JP6670597B2

JP6670597B2 - 両性イオン含有アクリジニウム化合物

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Publication number: JP6670597B2
Application number: JP2015237389A
Authority: JP
Inventors: ナトラジャン，アナンド; シャープ，ディビッド; ジャン，チンピン
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2009-11-16
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2020-03-25
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: EP3067345A1; CN102762539A; WO2011060228A1; ES2700649T3; US20120225497A1; EP2501681B1; CN105153115B; CN102762539B; EP2501681A4; US9575062B2; EP3067345B1; JP2019073533A; US8778624B2; CN105153115A; US20140295575A1; JP5852578B2; EP2501681A1; JP2016104742A; JP2013510934A; ES2585364T3

Description

本発明は、両性イオンを含有する親水性化学発光アクリジニウム化合物に関する。これらアクリジニウム化合物は、それらの親水性の性質のため、固相に対する低い非特異的結合を示し、そしてアッセイ感度を改善するのに潜在的に有用である。

背景
化学発光アクリジニウムエステルは、イムノアッセイ及び核酸アッセイの両方のための極めて有用な標識であることが明らかになっている。アクリジニウムエステルからの光放出は、アルカリ性過酸化水素との反応によって誘発され、この反応は、フェノールエステル結合の開裂、及び発光種である励起状態アクリドンの形成を引き起こす。フェノール脱離基の離脱に続くジオキセタノン中間体の形成が、その反応機構において提案されており、そして励起状態アクリドンへの前駆体であると推定される。アクリジニウムエステルからの光放出の期間は、反応条件にもよるが、通常は数秒以内で完了し、そして照度計を使用して定量的に測定することができる。イムノアッセイにおけるアクリジニウムエステル、９−カルボキシフェニル−Ｎ−メチルアクリジニウムブロミドの適用が、Simpson, J.S.A.らによって開示された（Nature vol. 279, pp. 646-647 (1979）。しかしながら、このアクリジニウムエステルは、かなり不安定であり、それによってその商業的有用性を制限している。この不安定性は、フェノールとアクリジニウム環との間の不安定な９−カルボキシフェニルエステル結合の加水分解に起因する。

アクリジニウムエステルにおけるフェノールエステルを安定させる試みにおいて、Ｌａｗら（Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, vol. 4, pp. 88-89 (1989)は、このエステル結合を安定させるために２個の隣接メチル基を導入した。得られた立体的に安定化されたアクリジニウムエステルは、ＤＭＡＥ−ＮＨＳ［２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシラート］と略されるが、２個のメチル基を欠くアクリジニウムエステルと同じ光出力を有することが見出された。他方では、先の化合物の安定性は、免疫グロブリンに抱される場合、はるかに優れており、そして３７℃、ｐＨ７での１週間後でさえ化学発光活性の損失を示さなかった。対照的に、非置換のアクリジニウムエステルは、同じ処理に付された場合、その活性のたった１０％を保持するだけであった。

ＤＭＡＥ及びその誘導体の疎水性の性質を緩和するために、Ｌａｗらによる米国特許第５，６５６，４２６号は、Ｎ−メチル基がＮ−スルホプロピル（ＮＳＰ）基で置き換えられている、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステルと呼ばれるＤＭＡＥの親水性バージョンを開示した。ＤＭＡＥ及びＮＳＰ−ＤＭＡＥの両方とも、現在、Siemens Healthcare Diagnosticsの市販の自動イムノアッセイ分析器ACS:180（商標）及びCentaur（商標）において広く使用されている。

ＮＳＰ−ＤＭＡＥの親水性をさらに増大させるために、Natrajanらは、米国特許第６，６６４，０４３（Ｂ２）号において、フェノールに結合しているポリ（エチレン）グリコール及びアニオン性スペルミン誘導体などの親水性修飾剤を有するＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体を開示した。そのような、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート−ＮＨＳと呼ばれ（ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧと略され）、そしてヘキサ（エチレン）グリコール誘導体（ＨＥＧ）を含有するアクリジニウムエステルの１つの構造は、以下の図において例示されている。この化合物において、α，ω−ジアミノヘキサ（エチレン）グリコール（ジアミノ−ＨＥＧ）部分が、アクリジニウムエステルの水溶解度を増大させるために、フェノールに結合している。グルタラート部分が、ジアミノ−ＨＥＧの末端に付加され、そして種々の分子の標識化を可能にするためにＮＨＳエステルに変換された。ＨＥＧに加えて、スルホン酸基及びカルボキシラート基を有するスペルミンから誘導されたアニオン性修飾剤はまた、米国特許第６，６６４，０４３（Ｂ２）号において、Natrajanらによって開示された。

最近、Natrajanらは、米国特許第７，３０９，６１５（Ｂ２）号において、アクリジニウム環のＣ２及び／又はＣ７における親水性アルコキシ基（ＯＲ^＊）（ここで、Ｒ^＊は、スルホプロピル部分もしくはエチレングリコール部分又はその組合せを含む基である）を含有する、親水性の高量子収率アクリジニウム化合物を記載した。このような化合物からの高められた光出力及びそれらの親水性の性質により、それらはイムノアッセイの感度を改善するのに有用になった。そのような、ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥ−ＡＣ−ＮＨＳ（ＨＱＹＡＥと略される）と呼ばれる化合物の１つの構造は、以下に例示されている。この化合物及び米国特許第７，３０９，６１５（Ｂ２）号に記載されている他の化合物は、フェノールに代わってアクリジニウム環に結合しているポリ（エチレン）グリコール又はアニオン性スルホン酸基を含有した。

前述の特許に開示されているアクリジニウムエステルの構造におけるポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）部分及びアニオンの取り込みは、これらのアクリジニウムエステルの親水性の性質を増大させるほか、これらの化合物から誘導される抱合体の非特異的結合を低下させることが意図されている。非特異的結合とは、粒子又はマイクロタイタープレートなどの固相を使用するアッセイにおいて、これらの固相に対するこれらのアクリジニウムエステル抱合体の望ましくない結合相互作用である。これらの望ましくない結合相互作用は、典型的には、アッセイのバックグラウンドを増大させ、それがアッセイにおいてシグナル対バックグラウンド比の正味の低下をもたらし、それによってアッセイ感度が下がる。

タンパク質吸着に抵抗する不活性表面を作り出すためのポリ（エチレン）グリコールの使用は、先行技術において説明されている。例えば、Ostuniらは、J. Am. Chem. Soc. 2000, 17, 5605-5620において、タンパク質吸着に対する抵抗性について自己集合単分子層に結合した多数の官能基を評価し、そしてポリ（エチレン）グリコール官能基が最良の抵抗性を与えるということを観察した。より最近になって、Laddらが、Biomacromolecules 2008, 9, 1357-1361において；及び他の者が、両性イオンで修飾された親水性表面は、タンパク質吸着に対してＰＥＧと同程度に不活性であるということを報告しており、そしてさらに、両性イオンは、ＰＥＧの酸化的開裂に対する性向のため、ＰＥＧよりも化学的により安定であろうということが仮定されている。幾つかの一般的な両性イオン、例えば、スルホベタイン、カルボキシベタイン、ホスホベタイン及びアミンオキシドなどの構造は、以下の図において例示されている。ＰＥＧのように、これらの両性イオンは、通常、所与の構造における正及び負電荷の釣り合いにより、電気的に中性である（Ｒ１〜Ｒ４は、典型的には、アルキル基である）。

両性イオンの例

窒素原子が第四級であるスルホベタインは、それらの電気的中性を広いｐＨ範囲にわたって維持する。他方では、三置換窒素を有するスルホベタインは、より高いｐＨ（ｐＨ＞７）において、窒素で脱プロトン化され、それによってその正電荷を中和することができるので、負電荷を獲得することができる。同様に、カルボキシベタインは、より高いｐＨにおいて電気的に中性であるが、低いｐＨ（ｐＨ＜５）において、カルボキシラート基でプロトン化されて正味の正電荷を獲得することができる。

プロテオミクスにおける適用のための、両性イオンで修飾された蛍光色素が、最近、米国特許出願第０２５９３３３（Ａ１）号においてDratz及びGriecoによって報告されている（２００７年１１月）。両性イオン色素で標識されたタンパク質は、水溶性であり、そして電気泳動分析をより施しやすいことが観察された。また、上記の著者は、両性イオン色素を使用したタンパク質分析のための方法をクレームしている。

非特異的結合などの化学発光アクリジニウムエステルの特性を改善するために、それに電気的に中性な両性イオン官能基を取り込むことは、先行技術において説明されていない。このような化合物は、米国特許第６，６６４，０４３（Ｂ２）号及び米国特許第７，３０９，６１５（Ｂ２）号においてNatrajanらによって記載されているＰＥＧ含有アクリジニウムエステルを補完し、そしてアッセイ感度を改善する可能性を有するものである。

当技術分野において、イムノアッセイ等のための改善された化学発光タグに対する必要性が引き続き存在する。したがって、本発明の目的は、固相に対する非特異的結合の減少を示す化学発光アクリジニウム化合物を提供することである。

発明の概要
上述の目的及びその他にしたがって、化学発光アクリジニウム化合物の特性は、分子内に両性イオン基を取り込んで、その親水性を増大させ、結果として固相との非特異的結合を減少させることによって、改善されるということが驚くべきことに見出された。

本発明の一態様において、（ｉ）アクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基であって、該炭化水素基は、最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されている、炭化水素基、及び（ii）置換炭化水素部分に連結している、アクリジニウム核のＣ_９位におけるカルボキシル又はスルホンアミド基を含む、化学発光アクリジニウム化合物が提供され、ここで、このアクリジニウム化合物は、アクリジニウム核のＣ_２位、アクリジニウム核のＣ_７位、カルボキシルもしくはスルホンアミド基に連結している炭化水素部分、又はアクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基に結合している、少なくとも１個の両性イオン官能基を含み；前記アクリジニウム化合物は、前記両性イオン官能基を含まない以外は同一のアクリジニウム化合物と比較して、固相に対する非特異的結合の減少を示す。

一実施態様において、化学発光アクリジニウム化合物は、式（Ｉ）で示される以下の構造：

［式中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、それらの各々は、最大２０個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはＲ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚであり；ここで、Ｒ^ａは、各々が最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される二価の基であり；
Ｒ_２及びＲ_３は、（ｉ）水素、（ii）電子供与基、又は（iii）基−Ｚから独立して選択され；
Ｚは、以下の形態：

で示される両性イオン基であり、
Ｘは、各々出現ごとに独立して、結合、−ＣＨ_２−、酸素、硫黄、−ＮＲ^Ｎ−、アミド（−ＮＲ^Ｎ（ＣＯ）−）、カルバマート（−ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）Ｏ−）又はウレア（−ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）ＮＲ^Ｎ−）から選択され；
Ｒ’及びＲ”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｚ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚ_２（ここで、Ｚ_２は、カルボキシラート（−ＣＯＯ⁻）、スルホナート（−ＳＯ_３ ⁻）、スルファート（−ＯＳＯ_３ ⁻）、ホスファート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ⁻））もしくはオキシド（−Ｏ⁻）から選択される）であるか；又は、Ｚ_２が、オキシド（−Ｏ⁻）である場合、Ｒ^ａは、存在しなくてもよく；
ｎは、各々出現ごとに独立して、１〜１２の間の整数から選択され；そして
Ｒ_４及びＲ_８は、同じか、又は異なり、そして水素、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル（−ＯＲ）、アルキルチオール（−ＳＲ）又は置換アミノ基（−ＮＲ_２）から選択され；
Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、水素又は基−（ＣＯ）−Ｒ_１５から独立して選択されるが、但し、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７のうちの２つは、水素であり、そしてＲ_５、Ｒ_６及びＲ_７のうちの１つは、前記基−（ＣＯ）−Ｒ_１５であり；
Ｒ_１５は、基−Ｚ又は基−Ｘ^ａＲ^＊であり、ここで、Ｘ^ａは、酸素、硫黄又は−ＮＲ^Ｎ−であり、そしてＲ^＊は、各々が最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有する、水素、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択されるか、あるいはＲ^＊は、基−Ｒ^ａ−Ｌであり、ここで、Ｌは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基であるが；但し、Ｒ_１５が、基−Ｚであるとき、Ｘは、各々出現ごとに独立して、結合、−ＣＨ_２−、酸素、硫黄又は−ＮＲ^Ｎ−から選択され；
Ｒは、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；そして
Ｒ^Ｎは、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、水素、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択されるが；
但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７のうちの少なくとも１つは、基Ｚである］を有するアクリジニウムエステルである。

別の実施態様において、化学発光アクリジニウム化合物は、式（II）で示される以下の構造：

［式中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、これらの各々は、最大２０個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはＲ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚであり；
Ｒ_２及びＲ_３は、（ｉ）水素、（ii）電子供与基、又は（iii）基−Ｚから独立して選択され；
Ｙ及びＹ’は、Ｒ、−Ｒ^ａ−Ｚ又は−Ｒ^ａ−Ｌから独立して選択され；ここで、Ｌは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基、求電子基又は求核基を含む、誘導体化可能官能基（derivitizable functional group）であり；
Ｚは、以下の形態：

で示される両性イオン基であり、
Ｘは、各々出現ごとに独立して、結合、−ＣＨ_２−、酸素、硫黄、−ＮＲ^Ｎ−、アミド（−ＮＨ（ＣＯ）−）、カルバマート（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）又はウレア（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）から選択され；
Ｒ’及びＲ”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｚ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚ_２であり、ここで、Ｚ_２は、カルボキシラート（−ＣＯＯ⁻）、スルホナート（−ＳＯ_３ ⁻）、スルファート（−ＯＳＯ_３ ⁻）、ホスファート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ⁻））又はオキシド（−Ｏ⁻）から選択されるか；あるいは、Ｚ_２が、オキシド（−Ｏ⁻）である場合、Ｒ^ａは、存在しなくてもよく；
ｎは、各々出現ごとに独立して、１〜１２の間の整数から選択され；
Ｒは、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
Ｒ^Ｎは、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、水素、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
そしてＲ^ａは、各々が最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される、二価の基であるが；
但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｙ及びＹ’のうちの少なくとも１個は、前記両性イオン基Ｚを含む］を有するアクリジニウムスルホンアミドである。

本発明の別の態様において、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーに結合している化学発光アクリジニウム化合物を含む分析物の検出のための試薬が提供され、このアクリジニウム化合物は、（ｉ）アクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基であって、該炭化水素基は、最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されている、炭化水素基、及び（ii）最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されている置換炭化水素部分に連結している、アクリジニウム核のＣ_９位におけるカルボキシル又はスルホンアミド基を含み、ここで、前記アクリジニウム化合物は、アクリジニウム核のＣ_２位、アクリジニウム核のＣ_７位、カルボキシルもしくはスルホンアミド基に連結している炭化水素部分、又はアクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基に結合している、少なくとも１個の両性イオン官能基を含み；前記アクリジニウム化合物は、前記両性イオン官能基を含まない以外は同一のアクリジニウム化合物と比較して、固相に対する非特異的結合の減少を示す。

