JP5852578B2 - 両性イオン含有アクリジニウム化合物 - Google Patents
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Description
化学発光アクリジニウムエステルは、イムノアッセイ及び核酸アッセイの両方のための極めて有用な標識であることが明らかになっている。アクリジニウムエステルからの光放出は、アルカリ性過酸化水素との反応によって誘発され、この反応は、フェノールエステル結合の開裂、及び発光種である励起状態アクリドンの形成を引き起こす。フェノール脱離基の離脱に続くジオキセタノン中間体の形成が、その反応機構において提案されており、そして励起状態アクリドンへの前駆体であると推定される。アクリジニウムエステルからの光放出の期間は、反応条件にもよるが、通常は数秒以内で完了し、そして照度計を使用して定量的に測定することができる。イムノアッセイにおけるアクリジニウムエステル、9−カルボキシフェニル−N−メチルアクリジニウムブロミドの適用が、Simpson, J.S.A.らによって開示された(Nature vol. 279, pp. 646-647 (1979)。しかしながら、このアクリジニウムエステルは、かなり不安定であり、それによってその商業的有用性を制限している。この不安定性は、フェノールとアクリジニウム環との間の不安定な9−カルボキシフェニルエステル結合の加水分解に起因する。
上述の目的及びその他にしたがって、化学発光アクリジニウム化合物の特性は、分子内に両性イオン基を取り込んで、その親水性を増大させ、結果として固相との非特異的結合を減少させることによって、改善されるということが驚くべきことに見出された。
[式中、
R1は、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、それらの各々は、最大20個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはR1は、基−Ra−Zであり;ここで、Raは、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される二価の基であり;
R2及びR3は、(i)水素、(ii)電子供与基、又は(iii)基−Zから独立して選択され;
Zは、以下の形態:
で示される両性イオン基であり、
Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH2−、酸素、硫黄、−NRN−、アミド(−NRN(CO)−)、カルバマート(−NRNC(O)O−)又はウレア(−NRNC(O)NRN−)から選択され;
R’及びR”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され;
Z1は、基−Ra−Z2(ここで、Z2は、カルボキシラート(−COO−)、スルホナート(−SO3 −)、スルファート(−OSO3 −)、ホスファート(−OP(O)(OR)(O−))もしくはオキシド(−O−)から選択される)であるか;又は、Z2が、オキシド(−O−)である場合、Raは、存在しなくてもよく;
nは、各々出現ごとに独立して、1〜12の間の整数から選択され;そして
R4及びR8は、同じか、又は異なり、そして水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル(−OR)、アルキルチオール(−SR)又は置換アミノ基(−NR2)から選択され;
R5、R6及びR7は、水素又は基−(CO)−R15から独立して選択されるが、但し、R5、R6及びR7のうちの2つは、水素であり、そしてR5、R6及びR7のうちの1つは、前記基−(CO)−R15であり;
R15は、基−Z又は基−XaR*であり、ここで、Xaは、酸素、硫黄又は−NRN−であり、そしてR*は、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択されるか、あるいはR*は、基−Ra−Lであり、ここで、Lは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基であるが;但し、R15が、基−Zであるとき、Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH2−、酸素、硫黄又は−NRN−から選択され;
Rは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され;そして
RNは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択されるが;
但し、R1、R2、R3、R5、R6及びR7のうちの少なくとも1つは、基Zである]を有するアクリジニウムエステルである。
[式中、
R1は、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、これらの各々は、最大20個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはR1は、基−Ra−Zであり;
R2及びR3は、(i)水素、(ii)電子供与基、又は(iii)基−Zから独立して選択され;
Y及びY’は、R、−Ra−Z又は−Ra−Lから独立して選択され;ここで、Lは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基、求電子基又は求核基を含む、誘導体化可能官能基(derivitizable functional group)であり;
Zは、以下の形態:
で示される両性イオン基であり、
Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH2−、酸素、硫黄、−NRN−、アミド(−NH(CO)−)、カルバマート(−NHC(O)O−)又はウレア(−NHC(O)NH−)から選択され;
R’及びR”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され;
Z1は、基−Ra−Z2であり、ここで、Z2は、カルボキシラート(−COO−)、スルホナート(−SO3 −)、スルファート(−OSO3 −)、ホスファート(−OP(O)(OR)(O−))又はオキシド(−O−)から選択されるか;あるいは、Z2が、オキシド(−O−)である場合、Raは、存在しなくてもよく;
nは、各々出現ごとに独立して、1〜12の間の整数から選択され;
Rは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され;
RNは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され;
そしてRaは、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される、二価の基であるが;
但し、R1、R2、R3、Y及びY’のうちの少なくとも1個は、前記両性イオン基Zを含む]を有するアクリジニウムスルホンアミドである。
本発明の主な目的は、両性イオン含有アクリジニウム化合物の構造であって、これらの構造的特徴を欠くアクリジニウム化合物と比較した場合、固相に対する低い非特異的結合を示す、両性イオン含有アクリジニウム化合物の構造を開示することである。本発明の別の目的は、2つの種類の両性イオン修飾のアクリジニウム化合物:(a)アクリジニウム環内に両性イオンを含有するアクリジニウム化合物、及び(b)フェノール脱離基に結合している両性イオンを含有するアクリジニウム化合物を開示することである。本発明の別の目的は、フェノールに結合している両性イオンを有するアクリジニウム化合物からの光放出が、この構造的修飾を持たないアクリジニウム化合物と比較した場合、予想外に速いことを開示することである。本発明のさらに別の目的は、両性イオン含有アクリジニウム化合物が、両性イオンを持たないアクリジニウム化合物と同程度に安定であり、そして同様の量子収率を有するということを実証することである。
[式中、
R1は、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、それらの各々は、最大20個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはR1は、基−Ra−Zであり;ここで、Raは、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される二価の基であり;
R2及びR3は、(i)水素、(ii)電子供与基、又は(iii)基−Zから独立して選択され;
Zは、以下の形態:
で示される両性イオン基であり、
Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH2−、酸素、硫黄、−NRN−、アミド(−NRN(CO)−)、カルバマート(−NRNC(O)O−)又はウレア(−NRNC(O)NRN−)から選択され;
R’及びR”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され;
Z1は、基−Ra−Z2(ここで、Z2は、カルボキシラート(−COO−)、スルホナート(−SO3 −)、スルファート(−OSO3 −)、ホスファート(−OP(O)(OR)(O−))もしくはオキシド(−O−)から選択される)であるか;又は、Z2が、オキシド(−O−)である場合、Raは、存在しなくてもよく;
nは、各々出現ごとに独立して、1〜12の間の整数から選択され;そして
R4及びR8は、同じか、又は異なり、そして水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル(−OR)、アルキルチオール(−SR)又は置換アミノ基(−NR2)から選択され;
R5、R6及びR7は、水素又は基−(CO)−R15から独立して選択されるが、但し、R5、R6及びR7のうちの2つは、水素であり、そしてR5、R6及びR7のうちの1つは、前記基−(CO)−R15であり;
R15は、基−Z又は基−XaR*であり、ここで、Xaは、酸素、硫黄又は−NRN−であり、そしてR*は、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択されるか、あるいはR*は、基−Ra−Lであり、ここで、Lは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基であるが;但し、R15が、基−Zであるとき、Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH2−、酸素、硫黄又は−NRN−から選択され;
Rは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され;そして
RNは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択されるが;
但し、R1、R2、R3、R5、R6及びR7のうちの少なくとも1つは、基Zである]を有するアクリジニウムエステルである。
からなる群より選択されるであろう。
(1)−OH;
(2)−O−N−スクシンイミジル;
(3)−NH−(CH2)5−C(O)−O−N−スクシンイミジル;
(4)−NH−(CH2)5−COOH;
(5)−NH−(C2H4O)i−C2H4NH−C(O)−(CH2)3−C(O)−O−N−スクシンイミジル(ここで、i=1〜5である);
(6)−NH−(C2H4O)i−C2H4NH−C(O)−(CH2)3−COOH(ここで、i=1〜5である);
(7)−NH−(C2H4O)i−C2H4NH2(ここで、i=1〜5である);及び
(8)−NH−R−NHR;ならびに
(9)−Z
からなる群より選択されるであろう。
[式中、R9、R10、R11 R12、R13及びR14は、各々出現ごとに独立して、メチル基又は基−(CH2CH2O)mCH3であり、ここで、mは、1〜5の整数である]から選択される分岐基である。
[式中、R1、R4、R8、R15、R’、R”、X、Z1及びnは、式(I)で定義したとおりであり、そしてR’、R”、X、Z1及びnは、各々出現ごとに独立して選択される]を有するであろう。
