ES2585364T3 - Compuestos de acridinio que contienen zwitteriones - Google Patents

Abstract

Compuesto de acridinio quimioluminiscente que tiene la siguiente estructura:**Fórmula** en la que, n', m', y q' son independientemente un número entero de 1-4, R1 es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo C1-35, cada uno de los cuales puede contener hasta 20 heteroátomos, o un grupo sulfopropilo o sulfobutilo, 10 o R1 es un grupo -Ra-Z; en el que Ra es un radical divalente seleccionado del alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroátomos; R2 y R3 se seleccionan independientemente de (i) hidrógeno, (ii) un grupo electrodonador, o (iii) un grupo -Z; Z es un grupo zwitteriónico de la forma:**Fórmula** X se selecciona independientemente en cada aparición de un enlace, -CH2-, oxígeno, azufre, -NRN-, amida (-NRN(CO)-), carbamato (-NRNC(O)O-) o urea (-NRNC(O)NRN-); R' y R" se seleccionan independientemente en cada aparición de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroátomos; Z1 es un grupo -Ra-Z2 en el que Z2 se selecciona de carboxilato (-COO-), sulfonato (-SO3 -), sulfato (-OSO3 -), fosfato (-OP(O)(OR)(O-)), u óxido (-O-); o, en el caso en el que Z2 es un óxido (-O-), Ra puede estar ausente; n es, seleccionado independientemente en cada aparición, un número entero de entre uno y 12; y R4 y R8 son iguales o diferentes y se seleccionan de hidrógeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR) o amino sustituido (-NR2) C1-35; R* se selecciona de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroátomos, o R* es un grupo -Ra-L, en el que L se selecciona del grupo que consiste en:**Fórmula** R se selecciona independientemente en cada aparición de grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35 que contienen cada uno hasta 20 heteroátomos; y RN se selecciona independientemente en cada aparición de hidrógeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35 que contienen cada uno hasta 20 heteroátomos.

Description

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COMPUESTOS DE ACRIDINIO QUE CONTIENEN ZWITTERIONES DESCRIPCION

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a compuestos de acridinio hidrofilos, quimioluminiscentes que contienen zwitteriones. Estos compuestos de acridinio, debido a su naturaleza hidrofila, presentan baja union no espedfica a fases solidas y son potencialmente utiles para mejorar la sensibilidad de ensayo.

Antecedentes

Han aparecido esteres de acridinio quimioluminiscentes que son marcadores extremadamente utiles tanto para inmunoensayos as^ como para ensayos de acidos nucleicos. La emision de luz desde los esteres de acridinio se desencadena mediante la reaccion con peroxido de hidrogeno alcalino que provoca la escision del enlace ester fenolico y la formacion de acridona en estado excitado, que es la especie que emite luz. Se ha propuesto la formacion de un producto intermedio de dioxetanona tras la salida del grupo saliente de fenol en el mecanismo de reaccion y se supone que es el precursor para la acridona en estado excitado. La duracion de la emision de luz desde los esteres de acridinio que, depende de las condiciones de reaccion, se completa normalmente en el plazo de unos cuantos segundos y puede medirse cuantitativamente usando un luminometro. Se dio a conocer la aplicacion del ester de acridinio bromuro de 9-carboxifenil-N-metilacridinio en un inmunoensayo por Simpson, J.S.A. et al. (Nature vol. 279, pags. 646-647 (1979). Sin embargo, este ester de acridinio es bastante inestable, limitando de ese modo su utilidad comercial. Esta inestabilidad surge de la hidrolisis de la union ester de 9-carboxifenilo labil entre el fenol y el anillo de acridinio.

En un intento por estabilizar el ester fenolico en esteres de acridinio, Law et al. (Journal of Bioluminescence and Chemoluminescence, vol. 4, pags. 88-89 (1989) introdujeron dos grupos metilo flanqueantes para estabilizar este enlace ester. Se encontro que el ester de acridinio estabilizado estericamente resultante, abreviado como DMAE- NHS [10-metilacridinio-9-carboxilato de 2',6'-dimetil-4'-(N-succinimidiloxicarbonil)fenilo] tema la misma produccion de luz que un ester de acridinio que careda de los dos grupos metilo. Por otra parte, la estabilidad del compuesto anterior cuando se conjugo con una inmunoglobulina era enormemente superior y no mostraba perdida de actividad de quimioluminiscencia ni siquiera despues de una semana a 37°C a pH 7. En cambio, el ester de acridinio no sustituido solo conservaba el 10% de su actividad cuando se sometfa al mismo tratamiento.