本発明のさらなる態様において、巨大分子分析物の検出又は定量のためのアッセイが提供され、このアッセイは、（ａ）分析物に対して特異的な結合分子に結合している、本発明による化学発光アクリジニウム化合物を含む抱合体を提供すること；（ｂ）固体担体であって、その上に前記分析物に対して特異的な第２結合分子を固定している固体担体を提供すること；（ｃ）上記抱合体、固相、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成すること；（ｄ）固体担体上に捕獲された結合複合体を分離すること；（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、工程（ｄ）からの結合複合体の化学発光を誘発すること；（ｆ）照度計を用いて光放出の量を測定すること；及び（ｇ）放出された光の量を分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算することを含む。

さらに別の態様において、小分子分析物の検出又は定量のためのアッセイが提供され、このアッセイは、（ａ）分析物と本発明による化学発光アクリジニウム化合物との抱合体を提供する工程；（ｂ）分析物に対して特異的な結合分子で固定された固体担体を提供する工程；（ｃ）上記抱合体、固体担体、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程；（ｄ）固体担体上に捕獲された結合複合体を分離する工程；（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、工程（ｄ）からの結合複合体の化学発光を誘発する工程；（ｆ）照度計を用いて光の量を測定する工程；及び（ｇ）放出された光の量を分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算する工程を含む。

さらに別の態様において、小分子分析物の検出のためのアッセイが提供され、このアッセイは、（ａ）分析物又は分析物類似体で固定された固体担体を提供すること；（ｂ）分析物に対して特異的な結合分子と本発明による化学発光アクリジニウム化合物との抱合体を提供すること；（ｃ）固相、抱合体、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成すること；（ｄ）固体担体上に捕獲された結合複合体を分離すること；（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、（ｄ）の結合複合体の化学発光を誘発すること；（ｆ）照度計を用いて光の量を測定すること；及び（ｇ）放出された光の量を分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算することを含む。

本発明のこれら及び他の態様は、添付の特許請求の範囲を含む、以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されるであろう。

本発明の複数の例示的両性イオン含有アクリジニウム化合物の化学構造を示す図である。本発明の他の例示的両性イオン含有アクリジニウム化合物の化学構造を示す図である。本発明の別の例示的両性イオン含有アクリジニウム化合物の化学構造を示す図である。時間の関数としてプロットされた、相対光単位（ＲＬＵ）％での、対照（ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ）及び例示的両性イオン含有アクリジニウム（ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳ）抱合体から放出された光のプロットである。時間の関数としてプロットされた、相対光単位（ＲＬＵ）％での、２つの抗体に対する対照（ＨＱＹＡＥ）及び例示的両性イオン含有アクリジニウム（ＮＳＰ−２，７−ＤＭＧ−ＤＭＡＥ）抱合体から放出された光のプロットである。時間の関数としてプロットされた、相対光単位（ＲＬＵ）％での、抗ＴＳＨＭａｂに対する対照（ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ）及び例示的両性イオン含有アクリジニウム（ＺＣ６Ｍ−ＡＥ及びＺＣ８Ｍ−ＡＥ）抱合体から放出された光のプロットである。

詳細な説明
本発明の主な目的は、両性イオン含有アクリジニウム化合物の構造であって、これらの構造的特徴を欠くアクリジニウム化合物と比較した場合、固相に対する低い非特異的結合を示す、両性イオン含有アクリジニウム化合物の構造を開示することである。本発明の別の目的は、２つの種類の両性イオン修飾のアクリジニウム化合物：（ａ）アクリジニウム環内に両性イオンを含有するアクリジニウム化合物、及び（ｂ）フェノール脱離基に結合している両性イオンを含有するアクリジニウム化合物を開示することである。本発明の別の目的は、フェノールに結合している両性イオンを有するアクリジニウム化合物からの光放出が、この構造的修飾を持たないアクリジニウム化合物と比較した場合、予想外に速いことを開示することである。本発明のさらに別の目的は、両性イオン含有アクリジニウム化合物が、両性イオンを持たないアクリジニウム化合物と同程度に安定であり、そして同様の量子収率を有するということを実証することである。

本発明による化学発光アクリジニウム化合物は、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド等であり得る。一実施態様において、化学発光アクリジニウム化合物は、（ｉ）アクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基であって、この炭化水素基は、最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されている、炭化水素基、及び（ii）置換炭化水素部分に連結している、アクリジニウム核のＣ_９位におけるカルボキシル又はスルホンアミド基を含み、ここで、このアクリジニウム化合物は、アクリジニウム核のＣ_２位、アクリジニウム核のＣ_７位、カルボキシルもしくはスルホンアミド基に連結している炭化水素部分、又はアクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基に結合している、少なくとも１個の両性イオン官能基を含み；前記アクリジニウム化合物は、前記両性イオン官能基を含まない以外は同一のアクリジニウム化合物と比較して、固相に対する非特異的結合の減少を示す。

窒素原子に結合している炭化水素基は、最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されており、したがって、それ自体、例えば、スルホプロピルもしくはスルホブチル基が環窒素に結合し、第四級環窒素上に正電荷及び−ＳＯ_３基上に負電荷がある場合、両性イオン基を構成することができる。そのような両性イオン基が存在したとしても、本発明による化合物は、さらに少なくとも１個の両性イオン基を含むであろうことは理解されるであろう。言い換えれば、本発明による化合物は、アクリジニウム核の窒素以外又はそれに加えて、ある原子上に正電荷を含むであろう。

一実施態様において、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_６のうちの少なくとも１つ又は厳密に１つが、基−Ｌ又は−Ｒ^ａ−Ｌを含み、ここで、Ｌは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための、脱離基、求電子基又は求核基を含む、誘導体化可能官能基である。いくつかの実施態様において、Ｌは、以下：

からなる群より選択されるであろう。

ある実施態様において、Ｒ_１５は、以下：
（１）−ＯＨ；
（２）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル；
（３）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル；
（４）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−ＣＯＯＨ；
（５）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｉ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｉ＝１〜５である）；
（６）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｉ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−ＣＯＯＨ（ここで、ｉ＝１〜５である）；
（７）−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｉ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ_２（ここで、ｉ＝１〜５である）；及び
（８）−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＲ；ならびに
（９）−Ｚ
からなる群より選択されるであろう。

Ｒ_１５が−ＯＨである場合について、特に言及することができる。

一実施態様において、Ｒ’又はＲ”は、基−Ｒ^ａ−Ｌを含み、ここで、Ｌは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための、誘導体化可能脱離基、求電子基又は求核基である。いくつかの実施態様において、Ｌは、上記で提供された基から選択されるであろう。一実施態様において、Ｒ’又はＲ”は、一出現で、基−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−スクシンイミジル、−Ｒ^ａ−Ｎ−マレイミド、−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｂｒ又は−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｉである。

いくつかの実施態様において、Ｒ_２及びＲ_３は両方とも、水素である。他の実施態様において、Ｒ_２及び／又はＲ_３は、例えば、電子供与基から選択されることができる。典型的な電子供与基は、ＯＲ、ＯＨ、ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ_２、ＮＲ^ＮＲ^Ｎを非限定的に含み；ここで、Ｒ及びＲ^Ｎは、各々出現ごとに独立して選択され、そして各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、水素アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール及びアラルキルからなる群より選択される。好ましい電子供与基は、アルコキシル（−ＯＲ）である。

いくつかの実施態様において、Ｒ_２及び／又はＲ_３は、（ｉ）アルコキシル（−ＯＲ）、（ii）基−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｌ−ＣＨ_３（ここで、ｌは、１〜１２の整数である）及び（iii）基−Ｏ−Ｇならびに（vi）基−Ｚからなる群より選択され得；ここで、Ｇは、各々出現ごとに独立して、

［式中、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４は、各々出現ごとに独立して、メチル基又は基−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍＣＨ_３であり、ここで、ｍは、１〜５の整数である］から選択される分岐基である。

一実施態様において、本発明による化学発光アクリジニウムエステル化合物は、式（Ia）で示される構造：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_４、Ｒ_８、Ｒ_１５、Ｒ’、Ｒ”、Ｘ、Ｚ_１及びｎは、式（Ｉ）で定義したとおりであり、そしてＲ’、Ｒ”、Ｘ、Ｚ_１及びｎは、各々出現ごとに独立して選択される］を有するであろう。

特定の実施態様において、Ｒ_１は、適切に、アルキル基、スルホプロピル基もしくはスルホブチル基であってもよく、Ｒ_４及びＲ_８は、低級アルキル、特にメチルであってもよく、Ｘは、酸素であってもよく、及び／又はＺ_１は、−ＳＯ_３であってもよい。一実施態様において、式（Ia）のアクリジニウムエステルは、以下の構造：

［式中、ｍは、０〜３の整数であり、そしてＲ_１５及びｎは、式（Ｉ）について先に定義したとおりであり、ｍ及びｎは、各々出現ごとに独立して選択される］を有するであろう。一実施態様において、本化合物は、以下の構造：

［式中、ｎは、各々出現ごとに独立して選択される、１〜１２の整数である］を有するであろう。

式（Ｉ）の別の代表的アクリジニウムエステル化合物は、式（Ib）：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_８、Ｒ_１５、Ｒ’、Ｒ”、Ｘ、Ｚ_１及びｎは、先に定義したとおりである］で示される構造を有する。一実施態様において、式（Ib）で示される化学発光アクリジニウムエステル化合物は、以下の構造：

［式中、ｍは、０〜３の整数であり、そしてＲ_２、Ｒ_１５及びｎは、先に定義したとおりである］を有する。一実施態様において、本発明によるアクリジニウムエステル化合物は、以下の構造：

［式中、ｎは、１〜１２の整数である］を有する。以下の構造：

［式中、ｎは、１〜１２の整数である］を有する。式（IB）のさらに別の化合物は、以下の構造：

を有しており、そしてＸが、結合（すなわち、Ｘが全く存在しない）又はメチレン単位−ＣＨ_２−である場合を表している。

式（Ｉ）の化学発光アクリジニウムエステル化合物の別の例は、式（Ic）：

［式中、ｎ’、ｍ’及びｑ’は、独立して１〜４の整数であり、そしてＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_８、Ｒ^Ｎ、Ｒ^＊、Ｒ’ Ｘ及びＺ_１は、先に定義したとおりである］で示される構造を有する。一実施態様において、Ｒ^＊は、基−Ｒ^ａ−Ｌを含み、ここで、Ｌは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基である。この実施態様による代表的化合物は、以下の構造：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_８は、先に定義したとおりである］を有する。いくつかの実施態様において、Ｒ_４及びＲ_４は、独立して、低級アルキル基、特にメチルであり；Ｒ_１は、アルキル（例えば、メチル）、スルホプロピル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−ＳＯ_３ ⁻）又はスルホブチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−ＳＯ_３ ⁻）であり；Ｒ_２及びＲ_３は、水素又は基−Ｏ−Ｇ（ここで、Ｇは、先のように定義されている）から独立して選択され；そして、Ｒ_１６は、（ｉ）水素、（ii）−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−スクシンイミジル、（iii）−Ｒ−Ｎ−マレイミド（ここで、Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアラルキルであり、これらの各々は、最大２０個までのヘテロ原子を場合により含むことができる）又は（iv）−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｘ（ここで、Ｘは、臭素（Ｂｒ）もしくはヨウ素（Ｉ）である）から選択される。

一実施態様において、式（Ic）の化学発光アクリジニウム化合物は、以下の構造：

［式中、Ｒ_２及びＲ_３は、先のように定義したとおりである］を有する。一実施態様において、Ｒ_２及びＲ_３は、水素又は基−Ｏ−Ｇ（ここで、Ｇは、本明細書で定義したとおりである）から独立して選択される。

式中、Ｒ_１〜Ｒ_８及びＺは、式（Ｉ）に対して定義したとおりであるが；但し、Ｒ_１が、アルキルスルホナート基であるときは、Ｘは、各々出現ごとに独立して、結合、−ＣＨ_２−、酸素又は−ＮＲ^Ｎ−から選択される。

式（Id）のいくつかの化学発光アクリジニウム化合物は、式（Ie）：

［式中、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_８、Ｒ_１５、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ^Ｎ、Ｚ_１及びｎは、式（Ｉ）で定義したとおりである］で示される構造を有するであろう。式（Ie）の例示的化合物は、以下の構造：

を有し、この化合物は、アクリジニウム核の正に荷電した窒素と釣り合わせるために対イオンＡ⁻を場合により含む。対イオンの選択に本質的には限定はないが、いくつかの実施態様において、Ａ−は、ＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハロゲン化物、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻、及びＮＯ_３ ⁻からなる群より選択される。

式（Ie）の例示的化学発光アクリジニウム化合物（図３にも示されている）は、以下の構造：

にしたがって、２個の両性イオン基を有し、本化合物は、アクリジニウム核の正に荷電した窒素と釣り合わせるために対イオンＡ⁻を場合により含む。

先に記載したアクリジニウムエステルに加えて、本発明はまた、例えば、アクリジニウムスルホンアミドを含む、化学発光を起こすことができる他のアクリジニウム化合物を包含する。いくつかの実施態様において、本発明によるアクリジニウムスルホンアミドは、式（II）：

［式中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル又はアラルキル基であり、それらの各々は、最大２０個までのヘテロ原子、又はスルホプロピルもしくはスルホブチル基を含有することができるか、あるいはＲ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚであり；
Ｒ_２及びＲ_３は、（ｉ）水素、（ii）電子供与基、又は（iii）基−Ｚから独立して選択され；
Ｙ及びＹ’は、Ｒ、−Ｒ^ａ−Ｚ又は−Ｒ^ａ−Ｌから独立して選択され；ここで、Ｌは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基、求電子基又は求核基を含む、誘導体化可能官能基であり；
Ｚは、以下の形態：

で示される両性イオン基であり、
Ｘは、各々出現ごとに独立して、結合、−ＣＨ_２−、酸素、硫黄、−ＮＲ^Ｎ−、アミド（−ＮＨ（ＣＯ）−）、カルバマート（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）又はウレア（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）から選択され；
Ｒ’及びＲ”は、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｚ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚ_２（ここで、Ｚ_２は、カルボキシラート（−ＣＯＯ⁻）、スルホナート（−ＳＯ_３ ⁻）、スルファート（−ＯＳＯ_３ ⁻）、ホスファート（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ⁻））もしくはオキシド（−Ｏ⁻）から選択される）であるか；又は、Ｚ_２が、オキシド（−Ｏ⁻）である場合、Ｒ^ａは、存在しなくてもよく；
ｎは、各々出現ごとに独立して、１〜１２の間の整数から選択され；そして
Ｒは、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
Ｒ^Ｎは、各々出現ごとに独立して、各々が最大２０個までのヘテロ原子を含有する、水素、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；そして
Ｒ^ａは、各々が最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有する、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択される、二価の基であるが；
但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｙ及びＹ’のうちの少なくとも１つは、前記両性イオン基Ｚを含む］で示される構造を有するであろう。

式（II）のアクリジニウムスルホンアミドのいくつかの実施態様において、Ｌは、本化合物が、分析物、分析物類似体、分析物の結合パートナーなどと抱合体を形成することができるようにする、官能基であり、そして：