[式中、mは、0〜3の整数であり、そしてR15及びnは、式(I)について先に定義したとおりであり、m及びnは、各々出現ごとに独立して選択される]を有するであろう。一実施態様において、本化合物は、以下の構造:
[式中、nは、各々出現ごとに独立して選択される、1〜12の整数である]を有するであろう。
[式中、R1、R2、R4、R8、R15、R’、R”、X、Z1及びnは、先に定義したとおりである]で示される構造を有する。一実施態様において、式(Ib)で示される化学発光アクリジニウムエステル化合物は、以下の構造:
[式中、mは、0〜3の整数であり、そしてR2、R15及びnは、先に定義したとおりである]を有する。一実施態様において、本発明によるアクリジニウムエステル化合物は、以下の構造:
[式中、nは、1〜12の整数である]を有する。以下の構造:
[式中、nは、1〜12の整数である]を有する。式(IB)のさらに別の化合物は、以下の構造:
を有しており、そしてXが、結合(すなわち、Xが全く存在しない)又はメチレン単位−CH2−である場合を表している。
[式中、n’、m’及びq’は、独立して1〜4の整数であり、そしてR1、R2、R3、R4、R8、RN、R*、R’ X及びZ1は、先に定義したとおりである]で示される構造を有する。一実施態様において、R*は、基−Ra−Lを含み、ここで、Lは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基である。この実施態様による代表的化合物は、以下の構造:
[式中、R1、R2、R3、R4及びR8は、先に定義したとおりである]を有する。いくつかの実施態様において、R4及びR4は、独立して、低級アルキル基、特にメチルであり;R1は、アルキル(例えば、メチル)、スルホプロピル(−CH2CH2CH2−SO3 −)又はスルホブチル(−CH2CH2CH2CH2−SO3 −)であり;R2及びR3は、水素又は基−O−G(ここで、Gは、先のように定義されている)から独立して選択され;そして、R16は、(i)水素、(ii)−C(O)−CH2CH2CH2−C(O)−N−スクシンイミジル、(iii)−R−N−マレイミド(ここで、Rは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアラルキルであり、これらの各々は、最大20個までのヘテロ原子を場合により含むことができる)又は(iv)−C(O)−CH2−X(ここで、Xは、臭素(Br)もしくはヨウ素(I)である)から選択される。
[式中、R2及びR3は、先のように定義したとおりである]を有する。一実施態様において、R2及びR3は、水素又は基−O−G(ここで、Gは、本明細書で定義したとおりである)から独立して選択される。
式中、R1〜R8及びZは、式(I)に対して定義したとおりであるが;但し、R1が、アルキルスルホナート基であるときは、Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH2−、酸素又は−NRN−から選択される。
[式中、R2、R3、R4、R8、R15、R’、R”、RN、Z1及びnは、式(I)で定義したとおりである]で示される構造を有するであろう。式(Ie)の例示的化合物は、以下の構造:
を有し、この化合物は、アクリジニウム核の正に荷電した窒素と釣り合わせるために対イオンA−を場合により含む。対イオンの選択に本質的には限定はないが、いくつかの実施態様において、A−は、CH3SO4 −、FSO3 −、CF3SO4 −、C4F9SO4 −、CH3C6H4SO3 −、ハロゲン化物、CF3COO−、CH3COO−、及びNO3 −からなる群より選択される。
にしたがって、2個の両性イオン基を有し、本化合物は、アクリジニウム核の正に荷電した窒素と釣り合わせるために対イオンA−を場合により含む。
[式中、
R1は、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、それらの各々は、最大20個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはR1は、基−Ra−Zであり;
R2及びR3は、(i)水素、(ii)電子供与基、又は(iii)基−Zから独立して選択され;
Y及びY’は、R、−Ra−Z又は−Ra−Lから独立して選択され;ここで、Lは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基、求電子基又は求核基を含む、誘導体化可能官能基であり;
Zは、以下の形態:
で示される両性イオン基であり、
Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH2−、酸素、硫黄、−NRN−、アミド(−NH(CO)−)、カルバマート(−NHC(O)O−)又はウレア(−NHC(O)NH−)から選択され;
R’及びR”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され;
Z1は、基−Ra−Z2(ここで、Z2は、カルボキシラート(−COO−)、スルホナート(−SO3 −)、スルファート(−OSO3 −)、ホスファート(−OP(O)(OR)(O−))もしくはオキシド(−O−)から選択される)であるか;又は、Z2が、オキシド(−O−)である場合、Raは、存在しなくてもよく;
nは、各々出現ごとに独立して、1〜12の間の整数から選択され;そして
Rは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され;
RNは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され;そして
Raは、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される、二価の基であるが;
但し、R1、R2、R3、Y及びY’のうちの少なくとも1つは、前記両性イオン基Zを含む]で示される構造を有するであろう。
からなる群より選択されうる。
[式中、RN、R’、R”、Z1及びnは、式(II)について定義したとおりである]を有する基から選択されるであろう。
[式中、nは、1〜12の整数であり、そしてmは、0〜3の整数である]であってもよい。
[式中、Yは、基−Ra−Z(ここで、Ra、R2、R3及びZは、先で定義したとおりである)を含む]で示される構造を有する。
[式中、R*は、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、水素、C1−35アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択されるか、あるいはR*は、基−Ra−L(ここで、Lは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基である)であり;n’、m’及びq’は、独立して、1〜4の整数であり、そしてR、RN、R1、R2、R3、R’及びZ1は、先に定義したとおりである]で示される構造を有する。
(a)(i)分析物に対して特異的な結合分子及び(ii)本発明の両性イオン含有アクリジニウムエステル又はスルホンアミド化合物の任意のものを含む抱合体を提供する工程;
(b)固体担体であって、その上に前記分析物に対して特異的な第2結合分子を固定した、固体担体を提供する工程;
(c)上記抱合体、固相、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程;
(d)上記固体担体上に捕獲された結合複合体を分離する工程;
(e)化学発光誘発試薬を加えることによって、工程(d)からの結合複合体の化学発光を誘発する工程;
(f)照度計を用いて光放出の量を測定する工程;及び
(g)放出された光の量を分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算する工程
を含む。
(a)分析物と本発明の両性イオン含有アクリジニウムエステル又はスルホンアミド化合物の任意のものとの抱合体を提供する工程;
(b)分析物に対して特異的な結合分子で固定された固体担体を提供する工程;
(c)上記抱合体、固体担体、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程;
(d)固体担体上に捕獲された結合複合体を分離する工程;
(e)化学発光誘発試薬を加えることによって、工程(d)からの結合複合体の化学発光を誘発する工程;
(f)照度計を用いて光の量を測定する工程;及び
(g)放出された光の量を分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算する工程
を含む。
a)分析物又は分析物類似体で固定された固体担体を提供する工程;
b)分析物に対して特異的な結合分子と本発明の両性イオン含有アクリジニウムエステル又はスルホンアミド化合物との抱合体を提供する工程;
c)上記固相、抱合体、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程;
d)固体担体上に捕獲された結合複合体を分離する工程;
e)化学発光誘発試薬を加えることによって、(d)の結合複合体の化学発光を誘発する工程;
f)照度計を用いて光の量を測定する工程;及び
g)放出された光の量を分析物の既知濃度と関連させる標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算する工程、
を含むアッセイで、小分子分析物の検出に有用である。
ZC3−AE−NHS、化合物1dの合成
a)化合物1a
無水テトラヒドロフラン(10mL)中の2,7−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル(0.1g、0.24mmol)、(米国特許第7,309,615号)、3−ジメチルアミノプロパノール(0.112mL、4当量)及びトリフェニルホスフィン(0.252g、4当量)の溶液を、窒素雰囲気下、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(0.188mL、4当量)で処理した。この反応物を室温で16時間撹拌した。溶離剤として酢酸エチルを使用するシリカでのTLC分析は、出発物質を示さず、そして75%酢酸エチル、24%メタノール及び1%トリエチルアミンを使用して、極性生成物(Rf 約0.15)が観察された。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を1N HCl(25mL)と酢酸エチル(25mL)で分液した。生成物を含有する水層を、さらに2回酢酸エチル(2×25mL)で抽出した。次に、酸性水層を、鮮黄色の懸濁液が形成されるまで、2.5%水酸化ナトリウム水溶液を滴下して処理した。この懸濁液を、酢酸エチル(3×25mL)で抽出した。次に、少量のこの溶液を、Phenomenex、C184.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→60%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用するHPLCによって分析した。生成物が、Rt=25分で溶離して観察され、それは主要成分であった。酢酸エチル溶液を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して黄色の粘着性固体を得た。収量=126mg(89%);MALDI-TOF MS 588.3 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](1〜2mL)中の化合物1a(0.126g、0.215mmol)、蒸留した1,3−プロパンスルトン(0.785g、30当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(0.470mL、10当量)の混合物を、窒素雰囲気下、150℃で24時間加熱した。次に、この反応物を室温に冷ました。少量(1〜2μL)の反応混合物を抜き取り、メタノール(0.1mL)で希釈し、そしてセクション(a)において先に記載した勾配を使用して分析HPLCによって分析した。主要生成物は、Rt=18分にて溶離して観察され、それは、MALDI-TOF MS分析によると(953.5 実測値)、トリアルキル化アクリジニウムエステル生成物1bに一致した。粗反応混合物を酢酸エチル(30mL)と水(30mL)で分液した。生成物を含有する水層を、さらに3回酢酸エチル(3×30mL)で抽出した。水層を減圧下で濃縮して粗アクリジニウムエステル1bを得た。この物質を1N HCl(15mL)に溶解し、そして窒素下、1.5時間還流し、そして次に室温に冷ました。反応混合物のHPLC分析はメチルエステルの完全な加水分解を示し、そして生成物1cがRt=16分にて溶離された。反応混合物を約10mLに濃縮し、そして生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速でのセクション(a)に記載したのと同じ勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量=116mg(全体で57%);MALDI-TOF MS 941.2 実測値。
