000r/min离心微球1~2min,弃上清液。用1mL 1×PBS重悬微球, 8000r/min离心微球1~2min,弃上清液;
6)用150μL 1×PBS重悬微球,转移至96孔板,上机检测。
5.杂交信号分析
使用Biotek公司Cytation 1成像系统以及Gen5 3.0图像数据存储和分析系统,获得微球载体的杂交荧光图像。分析获得的荧光图像,对目标核酸进行定性分析。分析过程具体如下:
1)调节参数:调节曝光以及焦点等参数,使微球的各个荧光通道均能清晰地显示。
2)成像:对整个小孔或者划定区域进行多荧光通道成像,软件形成一张多荧光通道的图片。
3)圈微球:通过分析软件把图片中的所有微球用圆圈圈出,每个微球的粒径,荧光颜色,荧光强度会被记录下来,通过EXCEL文件导出。
4)数据分析:在本案例中,粒径为50μm、带蓝色荧光,荧光强度为25000 的微球被解码为乙肝病毒Cap-HBV-1捕获微球;粒径为70μm、带绿色荧光,荧光强度为50000的微球被解码为乙肝病毒Cap-HBV-2捕获微球;粒径为 90μm、带红色荧光,荧光强度为20000的微球被解码为丙肝病毒Cap-HCV-1 捕获微球;粒径为110μm、带橙色荧光,荧光强度为30000的微球被解码为丙肝病毒Cap-HCV-2捕获微球。获得每个候选群体中间80%的微球个体数据,用于后续分析。
5)结果分析:统计每个候选群体中间80%的微球个体的Cy5荧光平均值,与阴性微球的Cy5荧光值的3倍相比较,如大于则为阳性,小于则为阴性。检测结果中两种微球对应的五种荧光强度如表2所示,因此,本实施例中临床病原微生物样本中乙肝病毒Cap-HBV-1呈阴性,乙肝病毒Cap-HBV-2呈阳性,丙肝病毒Cap-HCV-1呈阳性,丙肝病毒Cap-HCV-2呈阴性。
表2
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的应用范围包括且不限于以下方面。
1、临床病原微生物的检测,包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌、立克次体、螺旋体;还包括耐药基因的检测、细胞因子的检测、肿瘤标志物的检测和人类基因表达谱的检测。
2、食品相关微生物的检测,包括:1)菌落总数的检测;2)大肠菌群的检测;3)致病菌的检测,如沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、乳酸菌等的检测;4)霉菌及酵母菌的检测;5)病毒的检测,如肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马芷克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒,猪水泡病毒的检测。
3、农产品相关微生物的检测包括:1)菌落总数的检测;2)大肠菌群的检测;3)致病菌的检测,如沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、乳酸菌等的检测;4)霉菌及酵母菌的检测;5)病毒的检测,如肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马芷克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒,猪水泡病毒的检测。
4、畜禽病源微生物的检测,具体包括以下微生物类型和种类:
一类是动物病原微生物的检测,包括口蹄疫病毒、高致病性禽流感病毒、猪水泡病病毒、非洲猪瘟病毒、非洲马瘟病毒、牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒、牛传染性胸膜肺炎丝状支原体、牛海绵状脑病病原、痒病病原。
二类是动物病原微生物的检测,包括猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、狂犬病病毒、绵羊痘/山羊痘病毒、蓝舌病病毒、兔病毒性出血症病毒、炭疽芽孢杆菌、布氏杆菌。
三类是动物病原微生物的检测,包括:
1)多种动物共患病病原微生物:低致病性流感病毒、伪狂犬病病毒、破伤风梭菌、气肿疽梭菌、结核分支杆菌、副结核分支杆菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、致病性链球菌、李氏杆菌、产气荚膜梭菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭状芽孢杆菌、腐败梭菌和其他致病性梭菌、鹦鹉热衣原体、放线菌、钩端螺旋体。
2)牛病病原微生物的检测,所述病原微生物包括牛恶性卡他热病毒、牛白血病病毒、牛流行热病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒腹泻/粘膜病病毒、牛生殖器弯曲杆菌、日本血吸虫。
3)绵羊和山羊病病原微生物的检测,所述病原微生物包括山羊关节炎/脑脊髓炎病毒、梅迪/维斯纳病病毒、传染性脓疱皮炎病毒。
4)猪病病原微生物的检测,所述病原微生物包括日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪丹毒杆菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪密螺旋体。
5)马病病原微生物的检测,所述病原微生物包括马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、马病毒性流产病毒、马鼻炎病毒、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、假皮疽组织胞浆菌、溃疡性淋巴管炎假结核棒状杆菌。
6)禽病病原微生物的检测,所述病原微生物包括鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、小鹅瘟病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽白血病/肉瘤病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、鸡传染性贫血病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合征病毒、禽痘病毒、鸡病毒性关节炎病毒、禽传染性脑脊髓炎病毒、副鸡嗜血杆菌、鸡毒支原体、鸡球虫。