からなる群より選択されうる。

いくつかの実施態様において、Ｒ’又はＲ”は、基−Ｒ^ａ−Ｌを含む。他の実施態様において、Ｒ’又はＲ”は、一出現で、基−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−スクシンイミジル、−Ｒ^ａ−Ｎ−マレイミド、−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｂｒ又は−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｉである。

式（II）の化学発光アクリジニウムスルホンアミド化合物の追加的実施態様において、Ｒ_１は、メチル、スルホプロピル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−ＳＯ_３ ⁻）、スルホブチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−ＳＯ_３ ⁻）又は以下の構造：

［式中、Ｒ^Ｎ、Ｒ’、Ｒ”、Ｚ_１及びｎは、式（II）について定義したとおりである］を有する基から選択されるであろう。

Ｒ_２及びＲ_３の一方又は両方は、例えば、基Ｚであってもよく、そしてより具体的には、Ｒ_２及びＲ_３の一方又は両方は、基：

［式中、ｎは、１〜１２の整数であり、そしてｍは、０〜３の整数である］であってもよい。

式（II）の好ましい化学発光アクリジニウムスルホンアミド化合物において、Ｙ’は、各々が最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されている、アリール基、又はアルキル−アリール基、又はアリール、アルキル基を含むであろう。そのようなアクリジニウムスルホンアミド化合物の１つは、式（IIb）：

［式中、Ｙは、基−Ｒ^ａ−Ｚ（ここで、Ｒ^ａ、Ｒ_２、Ｒ_３及びＺは、先で定義したとおりである）を含む］で示される構造を有する。

式（II）の他の化学発光アクリジニウムスルホンアミド化合物は、式（IIc）：

［式中、Ｒ^＊は、各々が最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有する、水素、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択されるか、あるいはＲ^＊は、基−Ｒ^ａ−Ｌ（ここで、Ｌは、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーとの抱合体を形成するための脱離基である）であり；ｎ’、ｍ’及びｑ’は、独立して、１〜４の整数であり、そしてＲ、Ｒ^Ｎ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ’及びＺ_１は、先に定義したとおりである］で示される構造を有する。

式（Ｉ）に関連して定義された置換基Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ^Ｎ、Ｒ^＊、Ｒ’、Ｒ”、Ｚ、Ｘ、ｎ、ｍなどの選択は、したがってその選好も含めて、式（II）の相当するパラメーターの選択に等しく適用されるということは理解されるであろう。

本発明の両性イオン含有アクリジニウム化合物は、抗体などのタンパク質に抱合されるとき、低い非特異的結合を示す。非特異的結合とは、前述したように、粒子又はマイクロタイタープレートなどの固相を使用するアッセイにおいて、これらの固相に対する抱合体の望ましくない結合相互作用である。これらの望ましくない結合相互作用は、典型的には、アッセイのバックグラウンドを増大させ、それがアッセイにおいてシグナル対バックグラウンド比の正味の低下をもたらし、それによってアッセイ感度が下がる。本発明の種々の両性イオン含有アクリジニウム化合物の非特異的結合を評価するために、我々は、分析物ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）に対して産生させたマウスモノクローナル抗体（抗ＴＳＨＭａｂ）を使用して、これらの化合物の抗体抱合体を調製した。次に、これらの抱合体の非特異的結合を、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹＡＥを使用して調製した類似抱合体の非特異的結合と比較した。後者の２つの親水性アクリジニウムエステルは、先に述べ、かつ米国特許第６，６６４，０４３（Ｂ２）号及び米国特許第７，３０９，６１５（Ｂ２）号にそれぞれ記載されているように、それぞれフェノール及びアクリジニウム環に結合しているヘキサ（エチレン）グリコールを含有する。後者の化合物、ＨＱＹＡＥはまた、米国特許第７，３０９，６１５（Ｂ２）号に記載されているようにアクリジニウム環内の２個のアルコキシ電子供与基のため、増加した光出力（より高い量子収率）を有する。非特異的結合を、２つの異なる種類の粒子；民間販売業者（Dynal（商標））からの常磁性粒子（ＰＭＰ）及び磁性ラテックス粒子（ＭＬＰ）上で測定した。２つの粒子は、それらの固有組成が異なる。ＰＭＰは、主に、アミンを含有するシランコーティングを有する酸化鉄粒子からできている。アミンは、グルタルアルデヒドなどの試薬を使用してタンパク質を粒子表面に架橋結合するために使用される。一方、ＭＬＰは、磁気分離ができるようにドープした磁鉄鉱を有する多孔質ポリスチレンからできている。本評価で使用されるＰＭＰは、グルタルアルデヒドカップリング化学を使用して、粒子表面上において抗ＴＳＨ抗体でコーティングされた（固相「ＰＭＰ」）。本評価のために使用されたＭＬＰ（Dynal M280−ストレプトアビジン結合ビオチン化ポリクローナルヤギ抗ＰＴＨ抗体（固相「Ｍ２８０」）及びDynal M270−ストレプトアビジン結合ビオチン化モノクローナルマウス抗ｃＴｎＩ抗体（固相「Ｍ２７０」））は、ストレプトアビジンを表面上に固定し、次にそれらを使用して、分析物ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）又はｃＴＮＩ（心筋トロポニンＩ）を結合することができるビオチン標識抗体をさらに固定した。ストレプトアビジン−ビオチン結合相互作用は、周知であり、かつアッセイにおいて一般的に使用される。２つの種類の粒子（ＰＭＰ及びＭＬＰ）を、特定期間の間、抱合体の溶液と混合して、そして次に粒子を磁気的に分離し、一回洗浄し、そして次に、粒子と関連する化学発光を測定した（実験の詳細は、実施例１８に見出すことができる。）。総化学発光入力と比較したこの化学発光値の比は、非特異的結合部分（ｆＮＳＢ）と呼ばれる。したがって、低い非特異的結合を有する抱合体は、低いｆＮＳＢ値を有するであろうし、また、（以下でさらに説明される）本発明の両性イオン含有アクリジニウム化合物の例示的実施態様のこれらの値は、対照化合物と共に、以下の表１にまとめられている。

ＰＭＰ上のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹＡＥの抱合体は、それぞれ４×１０^−５及び１．６×１０^−５のｆＮＳＢ値を有する。本発明の両性イオン含有アクリジニウムエステルを使用して作製された他の全ての抱合体は、これらの値と同様の又はこれらの値よりも低いｆＮＳＢ値を有する。例えば、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ及びＺＣ６Ｍ−ＡＥ由来の抱合体は、それぞれ１．３×１０^−５及び３．７×１０^−５のｆＮＳＢ値を有する。前者のアクリジニウムエステルは、フェノールに結合している両性イオンを含有するのに対して、後者の化合物は、アクリジニウム環内に両性イオンを含有する。したがって、両方の種類の両性イオン修飾は、ＰＭＰ粒子に対して、ｆＮＳＢを減少するのに有効である。粒子表面上に抗ＰＴＨ抗体を有するDynal MLPに関して、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹＡＥの抱合体は、それぞれ５．２×１０^−４及び１．５×１０^−４のｆＮＳＢ値を有する。両性イオン含有アクリジニウムエステル由来の他の全ての抱合体は、ｆＮＳＢ（１．７×１０^−４）がＨＱＹＡＥ抱合体のものと同様のＺＣ１２−ＡＥを除いて、大幅に低いｆＮＳＢ値を有する。同様の結果が、抗ｃＴＮＩ抗体が表面上に固定された状態のDynal MLPに関して観察される。したがって、両性イオン含有アクリジニウムエステル抱合体は、これまで試験したＭＬＰに関して著しく低いｆＮＳＢ値を有し、そして先に論じたようにバックグラウンドシグナルを減少させることによってアッセイ感度を改善する可能性を提供する。

フェノールに結合した両性イオンを有する、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ及びＮＳＰ−２，７−ＤＭＧ−ＤＭＡＥ−Ｚ（ＤＭＧ＝ジメトキシグリセリルオキシ）のアクリジニウムエステル抱合体は、また、予想外に、図３及び図４中のグラフに図示されているように、それぞれＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹＡＥ由来の類似抱合体と比較すると、より速い光放出を示す。アクリジニウムエステル、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳは、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート−ＮＨＳに類似しているが、それは両方のアクリジニウムエステルは、同じアクリジニウム環を含有するが、フェノールに結合している異なる官能基を含有するという点においてである。前者の化合物は、フェノールに結合している両性イオンを含有するのに対して、後者の化合物は、ヘキサ（エチレン）グリコール誘導体を含有する。両性イオン含有化合物、ＮＳＰ−２，７−ＤＭＧ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳは、フェノールに結合している両性イオンを含有することに加えて、アクリジニウム環内に電子供与ジメトキシグリセリルオキシ（ＤＭＧ）官能基も有する。本化合物からの光出力は、２つの電子供与基のために、ＨＱＹＡＥのそれと同様であり、そして、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧの光出力よりも高い。

光測定は、照度計上で行い、そして各抱合体から放出された光（相対光単位；ＲＬＵとして表される）を種々の時間間隔で測定した。次に、各抱合体から放出された光の合計を使用して、各時間間隔で放出された光％（％ＲＬＵ）を計算した。図４から明らかなように、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧの抗ＴＳＨＭａｂ（Ｍａｂ＝モノクローナル抗体）抱合体は、完全な光放出に＞４秒を必要とするのに対して、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚの抱合体については、光放出は２秒以内で完了する。２つのアクリジニウムエステルのＢＳＡ抱合体（ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン）の同様の比較が、両性イオン含有アクリジニウムエステルについて著しく速い光放出を示す。

２つの異なる抗体、抗ＴＳＨＭａｂ及び抗ＨＢｓＡｇ−Ｍａｂ（ＨＢｓＡｇ＝Ｂ型肝炎、表面抗原）に対する高光出力アクリジニウムエステル、ＨＱＹＡＥ及びＮＳＰ−２，７−ＤＭＧ−ＤＭＡＥの抗体抱合体からの光放出を、図５で比較する。この場合においても、両性イオン含有化合物は、総光放出の完了が＜２秒である、著しく速い光放出を示すのに対し、ＨＱＹＡＥ由来の抱合体は、完全な光放出に約４秒かかる。加えて、２つのアクリジニウムエステルの相対化学発光（Ｒｅｌ．ＣＬ）は、２つの異なる抗体で同じであることが観察された。したがって、フェノールでの両性イオン導入は、光放出を加速させるが、アクリジニウムエステルの光出力全体を損なわない。

アクリジニウム化合物は、特に、アクリジニウムエステル、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹＡＥを使用する自動免疫化学機器、例えば、Centaur（商標）及びACS: 180（商標）（Siemens Healthcare Diagnostics）において、非常に有用な化学発光標識である。これら両方の機器は高いスループットを有し、このことは、これらがそれぞれ毎時、多数のイムノアッセイ試験、それぞれ２４０及び１８０試験を実施することを実行できるということを意味する。ＮＳＰ−ＤＭＡＥから誘導される試薬は、典型的には、それらの化学発光が、０．５％過酸化水素を含有する１００mM 硝酸、続いて０．２５N 水酸化ナトリウム＋界面活性剤の第２溶液を加えることによって誘発されるとき、５秒間にわたって光を放出する。両性イオンがフェノール上に位置する、本発明の両性イオン含有アクリジニウム化合物は、それらの速い光放出（放出された光の合計の≧９０％について≦２秒）のおかげで、ADVIA：Centaur（商標）などの自動免疫化学機器で使用されて、アクリジニウムエステル、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹＡＥを利用する以外は同一の試験と比較して、それらのスループットを増加させることができる。

最後に図６において、両性イオン含有アクリジニウムエステル、ＺＣ６Ｍ−ＡＥ、ＺＣ８Ｍ−ＡＥ（これらの構造は図１に示されている）及びＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳの抗ＴＳＨＭａｂ抱合体からの光放出の速度論を、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧのそれと比較した。フェノールでの両性イオン修飾を有するＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ抱合体は、先に述べたようにＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧよりも速い光放出を示す一方で、両性イオンがアクリジニウム環内に位置する、ＺＣ６Ｍ−ＡＥ及びＺＣ８Ｍ−ＡＥの２つのアクリジニウムエステル抱合体は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧと同様の放出速度論を示す。したがって、アクリジニウム環内の両性イオン導入も、これら２つの事例で観察されるように放出速度論に弊害をもたらすものではない。３つの両性イオン含有化合物、ＺＣ６Ｍ−ＡＥ、ＺＣ８Ｍ−ＡＥ及びＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚの抗ＴＳＨＭａｂ及び抗ＨＢｓＡｇＭａｂ抱合体からの総光出力も、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧと同様で同等のものであることが観察された。

最初にＤＭＡＥについてＬａｗらにより説明されたアクリジニウムエステルの高められた安定性は、商業的な自動免疫分析器でのそれらの有用性を促進する、これらの化合物の別の重要な特徴である。「安定性」とは、本化合物又は抱合体を、典型的には、生理的ｐＨ内である６〜９のｐＨ範囲の水溶液中で保存した場合の、ＲＬＵの損失により測定する、最小損失化学発光活性を意味する。機構的見地から、フェノールエステルの加水分解は、化学発光アクリジニウムエステルが非化学発光になる主な経路である。安定な抱合体は、アクリジニウムエステル試薬の長期の貯蔵寿命を確実にし、そしてまた、アッセイ性能が、所与の期間にわたって大きく変化しないということを確実にする。本発明の抗ＴＳＨ抗体の種々のアクリジニウムエステル抱合体（以下でさらに説明する）の安定性は、表２に列挙されている。抱合体の水溶液は、ｐＨ７．７の水性緩衝液中で、Centaur（商標）などの市販の自動機器に典型的な４℃か又は３７℃のいずれかで保存した。アクリジニウムエステルの加水分解が加速されると予想される３７℃でのより厳しい貯蔵条件は、種々のアクリジニウムエステルの相対的安定性の公正な比較を可能にした。光はＲＬＵとして、全ての抱合体について照度計を使用して定期的に記録した。一日目とも呼ばれる最初の時点で測定されたＲＬＵには、１００％の値を割り当てた。４週間後の各抱合体からの残りのＲＬＵは、表２に列挙されている。これらの測定に関係する他の詳細は、実施例１９に見出すことができる。

表２から、本発明の種々の両性イオン含有アクリジニウムエステル抱合体の化学発光安定性は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹＡＥのそれと同等である。３７℃で、４週間後、これら２つのアクリジニウムエステルの抱合体は、それらの化学発光活性のそれぞれ７５％及び５８％を保持する。他の両性イオン含有アクリジニウムエステルの全ての抱合体は、ＺＣ６−ＡＥの抱合体についての５２％からＮＳＰ−２Ｚ−ＤＭＡＥの抱合体についての９４％までと、同様の安定性を示す。４℃で、４週間後、全てのアクリジニウムエステル抱合体は、化学発光活性の最小損失を示した。