DMF(3mL)及び水(0.3mL)中のアクリジニウムカルボン酸1c(30mg、32μmol)の部分溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(7μL、1.5当量)及びTSTU(19mg、2当量)で処理した。この反応物を室温で激しく撹拌した。24時間後、セクション(a)に記載した勾配を使用する反応混合物のHPLC分析は、溶離Rt=17.5分にて生成物(約20%変換)を示した。次に、反応物を水(2.7mL)で希釈し、それによって清澄な溶液を得て、そして次にさらなるジイソプロピルエチルアミン(10μL、2当量)及びTSTU(50mg、5当量)で処理した。反応物を室温で0.5時間撹拌し、そして次に、HPLCによって分析すると、約40%変換を示した。次に、生成物を、セクション(b)に記載した勾配及びカラムを使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥して鮮黄色の粉末を得た。収量=11mg(33%);MALDI-TOF MS 1037.4 実測値。
ZC6−AE−NHS、化合物2dの合成
a)化合物2a
無水テトラヒドロフラン(5mL)中の2,7−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、(30mg、72μmol)、6−ジメチルアミノ−1−ヘキサノール(42mg、4当量)及びトリフェニルホスフィン(75mg、4当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(0.06mL、5当量)で処理した。反応物を、窒素雰囲気下、室温で16時間撹拌した。70%酢酸エチル、28%メタノール、2%トリエチルアミンを使用するシリカでのTLC分析が、極性生成物への完全な変換を示した。反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物はRt=25分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、実施例1、セクション(a)に記載したように単離した。収量=36mg(75%)。
イオン性液体[BMIM][PF6](1g)中の化合物2a(36mg、54μmol)、蒸留した1,3−プロパンスルトン(0.2g、30当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(0.120mL、10当量)の混合物を、窒素雰囲気下、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして酢酸エチル(30mL)と水(50mL)で分液した。生成物を含有する水層を分離し、そして酢酸エチルで2回(2×30mL)洗浄した。セクション(a)に記載した勾配を使用するこの水溶液のHPLC分析は、Rt=19分にて溶離するトリアルキル化生成物への>80%変換を、そしてRt=24分にて溶離する約20%ジアルキル化生成物を示した。粗アクリジニウムエステル生成物2bを含有する水層を、減圧下で濃縮した。残留物を、1N HCl(10mL)に溶解し、そして窒素雰囲気下で2時間還流した。次に、反応混合物を室温に冷まし、そしてHPLCによって分析すると、それはRt=17分にて溶離するアクリジニウムカルボン酸への完全な変換を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速でセクション(a)に記載したのと同じ勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物2cを得た。収量=39.4mg(全体で71%);MALDI-TOF MS 1025.1 実測値。
15% 水/DMF(4mL)中の化合物2c(39mg、38μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(0.033mL、5当量)及びTSTU(57mg、5当量)で処理した。反応物を室温で15分間撹拌し、そしてセクション(a)に記載したようにHPLCによって分析した。NHSエステル生成物2dへの完璧な変換を、溶離してRt=18.4分にて観察した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速でセクション(a)に記載したのと同じ勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥して化合物2dを得た。収量=28mg(66%);MALDI-TOF MS 1120.8 実測値。
ZC8−AE−NHS、化合物3dの合成
a)化合物3a
無水テトラヒドロフラン(5mL)中の2,7−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、(30mg、72μmol)、8−ジメチルアミノ−1−オクタノール(50mg、4当量)及びトリフェニルホスフィン(75mg、4当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(disopropyl azodicarboxylate)(0.06mL、5当量)で処理した。反応物を窒素雰囲気下で16時間撹拌した。少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物を溶離して、Rt=22.5分にて観察され、それは主要成分であった。生成物3aを、実施例1、セクション(a)に記載したように単離した。収量=58mg(定量的)、MALDI-TOF MS 728.6 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](1g)中の化合物3a(58mg、80μmol)、蒸留した1,3−プロパンスルトン(0.291g、30当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(0.175mL、10当量)の混合物を、窒素雰囲気下、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして酢酸エチル(30mL)と水(30mL)で分液した。生成物を含有する水層を分離し、そして酢酸エチルで2回(2×30mL)洗浄した。セクション(a)に記載した勾配を使用するこの水溶液のHPLC分析は、溶離してRt=1.5分にてアクリジニウムエステル生成物3bを示した(MALDI-TOF MS 1094 実測値)。水層を減圧下で濃縮し、そして回収した褐色の油状物を、窒素下、1N HCl(10mL)中で還流した。2時間後、反応物を室温に冷まし、そしてHPLCによって分析すると、溶離してRt=16分にて生成物を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物3cを得た。収量=30mg(全体で39%);MALDI-TOF MS 1082.4 実測値。
15% 水/DMF(2mL)中の化合物3c(23mg、21.3μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(18.6μL、5当量)及びTSTU(32mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→60%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物を、Rt=29分にて溶離して観察すると、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥して生成物3dを得た。収量=15mg(60%);MALDI-TOF MS 1178.8 実測値。
ZC12−AE−NHS、化合物4eの合成
a)12−ジメチルアミノ−1−ドデカノール、4a
無水テトラヒドロフラン(10mL)中の12−ブロモ−1−ドデカノール(1g、3.8mmol)の溶液を、テトラヒドロフラン(10mL)中のジメチルアミンの2.0M 溶液で処理した。反応物を室温で3日間撹拌した。溶離剤として25%酢酸エチル、75%ヘキサンを使用するシリカでのTLC分析が、ほとんど出発物質を含まない極性生成物の形成を示した。反応物を酢酸エチル(75mL)で希釈し、そして重炭酸ナトリウム水溶液及び水で2回洗浄した。次に、その酢酸エチル溶液を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。収量=1.2g(ロウ)。シリカでのTLC分析(25%メタノール、75%酢酸エチル)は、Rf 約0.1で縞状生成物(streaking product)を示した。この生成物4aを精製せずに使用した。
無水テトラヒドロフラン(5mL)中の2,7−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、(30mg、72μmol)、12−ジメチルアミノ−1−ドデカノール(66mg、4当量)及びトリフェニルホスフィン(75mg、4当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(0.06mL、5当量)で処理した。2時間後、反応物を、追加のトリフェニルホスフィン 4当量及びジイソプロピルアゾジカルボキシラート 5当量で処理した。30分後、少量を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用するHPLCによって分析した。生成物を溶離してRt=30分にて観察され、それは主要成分であった。生成物4bを、実施例1、セクション(a)に記載したように単離した。収量=57mg(95%)、MALDI-TOF MS 840.3 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](1mL)中の化合物4b(57mg、68μmol)、1,3−プロパンスルトン(0.250g、30当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(0.15mL、10当量)の混合物を、窒素下、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして実施例2、セクション(b)に記載したように処理した。セクション(a)に記載した勾配を使用した粗反応混合物のHPLC分析が、Rt=24分で溶離するアクリジニウムエステル生成物4cを示した(MALDI-TOF MS 1206.2 実測値)。粗生成物4cを、1N HCl(10mL)中で4時間還流した。次に、反応物を室温に冷まし、そしてHPLCによって分析すると、Rt=21分で溶離する生成物4dへの約70%変換を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して、化合物4dを得た。収量=22mg(全体で27%);MALDI-TOF MS 1193.4 実測値。