Para paliar la naturaleza hidrofoba de DMAE y sus derivados, la patente estadounidense n.° 5.656.426 de Law et al. dio a conocer una version hidrofila de DMAE denominada ester de NSP-DMAE-NHS en el que el grupo N-metilo se habfa reemplazado por un grupo N-sulfopropilo (NSP). Tanto DMAE como NSP-DMAE se usan ahora ampliamente en los analizadores de inmunoensayo comerciales, automatizados ACS:180™ y Centaur™ de Siemens Healthcare Diagnostics.

Para aumentar adicionalmente la hidrofilicidad de NSP-DMAE, Natrajan et al. en la patente estadounidense n.° 6.664.043 B2 dieron a conocer derivados de NSP-DMAE con modificadores hidrofilos tales como poli(etilen)glicol y derivados anionicos de espermina unidos al fenol. La estructura de un ester de acridinio de este tipo denominado NSP-DMAE-HEG-glutarato-NHS, (abreviado como NSPDMAE-HEG) y que contiene un derivado de hexa(etilen)glicol (HEG) se ilustra en el siguiente dibujo. En este compuesto, se une un resto de a,o-diamino hexa(etilen)glicol (diamino-HEG) al fenol para aumentar la solubilidad en agua del ester de acridinio. Se anadio un resto glutarato al extremo de diamino-HEG y se convirtio en el ester de NHS para permitir el marcaje de diversas moleculas. Ademas de HEG, tambien se dieron a conocer modificadores anionicos derivados de espermina con grupos sulfonato y carboxilato por Natrajan et al. en la patente estadounidense n.° 6.664.043 B2.

Recientemente, Natrajan et al. en la patente estadounidense n.° 7.309.615 B2 describieron compuestos de acridinio hidrofilos, de alto rendimiento cuantico que contienen grupos alcoxilo (OR*) en C2 y/o C7 del anillo de acridinio, en los que R* es un grupo que comprende un resto sulfopropilo o restos etilenglicol o una combinacion de los mismos. La produccion de luz potenciada a partir de tales compuestos y su naturaleza hidrofila hace que sean utiles para mejorar la sensibilidad de inmunoensayos. La estructura de un compuesto de este tipo denominado NSP-2,7- (oMHEG)2-DMAE-AC-NHS (abreviado como HQYAE) se ilustra a continuacion. Este compuesto y otros compuestos descritos en la patente estadounidense n.° 7.309.615 B2 contema grupos sulfonato anionicos o poli(etilen)glicol unidos al anillo de acridinio en vez del fenol.

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imagen1

glutarato

anillo de acridinio

Estructura de NSP-2,7-(OMHEG)3-DMA-AC-NHS

SO,

ester de NHS para

HE(i

marcaje

grupo saliente

de fenol

"V

5 H

Estructura de NSP-DMAE-HEG-glutarato-NHS

Se pretend^a la incorporacion de restos poli(etilen)glicol (PEG) y aniones en las estructuras de esteres de acridinio dadas a conocer en las patentes mencionadas anteriormente para aumentar la naturaleza hidrofila de estos esteres de acridinio asf como para disminuir la union no espedfica de conjugados derivados de estos compuestos. La union no espedfica, en ensayos que usan fases solidas tales como partmulas o placas de microtitulacion, son interacciones de union no deseadas de estos conjugados de ester de acridinio con estas fases solidas. Estas interacciones de union no deseadas aumentan normalmente el fondo del ensayo conduciendo a una disminucion neta de la relacion de la senal con respecto al fondo en el ensayo y disminuyendo de ese modo la sensibilidad del ensayo.

Se ha descrito el uso de poli(etilen)glicol para disenar superficies inertes que resisten la adsorcion de protemas en la tecnica anterior. Por ejemplo, Ostuni et al. en J. Am. Chem. Soc. 2000, 17, 5605-5620, evaluaron numerosos grupos funcionales unidos a monocapas autoensambladas para determinar la resistencia a la adsorcion de protemas y observaron que los grupos funcionales poli(etilen)glicol confenan la mejor resistencia. Mas recientemente, Ladd et al. en Biomacromolecules 2008, 9, 1357-1361; y otros grupos han notificado que superficies hidrofilas modificadas con zwitteriones son tan inertes frente a la adsorcion de protemas como PEG y ademas, se ha postulado que los zwitteriones senan qmmicamente mas estables que PEG debido a la propension de este ultimo a la escision oxidativa. Se ilustran las estructuras de algunos zwitteriones comunes tales como sulfobetamas, carboxibetamas, fosfobetamas y oxidos de amina en el siguiente dibujo. Como PEG, estos zwitteriones normalmente son electricamente neutros, debido al equilibrio de cargas positivas y negativas dentro de una estructura dada (R1-R4 son normalmente grupos alquilo).