本発明の両性イオン含有アクリジニウム化合物は、分析物の測定又は定量化についてのアッセイにおける標識として有用である。そのようなアッセイで典型的に測定される分析物は、何らかの臨床関連の物質であることが多く、そして大きな巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、ウイルスバクテリアなどから、小分子、例えば、エタノール、ビタミン、ステロイド、ホルモン、治療薬などまで幅広い分子に及ぶことができる。「サンドイッチ」イムノアッセイは、典型的には、抗体などの２つの結合分子を使用する、大分子（巨大分子分析物とも呼ぶ）の検出を包含する。１種の抗体を、固相、例えば、粒子、ビーズ、膜、マイクロタイタープレートもしくは任意の他の固体表面に固定又は結合させる。抗体などの結合分子の固相への結合のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、抗体を、グルタルアルデヒドなどの架橋分子を使用することによって、表面上にアミンを含有する粒子に共有結合させることができる。この結合はまた、非共有結合性であってもよく、そして固相、例えば、ポリスチレンビーズ及びマイクロタイタープレートの表面への結合分子の単純吸着を含むこともできる。第２抗体は、しばしば標識と呼ばれる化学発光分子又は蛍光分子と共有結合させることが多い。抗体及び他の結合タンパク質などの結合分子の標識化も、当技術分野において周知であり、そして一般的に抱合反応と呼ばれており、そして標識抗体は、抱合体と呼ばれることが多い。典型的に、標識上のアミン反応性部分は、抗体上のアミンと反応して、アミド結合を形成する。抗体と標識との間の他の結合、例えば、チオエーテル、エステル、カルバマート等も周知である。アッセイにおいて、２種の抗体は、巨大分子分析物の異なる領域に結合する。巨大分子分析物は、例えば、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルス、受容体又は合成ポリマーであり得る。結合分子は、抗体、抗体フラグメント、核酸、ペプチド、結合タンパク質又は合成結合ポリマーであり得る。例えば、葉酸結合タンパク質（「ＦＢＰ」）は、分析物である葉酸に結合する。様々な分析物に結合することができる合成結合分子も、Mossbach et al. Biotechnology vol. 14, pp. 163-170 (1995)によって開示されている。

固定された抗体及び標識抗体を有する固相が、分析物を含有するサンプルと混合されると、分析物と２種の抗体との間で結合複合体が形成される。この種類のアッセイはしばしば、固相が関与するので、異種アッセイと呼ばれる。それから、結合複合体と関連する化学発光又は蛍光シグナルを測定することができ、そして分析物の存在又は非存在を推測することができる。通常、結合複合体を、シグナル発生前に、過剰量の標識抗体などの残りの結合反応成分から分離する。例えば、結合複合体が、磁性ビーズと結合する場合、磁石を使用してバルク溶液からビーズと結合した結合複合体を分離することができる。一連の「標準」、すなわち既知濃度の分析物を使用することによって、２種の抗体を使用して、「用量反応」曲線を生成することができる。したがって、用量反応曲線は、ある量の測定されたシグナルを分析物の特定濃度と相関させる。サンドイッチアッセイにおいて、分析物の濃度が上昇すると、シグナルの量も増加する。次に、未知のサンプルにおける分析物の濃度を、巨大分子分析物を含有する未知のサンプルによって生成されたシグナルを用量反応曲線と比較することによって計算することができる。

同様に、２種の結合成分はまた、核酸分析物の異なる領域に結合又はハイブリダイズする核酸であることができる。次に、核酸分析物の濃度を、同様の方法で演繹することができる。

小分子分析物、例えば、ステロイド、ビタミン、ホルモン、治療薬又は小ペプチドなどのための別クラスのイムノアッセイは、一般的には競合アッセイと呼ぶアッセイ形式を利用する。典型的には、競合アッセイでは、抱合体は、対象の分析物及び化学発光又は蛍光標識から、２個の分子を共有結合することによって、できている。小分子分析物をそういうものとして使用することができるか、又はその構造を、標識への抱合前に変化させることができる。変化させられた構造を有する分析物は類似体と呼ばれる。標識を分析物と連結させるための化学作用を可能にするために、分析物の構造類似体を使用することがしばしば必要である。時には、分析物の構造類似体を、抗体などの結合分子へのその結合を弱めるか又は高めるために使用する。そのような技術は、当技術分野において周知である。対象の分析物に対する抗体又は結合タンパク質を、しばしば、直接的又はビオチン−アビジン系などの二次的結合相互作用を介するかのいずれかで固相上に固定する。

サンプル中の分析物の濃度は、競合アッセイにおいて、分析物含有サンプル及び分析物−標識抱合体を限定量の固相固定結合分子に対して競合させることによって演繹することができる。サンプル中の分析物の濃度が上昇すると、固相上の結合分子により捕獲された分析物−標識抱合体の量は、減少する。一連の「標準」、すなわち既知濃度の分析物を利用することによって、固相上の結合分子によって捕獲された分析物−標識抱合体からのシグナルを、分析物の濃度と逆相関させる、用量反応曲線を構築することができる。いったん用量反応曲線をこの方法で編み出したら、未知のサンプル中の同じ分析物の濃度を、この未知のサンプルから得たシグナルを用量反応曲線におけるシグナルと比較することによって演繹することができる。

小分子分析物についての競合アッセイの別の形式は、対象の分析物又は分析物類似体、及び化学発光標識又は蛍光標識と抱合している、分析物に特異的な抗体又は結合タンパク質で固定されている固相の使用を伴う。この形式では、抗体−標識抱合体は、固相上の分析物又は分析物類似体との結合相互作用を介して、固相上に捕獲される。次に、サンプル中に存在する対象の分析物は、抗体−標識抱合体に「競合的に」結合し、このようにして抗体−標識抱合体と固相との相互作用を阻害又は置き換える。このようにして、固相上に捕獲された抗体−標識抱合体から生成されたシグナルの量を、サンプル中の分析物の量と相関させる。

これらの方法と関連して使用するための試薬も、本発明によって提供され、そして典型的には、分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーに結合している化学発光アクリジニウム化合物を含み、このアクリジニウム化合物は、（ｉ）アクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基であって、該炭化水素基は最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されている、炭化水素基、及び（ii）最大２０個までのヘテロ原子で場合により置換されている置換炭化水素部分に連結しているアクリジニウム核のＣ_９位におけるカルボキシル又はスルホンアミド基を含み、ここで、前記アクリジニウム化合物は、アクリジニウム核のＣ_２位、アクリジニウム核のＣ_７位、カルボキシルもしくはスルホンアミド基に連結している炭化水素部分、又はアクリジニウム核の窒素原子に結合している炭化水素基に結合している、少なくとも１個の両性イオン官能基を含み；前記アクリジニウム化合物は、前記両性イオン官能基を含まない以外は同一のアクリジニウム化合物と比較して、固相に対する非特異的結合の減少を示す。

上記にしたがって、巨大分子分析物の検出又は定量のためのアッセイは、本発明の一実施態様によれば、以下の工程：
（ａ）（ｉ）分析物に対して特異的な結合分子及び（ii）本発明の両性イオン含有アクリジニウムエステル又はスルホンアミド化合物の任意のものを含む抱合体を提供する工程；
（ｂ）固体担体であって、その上に前記分析物に対して特異的な第２結合分子を固定した、固体担体を提供する工程；
（ｃ）上記抱合体、固相、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程；
（ｄ）上記固体担体上に捕獲された結合複合体を分離する工程；
（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、工程（ｄ）からの結合複合体の化学発光を誘発する工程；
（ｆ）照度計を用いて光放出の量を測定する工程；及び
（ｇ）放出された光の量を分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算する工程
を含む。

別の実施態様において、小分子分析物の検出又は定量のためのアッセイが提供され、それは、
（ａ）分析物と本発明の両性イオン含有アクリジニウムエステル又はスルホンアミド化合物の任意のものとの抱合体を提供する工程；
（ｂ）分析物に対して特異的な結合分子で固定された固体担体を提供する工程；
（ｃ）上記抱合体、固体担体、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程；
（ｄ）固体担体上に捕獲された結合複合体を分離する工程；
（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、工程（ｄ）からの結合複合体の化学発光を誘発する工程；
（ｆ）照度計を用いて光の量を測定する工程；及び
（ｇ）放出された光の量を分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算する工程
を含む。

代替的アッセイ形式において、本発明の両性イオン含有アクリジニウム化合物は、また、以下の工程：
ａ）分析物又は分析物類似体で固定された固体担体を提供する工程；
ｂ）分析物に対して特異的な結合分子と本発明の両性イオン含有アクリジニウムエステル又はスルホンアミド化合物との抱合体を提供する工程；
ｃ）上記固相、抱合体、及び分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して結合複合体を形成する工程；
ｄ）固体担体上に捕獲された結合複合体を分離する工程；
ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、（ｄ）の結合複合体の化学発光を誘発する工程；
ｆ）照度計を用いて光の量を測定する工程；及び
ｇ）放出された光の量を分析物の既知濃度と関連させる標準用量反応曲線と、反応混合物から放出された光の量を比較することによって、分析物の存在を検出するか又は分析物の濃度を計算する工程、
を含むアッセイで、小分子分析物の検出に有用である。

化学発光誘発試薬は、過酸化水素又はペルオキシド塩のいずれかであり得る。

巨大分子分析物は、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルス、合成ポリマー等であり得る。

小分子分析物は、ステロイド、ビタミン、ホルモン、治療薬、小ペプチド等であり得る。

本アッセイにおける結合分子は、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質、核酸、ペプチド、受容体又は合成結合分子であり得る。

実施例１
ＺＣ３−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物１ｄの合成
ａ）化合物１ａ
無水テトラヒドロフラン（１０mL）中の２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル（０．１ｇ、０．２４mmol）、（米国特許第７，３０９，６１５号）、３−ジメチルアミノプロパノール（０．１１２mL、４当量）及びトリフェニルホスフィン（０．２５２ｇ、４当量）の溶液を、窒素雰囲気下、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（０．１８８mL、４当量）で処理した。この反応物を室温で１６時間撹拌した。溶離剤として酢酸エチルを使用するシリカでのＴＬＣ分析は、出発物質を示さず、そして７５％酢酸エチル、２４％メタノール及び１％トリエチルアミンを使用して、極性生成物（Ｒｆ約０．１５）が観察された。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を１N ＨＣｌ（２５mL）と酢酸エチル（２５mL）で分液した。生成物を含有する水層を、さらに２回酢酸エチル（２×２５mL）で抽出した。次に、酸性水層を、鮮黄色の懸濁液が形成されるまで、２．５％水酸化ナトリウム水溶液を滴下して処理した。この懸濁液を、酢酸エチル（３×２５mL）で抽出した。次に、少量のこの溶液を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用するＨＰＬＣによって分析した。生成物が、Ｒｔ＝２５分で溶離して観察され、それは主要成分であった。酢酸エチル溶液を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して黄色の粘着性固体を得た。収量＝１２６mg（８９％）；MALDI-TOF MS 588.3 実測値。

ｂ）化合物１ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（１〜２mL）中の化合物１ａ（０．１２６ｇ、０．２１５mmol）、蒸留した１，３−プロパンスルトン（０．７８５ｇ、３０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（０．４７０mL、１０当量）の混合物を、窒素雰囲気下、１５０℃で２４時間加熱した。次に、この反応物を室温に冷ました。少量（１〜２μL）の反応混合物を抜き取り、メタノール（０．１mL）で希釈し、そしてセクション（ａ）において先に記載した勾配を使用して分析ＨＰＬＣによって分析した。主要生成物は、Ｒｔ＝１８分にて溶離して観察され、それは、MALDI-TOF MS分析によると（953.5 実測値）、トリアルキル化アクリジニウムエステル生成物１ｂに一致した。粗反応混合物を酢酸エチル（３０mL）と水（３０mL）で分液した。生成物を含有する水層を、さらに３回酢酸エチル（３×３０mL）で抽出した。水層を減圧下で濃縮して粗アクリジニウムエステル１ｂを得た。この物質を１N ＨＣｌ（１５mL）に溶解し、そして窒素下、１．５時間還流し、そして次に室温に冷ました。反応混合物のＨＰＬＣ分析はメチルエステルの完全な加水分解を示し、そして生成物１ｃがＲｔ＝１６分にて溶離された。反応混合物を約１０mLに濃縮し、そして生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速でのセクション（ａ）に記載したのと同じ勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝１１６mg（全体で５７％）；MALDI-TOF MS 941.2 実測値。

ｃ）化合物１ｄ
ＤＭＦ（３mL）及び水（０．３mL）中のアクリジニウムカルボン酸１ｃ（３０mg、３２μmol）の部分溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（７μL、１．５当量）及びＴＳＴＵ（１９mg、２当量）で処理した。この反応物を室温で激しく撹拌した。２４時間後、セクション（ａ）に記載した勾配を使用する反応混合物のＨＰＬＣ分析は、溶離Ｒｔ＝１７．５分にて生成物（約２０％変換）を示した。次に、反応物を水（２．７mL）で希釈し、それによって清澄な溶液を得て、そして次にさらなるジイソプロピルエチルアミン（１０μL、２当量）及びＴＳＴＵ（５０mg、５当量）で処理した。反応物を室温で０．５時間撹拌し、そして次に、ＨＰＬＣによって分析すると、約４０％変換を示した。次に、生成物を、セクション（ｂ）に記載した勾配及びカラムを使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥して鮮黄色の粉末を得た。収量＝１１mg（３３％）；MALDI-TOF MS 1037.4 実測値。

以下の反応は、ＺＣ３−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物１ｄの合成を説明するものである。

実施例２
ＺＣ６−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物２ｄの合成
ａ）化合物２ａ
無水テトラヒドロフラン（５mL）中の２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、（３０mg、７２μmol）、６−ジメチルアミノ−１−ヘキサノール（４２mg、４当量）及びトリフェニルホスフィン（７５mg、４当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（０．０６mL、５当量）で処理した。反応物を、窒素雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。７０％酢酸エチル、２８％メタノール、２％トリエチルアミンを使用するシリカでのＴＬＣ分析が、極性生成物への完全な変換を示した。反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物はＲｔ＝２５分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、実施例１、セクション（ａ）に記載したように単離した。収量＝３６mg（７５％）。

ｂ）化合物２ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（１ｇ）中の化合物２ａ（３６mg、５４μmol）、蒸留した１，３−プロパンスルトン（０．２ｇ、３０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（０．１２０mL、１０当量）の混合物を、窒素雰囲気下、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして酢酸エチル（３０mL）と水（５０mL）で分液した。生成物を含有する水層を分離し、そして酢酸エチルで２回（２×３０mL）洗浄した。セクション（ａ）に記載した勾配を使用するこの水溶液のＨＰＬＣ分析は、Ｒｔ＝１９分にて溶離するトリアルキル化生成物への＞８０％変換を、そしてＲｔ＝２４分にて溶離する約２０％ジアルキル化生成物を示した。粗アクリジニウムエステル生成物２ｂを含有する水層を、減圧下で濃縮した。残留物を、１N ＨＣｌ（１０mL）に溶解し、そして窒素雰囲気下で２時間還流した。次に、反応混合物を室温に冷まし、そしてＨＰＬＣによって分析すると、それはＲｔ＝１７分にて溶離するアクリジニウムカルボン酸への完全な変換を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速でセクション（ａ）に記載したのと同じ勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物２ｃを得た。収量＝３９．４mg（全体で７１％）；MALDI-TOF MS 1025.1 実測値。