DMF(3.4mL)及び水(0.6mL)中の化合物4d(22mg、18.4μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(16μL、5当量)及びTSTU(28mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=22分で溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→1000%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥して生成物4eを得た。収量=15.4mg(64%);MALDI-TOF MS 1290.6 実測値。
ZC3M−AE−NHS、化合物5dの合成
a)化合物5a
無水テトラヒドロフラン(3mL)中の2−ヒドロキシアクリジンメチルエステル(25mg、62.3μmol)(米国特許第7,309,615号でのジヒドロキシ誘導体と同様の方法で合成した)、3−ジメチルアミノ−1−プロパノール(15μL、2当量)及びトリフェニルホスフィン(33mg、2当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(25μL、2当量)で処理した。反応物を、窒素下、室温で撹拌した。1時間後、溶離剤として1:1、酢酸エチル/メタノールを使用するシリカでのTLC分析は、Rf 約0.2の極性生成物の完全形成を示した。少量の反応混合物のHPLC分析は、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物をRt=25.2分にて溶離し観察すると、それは主要成分であった。反応物を酢酸エチル(25mL)及び1N HCl(25mL)で希釈した。生成物を含むHCl層を分離し、そして酢酸エチルで2回(2×25mL)洗浄した。次に、HCl層を氷中で冷却し、そして懸濁が形成されるまで5%KOH水溶液で処理した。この懸濁液を酢酸エチル(2×25mL)で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を水(25mL)で洗浄した。次に、それを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して化合物5aを得た。収量24.5mg(82%);MALDI-TOF MS 487.5 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](0.5mL)中の化合物5a(24.5mg、51.3μmol)、1,3−プロパンスルトン(125mg、20当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(79μL、7当量)の混合物を、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量(1〜2μL)を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション(a)に記載したようにHPLCによって分析した。アクリジニウムエステル生成物5bを、Rt=18分にて溶離し観察した(>80%変換;MALDI-TOF MS 731.04 実測値)。反応物を酢酸エチル(25mL)と水(25mL)で分液した。生成物を含有する水層を分離し、そして酢酸エチル(50mL)で1回洗浄した。次に、それを減圧下で濃縮した。残留物を、窒素下、1N HCl 10mL中で2時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のHPLC分析が、Rt=15分で溶離する生成物5cの完全形成を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物5cを得た。収量=32mg(全体で89%);MALDI-TOF MS 717.1 実測値。
DMF(3.4mL)及び水(0.6mL)中の化合物5c(32mg、44.6μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(39μL、5当量)及びTSTU(67mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物がRt=17分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物5dを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結しそして凍結乾燥した。収量=25mg(69%);MALDI-TOF MS 814.1 実測値。
ZC6M−AE−NHS、化合物6dの合成
a)化合物6a
無水テトラヒドロフラン(3mL)中の2−ヒドロキシアクリジンメチルエステル(25mg、62.3μmol)、6−ジメチルアミノ−1−ヘキサノール(18mg、2当量)及びトリフェニルホスフィン(33mg、2当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(25μL、2当量)で処理した。反応物を、窒素下、室温で1時間撹拌し、そして次にセクション(a)、実施例5に記載したように処理した。少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=22分にて溶離され観察すると、それは主要成分であった。収量33.5mg(定量的);MALDI-TOF MS 529.5 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](0.5mL)中の化合物6a(33.5mg、63.3μmol)、1,3−プロパンスルトン(155mg、20当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(97μL、7当量)の混合物を、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量(1〜2μL)を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション(a)に記載したようにHPLCによって分析した。アクリジニウムエステル生成物6bが、Rt=16分で溶離して観察された(>80%変換;MALDI-TOF MS 773.5 実測値)。反応混合物を、セクション(b)、実施例5に記載したように処理した。アクリジニウムエステル6bを、窒素下、1N HCl 10mL中で2時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のHPLC分析が、Rt=14分で溶離する生成物6cの完全な形成を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物6cを得た。収量=26.8mg(全体で56%)。
DMF(3.4mL)及び水(0.6mL)中の化合物6c(26.9mg、35.3μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(31μL、5当量)及びTSTU(53mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=15.4分で溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物6dを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=19.3mg(63%);MALDI-TOF MS 856.2 実測値。
ZC8M−AE−NHS、化合物7dの合成
a)化合物7a
無水テトラヒドロフラン(5mL)中の2−ヒドロキシアクリジンメチルエステル(30mg、75μmol)、8−ジメチルアミノ−1−オクタノール(26mg、2当量)及びトリフェニルホスフィン(40mg、2当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(30μL、2当量)で処理した。反応物を、窒素下、室温で1時間撹拌し、そして次に、セクション(a)、実施例5に記載したように処理した。少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=24分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。収量13mg(31%);MALDI-TOF MS 557.1 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](0.2mL)中の化合物7a(13mg、23.3μmol)、1,3−プロパンスルトン(57mg、20当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(36μL、7当量)の混合物を、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量(1〜2μL)を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション(a)に記載したようにHPLCにより分析した。アクリジニウムエステル生成物7bが、Rt=17.4分にて溶離して観察された(>80%変換;MALDI-TOF MS 800.8 実測値)。反応混合物を、セクション(b)、実施例5に記載したように処理した。アクリジニウムエステル7bを、窒素下、1N HCl 5mL中で2時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のHPLC分析が、Rt=15.3分で溶離する生成物7cの完全な形成を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物7cを得た。収量=6.8mg(全体で37%);MALDI-TOF MS 787.8 実測値。
DMF(1.7mL)及び水(0.3mL)中の化合物7c(6.8mg、8.6μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(7.5μL、5当量)及びTSTU(13mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。30分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=16.5分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物7dを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=5mg(66%);MALDI-TOF MS 885.0 実測値。
AZC3−AE−NHS、化合物8dの合成
a)化合物8a
化合物、2−ヒドロキシ−7−メトキシアクリジンメチルエステルを、米国特許第7,319,041(B2)号に記載されている反応を使用して、2−ベンジルオキシ−7−メトキシアクリジン−9カルボン酸及びメチル2,6−ジメチル−4−ヒドロキシベンゾアートから合成した。無水テトラヒドロフラン(5mL)中の2−ヒドロキシ−7−メトキシアクリジンメチルエステル(25mg、0.058mmol)、3−ジメチルアミノ−1−プロパノール(13.6μL、2当量)及びトリフェニルホスフィン(30mg、2当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(23μL、2当量)で処理した。反応物を、窒素下、室温で撹拌した。1時間後、それをセクション(a)、実施例5に記載したように処理した。少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物がRt=20分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。収量27mg(90%);MALDI-TOF MS 517.9 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](0.5mL)中の化合物8a(27mg、52.2μmol)、1,3−プロパンスルトン(128mg、20当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(80μL、7当量)の混合物を、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量(1〜2μL)を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション(a)に記載したようにHPLCによって分析した。アクリジニウムエステル生成物8bが、Rt=15.2分にて溶離して観察された。反応混合物を、セクション(b)、実施例5に記載したように処理した。アクリジニウムエステル8bを、窒素下、1N HCl 10mL中で2時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のHPLC分析は、Rt=13.5分で溶離する生成物8cの完全な形成を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物8cを得た。収量=22mg(全体で56%);MALDI-TOF MS 747.4 実測値。