Ejemplos de zwitteriones

Sulfobetamas

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zwitterionicas a pH tanto alto como bajo anionicas a pH > 7

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Carboxibetama Fosfobetama Oxido de amina terciaria

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Cationica a pH bajo

Las sulfobetamas en las que el atomo de nitrogeno es cuaternario mantienen su neutralidad electrica a lo largo de un amplio intervalo de pH. Por otro lado, las sulfobetamas con un nitrogeno trisustituido pueden adquirir una carga negativa a mayor pH (pH >7) debido a que pueden desprotonarse en el nitrogeno neutralizando de ese modo su carga positiva. De manera similar, las carboxibetamas son electricamente neutras a mayor pH pero pueden protonarse en el grupo carboxilato y adquirir una carga positiva neta a pH bajo (pH <5).

Recientemente se han notificado colorantes fluorescentes modificados con zwitteriones para aplicaciones en proteomica por Dratz y Grieco en la solicitud de la patente estadounidense n.° 0259333 A1 (noviembre de 2007). Se observo que protemas marcadas con colorantes zwitterionicos eran solubles en agua y mas apropiadas para el analisis electroforetico y los autores anteriores han reivindicado metodos para el analisis de protemas usando colorantes zwitterionicos.

La incorporacion de grupos funcionales zwitterionicos, electricamente neutros en esteres de acridinio quimioluminiscentes para mejorar sus propiedades tales como union no espedfica no se ha descrito en la tecnica anterior. Tales compuestos complementan los esteres de acridinio que contienen PEG descritos por Natrajan et al. en la patente estadounidense n.° 6.664.043 B2 y la patente estadounidense n.° 7.309.615 B2 y, tienen el potencial de mejorar la sensibilidad del ensayo.

Existe la necesidad continuada en la tecnica de etiquetas quimioluminiscentes mejoradas para inmunoensayos y similares. Por tanto, es un objeto de la invencion proporcionar compuestos de acridinio quimioluminiscentes que presenten union no espedfica reducida a una fase solida.

Sumario de la invencion

Segun los objetivos anteriores y otros, se ha encontrado sorprendentemente que se mejoran las propiedades de compuestos de acridinio quimioluminiscentes incorporando grupos zwitterionicos en la molecula para aumentar su hidrofilicidad y reducir por consiguiente la union no espedfica con fases solidas.

En un aspecto de la invencion, se proporciona un compuesto de acridinio quimioluminiscente que comprende (i) un grupo hidrocarbonado unido al atomo de nitrogeno del nucleo de acridinio, estando dicho grupo hidrocarbonado opcionalmente sustituido con hasta 20 heteroatomos, y (ii) un grupo carboxilo o sulfonamida en la posicion Cg del nucleo de acridinio unido a un resto hidrocarbonado sustituido, en el que el compuesto de acridinio comprende al menos un grupo funcional zwitterionico unido la posicion C2 del nucleo de acridinio, la posicion C7 del nucleo de acridinio, el resto hidrocarbonado unido al grupo carboxilo o sulfonamida, o el grupo hidrocarbonado unido al atomo de nitrogeno del nucleo de acridinio; en el que dicho compuesto de acridinio presenta union no espedfica reducida a una fase solida en comparacion con un compuesto de acridinio por lo demas identico que no comprende dicho grupo funcional zwitterionico.

El compuesto de acridinio quimioluminiscente de la invencion es un ester de acridinio que tiene la siguiente estructura mostrada en la formula I:

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R'

en la que, n’, m’, y q’ son independientemente un numero entero de 1-4,

Ri es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo C1-35, cada uno de los cuales puede contener hasta 20 heteroatomos, o un grupo sulfopropilo o sulfobutilo, o R1 es un grupo -Ra-Z; en el que Ra es un radical divalente seleccionado del alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroatomos;

R2 y R3 se seleccionan independientemente de (i) hidrogeno, (ii) un grupo electrodonador o (iii) un grupo -Z;

Z es un grupo zwitterionico de la forma:

X se selecciona independientemente en cada aparicion de un enlace, -CH2-, oxigeno, azufre, -NRN-, amida -(NRN(CO)-), carbamato (-NRNC(O)O-) o urea (-NRNC(O)NRN-);