ｃ）化合物２ｄ
１５％水／ＤＭＦ（４mL）中の化合物２ｃ（３９mg、３８μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（０．０３３mL、５当量）及びＴＳＴＵ（５７mg、５当量）で処理した。反応物を室温で１５分間撹拌し、そしてセクション（ａ）に記載したようにＨＰＬＣによって分析した。ＮＨＳエステル生成物２ｄへの完璧な変換を、溶離してＲｔ＝１８．４分にて観察した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速でセクション（ａ）に記載したのと同じ勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥して化合物２ｄを得た。収量＝２８mg（６６％）；MALDI-TOF MS 1120.8 実測値。

以下の反応は、ＺＣ６−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物２ｄの合成を説明するものである。

実施例３
ＺＣ８−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物３ｄの合成
ａ）化合物３ａ
無水テトラヒドロフラン（５mL）中の２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、（３０mg、７２μmol）、８−ジメチルアミノ−１−オクタノール（５０mg、４当量）及びトリフェニルホスフィン（７５mg、４当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（disopropyl azodicarboxylate）（０．０６mL、５当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下で１６時間撹拌した。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物を溶離して、Ｒｔ＝２２．５分にて観察され、それは主要成分であった。生成物３ａを、実施例１、セクション（ａ）に記載したように単離した。収量＝５８mg（定量的）、MALDI-TOF MS 728.6 実測値。

ｂ）化合物３ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（１ｇ）中の化合物３ａ（５８mg、８０μmol）、蒸留した１，３−プロパンスルトン（０．２９１ｇ、３０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（０．１７５mL、１０当量）の混合物を、窒素雰囲気下、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして酢酸エチル（３０mL）と水（３０mL）で分液した。生成物を含有する水層を分離し、そして酢酸エチルで２回（２×３０mL）洗浄した。セクション（ａ）に記載した勾配を使用するこの水溶液のＨＰＬＣ分析は、溶離してＲｔ＝１．５分にてアクリジニウムエステル生成物３ｂを示した（MALDI-TOF MS 1094 実測値）。水層を減圧下で濃縮し、そして回収した褐色の油状物を、窒素下、１N ＨＣｌ（１０mL）中で還流した。２時間後、反応物を室温に冷まし、そしてＨＰＬＣによって分析すると、溶離してＲｔ＝１６分にて生成物を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物３ｃを得た。収量＝３０mg（全体で３９％）；MALDI-TOF MS 1082.4 実測値。

ｃ）化合物３ｄ
１５％水／ＤＭＦ（２mL）中の化合物３ｃ（２３mg、２１．３μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１８．６μL、５当量）及びＴＳＴＵ（３２mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物を、Ｒｔ＝２９分にて溶離して観察すると、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥して生成物３ｄを得た。収量＝１５mg（６０％）；MALDI-TOF MS 1178.8 実測値。

以下の反応は、ＺＣ８−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物３ｄの合成を説明するものである。

実施例４
ＺＣ１２−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物４ｅの合成
ａ）１２−ジメチルアミノ−１−ドデカノール、４ａ
無水テトラヒドロフラン（１０mL）中の１２−ブロモ−１−ドデカノール（１ｇ、３．８mmol）の溶液を、テトラヒドロフラン（１０mL）中のジメチルアミンの２．０M 溶液で処理した。反応物を室温で３日間撹拌した。溶離剤として２５％酢酸エチル、７５％ヘキサンを使用するシリカでのＴＬＣ分析が、ほとんど出発物質を含まない極性生成物の形成を示した。反応物を酢酸エチル（７５mL）で希釈し、そして重炭酸ナトリウム水溶液及び水で２回洗浄した。次に、その酢酸エチル溶液を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。収量＝１．２ｇ（ロウ）。シリカでのＴＬＣ分析（２５％メタノール、７５％酢酸エチル）は、Ｒｆ約０．１で縞状生成物（streaking product）を示した。この生成物４ａを精製せずに使用した。

ｂ）化合物４ｂ
無水テトラヒドロフラン（５mL）中の２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル、（３０mg、７２μmol）、１２−ジメチルアミノ−１−ドデカノール（６６mg、４当量）及びトリフェニルホスフィン（７５mg、４当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（０．０６mL、５当量）で処理した。２時間後、反応物を、追加のトリフェニルホスフィン４当量及びジイソプロピルアゾジカルボキシラート５当量で処理した。３０分後、少量を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用するＨＰＬＣによって分析した。生成物を溶離してＲｔ＝３０分にて観察され、それは主要成分であった。生成物４ｂを、実施例１、セクション（ａ）に記載したように単離した。収量＝５７mg（９５％）、MALDI-TOF MS 840.3 実測値。

ｃ）化合物４ｄ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（１mL）中の化合物４ｂ（５７mg、６８μmol）、１，３−プロパンスルトン（０．２５０ｇ、３０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（０．１５mL、１０当量）の混合物を、窒素下、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして実施例２、セクション（ｂ）に記載したように処理した。セクション（ａ）に記載した勾配を使用した粗反応混合物のＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝２４分で溶離するアクリジニウムエステル生成物４ｃを示した（MALDI-TOF MS 1206.2 実測値）。粗生成物４ｃを、１N ＨＣｌ（１０mL）中で４時間還流した。次に、反応物を室温に冷まし、そしてＨＰＬＣによって分析すると、Ｒｔ＝２１分で溶離する生成物４ｄへの約７０％変換を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して、化合物４ｄを得た。収量＝２２mg（全体で２７％）；MALDI-TOF MS 1193.4 実測値。

ｄ）化合物４ｅ
ＤＭＦ（３．４mL）及び水（０．６mL）中の化合物４ｄ（２２mg、１８．４μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１６μL、５当量）及びＴＳＴＵ（２８mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝２２分で溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１０００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥して生成物４ｅを得た。収量＝１５．４mg（６４％）；MALDI-TOF MS 1290.6 実測値。

以下の反応は、ＺＣ１２−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物４ｅの合成を説明するものである。

実施例５
ＺＣ３Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物５ｄの合成
ａ）化合物５ａ
無水テトラヒドロフラン（３mL）中の２−ヒドロキシアクリジンメチルエステル（２５mg、６２．３μmol）（米国特許第７，３０９，６１５号でのジヒドロキシ誘導体と同様の方法で合成した）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール（１５μL、２当量）及びトリフェニルホスフィン（３３mg、２当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（２５μL、２当量）で処理した。反応物を、窒素下、室温で撹拌した。１時間後、溶離剤として１：１、酢酸エチル／メタノールを使用するシリカでのＴＬＣ分析は、Ｒｆ約０．２の極性生成物の完全形成を示した。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析は、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物をＲｔ＝２５．２分にて溶離し観察すると、それは主要成分であった。反応物を酢酸エチル（２５mL）及び１N ＨＣｌ（２５mL）で希釈した。生成物を含むＨＣｌ層を分離し、そして酢酸エチルで２回（２×２５mL）洗浄した。次に、ＨＣｌ層を氷中で冷却し、そして懸濁が形成されるまで５％ＫＯＨ水溶液で処理した。この懸濁液を酢酸エチル（２×２５mL）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を水（２５mL）で洗浄した。次に、それを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して化合物５ａを得た。収量２４．５mg（８２％）；MALDI-TOF MS 487.5 実測値。

ｂ）化合物５ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（０．５mL）中の化合物５ａ（２４．５mg、５１．３μmol）、１，３−プロパンスルトン（１２５mg、２０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（７９μL、７当量）の混合物を、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量（１〜２μL）を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション（ａ）に記載したようにＨＰＬＣによって分析した。アクリジニウムエステル生成物５ｂを、Ｒｔ＝１８分にて溶離し観察した（＞８０％変換；MALDI-TOF MS 731.04 実測値）。反応物を酢酸エチル（２５mL）と水（２５mL）で分液した。生成物を含有する水層を分離し、そして酢酸エチル（５０mL）で１回洗浄した。次に、それを減圧下で濃縮した。残留物を、窒素下、１N ＨＣｌ１０mL中で２時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝１５分で溶離する生成物５ｃの完全形成を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物５ｃを得た。収量＝３２mg（全体で８９％）；MALDI-TOF MS 717.1 実測値。

ｃ）化合物５ｄ
ＤＭＦ（３．４mL）及び水（０．６mL）中の化合物５ｃ（３２mg、４４．６μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（３９μL、５当量）及びＴＳＴＵ（６７mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物がＲｔ＝１７分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物５ｄを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結しそして凍結乾燥した。収量＝２５mg（６９％）；MALDI-TOF MS 814.1 実測値。

以下の反応は、ＺＣ３Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物５ｄの合成を説明するものである。

実施例６
ＺＣ６Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物６ｄの合成
ａ）化合物６ａ
無水テトラヒドロフラン（３mL）中の２−ヒドロキシアクリジンメチルエステル（２５mg、６２．３μmol）、６−ジメチルアミノ−１−ヘキサノール（１８mg、２当量）及びトリフェニルホスフィン（３３mg、２当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（２５μL、２当量）で処理した。反応物を、窒素下、室温で１時間撹拌し、そして次にセクション（ａ）、実施例５に記載したように処理した。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝２２分にて溶離され観察すると、それは主要成分であった。収量３３．５mg（定量的）；MALDI-TOF MS 529.5 実測値。

ｂ）化合物６ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（０．５mL）中の化合物６ａ（３３．５mg、６３．３μmol）、１，３−プロパンスルトン（１５５mg、２０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（９７μL、７当量）の混合物を、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量（１〜２μL）を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション（ａ）に記載したようにＨＰＬＣによって分析した。アクリジニウムエステル生成物６ｂが、Ｒｔ＝１６分で溶離して観察された（＞８０％変換；MALDI-TOF MS 773.5 実測値）。反応混合物を、セクション（ｂ）、実施例５に記載したように処理した。アクリジニウムエステル６ｂを、窒素下、１N ＨＣｌ１０mL中で２時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝１４分で溶離する生成物６ｃの完全な形成を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物６ｃを得た。収量＝２６．８mg（全体で５６％）。

ｃ）化合物６ｄ
ＤＭＦ（３．４mL）及び水（０．６mL）中の化合物６ｃ（２６．９mg、３５．３μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（３１μL、５当量）及びＴＳＴＵ（５３mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝１５．４分で溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物６ｄを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝１９．３mg（６３％）；MALDI-TOF MS 856.2 実測値。

以下の反応は、ＺＣ６Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物６ｄの合成を説明するものである。

実施例７
ＺＣ８Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物７ｄの合成
ａ）化合物７ａ
無水テトラヒドロフラン（５mL）中の２−ヒドロキシアクリジンメチルエステル（３０mg、７５μmol）、８−ジメチルアミノ−１−オクタノール（２６mg、２当量）及びトリフェニルホスフィン（４０mg、２当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（３０μL、２当量）で処理した。反応物を、窒素下、室温で１時間撹拌し、そして次に、セクション（ａ）、実施例５に記載したように処理した。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝２４分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。収量１３mg（３１％）；MALDI-TOF MS 557.1 実測値。

ｂ）化合物７ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（０．２mL）中の化合物７ａ（１３mg、２３．３μmol）、１，３−プロパンスルトン（５７mg、２０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（３６μL、７当量）の混合物を、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量（１〜２μL）を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション（ａ）に記載したようにＨＰＬＣにより分析した。アクリジニウムエステル生成物７ｂが、Ｒｔ＝１７．４分にて溶離して観察された（＞８０％変換；MALDI-TOF MS 800.8 実測値）。反応混合物を、セクション（ｂ）、実施例５に記載したように処理した。アクリジニウムエステル７ｂを、窒素下、１N ＨＣｌ５mL中で２時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝１５．３分で溶離する生成物７ｃの完全な形成を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物７ｃを得た。収量＝６．８mg（全体で３７％）；MALDI-TOF MS 787.8 実測値。

ｃ）化合物７ｄ
ＤＭＦ（１．７mL）及び水（０．３mL）中の化合物７ｃ（６．８mg、８．６μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（７．５μL、５当量）及びＴＳＴＵ（１３mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝１６．５分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物７ｄを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝５mg（６６％）；MALDI-TOF MS 885.0 実測値。

以下の反応は、ＺＣ８Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物７ｄの合成を説明するものである。

実施例８
ＡＺＣ３−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物８ｄの合成
ａ）化合物８ａ
化合物、２−ヒドロキシ−７−メトキシアクリジンメチルエステルを、米国特許第７，３１９，０４１（Ｂ２）号に記載されている反応を使用して、２−ベンジルオキシ−７−メトキシアクリジン−９カルボン酸及びメチル２，６−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾアートから合成した。無水テトラヒドロフラン（５mL）中の２−ヒドロキシ−７−メトキシアクリジンメチルエステル（２５mg、０．０５８mmol）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール（１３．６μL、２当量）及びトリフェニルホスフィン（３０mg、２当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（２３μL、２当量）で処理した。反応物を、窒素下、室温で撹拌した。１時間後、それをセクション（ａ）、実施例５に記載したように処理した。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物がＲｔ＝２０分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。収量２７mg（９０％）；MALDI-TOF MS 517.9 実測値。

ｂ）化合物８ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（０．５mL）中の化合物８ａ（２７mg、５２．２μmol）、１，３−プロパンスルトン（１２８mg、２０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（８０μL、７当量）の混合物を、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量（１〜２μL）を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション（ａ）に記載したようにＨＰＬＣによって分析した。アクリジニウムエステル生成物８ｂが、Ｒｔ＝１５．２分にて溶離して観察された。反応混合物を、セクション（ｂ）、実施例５に記載したように処理した。アクリジニウムエステル８ｂを、窒素下、１N ＨＣｌ１０mL中で２時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のＨＰＬＣ分析は、Ｒｔ＝１３．５分で溶離する生成物８ｃの完全な形成を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物８ｃを得た。収量＝２２mg（全体で５６％）；MALDI-TOF MS 747.4 実測値。

ｃ）化合物８ｄ
ＤＭＦ（３．６mL）及び水（０．４mL）中の化合物８ｃ（２２mg、２９．５μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２６μL、５当量）及びＴＳＴＵ（４４mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝１４．６分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物８ｄを含有するＨＰＬＣ画分を合わせて、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝１７．６mg（７０％）；MALDI-TOF MS 843.9.0 実測値。

以下の反応は、ＡＺＣ３Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物８ｄの合成を説明するものである。

実施例９
ＡＺＣ６−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物９ｄの合成
ａ）化合物９ａ
無水テトラヒドロフラン（３mL）中の２−ヒドロキシ−７−メトキシアクリジンメチルエステル（２５mg、０．０５８mmol）、６−ジメチルアミノ−１−ヘキサノール（１７mg、２当量）及びトリフェニルホスフィン（３０mg、２当量）の溶液を、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（２３μL、２当量）で処理した。反応物を窒素下、室温で撹拌した。２時間後、それをセクション（ａ）、実施例５に記載したように処理した。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝２２．５分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。収量２０mg（６３％）；MALDI-TOF MS 559.8 実測値。