DMF(3.6mL)及び水(0.4mL)中の化合物8c(22mg、29.5μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(26μL、5当量)及びTSTU(44mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。30分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=14.6分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物8dを含有するHPLC画分を合わせて、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=17.6mg(70%);MALDI-TOF MS 843.9.0 実測値。
AZC6−AE−NHS、化合物9dの合成
a)化合物9a
無水テトラヒドロフラン(3mL)中の2−ヒドロキシ−7−メトキシアクリジンメチルエステル(25mg、0.058mmol)、6−ジメチルアミノ−1−ヘキサノール(17mg、2当量)及びトリフェニルホスフィン(30mg、2当量)の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート(23μL、2当量)で処理した。反応物を窒素下、室温で撹拌した。2時間後、それをセクション(a)、実施例5に記載したように処理した。少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=22.5分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。収量20mg(63%);MALDI-TOF MS 559.8 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](0.5mL)中の化合物9a(20mg、35.9μmol)、1,3−プロパンスルトン(87mg、20当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(59μL、7当量)の混合物を、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量(1〜2μL)を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション(a)に記載したようにHPLCによって分析した。アクリジニウムエステル生成物9bが、Rt=15.7分にて溶離して観察された(MALDI-TOF MS 803.9 実測値)。反応混合物を、セクション(b)、実施例5に記載したように処理した。アクリジニウムエステル9bを窒素下、1N HCl 10mL中で2時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のHPLC分析は、Rt=14.9分で溶離する生成物9cの完全な形成を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物9cを得た。収量=18.3mg(全体で65%);MALDI-TOF MS 790.4 実測値。
DMF(3.6mL)及び水(0.4mL)中の化合物9c(18.3mg、23.2μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(20μL、5当量)及びTSTU(35mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。30分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=16分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物9dを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=14mg(68%);MALDI-TOF MS 887.6 実測値。
NSP−2Z−DMAE−NHS、化合物10fの合成
a)化合物10a
無水テトラヒドロフラン(10mL)中の4−ブロモベンジルブロミド(2g、8mmol)の溶液を、テトラヒドロフラン中のジメチルアミン(20mL)mL)の2.0M 溶液で処理した。反応物を室温で3日間撹拌した。次に、反応混合物を、酢酸エチル(75mL)で希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液 100mLで洗浄した。酢酸エチル層を分離し、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ヘキサン中の15%酢酸エチルを使用するシリカでのTLC分析は、出発物質を示さず、そしてRf=0.1の極性生成物の形成を示した。その酢酸エチル溶液を減圧下で濃縮して明黄色の油状物を得た。収量=1.63g。
無水DMF(20mL)中のイサチン(1.12g、7.6mmol)の溶液を、窒素下、氷浴中で冷却し、そして水素化ナトリウム(0.366g、1.2当量、鉱油中60%分散液)で処理した。反応物を氷浴中で30分間撹拌し、そして次に、化合物10a(1.63g、7.6mmol)をDMF(5mL)中の溶液として、ヨウ化銅(2.9g、2当量)と共に加えた。反応物を窒素下、140℃で24時間加熱した。次に、それを室温に冷まし、酢酸エチル(30mL)で希釈し、そして濾過した。溶離剤として酢酸エチル中の10%メタノールを使用する、濾液のシリカでのTLCは、Rf 約0.1の極性生成物を示した。濾液を減圧下で濃縮した。残留物を10%KOH水溶液 100mLに懸濁し、そして窒素下、4時間還流した。次に、反応混合物を室温に冷まし、そしてpH5になるまで2N HClで酸性化した。黄色の沈殿物が現れ、それを濾過により回収し、そして真空下で乾燥させた。収量=0.6g。この化合物をそのまま次の反応に使用した。
無水ピリジン(15mL)中の化合物10b(0.2g、0.714mmol)の懸濁液を、窒素下、p−トルエンスルホニルクロリド(272mg、2当量)で処理した。5分間簡単に撹拌した後、メチル2,6−ジメチル−4−ヒドロキシベンゾアート(128mg、0.714mmol)を加えた。得られた反応物を室温で3日間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を酢酸エチル(40mL)と1N HCl(50mL)で分液した。生成物を含有するHCl層を分離し、そして酢酸エチルで2回(2×40mL)洗浄した。次に、HCl溶液を氷浴中で冷却し、そして黄色の沈殿物が分離するまで5%KOH水溶液を滴下して処理した(pH約8)。この懸濁液を、酢酸エチル(2×50mL)で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を、水で1回洗浄し、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして粗生成物を、溶離剤として酢酸エチルを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収量=95mg(30%);MALDI-TOF MS 443.7 実測値。
イオン性液体[BMIM][PF6](0.5mL)中の化合物10c(22mg、49.5μmol)、1,3−プロパンスルトン(120mg、20当量)及び2,6−ジ−tert−ブチルピリジン(81.5μL、7.5当量)の混合物を、150℃で24時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量(1〜2μL)を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてPhenomenex、C184.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用するHPLCによって分析した。生成物10dが、Rt=17.2分にて溶離して観察された(約40%変換)。反応混合物を、セクション(b)、実施例5に記載したように処理した。アクリジニウムエステル10dを、窒素下、1N HCl 10mL中で2時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のHPLC分析は、Rt=14.0分で溶離する生成物10eの完全な形成を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物10eを得た。収量=14.5mg(全体で44%);MALDI-TOF MS 673.3 実測値。
DMF(1.8mL)及び水(0.2mL)中の化合物10e(14.5mg、21.5μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(18.8μL、5当量)及びTSTU(32mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=16.5分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物10fを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=14mg(85%);MALDI-TOF MS 769.5 実測値。
NSP−DMAE−Z−NHS、化合物11fの合成
a)化合物11a
クロロホルム(40mL)中のN,N−ビス(3−アミノプロピル)メチルアミン(1g、6.9mmol)の溶液を、ベンジルオキシカルボニルスクシンイミド(3.78g、2.2当量)で処理した。反応物を室温で16時間撹拌した。酢酸エチル中の15%メタノールを使用する反応混合物のシリカでのTLC分析は、完全反応での極性生成物の形成を示した。反応混合物を、クロロホルム(40mL)で希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。次に、それを、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して粘性油状物を得た。それは貯蔵すると凝固してロウ状の固体になった。収量=3.2g;MALDI-TOF MS 414.4 実測値。
無水DMF(15mL)中の化合物11a(1.2g、2.9mmol)の溶液を、1,3−プロパンスルトン(0.71g、2当量)で処理した。反応物を窒素下、145℃で1時間加熱した。少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=19.6分にて溶離(約80%変換)、出発物質がRt=21.6分にて溶離して観察された。反応混合物を減圧下で濃縮し、そして回収した油状物を、メタノール(20mL)に溶解した。40%メタノール、60%酢酸エチルを使用するシリカでのTLC分析は、出発物質(Rf 約0.3)から生成物(Rf 約0.2)の完全な分離を示した。上記の反応を、同じ規模で繰り返し、そして合わせた反応混合物を、溶離剤として40%メタノール、60%酢酸エチルを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率=1.55g(60%);白色の泡状物;MALDI-TOF MS 536.4 実測値。