R’ y R” se seleccionan independientemente en cada aparicion de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroatomos;

Z1 es un grupo -Ra-Z2 en el que Z2 se selecciona de carboxilato (-COO-), sulfonato (-SO3-), sulfato (-OSO3-), fosfato (-OP(O)(OR)(O-)) u oxido (-O-); o, en el caso en el que Z2 es un oxido (-O-), Ra puede estar ausente;

n es, seleccionado independientemente en cada aparicion, un numero entero de entre uno y 12; y

R4 y R8 son iguales o diferentes y se seleccionan de hidrogeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR) o amino sustituido (-NR2) Ci-35;

R* se selecciona de hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroatomos, o R* es un grupo -Ra-L, en el que L se selecciona del grupo que consiste en:

R'

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R"

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R se selecciona independientemente en cada aparicion de grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35 que contienen cada uno hasta 20 heteroatomos; y

RN se selecciona independientemente en cada aparicion de hidrogeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35 que contienen cada uno hasta 20 heteroatomos.

En otro aspecto de la invencion, se proporciona un reactivo para la deteccion de un analito que comprende un compuesto de acridinio quimioluminiscente de formula I unido un analito, analogo de analito o pareja de union para un analito, comprendiendo el compuesto de acridinio (i) un grupo hidrocarbonado unido al atomo de nitrogeno del nucleo de acridinio, estando dicho grupo hidrocarbonado opcionalmente sustituido con hasta 20 heteroatomos, y (ii) un grupo carboxilo en la posicion Cg del nucleo de acridinio unido a un resto hidrocarbonado sustituido que esta opcionalmente sustituido con hasta 20 heteroatomos, en el que dicho compuesto de acridinio comprende al menos un grupo funcional zwitterionico unido al resto hidrocarbonado unido al grupo carboxilo y, opcionalmente, tambien a la posicion C2 del nucleo de acridinio, la posicion C7 del nucleo de acridinio, o el grupo hidrocarbonado unido al atomo de nitrogeno del nucleo de acridinio; en el que dicho compuesto de acridinio presenta union no espedfica reducida a una fase solida en comparacion con un compuesto de acridinio por lo demas identico que no comprende dicho grupo funcional zwitterionico.

En un aspecto adicional de la invencion, se proporciona un ensayo para la deteccion o cuantificacion de un analito macromolecular que comprende: (a) proporcionar un conjugado que comprende un compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la invencion unido a una molecula de union espedfica para un analito; (b) proporcionar un soporte solido que tiene inmovilizada sobre el mismo una segunda molecula de union espedfica para dicho analito; (c) mezclar el conjugado, la fase solida y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union; (d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido; (e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de la etapa (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia; (f) medir la cantidad de emision de luz con un luminometro; y (g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

En aun otro aspecto, se proporciona un ensayo para la deteccion o cuantificacion de un analito de molecula pequena que comprende las etapas de: (a) proporcionar un conjugado de un analito con un compuesto de acridinio

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quimioluminiscente segun la invencion; (b) proporcionar un soporte solido inmovilizado con una molecula de union espedfica para el analito; (c) mezclar el conjugado, el soporte solido y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union; (d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido; (e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de la etapa (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia; (f) medir la cantidad de luz con un luminometro; y (g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

En otro aspecto todavfa, se proporciona un ensayo para la deteccion de un analito de molecula pequena que comprende: (a) proporcionar un soporte solido inmovilizado con un analito o un analogo de analito; (b) proporcionar un conjugado de una molecula de union espedfica para el analito con un compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la invencion; (c) mezclar la fase solida, el conjugado y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union; (d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido; (e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia; (f) medir la cantidad de luz con un luminometro; y (g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

Estos y otros aspectos de la invencion se entenderan mejor mediante referencia a la siguiente descripcion detallada, incluyendo las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 proporciona las estructuras qmmicas de una pluralidad de compuestos de acridinio que contienen zwitteriones (que no son segun la presente invencion).

La figura 2 proporciona las estructuras qmmicas de otros compuestos de acridinio que contienen zwitteriones a modo de ejemplo de la presente invencion.

La figura 3 proporciona las estructuras qmmicas de otro compuesto de acridinio que contiene zwitteriones a modo de ejemplo de la presente invencion.

La figura 4 es una representacion grafica de la luz emitida desde conjugados de acridinio de control (NSP-DMAE- HEG) y que contienen zwitteriones a modo de ejemplo (NSP-DMAE-Z-NHS) en tanto por ciento de unidades relativas de luz (URL), representado graficamente en funcion del tiempo.