ｂ）化合物９ｃ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（０．５mL）中の化合物９ａ（２０mg、３５．９μmol）、１，３−プロパンスルトン（８７mg、２０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（５９μL、７当量）の混合物を、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量（１〜２μL）を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてセクション（ａ）に記載したようにＨＰＬＣによって分析した。アクリジニウムエステル生成物９ｂが、Ｒｔ＝１５．７分にて溶離して観察された（MALDI-TOF MS 803.9 実測値）。反応混合物を、セクション（ｂ）、実施例５に記載したように処理した。アクリジニウムエステル９ｂを窒素下、１N ＨＣｌ１０mL中で２時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のＨＰＬＣ分析は、Ｒｔ＝１４．９分で溶離する生成物９ｃの完全な形成を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物９ｃを得た。収量＝１８．３mg（全体で６５％）；MALDI-TOF MS 790.4 実測値。

ｃ）化合物９ｄ
ＤＭＦ（３．６mL）及び水（０．４mL）中の化合物９ｃ（１８．３mg、２３．２μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２０μL、５当量）及びＴＳＴＵ（３５mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝１６分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物９ｄを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝１４mg（６８％）；MALDI-TOF MS 887.6 実測値。

以下の反応は、ＡＺＣ６Ｍ−ＡＥ−ＮＨＳ、化合物９ｄの合成を説明するものである。

実施例１０
ＮＳＰ−２Ｚ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ、化合物１０ｆの合成
ａ）化合物１０ａ
無水テトラヒドロフラン（１０mL）中の４−ブロモベンジルブロミド（２ｇ、８mmol）の溶液を、テトラヒドロフラン中のジメチルアミン（２０mL）mL）の２．０M 溶液で処理した。反応物を室温で３日間撹拌した。次に、反応混合物を、酢酸エチル（７５mL）で希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液１００mLで洗浄した。酢酸エチル層を分離し、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ヘキサン中の１５％酢酸エチルを使用するシリカでのＴＬＣ分析は、出発物質を示さず、そしてＲｆ＝０．１の極性生成物の形成を示した。その酢酸エチル溶液を減圧下で濃縮して明黄色の油状物を得た。収量＝１．６３ｇ。

ｂ）化合物１０ｂ
無水ＤＭＦ（２０mL）中のイサチン（１．１２ｇ、７．６mmol）の溶液を、窒素下、氷浴中で冷却し、そして水素化ナトリウム（０．３６６ｇ、１．２当量、鉱油中６０％分散液）で処理した。反応物を氷浴中で３０分間撹拌し、そして次に、化合物１０ａ（１．６３ｇ、７．６mmol）をＤＭＦ（５mL）中の溶液として、ヨウ化銅（２．９ｇ、２当量）と共に加えた。反応物を窒素下、１４０℃で２４時間加熱した。次に、それを室温に冷まし、酢酸エチル（３０mL）で希釈し、そして濾過した。溶離剤として酢酸エチル中の１０％メタノールを使用する、濾液のシリカでのＴＬＣは、Ｒｆ約０．１の極性生成物を示した。濾液を減圧下で濃縮した。残留物を１０％ＫＯＨ水溶液１００mLに懸濁し、そして窒素下、４時間還流した。次に、反応混合物を室温に冷まし、そしてｐＨ５になるまで２N ＨＣｌで酸性化した。黄色の沈殿物が現れ、それを濾過により回収し、そして真空下で乾燥させた。収量＝０．６ｇ。この化合物をそのまま次の反応に使用した。

ｃ）化合物１０ｃ
無水ピリジン（１５mL）中の化合物１０ｂ（０．２ｇ、０．７１４mmol）の懸濁液を、窒素下、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（２７２mg、２当量）で処理した。５分間簡単に撹拌した後、メチル２，６−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾアート（１２８mg、０．７１４mmol）を加えた。得られた反応物を室温で３日間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を酢酸エチル（４０mL）と１N ＨＣｌ（５０mL）で分液した。生成物を含有するＨＣｌ層を分離し、そして酢酸エチルで２回（２×４０mL）洗浄した。次に、ＨＣｌ溶液を氷浴中で冷却し、そして黄色の沈殿物が分離するまで５％ＫＯＨ水溶液を滴下して処理した（ｐＨ約８）。この懸濁液を、酢酸エチル（２×５０mL）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を、水で１回洗浄し、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして粗生成物を、溶離剤として酢酸エチルを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収量＝９５mg（３０％）；MALDI-TOF MS 443.7 実測値。

ｄ）化合物１０ｅ
イオン性液体［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（０．５mL）中の化合物１０ｃ（２２mg、４９．５μmol）、１，３−プロパンスルトン（１２０mg、２０当量）及び２，６−ジ−tert−ブチルピリジン（８１．５μL、７．５当量）の混合物を、１５０℃で２４時間加熱した。次に、反応物を室温に冷まし、そして少量（１〜２μL）を抜き取り、メタノールで希釈し、そしてPhenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用するＨＰＬＣによって分析した。生成物１０ｄが、Ｒｔ＝１７．２分にて溶離して観察された（約４０％変換）。反応混合物を、セクション（ｂ）、実施例５に記載したように処理した。アクリジニウムエステル１０ｄを、窒素下、１N ＨＣｌ１０mL中で２時間還流し、そして室温に冷ました。反応混合物のＨＰＬＣ分析は、Ｒｔ＝１４．０分で溶離する生成物１０ｅの完全な形成を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮して化合物１０ｅを得た。収量＝１４．５mg（全体で４４％）；MALDI-TOF MS 673.3 実測値。

ｃ）化合物１０ｆ
ＤＭＦ（１．８mL）及び水（０．２mL）中の化合物１０ｅ（１４．５mg、２１．５μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１８．８μL、５当量）及びＴＳＴＵ（３２mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝１６．５分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１０ｆを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝１４mg（８５％）；MALDI-TOF MS 769.5 実測値。

以下の反応は、ＮＳＰ−２Ｚ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ、化合物１０ｆの合成を説明するものである。

実施例１１
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳ、化合物１１ｆの合成
ａ）化合物１１ａ
クロロホルム（４０mL）中のＮ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミン（１ｇ、６．９mmol）の溶液を、ベンジルオキシカルボニルスクシンイミド（３．７８ｇ、２．２当量）で処理した。反応物を室温で１６時間撹拌した。酢酸エチル中の１５％メタノールを使用する反応混合物のシリカでのＴＬＣ分析は、完全反応での極性生成物の形成を示した。反応混合物を、クロロホルム（４０mL）で希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。次に、それを、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して粘性油状物を得た。それは貯蔵すると凝固してロウ状の固体になった。収量＝３．２ｇ；MALDI-TOF MS 414.4 実測値。

ｂ）化合物１１ｂ
無水ＤＭＦ（１５mL）中の化合物１１ａ（１．２ｇ、２．９mmol）の溶液を、１，３−プロパンスルトン（０．７１ｇ、２当量）で処理した。反応物を窒素下、１４５℃で１時間加熱した。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝１９．６分にて溶離（約８０％変換）、出発物質がＲｔ＝２１．６分にて溶離して観察された。反応混合物を減圧下で濃縮し、そして回収した油状物を、メタノール（２０mL）に溶解した。４０％メタノール、６０％酢酸エチルを使用するシリカでのＴＬＣ分析は、出発物質（Ｒｆ約０．３）から生成物（Ｒｆ約０．２）の完全な分離を示した。上記の反応を、同じ規模で繰り返し、そして合わせた反応混合物を、溶離剤として４０％メタノール、６０％酢酸エチルを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率＝１．５５ｇ（６０％）；白色の泡状物；MALDI-TOF MS 536.4 実測値。

ｃ）化合物１１ｃ
化合物１１ｂ（０．８ｇ、１．４９mmol）を、３３％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ１５mL中、室温で２４時間撹拌した。次に、エーテル（１００mL）を加えると、白色の粒状固体が分離した。生成物を沈降させ、そしてエーテルをデカントした。この手順を、エーテルで２回（２×５０mL）繰り返した。最後に、生成物を真空下で乾燥させた。回収した粘性油状物を、水５〜６mLに溶解し、−８０℃に凍結し、そして凍結乾燥して、ガラス状固体を得た。収量＝０．７６６ｇ（定量的）；MALDI-TOF MS 268.2 実測値。可視化のために２５％アンモニア、７５％メタノール及びニンヒドリンを使用するシリカでのＴＬＣ分析が、Ｒｆ約０．２の単一スポットを示した。

ｄ）化合物１１ｄ
ＤＭＦ（３mL）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ（３０mg、６１μmol、米国特許第６，６６４，０４３（Ｂ２）号）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１６μL、１．５当量）及びＴＳＴＵ（２２mg、１．２当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物がＲｔ＝２０分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。このＮＨＳエステルのＤＭＦ溶液（１．５mL）の半分を、ＤＭＦ（１mL）及び０．１５M 重炭酸ナトリウム（１mL）に溶解した化合物１１ｃ（５０mg、０．１８７mmol、遊離アミン形態）の溶液に、滴下した。反応物を室温で撹拌した。３時間後、ＨＰＬＣ分析は、１２．４分で溶離して、生成物１１ｄへの完全な変換を示した。１０→４０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配を使用して、生成物をＲｔ＝１９．２分で溶離した。

生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→４０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１１ｄを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収率＝１９mg（８３％）；MALDI-TOF MS 743.2 実測値。

ｅ）化合物１１ｆ
メタノール（３．６mL）及び水（０．４mL）中の化合物１１ｄ（４５mg、６０．６μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（５３μL、５当量）及びグルタル酸無水物（３５mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物１１ｅがＲｔ＝１４分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、ＤＭＦ（３．６mL）及び水（０．４mL）に溶解した。この溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１０６μL、１０当量）及びＴＳＴＵ（１８２mg、１０当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１０分後、ＨＰＬＣ分析は、Ｒｔ＝１５．３分で溶離する生成物１１ｆへの完全な変換を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→４０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１１ｆを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収率＝２８．７mg（５０％）；MALDI-TOF MS 955.2 実測値。

以下の反応は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳ、化合物１１ｆの合成を説明するものである。

実施例１２
ＮＳＰ−２，７−ＤＭＧ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳ、化合物１２ｈの合成
ａ）１，３−ジメトキシグリセロール、化合物１２ａ
無水メタノール（１００mL）を、水酸化カリウムペレット（２５ｇ、０．４４６mol）で処理し、そしてその懸濁液を、全ての塩基が溶解するまで室温で撹拌した。次に、この溶液を氷浴中で冷却し、そしてエピクロロヒドリン（０．２２３mol、２０．６ｇ）を滴下した。添加の完了後、反応物を室温に温め、そして窒素下、油浴中で、７５〜８０℃で１６時間加熱した。次に、反応物を、室温に冷まし、そして濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。回収した油状物を、酢酸エチル（１５０mL）に溶解し、そして再度濾過し、そして次に減圧下で濃縮した。無色の油状物（２１．５ｇ）を回収し、それを真空蒸留によって精製して、１，３−ジメトキシグリセロール、化合物１２ａ１２．９ｇ（５０％）を得た。

ｂ）化合物１２ｂ
無水ピリジン（２０mL）中の１，３−ジメトキシグリセロール、化合物１２ａ（１ｇ、８．３mmol）の溶液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（２．３８ｇ、１．５当量）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．２５３ｇ、０．２５当量）で処理した。反応物を窒素下、室温で３日間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を酢酸エチル（１００mL）と１N ＨＣｌ（５０mL）で分液した。酢酸エチル層を分離し、そして１n ＨＣｌ（５０mL）で１回、続いて重炭酸ナトリウム水溶液（３×５０mL）で洗浄した。次に、それを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗生成物（２．５ｇ）を、溶離剤としてヘキサン中の２０％酢酸エチルを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収量＝１．７９ｇ（６５％）。

ｃ）化合物１２ｃ
無水ＤＭＦ（６mL）中の２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル（０．１ｇ、０．２４mmol）、化合物１２ｂ（０．４ｇ、１．４５mmol）及び炭酸セシウム（０．２ｇ、２．５当量）の溶液を、窒素下、油浴中、９０〜１００℃で加熱した。５時間後、反応物を室温に冷ました。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝２６．５分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を、酢酸エチル（５０mL）と水（５０mL）で分液した。酢酸エチル層を分離し、そして水で２回（２×５０mL）洗浄した。次に、それを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗生成物（０．３７ｇ）を、１：１、酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカでの分取ＴＬＣによって精製した。精製済み収量＝５８mg（４０％）；MALDI-TOF MS 623.1 実測値。

ｄ）化合物１２ｅ
化合物１２ｃ（５８mg、９３．２５μmol）、蒸留した１，３−プロパンスルトン（１．１４ｇ、１００当量）及び重炭酸ナトリウム（７８mg、１０当量）の混合物を、１４０〜１５０℃で加熱した。２時間後、反応物を室温に冷ました。少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析は、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物１２ｄが、Ｒｔ＝２０分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。反応混合物を、１：１、酢酸エチル／ヘキサン２０mLで処理し、そして混合物を短時間超音波処理してガム状物を分散させた。生成物を沈降させ、そして溶媒をデカントによって除去した。粗生成物を真空下で乾燥させ、そして次に、１N ＨＣｌ１０mLに懸濁し、そして窒素下で３時間還流した。次に、それを、室温に冷まし、そしてＨＰＬＣによって分析すると、メチルエステルの完全な加水分解を示し、生成物１２ｅがＲｔ＝１７．０分で溶離した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１２ｅを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝５６mg（８２％）；MALDI-TOF MS 730.9 実測値。

ｅ）化合物１２ｆ
ＤＭＦ（３mL）中の化合物１２ｅ（５５mg、７５．３μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２０μL、１．５当量）及びＴＳＴＵ（２７mg、１．２当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１０分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析は、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。ＮＨＳエステルがＲｔ＝１８分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、ＮＨＳエステルのＤＭＦ溶液を、水（１．６８mL）及び０．５M 重炭酸ナトリウム（１．６８mL）に溶解した化合物１１ｃ（１６８mg、０．３７６mmol、２ＨＢｒ塩）の溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、ＨＰＬＣ分析は、１２．４分で溶離する生成物１２ｅへの完全な変換を示した。

生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１２ｆを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝６３．８mg（８６％）；MALDI-TOF 979.1MS 実測値。

ｆ）化合物１２ｈ
メタノール（４．０mL）中の化合物１２ｆ（６３．８mg、６５．２μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（５７μL、５当量）及びグルタル酸無水物（７４mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→１００％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物１２ｇが、Ｒｔ＝１３．５分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。次に、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、ＤＭＦ（５．４mL）及び水（０．６mL）に溶解した。この溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１１４μL、１０当量）及びＴＳＴＵ（２００mg、１０当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、ＨＰＬＣ分析は、Ｒｔ＝１４．３分で溶離する生成物１２ｈへの完全な変換を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１２ｈを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝４９．３mg（６３％）；MALDI-TOF MS 1188.9 実測値。

以下の反応は、ＮＳＰ−２，７−ＤＭＧ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳ、化合物１２ｈの合成を説明するものである。