化合物11b(0.8g、1.49mmol)を、33%HBr/AcOH 15mL中、室温で24時間撹拌した。次に、エーテル(100mL)を加えると、白色の粒状固体が分離した。生成物を沈降させ、そしてエーテルをデカントした。この手順を、エーテルで2回(2×50mL)繰り返した。最後に、生成物を真空下で乾燥させた。回収した粘性油状物を、水 5〜6mLに溶解し、−80℃に凍結し、そして凍結乾燥して、ガラス状固体を得た。収量=0.766g(定量的);MALDI-TOF MS 268.2 実測値。可視化のために25%アンモニア、75%メタノール及びニンヒドリンを使用するシリカでのTLC分析が、Rf 約0.2の単一スポットを示した。
DMF(3mL)中のNSP−DMAE(30mg、61μmol、米国特許第6,664,043(B2)号)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(16μL、1.5当量)及びTSTU(22mg、1.2当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物がRt=20分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。このNHSエステルのDMF溶液(1.5mL)の半分を、DMF(1mL)及び0.15M 重炭酸ナトリウム(1mL)に溶解した化合物11c(50mg、0.187mmol、遊離アミン形態)の溶液に、滴下した。反応物を室温で撹拌した。3時間後、HPLC分析は、12.4分で溶離して、生成物11dへの完全な変換を示した。10→40%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配を使用して、生成物をRt=19.2分で溶離した。
メタノール(3.6mL)及び水(0.4mL)中の化合物11d(45mg、60.6μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(53μL、5当量)及びグルタル酸無水物(35mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物11eがRt=14分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、DMF(3.6mL)及び水(0.4mL)に溶解した。この溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(106μL、10当量)及びTSTU(182mg、10当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。10分後、HPLC分析は、Rt=15.3分で溶離する生成物11fへの完全な変換を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→40%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物11fを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収率=28.7mg(50%);MALDI-TOF MS 955.2 実測値。
NSP−2,7−DMG−DMAE−Z−NHS、化合物12hの合成
a)1,3−ジメトキシグリセロール、化合物12a
無水メタノール(100mL)を、水酸化カリウムペレット(25g、0.446mol)で処理し、そしてその懸濁液を、全ての塩基が溶解するまで室温で撹拌した。次に、この溶液を氷浴中で冷却し、そしてエピクロロヒドリン(0.223mol、20.6g)を滴下した。添加の完了後、反応物を室温に温め、そして窒素下、油浴中で、75〜80℃で16時間加熱した。次に、反応物を、室温に冷まし、そして濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。回収した油状物を、酢酸エチル(150mL)に溶解し、そして再度濾過し、そして次に減圧下で濃縮した。無色の油状物(21.5g)を回収し、それを真空蒸留によって精製して、1,3−ジメトキシグリセロール、化合物12a 12.9g(50%)を得た。
無水ピリジン(20mL)中の1,3−ジメトキシグリセロール、化合物12a(1g、8.3mmol)の溶液を、p−トルエンスルホニルクロリド(2.38g、1.5当量)及び4−ジメチルアミノピリジン(0.253g、0.25当量)で処理した。反応物を窒素下、室温で3日間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を酢酸エチル(100mL)と1N HCl(50mL)で分液した。酢酸エチル層を分離し、そして1n HCl(50mL)で1回、続いて重炭酸ナトリウム水溶液(3×50mL)で洗浄した。次に、それを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗生成物(2.5g)を、溶離剤としてヘキサン中の20%酢酸エチルを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収量=1.79g(65%)。
無水DMF(6mL)中の2,7−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル(0.1g、0.24mmol)、化合物12b(0.4g、1.45mmol)及び炭酸セシウム(0.2g、2.5当量)の溶液を、窒素下、油浴中、90〜100℃で加熱した。5時間後、反応物を室温に冷ました。少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=26.5分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を、酢酸エチル(50mL)と水(50mL)で分液した。酢酸エチル層を分離し、そして水で2回(2×50mL)洗浄した。次に、それを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗生成物(0.37g)を、1:1、酢酸エチル/ヘキサンを使用するシリカでの分取TLCによって精製した。精製済み収量=58mg(40%);MALDI-TOF MS 623.1 実測値。
化合物12c(58mg、93.25μmol)、蒸留した1,3−プロパンスルトン(1.14g、100当量)及び重炭酸ナトリウム(78mg、10当量)の混合物を、140〜150℃で加熱した。2時間後、反応物を室温に冷ました。少量の反応混合物のHPLC分析は、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物12dが、Rt=20分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。反応混合物を、1:1、酢酸エチル/ヘキサン 20mLで処理し、そして混合物を短時間超音波処理してガム状物を分散させた。生成物を沈降させ、そして溶媒をデカントによって除去した。粗生成物を真空下で乾燥させ、そして次に、1N HCl 10mLに懸濁し、そして窒素下で3時間還流した。次に、それを、室温に冷まし、そしてHPLCによって分析すると、メチルエステルの完全な加水分解を示し、生成物12eがRt=17.0分で溶離した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物12eを含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量=56mg(82%);MALDI-TOF MS 730.9 実測値。
DMF(3mL)中の化合物12e(55mg、75.3μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(20μL、1.5当量)及びTSTU(27mg、1.2当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。10分後、少量の反応混合物のHPLC分析は、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。NHSエステルがRt=18分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、NHSエステルのDMF溶液を、水(1.68mL)及び0.5M 重炭酸ナトリウム(1.68mL)に溶解した化合物11c(168mg、0.376mmol、2HBr塩)の溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。30分後、HPLC分析は、12.4分で溶離する生成物12eへの完全な変換を示した。
メタノール(4.0mL)中の化合物12f(63.8mg、65.2μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(57μL、5当量)及びグルタル酸無水物(74mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→100%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物12gが、Rt=13.5分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、DMF(5.4mL)及び水(0.6mL)に溶解した。この溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(114μL、10当量)及びTSTU(200mg、10当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、HPLC分析は、Rt=14.3分で溶離する生成物12hへの完全な変換を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物12hを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=49.3mg(63%);MALDI-TOF MS 1188.9 実測値。
NSP−DMAE−Z2−NHS、化合物13eの合成
a)化合物13a
無水エーテル(5mL)中の2−クロロエタンスルホニルクロリド(0.126mL、1.2mmol)の溶液を、窒素雰囲気下、氷塩浴中、−5℃に冷却し、そして2,6−ルチジン(0.14mL、1.2mmol)で一度に処理した。反応物を、−5℃で30分間撹拌し、次に室温に温めた。次に、反応物を、グラスウールを通して濾過して、酢酸(5mL)に溶解した11a(0.325g、0.79mmol)の撹拌した溶液に注いだ。4〜5時間後、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエン(5mL)に懸濁し、そして減圧下で濃縮した。粗生成物を水(50mL)と酢酸エチル(50mL)で分液した。水層を分離し、そしてクロロホルム(50mL)で1回洗浄した。水層を、水酸化アンモニウムでpH9に調整し、そして酢酸エチル(3×50mL)で抽出した。次に、水層を減圧下で濃縮して白色の固体を得た。収量=0.18g、(43%);MALDI-TOF MS 522.8 実測値)。
化合物13a(78mg、0.15mmol)を、33% HBr/AcOH 5mL中、室温で24時間撹拌した。次に、エーテル(75mL)を加えると、白色の粒状固体が分離した。生成物を沈降させ、そしてエーテルをデカントした。この手順を、エーテルで2回(2×50mL)繰り返した。最後に、生成物を真空下で乾燥させた。収量=48mg(77%)。この物質をそのまま次の反応に使用した。
DMF(1mL)中のNSP−DMAE(14mg、28.4μmol、米国特許第6,664,043(B2)号)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(7.4μL、1.5当量)及びTSTU(10.3mg、1.2当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。30分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=20分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。このNHSエステルのDMF溶液を、0.25M 重炭酸ナトリウム(3mL)に溶解した化合物13b(48mg、0.116mmol、HBr塩)の溶液に滴下した。反応物を、室温で撹拌した。30分後、HPLC分析は、12.4分間で溶離する生成物13cへの完全な変換を示した。