La figura 5 es una representacion grafica de la luz emitida desde conjugados de acridinio de control (HQYAE) y que contienen zwitteriones a modo de ejemplo (NSP-2,7-DMG-DMAE) con dos anticuerpos en tanto por ciento de unidades relativas de luz (URL), representado graficamente en funcion del tiempo.

La figura 6 es una representacion grafica de la luz emitida desde conjugados de acridinio de control (NSP-DMAE-Z) y que contienen zwitteriones a modo de ejemplo (ZC6M-AE y ZC8M-AE) con AcM anti-TSH en tanto por ciento de unidades relativas de luz (URL), representado graficamente en funcion del tiempo.

Descripcion detallada

El objetivo principal de esta invencion es dar a conocer estructuras de compuestos de acridinio que contienen zwitteriones que presentan baja union no espedfica a fases solidas en comparacion con compuestos de acridinio que carecen de esas caractensticas estructurales. Otro objetivo de esta invencion es dar a conocer dos tipos de modificacion zwitterionica de compuestos de acridinio: (a) compuestos de acridinio que contienen zwitteriones en el anillo de acridinio y, (b) compuestos de acridinio que contienen zwitteriones unidos al grupo saliente de fenol. Otro objetivo de la presente invencion es dar a conocer la emision de luz inesperadamente mas rapida desde compuestos de acridinio con zwitteriones unidos al fenol en comparacion con compuestos de acridinio sin esta modificacion estructural. Aun otro objetivo de la presente invencion es demostrar que los compuestos de acridinio que contienen zwitteriones son tan estables como los compuestos de acridinio sin zwitteriones y tienen rendimientos cuanticos comparables.

Los compuestos de acridinio quimioluminiscentes segun la invencion son esteres de acridinio. Los compuestos de acridinio quimioluminiscentes comprenden (i) un grupo hidrocarbonado unido al atomo de nitrogeno del nucleo de acridinio, estando el grupo hidrocarbonado opcionalmente sustituido con hasta 20 heteroatomos, y (ii) un grupo carboxilo en la posicion Cg del nucleo de acridinio unido a un resto hidrocarbonado sustituido, en el que el compuesto de acridinio comprende al menos un grupo funcional zwitterionico unido al resto hidrocarbonado unido al grupo carboxilo y, opcionalmente, a la posicion C2 del nucleo de acridinio, la posicion C7 del nucleo de acridinio, o el grupo hidrocarbonado unido al atomo de nitrogeno del nucleo de acridinio; en el que dicho compuesto de acridinio presenta union no espedfica reducida a una fase solida en comparacion con un compuesto de acridinio por lo demas identico que no comprende dicho grupo funcional zwitterionico.

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El grupo hidrocarbonado unido al atomo de nitrogeno esta opcionalmente sustituido con hasta 20 heteroatomos y, por tanto, puede constituir en s^ mismo un grupo zwitterionico, por ejemplo, en el caso de un grupo sulfopropilo o sulfobutilo unido al nitrogeno de anillo en el que hay una carga positiva en el nitrogeno de anillo cuaternario y una carga positiva en el grupo -SO3. Se entendera que aunque este presente un grupo zwitterionico de este tipo, los compuestos segun la invencion comprenderan ademas al menos un grupo zwitterionico. Dicho de otra manera, los compuestos segun la invencion comprenderan una carga positiva en un atomo distinto de, o ademas de, el nitrogeno del nucleo de acridinio.

El compuesto de acridinio quimioluminiscente es un ester de acridinio que tiene la estructura mostrada en la formula I anterior.

En una realizacion, al menos uno, o exactamente uno de, R1, R2 y R3, comprende un grupo -L o -Ra-L, en el que L es un grupo funcional derivatizable que comprende un grupo saliente, grupo electrofilo o grupo nucleofilo para formar un conjugado con un analito, analogo de analito o pareja de union para un analito. L se seleccionara del grupo que consiste en:

imagen10

En una realizacion, R o R comprende un grupo -Ra-L, en el que L se selecciona del grupo proporcionado anteriormente. En una realizacion, R' o R” es, en una aparicion, un grupo -Ra-C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-N- succinimidilo, -Ra-N-maleimido, -Ra-C(O)-CH2-Br o -Ra-C(O)-CH2-I.