実施例１３
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ２−ＮＨＳ、化合物１３ｅの合成
ａ）化合物１３ａ
無水エーテル（５mL）中の２−クロロエタンスルホニルクロリド（０．１２６mL、１．２mmol）の溶液を、窒素雰囲気下、氷塩浴中、−５℃に冷却し、そして２，６−ルチジン（０．１４mL、１．２mmol）で一度に処理した。反応物を、−５℃で３０分間撹拌し、次に室温に温めた。次に、反応物を、グラスウールを通して濾過して、酢酸（５mL）に溶解した１１ａ（０．３２５ｇ、０．７９mmol）の撹拌した溶液に注いだ。４〜５時間後、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエン（５mL）に懸濁し、そして減圧下で濃縮した。粗生成物を水（５０mL）と酢酸エチル（５０mL）で分液した。水層を分離し、そしてクロロホルム（５０mL）で１回洗浄した。水層を、水酸化アンモニウムでｐＨ９に調整し、そして酢酸エチル（３×５０mL）で抽出した。次に、水層を減圧下で濃縮して白色の固体を得た。収量＝０．１８ｇ、（４３％）；MALDI-TOF MS 522.8 実測値）。

少量の生成物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex PRODIGY、Ｃ_１８１０mm×２５cmカラム及び４．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。清浄な生成物がＲｔ＝２１分にて溶離して、そして出発物質がないことが観察された。

ｂ）化合物１３ｂ
化合物１３ａ（７８mg、０．１５mmol）を、３３％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ５mL中、室温で２４時間撹拌した。次に、エーテル（７５mL）を加えると、白色の粒状固体が分離した。生成物を沈降させ、そしてエーテルをデカントした。この手順を、エーテルで２回（２×５０mL）繰り返した。最後に、生成物を真空下で乾燥させた。収量＝４８mg（７７％）。この物質をそのまま次の反応に使用した。

ｃ）化合物１３ｃ
ＤＭＦ（１mL）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ（１４mg、２８．４μmol、米国特許第６，６６４，０４３（Ｂ２）号）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（７．４μL、１．５当量）及びＴＳＴＵ（１０．３mg、１．２当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝２０分にて溶離して観察され、それは主要成分であった。このＮＨＳエステルのＤＭＦ溶液を、０．２５M 重炭酸ナトリウム（３mL）に溶解した化合物１３ｂ（４８mg、０．１１６mmol、ＨＢｒ塩）の溶液に滴下した。反応物を、室温で撹拌した。３０分後、ＨＰＬＣ分析は、１２．４分間で溶離する生成物１３ｃへの完全な変換を示した。

生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１３ｃを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝１９mg（９０％）。

ｄ）化合物１３ｅ
メタノール（３．６mL）及び水（０．４mL）中の化合物１３ｃ（１９mg、２６．１μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２２．８μL、５当量）及びグルタル酸無水物（１５mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物１３ｄが、Ｒｔ＝１４．６分にて溶離して観察され、それは主要成分であった（＞８０％）。次に、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、ＤＭＦ（３．６mL）及び水（０．４mL）に溶解した。この溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（４５．６μL、１０当量）及びＴＳＴＵ（７９mg、１０当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、ＨＰＬＣ分析は、Ｒｔ＝１５．７分で溶離する生成物１３ｅへの完全な変換を示した。生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１３ｅを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝１５mg（６０％）。

以下の反応は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ２−ＮＨＳ、化合物１３ｅの合成を説明するものである。

実施例１４
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＺＣＢ−ＮＨＳ、化合物１４ｄの合成
ａ）化合物１４ａ
ＭｅＣＮ（５mL）に溶解した１１ａ（０．６ｇ、１．４５mmol）の溶液を、アクリル酸（１mL、１．４５mmol）で処理した。反応物を室温で３６時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、そして粗生成物を、溶離剤として３：２、ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝０．４３２ｇ、（６１％）；MALDI-TOF MS 486.1 実測値）。

ｂ）化合物１４ｂ
化合物１４ａ（０．４３ｇ、０．８８mmol）を、３３％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ１０mL中、室温で２４時間撹拌した。次に、エーテル（１００mL）を加えると、白色の粒状固体が分離した。生成物を沈降させ、そしてエーテルをデカントした。この手順をエーテルで４回（４×５０mL）繰り返した。最後に、生成物を真空下で乾燥させた。次に、それを水（５mL）に溶解し、凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝０．３５ｇ（定量的）；MALDI-TOF MS 218.3 実測値。

ｃ）化合物１４ｃ
ＤＭＦ（２mL）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ（２５mg、５１．０μmol、米国特許第６，６６４，０４３（Ｂ２）号）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１１．３μL、１．５当量）及びＴＳＴＵ（１８．３mg、１．２当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、このＮＨＳエステルのＤＭＦ溶液を、０．２５M 重炭酸ナトリウム（０．８mL）に溶解した化合物１４ｂ（８０mg、０．２mmol、ＨＢｒ塩）の溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施したＨＰＬＣ分析は、１２．０分間で溶離する生成物１４ｃへの完全な変換を示した。

生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１４ｃを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝３８mg（定量的）；MALDI-TOF MS 692.9 実測値。

ｅ）化合物１４ｄ
ＤＭＦ（１．０mL）及びＤＭＳＯ（２．０mL）中の化合物１４ｃ（２０mg、２９μmol）の溶液を、ジイソプロピルチルアミン（diisopropylthylamine）（８．６μL、２当量）で処理し、ＤＭＦ（１mL）中のグルタル酸ジスクシンイミジル（３８mg、０．１１７mmol）の撹拌した溶液に滴下した。この反応物を室温で撹拌した。６０分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物１４ｄが、Ｒｔ＝１５．０分にて溶離して観察され、それは主要成分であった（＞７０％）。この生成物を、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物１４ｄを含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝４mg（１５％）；MALDI-TOF MS 905.5 実測値。

以下の反応は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＺＣＢ−ＮＨＳ、化合物１４ｄの合成を説明するものである。

実施例１５
ＣＮ−ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ３−ＮＨＳ、化合物１５ｆの合成
ａ）化合物１５ａ
塩化チオニル（５mL）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥメチルエステル（０．２２３ｇ、０．４４mmol）の懸濁液を、窒素雰囲気下、８０℃で激しく撹拌しながら加熱した。１時間後、暗色の溶液が形成され、これを室温に冷ました。ヘキサン（５０mL）を加え、そして暗褐色の粘着性固体を分離させた。ヘキサンをデカントし、そして残留物をヘキサン（２５mL）で一回すすぎ、そして真空下で非常に軽く乾燥させた。この粘着性固体に、無水ＭｅＣＮ（１０mL）中のＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１０mL、過剰量）の溶液を加えた。暗褐色の溶液が形成され、これを室温で撹拌した。１５分後、少量の反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→７０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の３０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物１５ａは、Ｒｔ＝１９分にて溶離して幅広いピーク（abroad peak）として観察された。反応混合物を減圧下で濃縮し、そして残留物をメタノール（５mL）に溶解し、トルエン（１５mL）で希釈し減圧下で濃縮して褐色の粘着泡状物を得た。粗収量＝０．４６ｇ。生成物を、溶離剤としてメタノールを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収量＝０．２２ｇ、（８７％）；MALDI-TOF MS 577.9 実測値。

ｂ）化合物１５ｂ
［ＢＭＩＭ］［ＰＦ６］（３mL）中の化合物１５ａ、（０．２２ｇ、０．３８mmol）、蒸留した１，３−プロパンスルトン（０．４６５ｇ、１０当量、及び２，６−ジ−tertブチルピリジン（０．４２mL、５当量）の混合物を、１５５℃で１６時間、激しく撹拌しながら加熱した。次に、それを室温に冷まし、そして酢酸エチル（１００mL）を加えた。生成物が沈殿し、そして濾過により回収し、そして酢酸エチル（２５mL）及びメタノール（２０mL）ですすいだ。次に、粗生成物を、１：１水／メタノール５０mLを含むＲＢフラスコに移した。少量の粗反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→４０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。生成物が、Ｒｔ＝３３分にて溶離して観察された（約９０％変換）。減圧下でこの水溶液を蒸発させて、褐色の固体０．３５ｇを得た。MALDI-TOF MS 699.2 実測値。この物質をそのまま次の反応に使用した。

ｃ）化合物１５ｃ
化合物１５ｂ（０．３５ｇ、粗）を１N ＨＣｌ（２０mL）に懸濁し、そして窒素雰囲気下で１．５時間加熱還流した。セクション（ｂ）に示したＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝２７分間にて溶離する生成物を示した。この反応物を室温に冷ました。生成物１５ｃを、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝１４mg；MALDI-TOF MS 685.7 実測値。

ｄ）化合物１５ｄ
ＤＭＦ（２mL）中の化合物１５ｃ（１４mg、２０μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（６μL、２当量）及びＴＳＴＵ（１２．３mg、２当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１０分後、少量の粗反応混合物のＨＰＬＣ分析を、Phenomenex、Ｃ_１８４．６mm×２５cmカラム及び１．０mL／分の流速での１０→４０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用して実施した。２２分にて溶離するＮＨＳエステルへの完全な変換が観察された。このＤＭＦ溶液を、０．２５M 重炭酸ナトリウム（１mL）中の化合物１１ｃ（４６mg、５当量、ＨＢｒ塩）の撹拌した溶液に滴下した。得られた溶液を室温で撹拌した。１５分後、ＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝１４分にて溶離する主要生成物を示した。

生成物１５ｄを、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、そして減圧下で濃縮した。収量＝１８mg（定量的）；MALDI-TOF MS 935.8 実測値。

ｅ）化合物１５ｆ
メタノール（１．８mL）及び水（０．２mL）中の化合物１５ｄ（１８mg、１９．２μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２６μL、５当量）及びグルタル酸無水物（１７mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、セクション（ｄ）に記載したＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝１６．２分にて溶離するグルタル酸誘導体１５ｅへの完全な変換を示した。この反応物をトルエン（５mL）で希釈し、そして減圧下で濃縮した。残留物をＤＭＦ（１．８mL）及び水（０．２mL）に溶解し、そしてジイソプロピルエチルアミン（５２μL、１０当量）及びＴＳＴＵ（９０mg、１０当量）で処理した。この反応物を室温で撹拌した。３０分後、ＨＰＬＣ分析が、Ｒｔ＝１９分にて溶離する生成物への完全な変換。生成物１５ｆは、YMC、Ｃ_１８３０×３００mmカラム及び２０mL／分の溶媒流速での１０→６０％Ｂ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）の４０分間勾配ならびに２６０nmでのＵＶ検出を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を合わせ、−８０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。収量＝６．５mg（３０％）；MALDI-TOF MS 1146.6 実測値。

以下の反応は、ＣＮ−ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ３−ＮＨＳ、化合物１５ｆの合成を説明するものである。

実施例１６
抗ＴＳＨＭａｂのアクリジニウムエステルでの標識化のための一般手順
抗体の原液（５mg／mL、２００μL、１．０mg、６．７nmol）を、０．１M 炭酸ナトリウムｐＨ９（２５０μL）で希釈して約２．０mg／mL溶液を得た。この溶液に、ＤＭＦ／水１：１溶液又はＤＭＳＯのいずれかにおける溶液としてアクリジニウムＮＨＳエステル１０当量を加えた。例えば、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−Ｚ−ＮＨＳ、１１ｆを使用する場合、これは６４μgの添加を必要とし、このアクリジニウムエステルの５mg／mL溶液（１２．８μL）として加えた。標識化反応物を４℃で１６時間穏やかに撹拌し、そして次に、脱イオン水で４mLに希釈した。次に、これらの希釈溶液を、４mL Centricon（商標）フィルター（ＭＷ３０，０００カットオフ）に移し、そして４０００Ｇで遠心分離して容量を約０．２mLまで減らした。この手順をさらに３回繰り返した。最終的に、濾過された抱合体を、質量スペクトル分析及びＲＬＵ測定のために、総容量２５０μLの水に希釈した。

質量スペクトルを、Voyager DE MALDI-TOF質量分析計に記録し、そして非標識抗体を基準として使用した。抱合体溶液約２μLを、シナピン酸（sinnapinic acid）マトリックス溶液（ＨＰ）２μLと混合し、そしてそれをMALDIプレート上に点在させた。完全に乾燥させた後、質量スペクトルを記録した。非標識抗体及び抱合体についての質量値における差から、ＡＥ取り込みの範囲を測定することができた。典型的には、これらの標識化条件下で、約５つのＡＥ標識が、抗体に取り込まれた。

実施例１７
化学発光測定
各アクリジニウムエステル標識抗体を、０．１M リン酸ナトリウム、０．１５M 塩化ナトリウム、６mM アジ化ナトリウム及び１ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる緩衝液中、０．２nMの濃度に希釈した。試験した各アクリジニウムエステル−抗体抱合体１０μLについての化学発光速度論を、試薬１（０．１M 硝酸及び０．５％過酸化水素）及び試薬２（０．２５M 水酸化ナトリウム及び０．０５％セチルトリメチル塩化アンモニウム）の各々３００μLを順次添加をして、Berthold Technolgies Autolumat LB953照度計を用いて、標準条件下、１０秒ごと（for 10 seconds）０．１秒間隔でまとめた。試験したアクリジニウム化合物の化学発光速度論を、光放出の相対速度ならびに総光出力について比較した。

実施例１８
非特異的結合の測定
両性イオン性アクリジニウム化合物を、イムノアッセイにおける標識として、同じイムノアッセイにおいて別個に標識として使用した対照アクリジニウム化合物との比較のために、試験した。Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）ＴＳＨ３アッセイは、ACS:180（登録商標）に適用するためのSiemens Healthcare Diagnosticsによって製造されている商業的に販売されている一連のイムノアッセイのうちの１つである。ＴＳＨ３アッセイは、サンプル中の分析物ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の測定のために抗ＴＳＨ抗体の化学発光アクリジニウム化合物を使用するサンドイッチイムノアッセイである。

ＴＳＨ３アッセイは２つの抗体を有し、そのうちの一方はアクリジニウム化合物に結合したマウス抗体であり、この組合せはトレーサーと呼ばれ、一方、他方の抗体は常磁性粒子（ＰＭＰ）に結合し、ここで、この組合せは固相と呼ばれる。このアッセイ例において、両性イオン性アクリジニウム化合物そしてまた対照アクリジニウム化合物の両方とも、同じ抗体の別々の部分に各々結合した。このアッセイ例において、アクリジニウムエステル抱合体すなわちトレーサーが、サンプル中のＴＳＨ分析物が非存在の下で試験された場合に、非特異的結合のみが測定された。トレーサーを、０．１５M Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（N-2-hdroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid）（ＨＥＰＥＳ）、０．１５M 塩化ナトリウム、７．７mM アジ化ナトリウム、１．０mM エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１２mM ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Triton X-100）、５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２０ｇ／ＬアムホテリシンＢ、０．４８ｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、１ｇ／ＬマウスＩｇＧ、１０mg／ＬヒツジＩｇＧ、５．０ｇ／Ｌマウス血清、０．０５ｇ／Ｌ antifoam Bを含有するｐＨ７．７の緩衝液中、２．２nMの濃度に希釈した。このアッセイ例において、３つの固相を、アクリジニウム化合物を用いて試験した：Siemens Healthcare Diagnostics TSH3アッセイ固相、Siemens Healthcare Diagnostics iPTH（無傷副甲状腺ホルモン）アッセイ固相（Dynal M280-ストレプトアビジン結合ビオチン化ポリクローナルヤギ抗ＰＴＨ抗体）及びSiemens Healthcare Diagnostics TnI（トロポニンＩ）−ウルトラアッセイ（Dynal M270-ストレプトアビジン結合ビオチン化モノクローナルマウス抗ＴｎＩ抗体）。

Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）は、異なる分析物についての一連のイムノアッセイを実施するように設計された自動ロボット装置である。Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）ＴＳＨ３アッセイについての自動手順は、ＴＳＨ分析物を含有しない各々の血清サンプル２００μLを別個のキュベットに分注することで開始した。キュベットは、トレーサー、サンプル及び固相を混合するための光学的に透明又は半透明の容器であり、そしてその中で化学発光を測定する。サンプルは、分析物ＴＳＨを含有しなかった。次に、ACS:180（登録商標）が、２．２nM（０．２２pmol）トレーサー０．１００mL及び０．３ｇ／Ｌ固相０．２２５mL（６７μg）を、サンプルを含有する各キュベット内に分注し、同量のトレーサー及び固相が、試験される全てのアクリジニウム化合物に使用されるようにした。２つのアッセイ試薬のうちの第１試薬は溶液であり、それは、アクリジニウム化合物と抱合した抗ＴＳＨ抗体を含有した。両性イオン性アクリジニウム化合物及び対照アクリジニウム化合物の両方を、トレーサーのための標識として別個に試験した。トレーサーを、先に記載した手順を使用し、アクリジニウム化合物及びＴＳＨ結合マウス抗体を使用して調製及び精製した。各トレーサーにおける１抗体当たりのアクリジニウム化合物の数は、試験した全てのアクリジニウム化合物についてほぼ同じだった。したがって、各アクリジニウム化合物について測定した非特異的結合におけるいかなる差も、アクリジニウム化合物の構造に関連し得る。各キュベット内のトレーサー、サンプル及び固相の混合物を、３７℃で５．０分間加熱した。キュベット内の混合物からの固相の磁気分離、続くキュベットからの流体の除去、及びキュベット内の固相の水での洗浄によって、非結合トレーサーを固相から除去して、固相及びそれに結合している任意のトレーサー以外の全てを除去した。

固相上のアクリジニウム化合物からの化学発光は、Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）試薬１及びSiemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）試薬２の各々０．３０mLの順次添加に続く光放出で開始した。Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）試薬１は、０．１M 硝酸及び０．５％過酸化水素であった。Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）試薬２は、０．２５M 水酸化ナトリウム及び０．０５％セチルトリメチル塩化アンモニウムであった。次に、各キュベット内の化学発光を相対光単位（ＲＬＵ）として測定した、各キュベットが一つのアッセイサンプルに対応する。試験される各アクリジニウム化合物についての非特異的結合を、ＲＬＵを単位とする化学発光として測定し、ＲＬＵ数はSiemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）によって測定された。非特異的結合部分を、トレーサー０．２２pmolからの各キュベット内への総化学発光入力に対する非特異的結合化学発光の比率として定義する。非特異的結合部分の最小化が、特定シグナルの測定を最大化し、したがって少量の分析物の測定を改善し、そしてイムノアッセイ性能を高める。このアッセイ例において、両性イオン性アクリジニウム化合物は、より低い非特異的結合部分を有し、したがって、イムノアッセイ性能を高めることが期待されるだろう。

実施例１９
アクリジニウム抱合体化学発光安定性の測定
両性イオン性アクリジニウム化合物及び対照アクリジニウム化合物ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ及びＨＱＹ−ＡＥの抱合体を、０．１５M Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．１５M 塩化ナトリウム、７．７mM アジ化ナトリウム、１．０mM エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１２mM ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Triton X-100）、５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２０ｇ／ＬアムホテリシンＢ、０．４８ｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、１ｇ／ＬマウスＩｇＧ、１０mg／ＬヒツジＩｇＧ、５．０ｇ／Ｌマウス血清、０．０５ｇ／Ｌ antifoam Bを含有するｐＨ７．７の緩衝液中、０．１nMの濃度に希釈した。次に、全ての抱合体を、密閉したポリエチレンボトル内で４週間、４℃又は３７℃のいずれかで保存した。４℃又は３７℃のいずれかで保存した各トレーサー１０μLを、Siemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）試薬１及び２を使用するSiemens Healthcare Diagnostics ACS:180（登録商標）と同じ化学発光測定方法を使用する、Bertholdt ALB953化学照度計での化学発光測定のために、定期的に取り除いた。次に、化学発光を、４℃又は３７℃のいずれかにおける保存開始時での各トレーサーについて決定した化学発光に対するパーセンテージとして比較した。対照アクリジニウム化合物に対して高められた又は同等の化学発光安定性が、新規アクリジニウム化合物に対する望ましい特性であり、生成物のより長い又は同等の貯蔵寿命、及びより良好又は同等の日毎の結果の再現性を提供するであろう。

Claims

以下の構造：

［式中、
Ｒ_１は、スルホプロピルもしくはスルホブチル基であるか、あるいはＲ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚであり；
Ｒ_２及びＲ_３は、（ｉ）水素、（ii）電子供与基、（iii）基−Ｚ、（iv）基−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｌ−ＣＨ_３（ここで、ｌは、１〜１２の整数である）、又は（v）基−Ｏ−Ｇから独立して選択され；ここで、該電子供与基は、ＯＲ、ＯＨ、ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ_２、ＮＲ^ＮＲ^Ｎから選択され；
Ｙは、Ｒ、−Ｒ^ａ−Ｚ又は−Ｒ^ａ−Ｌから選択され；
Ｙ’は、各々が場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、Ｃ _１−３５アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキル、−Ｒ ^ａ −Ｚ又は−Ｒ ^ａ −Ｌから選択され；
Ｚは、形態：

で示される両性イオン基であり、
Ｘは、各々出現ごとに独立して、結合、−ＣＨ_２−、酸素、硫黄、−ＮＲ^Ｎ−、アミド（−ＮＲ^Ｎ（ＣＯ）−）、カルバマート（−ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）Ｏ−）又はウレア（−ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）ＮＲ^Ｎ−）から選択され；
Ｒ’及びＲ”は、各々出現ごとに独立して、−Ｒ ^ａ −Ｌ、又は、各々が場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルから選択され；
Ｚ_１は、基−Ｒ^ａ−Ｚ_２（ここで、Ｚ_２は、カルボキシラート（−ＣＯＯ⁻）又はスルホナート（−ＳＯ_３ ⁻）から選択される）であり；
ｎは、各々出現ごとに独立して、１〜１２の間の整数から選択され；
Ｌは、下記：

からなる群より選択され；
Ｇは、各々出現ごとに独立して、

［式中、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３及びＲ_１４は、各々出現ごとに独立して、メチル基又は基−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍＣＨ_３であり、ここで、ｍは、１〜５の整数である］から選択される分岐基であり；
Ｒは、各々出現ごとに独立して、各々は場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
Ｒ^Ｎは、各々出現ごとに独立して、各々は場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、水素、Ｃ_１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；そして
Ｒ^ａは、各々は場合により最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有してもよい、Ｃ_１−３５アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン又はアラルキレン基から選択されるが；
但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｙ及びＹ’のうちの少なくとも１つは、前記両性イオン基Ｚを含む］を有する化学発光アクリジニウム化合物。
Ｒ’又はＲ”が、基−Ｒ^ａ−Ｌであり、ここで−Ｒ^ａ−Ｌは３５個以下の炭素原子を含む、請求項１記載の化学発光アクリジニウム化合物。
Ｒ’又はＲ”が、Ｚの一出現ごとに、基−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−スクシンイミジル、−Ｒ^ａ−Ｎ−マレイミド、−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｂｒ又は−Ｒ^ａ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｉである（ここで、Ｒ’又はＲ”は３５個未満の炭素原子を含む）、請求項１記載の化学発光アクリジニウム化合物。
Ｒ_１が、スルホプロピル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−ＳＯ_３ ⁻）、スルホブチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−ＳＯ_３ ⁻）又は構造：

［式中、Ｒ^Ｎ、Ｒ’、Ｒ”、Ｚ_１及びｎは、請求項１で定義したとおりである］を有する基から選択される、請求項１記載の化学発光アクリジニウム化合物。
Ｒ_２及びＲ_３の一方又は両方が、基Ｚである、請求項１記載の化学発光アクリジニウム化合物。
Ｒ_２及びＲ_３の一方又は両方が、基：

［式中、ｎは、１〜１２の整数であり、そしてｍは、０〜３の整数である］である、請求項５記載の化学発光アクリジニウム化合物。
以下の構造：

［式中、Ｙは、基−Ｒ^ａ−Ｚであり、ここで、Ｒ^ａ、Ｒ_２、Ｒ_３及びＺは、請求項１に定義したとおりである］を有する、請求項１記載の化学発光アクリジニウム化合物。
以下の構造：

［式中、
Ｒ _１は、スルホプロピルもしくはスルホブチル基であるか、あるいはＲ _１は、基−Ｒ ^ａ −Ｚであり；
Ｒ _２及びＲ _３は、（ｉ）水素、（ii）電子供与基、（iii）基−Ｚ、（iv）基−Ｏ−（ＣＨ _２ＣＨ _２ −Ｏ） _ｌ −ＣＨ _３（ここで、ｌは、１〜１２の整数である）、又は（v）基−Ｏ−Ｇから独立して選択され；ここで、該電子供与基は、ＯＲ、ＯＨ、ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ _２、ＮＲ ^ＮＲ ^Ｎから選択され；
Ｚは、形態：

で示される両性イオン基であり、
Ｘは、各々出現ごとに独立して、結合、−ＣＨ _２ −、酸素、硫黄、−ＮＲ ^Ｎ −、アミド（−ＮＲ ^Ｎ（ＣＯ）−）、カルバマート（−ＮＲ ^ＮＣ（Ｏ）Ｏ−）又はウレア（−ＮＲ ^ＮＣ（Ｏ）ＮＲ ^Ｎ −）から選択され；
Ｒ’及びＲ”は、各々出現ごとに独立して、−Ｒ ^ａ −Ｌ、又は、各々が場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、Ｃ _１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルから選択され；
Ｚ _１は、基−Ｒ ^ａ −Ｚ _２（ここで、Ｚ _２は、カルボキシラート（−ＣＯＯ ⁻ ）又はスルホナート（−ＳＯ _３ ⁻ ）から選択される）であり；
ｎは、各々出現ごとに独立して、１〜１２の間の整数から選択され；
Ｌは、下記：

からなる群より選択され；
Ｇは、各々出現ごとに独立して、

［式中、Ｒ _９、Ｒ _１０、Ｒ _１１、Ｒ _１２、Ｒ _１３及びＲ _１４は、各々出現ごとに独立して、メチル基又は基−（ＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ） _ｍＣＨ _３であり、ここで、ｍは、１〜５の整数である］から選択される分岐基であり；
Ｒ ^Ｎは、各々出現ごとに独立して、各々は場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、水素、Ｃ _１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基から選択され；
Ｒ ^ａは、各々は場合により最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有してもよい、Ｃ _１−３５アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン又はアラルキレン基から選択され；
Ｒ^＊は、各々が最大２０個までのヘテロ原子を場合により含有してもよい、水素、Ｃ _１−３５アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルから選択されるか、あるいはＲ^＊は、基−Ｒ^ａ−Ｌであり；ｎ’、ｍ’及びｑ’は、独立して、１〜４の整数であり；そして
Ｒは、各々が場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、Ｃ _１−２９アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルから選択されるが；
但し、Ｒ _１、Ｒ _２及びＲ _３のうちの少なくとも１つは、前記両性イオン基Ｚを含む］を有する、化学発光アクリジニウム化合物。
分析物、分析物類似体又は分析物の結合パートナーに共有結合している、請求項１又は８記載の化学発光アクリジニウム化合物から形成される抱合体を含む分析物の検出のための試薬。
巨大分子分析物の検出又は定量のためのアッセイであって、
（ａ）巨大分子分析物に対して特異的な結合分子に共有結合している、請求項１又は８記載の化学発光アクリジニウム化合物を含む抱合体を提供すること、
（ｂ）固体担体であって、その上に前記分析物に対して特異的な第２結合分子を固定している固体担体を提供すること、
（ｃ）前記抱合体、固体担体、及び前記分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して反応混合物内で結合複合体を形成すること、
（ｄ）前記反応混合物から前記固体担体上に捕獲された前記結合複合体を分離すること、
（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、工程（ｄ）からの前記結合複合体の化学発光を誘発すること、
（ｆ）照度計を用いて光放出の量を測定すること、及び
（ｇ）放出された光の量を前記巨大分子分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、工程（ｅ）からの結合複合体から放出された光の量を比較することによって、前記巨大分子分析物の存在を検出するか又は前記巨大分子分析物の濃度を計算することを含む、アッセイ。
提供された小分子分析物の検出又は定量のためのアッセイであって、
（ａ）小分子分析物が共有結合した請求項１又は８記載の化学発光アクリジニウム化合物の抱合体を提供する工程、
（ｂ）前記小分子分析物に対して特異的な結合分子がその上に固定された固体担体を提供する工程、
（ｃ）前記抱合体、固体担体、及び前記小分子分析物を含有していると疑われるサンプルを混合して反応混合物内で結合複合体を形成する工程、
（ｄ）前記反応混合物から前記固体担体上に捕獲された前記結合複合体を分離する工程、
（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、工程（ｄ）からの前記結合複合体の化学発光を誘発する工程、
（ｆ）照度計を用いて光の量を測定する工程、及び
（ｇ）放出された光の量を前記小分子分析物の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、工程（ｅ）からの結合複合体から放出された光の量を比較することによって、前記小分子分析物の存在を検出するか又は前記小分子分析物の濃度を計算する工程を含む、アッセイ。
小分子分析物の検出のためのアッセイであって、
（ａ）小分子分析物又は小分子分析物類似体がその上に固定された固体担体を提供すること、
（ｂ）請求項１又は８記載の化学発光アクリジニウム化合物に共有結合した前記小分子分析物又は前記小分子分析物類似体に対して特異的な結合分子の抱合体を提供すること、
（ｃ）前記固体担体、前記抱合体、及び前記小分子分析物又は前記小分子分析物類似体を含有していると疑われるサンプルを混合して反応混合物内で結合複合体を形成すること、
（ｄ）前記反応混合物から前記固体担体上に捕獲された前記結合複合体を分離すること、
（ｅ）化学発光誘発試薬を加えることによって、（ｄ）の前記結合複合体の化学発光を誘発すること、
（ｆ）照度計を用いて光の量を測定すること、及び
（ｇ）放出された光の量を前記小分子分析物又は前記小分子分析物類似体の既知濃度と関連づける標準用量反応曲線と、工程（ｅ）からの結合複合体から放出された光の量を比較することによって、前記小分子分析物又は前記小分子分析物類似体の存在を検出するか又は前記小分子分析物又は前記小分子分析物類似体の濃度を計算することを含む、アッセイ。
Ｙ’が、各々が場合により最大２０個までのヘテロ原子を含有してもよい、Ｃ _１−３５アリール、アルキル−アリール、−Ｒ ^ａ −Ｚ又は−Ｒ ^ａ −Ｌから選択される、請求項１記載の化学発光アクリジニウム化合物。