7)兔病病原微生物的检测,所述病原微生物包括兔粘液瘤病病毒、野兔热土拉杆菌、兔支气管败血波氏杆菌、兔球虫。
8)水生动物病病原微生物的检测,所述病原微生物包括流行性造血器官坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、马苏大麻哈鱼病毒、病毒性出血性败血症病毒、锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾鮰病毒、病毒性脑病和视网膜病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒、白鲟虹彩病毒、中肠腺坏死杆状病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、核多角体杆状病毒、虾产卵死亡综合症病毒、鳖鳃腺炎病毒、Taura综合症病毒、对虾白斑综合症病毒、黄头病病毒、草鱼出血病毒、鲤春病毒血症病毒、鲍球形病毒、鲑鱼传染性贫血病毒。
9)蜜蜂病病原微生物的检测,所述病原微生物包括美洲幼虫腐臭病幼虫杆菌、欧洲幼虫腐臭病蜂房蜜蜂球菌、白垩病蜂球囊菌、蜜蜂微孢子虫、跗腺螨、雅氏大蜂螨。
10)其他动物病病原微生物的检测,所述病原微生物包括犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、猫泛白细胞减少综合症病毒、水貂阿留申病病毒、水貂病毒性肠炎病毒。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉尚码生物科技有限公司
<120> 一种微球编码载体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcccggtaaa cagatgagta ttg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatataccg cacttaaaaa ag 22
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaaaaaaa ccggaaagct tgactttatt cacc 34
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaaaaaa ccggaaagct tgtcaataaa gtt 33
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaaaaaaaa acccaacact actctggcta g 31
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaaaaaaaa atcactcccc tgtggaagga ac 32
Claims (8)
1.一种微球编码载体,其特征在于,是通过以下方法制备的:
1)获得一种已知粒径、荧光种类及荧光强度的微粒载体,所述微粒载体表面具有至少一种可偶联基团;所述微粒载体只包被一种荧光标记;
2)获得一种捕获探针分子,该捕获探针分子含有一段特异性的核酸序列和至少一种可偶联基团,所述核酸序列能够与被检测的目标核酸分子形成一定程度的互补配对,所述可偶联基团可与微粒载体表面的可偶联基团发生偶联作用;
3)在一定条件下,使捕获探针与微粒载体表面结合,获得能够特异性结合待测目标核酸分子的特异性检测载体。
2.根据权利要求1所述的一种微球编码载体,其特征在于,所述微粒载体选自琼脂糖凝胶微粒、葡聚糖凝胶微珠、纤维素微珠、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酸酯脂质体复合微粒、壳聚糖微粒、金磁微粒、玻璃珠、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球。
3.根据权利要求1所述的一种微球编码载体,其特征在于,所述微粒载体的直径为0.1μm~100μm。
4.根据权利要求1所述的一种微球编码载体,其特征在于,所述微粒载体包被的荧光标记颜色选自红、橙、蓝、绿、紫中的任一种。
5.根据权利要求1所述的一种微球编码载体,其特征在于,所述微粒载体表面的可偶联基团选自羟基、巯基、氨基、羧基、醛基。
6.根据权利要求1所述的一种微球编码载体,其特征在于,所述捕获探针分子的可偶联基团选自羟基、巯基、氨基、羧基、醛基。
7.一种核酸分子的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)获得权利要求1-6任一项所述的一种微球编码载体;
2)提取待测目标核酸样本;
3)对待测目标核酸进行荧光标记;
4)液相杂交:在核酸杂交条件下,使步骤3)获得的被荧光标记的待测目标核酸与步骤1)获得的微球编码载体接触,使待测目标核酸分子与偶联于微球编码载体表面的捕获探针进行杂交,获得待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体;
5)杂交信号分析:对步骤4)中的待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体进行检测,根据微球编码载体的微粒载体直径、荧光颜色、荧光强度来区分微球编码载体的种类,检测待测目标核酸的荧光种类和强度,确定待测目标核酸分子的存在和含量。
8.根据权利要求7所述的一种核酸分子的检测方法,其特征在于,所述步骤5)中采用宽场显微成像对步骤4)中的待测目标核酸分子与微球编码载体的结合体进行分析,具体方法为:获得微球载体的杂交荧光图像,对整个划定区域进行多荧光通道成像形成一张多荧光通道的图片,通过分析软件把图片中的所有微球用圆圈圈出,记录每个微球的粒径、荧光颜色、荧光强度从而区分不同类的微球,最后通过反应荧光强度进行待测目标核酸分子定量。
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