メタノール(3.6mL)及び水(0.4mL)中の化合物13c(19mg、26.1μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(22.8μL、5当量)及びグルタル酸無水物(15mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。30分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物13dが、Rt=14.6分にて溶離して観察され、それは主要成分であった(>80%)。次に、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、DMF(3.6mL)及び水(0.4mL)に溶解した。この溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(45.6μL、10当量)及びTSTU(79mg、10当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、HPLC分析は、Rt=15.7分で溶離する生成物13eへの完全な変換を示した。生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→60%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物13eを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=15mg(60%)。
NSP−DMAE−ZCB−NHS、化合物14dの合成
a)化合物14a
MeCN(5mL)に溶解した11a(0.6g、1.45mmol)の溶液を、アクリル酸(1mL、1.45mmol)で処理した。反応物を室温で36時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして粗生成物を、溶離剤として3:2、MeOH:EtOAcを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量=0.432g、(61%);MALDI-TOF MS 486.1 実測値)。
化合物14a(0.43g、0.88mmol)を、33% HBr/AcOH 10mL中、室温で24時間撹拌した。次に、エーテル(100mL)を加えると、白色の粒状固体が分離した。生成物を沈降させ、そしてエーテルをデカントした。この手順をエーテルで4回(4×50mL)繰り返した。最後に、生成物を真空下で乾燥させた。次に、それを水(5mL)に溶解し、凍結し、そして凍結乾燥した。収量=0.35g(定量的);MALDI-TOF MS 218.3 実測値。
DMF(2mL)中のNSP−DMAE(25mg、51.0μmol、米国特許第6,664,043(B2)号)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(11.3μL、1.5当量)及びTSTU(18.3mg、1.2当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。30分後、このNHSエステルのDMF溶液を、0.25M 重炭酸ナトリウム(0.8mL)に溶解した化合物14b(80mg、0.2mmol、HBr塩)の溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。30分後、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施したHPLC分析は、12.0分間で溶離する生成物14cへの完全な変換を示した。
DMF(1.0mL)及びDMSO(2.0mL)中の化合物14c(20mg、29μmol)の溶液を、ジイソプロピルチルアミン(diisopropylthylamine)(8.6μL、2当量)で処理し、DMF(1mL)中のグルタル酸ジスクシンイミジル(38mg、0.117mmol)の撹拌した溶液に滴下した。この反応物を室温で撹拌した。60分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物14dが、Rt=15.0分にて溶離して観察され、それは主要成分であった(>70%)。この生成物を、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→60%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物14dを含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=4mg(15%);MALDI-TOF MS 905.5 実測値。
CN−NSP−DMAE−Z3−NHS、化合物15fの合成
a)化合物15a
塩化チオニル(5mL)中のNSP−DMAEメチルエステル(0.223g、0.44mmol)の懸濁液を、窒素雰囲気下、80℃で激しく撹拌しながら加熱した。1時間後、暗色の溶液が形成され、これを室温に冷ました。ヘキサン(50mL)を加え、そして暗褐色の粘着性固体を分離させた。ヘキサンをデカントし、そして残留物をヘキサン(25mL)で一回すすぎ、そして真空下で非常に軽く乾燥させた。この粘着性固体に、無水MeCN(10mL)中のN,N−ジメチルエチレンジアミン(10mL、過剰量)の溶液を加えた。暗褐色の溶液が形成され、これを室温で撹拌した。15分後、少量の反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→70%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の30分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物15aは、Rt=19分にて溶離して幅広いピーク(abroad peak)として観察された。反応混合物を減圧下で濃縮し、そして残留物をメタノール(5mL)に溶解し、トルエン(15mL)で希釈し減圧下で濃縮して褐色の粘着泡状物を得た。粗収量=0.46g。生成物を、溶離剤としてメタノールを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収量=0.22g、(87%);MALDI-TOF MS 577.9 実測値。
[BMIM][PF6](3mL)中の化合物15a、(0.22g、0.38mmol)、蒸留した1,3−プロパンスルトン(0.465g、10当量、及び2,6−ジ−tertブチルピリジン(0.42mL、5当量)の混合物を、155℃で16時間、激しく撹拌しながら加熱した。次に、それを室温に冷まし、そして酢酸エチル(100mL)を加えた。生成物が沈殿し、そして濾過により回収し、そして酢酸エチル(25mL)及びメタノール(20mL)ですすいだ。次に、粗生成物を、1:1 水/メタノール 50mLを含むRBフラスコに移した。少量の粗反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→40%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。生成物が、Rt=33分にて溶離して観察された(約90%変換)。減圧下でこの水溶液を蒸発させて、褐色の固体 0.35gを得た。MALDI-TOF MS 699.2 実測値。この物質をそのまま次の反応に使用した。
化合物15b(0.35g、粗)を1N HCl(20mL)に懸濁し、そして窒素雰囲気下で1.5時間加熱還流した。セクション(b)に示したHPLC分析が、Rt=27分間にて溶離する生成物を示した。この反応物を室温に冷ました。生成物15cを、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→60%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量=14mg;MALDI-TOF MS 685.7 実測値。
DMF(2mL)中の化合物15c(14mg、20μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(6μL、2当量)及びTSTU(12.3mg、2当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。10分後、少量の粗反応混合物のHPLC分析を、Phenomenex、C18 4.6mm×25cmカラム及び1.0mL/分の流速での10→40%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用して実施した。22分にて溶離するNHSエステルへの完全な変換が観察された。このDMF溶液を、0.25M 重炭酸ナトリウム(1mL)中の化合物11c(46mg、5当量、HBr塩)の撹拌した溶液に滴下した。得られた溶液を室温で撹拌した。15分後、HPLC分析が、Rt=14分にて溶離する主要生成物を示した。
メタノール(1.8mL)及び水(0.2mL)中の化合物15d(18mg、19.2μmol)の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(26μL、5当量)及びグルタル酸無水物(17mg、5当量)で処理した。反応物を室温で撹拌した。15分後、セクション(d)に記載したHPLC分析が、Rt=16.2分にて溶離するグルタル酸誘導体15eへの完全な変換を示した。この反応物をトルエン(5mL)で希釈し、そして減圧下で濃縮した。残留物をDMF(1.8mL)及び水(0.2mL)に溶解し、そしてジイソプロピルエチルアミン(52μL、10当量)及びTSTU(90mg、10当量)で処理した。この反応物を室温で撹拌した。30分後、HPLC分析が、Rt=19分にて溶離する生成物への完全な変換。生成物15fは、YMC、C18 30×300mmカラム及び20mL/分の溶媒流速での10→60%B(A=0.05%TFAを含む水、B=0.05%TFAを含むMeCN)の40分間勾配ならびに260nmでのUV検出を使用する分取HPLCによって精製した。生成物を含有するHPLC画分を合わせ、−80℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量=6.5mg(30%);MALDI-TOF MS 1146.6 実測値。
抗TSH Mabのアクリジニウムエステルでの標識化のための一般手順
抗体の原液(5mg/mL、200μL、1.0mg、6.7nmol)を、0.1M 炭酸ナトリウムpH9(250μL)で希釈して約2.0mg/mL溶液を得た。この溶液に、DMF/水 1:1溶液又はDMSOのいずれかにおける溶液としてアクリジニウムNHSエステル 10当量を加えた。例えば、NSP−DMAE−Z−NHS、11fを使用する場合、これは64μgの添加を必要とし、このアクリジニウムエステルの5mg/mL溶液(12.8μL)として加えた。標識化反応物を4℃で16時間穏やかに撹拌し、そして次に、脱イオン水で4mLに希釈した。次に、これらの希釈溶液を、4mL Centricon(商標)フィルター(MW30,000カットオフ)に移し、そして4000Gで遠心分離して容量を約0.2mLまで減らした。この手順をさらに3回繰り返した。最終的に、濾過された抱合体を、質量スペクトル分析及びRLU測定のために、総容量250μLの水に希釈した。
化学発光測定
各アクリジニウムエステル標識抗体を、0.1M リン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、6mM アジ化ナトリウム及び1g/L ウシ血清アルブミン(BSA)からなる緩衝液中、0.2nMの濃度に希釈した。試験した各アクリジニウムエステル−抗体抱合体10μLについての化学発光速度論を、試薬1(0.1M 硝酸及び0.5%過酸化水素)及び試薬2(0.25M 水酸化ナトリウム及び0.05%セチルトリメチル塩化アンモニウム)の各々 300μLを順次添加をして、Berthold Technolgies Autolumat LB953照度計を用いて、標準条件下、10秒ごと(for 10 seconds)0.1秒間隔でまとめた。試験したアクリジニウム化合物の化学発光速度論を、光放出の相対速度ならびに総光出力について比較した。
非特異的結合の測定
両性イオン性アクリジニウム化合物を、イムノアッセイにおける標識として、同じイムノアッセイにおいて別個に標識として使用した対照アクリジニウム化合物との比較のために、試験した。Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180(登録商標)TSH3アッセイは、ACS:180(登録商標)に適用するためのSiemens Healthcare Diagnosticsによって製造されている商業的に販売されている一連のイムノアッセイのうちの1つである。TSH3アッセイは、サンプル中の分析物TSH(甲状腺刺激ホルモン)の測定のために抗TSH抗体の化学発光アクリジニウム化合物を使用するサンドイッチイムノアッセイである。
アクリジニウム抱合体化学発光安定性の測定
両性イオン性アクリジニウム化合物及び対照アクリジニウム化合物NSP−DMAE−HEG及びHQY−AEの抱合体を、0.15M N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES)、0.15M 塩化ナトリウム、7.7mM アジ化ナトリウム、1.0mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、12mM t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Triton X-100)、5g/L ウシ血清アルブミン(BSA)、0.20g/L アムホテリシンB、0.48g/L 硫酸ゲンタマイシン、1g/L マウスIgG、10mg/L ヒツジIgG、5.0g/L マウス血清、0.05g/L antifoam Bを含有するpH7.7の緩衝液中、0.1nMの濃度に希釈した。次に、全ての抱合体を、密閉したポリエチレンボトル内で4週間、4℃又は37℃のいずれかで保存した。4℃又は37℃のいずれかで保存した各トレーサー 10μLを、Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180(登録商標)試薬1及び2を使用するSiemens Healthcare Diagnostics ACS:180(登録商標)と同じ化学発光測定方法を使用する、Bertholdt ALB953化学照度計での化学発光測定のために、定期的に取り除いた。次に、化学発光を、4℃又は37℃のいずれかにおける保存開始時での各トレーサーについて決定した化学発光に対するパーセンテージとして比較した。対照アクリジニウム化合物に対して高められた又は同等の化学発光安定性が、新規アクリジニウム化合物に対する望ましい特性であり、生成物のより長い又は同等の貯蔵寿命、及びより良好又は同等の日毎の結果の再現性を提供するであろう。
Claims (27)
- 以下の構造:
[式中、
R 1 は、C 1−35 アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、それらの各々は、最大20個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはR 1 は、基−R a −Zであり;ここで、R a は、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C 1−35 アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される二価の基であり;
R 2 及びR 3 は、(i)水素、(ii)アルコキシル(−OR)、基−O−(CH 2 CH 2 −O) l −CH 3 (ここで、lは、1〜12の整数である)及び基−O−Gから選ばれる電子供与基、又は(iii)基−Zから独立して選択され;ここで、Gが、各々出現ごとに独立して、
{式中、R 9 、R 10 、R 11 、R 12 、R 13 及びR 14 は、各々出現ごとに独立して、メチル基又は基−(CH 2 CH 2 O) m CH 3 であり、ここで、mが、1〜5の整数である}から選択される分岐基であり;
Zは、下記形態:
で示される両性イオン基であり、
Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH 2 −、酸素、硫黄、又は−NR N −から選択され;
R’及びR”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、C 1−35 アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され;
Z 1 は、基−R a −Z 2 (ここで、Z 2 は、カルボキシラート(−COO − )、又はスルホナート(−SO 3 − )から選択される)であり;
nは、各々出現ごとに独立して、1〜12の間の整数から選択され;そして
R 4 及びR 8 は、同じか、又は異なり、そして水素、C 1−35 アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル(−OR)、アルキルチオール(−SR)又は置換アミノ基(−NR 2 )から選択され;
R 5 及びR 7 は、水素であり;
R 6 は、基−(CO)−R 15 であり;
R 15 は、基−Z又は基−X a R * であり、ここで、X a は、酸素、硫黄又は−NR N −であり、そしてR * は、各々が最大20個までのヘテロ原子を場合により含有する、水素、C 1−35 アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択されるか、あるいはR * は、基−R a −Lであり;但し、R 15 が、基−Zであるとき、Xは、各々出現ごとに独立して、結合、−CH 2 −、酸素、硫黄又は−NR N −から選択され;
Rは、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、C 1−35 アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され;そして
R N は、各々出現ごとに独立して、各々が最大20個までのヘテロ原子を含有する、水素、C 1−35 アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択されるが;
但し、R 1 、R 2 、R 3 及びR 6 のうちの少なくとも1つは、基Zを含み;
Lが、
からなる群より選択される]を有する化学発光アクリジニウム化合物であって、前記化合物は、前記両性イオン基を含まない以外は同一のアクリジニウム化合物と比較して、固相に対する非特異的結合の減少を示す、化学発光アクリジニウム化合物。 - R15が、
(1)−OH;
(2)−O−N−スクシンイミジル;
(3)−NH−(CH2)5−C(O)−O−N−スクシンイミジル;
(4)−NH−(CH2)5−COOH;
(5)−NH−(C2H4O)i−C2H4NH−C(O)−(CH2)3−C(O)−O−N−スクシンイミジル(ここで、i=1〜5である);
(6)−NH−(C2H4O)i−C2H4NH−C(O)−(CH2)3−COOH(ここで、i=1〜5である);
(7)−NH−(C2H4O)i−C2H4NH2(ここで、i=1〜5である);及び
(8)−NH−R−NHR;ならびに
(9)−Z
からなる群より選択される、請求項1記載の化学発光アクリジニウム化合物。 - R15が、−OHである、請求項2記載の化学発光アクリジニウム化合物。
- R’又はR”が、一出現で、基−Ra−C(O)−CH2CH2CH2−C(O)−N−スクシンイミジル、−Ra−N−マレイミド、−Ra−C(O)−CH2−Br又は−Ra−C(O)−CH2−Iである、請求項1記載の化学発光アクリジニウム化合物。
- R*が、基−Ra−Lを含む、請求項9記載の化学発光アクリジニウム化合物。
- R1が、メチル、スルホプロピル(−CH2CH2CH2−SO3 −)又はスルホブチル(−CH2CH2CH2CH2−SO3 −)基から選択され;そしてR2及びR3が、水素又は基−O−G(ここで、Gは、請求項1で定義されている)から独立して選択される、請求項11記載の化学発光アクリジニウム化合物。
- R2及びR3が、水素又は基−O−G(ここで、Gは、請求項1で定義したとおりである)から独立して選択される、請求項17記載の化学発光アクリジニウム化合物。
- R2及びR3が、水素である、請求項17記載の化学発光アクリジニウム化合物。
- 分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーに結合している請求項1〜23のいずれかに記載の化学発光アクリジニウム化合物を含む分析物の検出のための試薬。
- 巨大分子分析物の検出又は定量のためのアッセイであって、
(a)分析物に対して特異的な結合分子に結合している、請求項1〜23のいずれかに記載の化学発光アクリジニウム化合物を含む抱合体を提供すること、
(b)固体担体であって、その上に前記分析物に対して特異的な第2結合分子を固定している固体担体を提供すること、
(c)前記抱合体、固相、及び前記分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成すること、
(d)前記固体担体上に捕獲された前記結合複合体を分離すること、
(e)化学発光誘発試薬を加えることによって、工程(d)からの前記結合複合体の化学発光を誘発すること、
(f)照度計を用いて光放出の量を測定すること、及び
(g)放出された光の量を前記分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量とを比較することによって、前記分析物の存在を検出するか又は前記分析物の濃度を計算することを含む、アッセイ。 - 小分子分析物の検出又は定量のためのアッセイであって、
(a)分析物と請求項1〜23のいずれかに記載の化学発光アクリジニウム化合物との抱合体を提供する工程、
(b)前記分析物に対して特異的な結合分子で固定された固体担体を提供する工程、
(c)前記抱合体、固体担体、及び前記分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程、
(d)前記固体担体上に捕獲された前記結合複合体を分離する工程、
(e)化学発光誘発試薬を加えることによって、工程(d)からの前記結合複合体の化学発光を誘発する工程、
(f)照度計を用いて光の量を測定する工程、及び
(g)放出された光の量を前記分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量とを比較することによって、前記分析物の存在を検出するか又は前記分析物の濃度を計算する工程を含む、アッセイ。 - 小分子分析物の検出のためのアッセイであって、
(a)分析物又は分析物類似体で固定された固体担体を提供すること、
(b)前記分析物に対して特異的な結合分子と請求項1〜23のいずれかに記載の化学発光アクリジニウム化合物との抱合体を提供すること、
(c)前記固相、前記抱合体、及び前記分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成すること、
(d)前記固体担体上に捕獲された前記結合複合体を分離すること、
(e)化学発光誘発試薬を加えることによって、(d)の前記結合複合体の化学発光を誘発すること、
(f)照度計を用いて光の量を測定すること、及び
(g)放出された光の量を前記分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量とを比較することによって、前記分析物の存在を検出するか又は前記分析物の濃度を計算することを含む、アッセイ。
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