En algunas realizaciones, R2 y R3 son ambos hidrogeno. En otra realizacion, R2 y/o R3 pueden seleccionarse, por ejemplo, de grupos electrodonadores. Los grupos electrodonadores tfpicos incluyen, sin limitacion, OR, OH, SR, Sh, NH2, NRNRN; en el que R y RN se seleccionan independientemente en cada aparicion y se seleccionan del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo, que contienen cada uno hasta 20 heteroatomos. Un grupo electrodonador preferido es alcoxilo (-OR).

En algunas realizaciones, R2 y/o R3 pueden seleccionarse del grupo que consiste en (i) alcoxilo (-OR), (ii) un grupo -O-(CH2CH2-O)-CH3 en el que l es un numero entero desde 1 hasta 12, y (iii) un grupo-O-G, y (vi) un grupo -Z; en el que G es un grupo ramificado seleccionado independientemente en cada aparicion de:

imagen11

en las que R9, R10, R11 R12, R13 y R14 son independientemente en cada aparicion un grupo metilo o un grupo - (CH2CH2O)mCH3, en el que m es un numero entero desde 1 hasta 5.

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Otro ejemplo de un compuesto de ester de acridinio quimioluminiscente segun la formula I, tiene la estructura mostrada en la formula Ic:

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en la que n’, m’, y q’ son independientemente un numero entero de 1-4, y R1, R2, R3, R4, R8, RN, R*, R’ X y Z1 son tal como se definieron anteriormente. En una realizacion, R* comprende un grupo -Ra-L, en el que L es tal como se definio anteriormente. Un compuesto representativo segun esta realizacion tiene la siguiente estructura:

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en la que R1, R2, R3, R4, y R8 son tal como se definieron anteriormente. En algunas realizaciones R4 y R4 son

independientemente grupos alquilo inferior, y en particular metilo; R1 es alquilo (por ejemplo, metilo), sulfopropilo (-CH2CH2CH2-SO3-) o sulfobutilo (-CH2CH2 CH2CH2-SO3-); R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno 20 o un grupo -O-G, en el que G se define como anteriormente; y R16 se selecciona de (i) hidrogeno, (ii) - C(O)-

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CH2CH2CH2-C(O)-N-succinimidilo, (iii) -R-N-maleimido en el que R es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo, cada uno de los cuales puede comprender opcionalmente hasta 20 heteroatomos, o (iv) -C(O)- CH2-X en el que X es bromo (Br) o yodo (I).

En una realizacion, un compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la formula Ic, tiene la siguiente estructura:

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en la que R2 y R3 son tal como se definen como anteriormente.

Un compuesto de acridinio quimioluminiscente a modo de ejemplo segun la formula le (tambien mostrado en la figura 3) tiene dos grupos zwitterionicos, segun la siguiente estructura:

imagen15

en el que el compuesto incluye un opcionalmente contraion A- para equilibrar el nitrogeno cargado positivamente del nucleo de acridinio.

Los compuestos de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion presentan baja union no espedfica cuando se conjugan con protemas tales como anticuerpos. La union no espedfica, tal como se describio previamente, en ensayos que usan fases solidas tales como particulas o placas de microtitulacion son interacciones de union no deseadas de conjugados con estas fases solidas. Estas interacciones de union no deseadas aumentan normalmente el fondo del ensayo conduciendo a una disminucion neta de la relacion de la senal con respecto al fondo en el ensayo y disminuyendo de ese modo la sensibilidad del ensayo. Para evaluar la union no espedfica de los diversos compuestos de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion, se prepararon conjugados de anticuerpo de estos compuestos usando un anticuerpo monoclonal murino (AcM anti-TSH) producido contra el analito TSH (hormona estimulante de la tiroides). La union no espedfica de estos conjugados se comparo entonces con la union no espedfica de conjugados analogos preparados usando NSP-DMAE-HEG y HQYAE. Estos dos ultimos esteres de acridinio hidrofilos, tal como se menciono previamente y se describe en la patente estadounidense n.° 6.664.043 B2 y patente estadounidense n.° 7.309.615 B2 respectivamente, contienen

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hexa(etilen)glicol unido al fenol y el anillo de acridinio respectivamente. Este ultimo compuesto, HQYAE, tambien tiene una produccion de luz aumentada (mayor rendimiento cuantico) debido a los dos grupos alcoxilo, electrodonadores en el anillo de acridinio tal como se describe en la patente estadounidense n.° 7.309.615 B2. Se midio la union no espedfica en dos clases diferentes de partfculas; partfculas paramagneticas (PMP) y pardculas de latex magneticas (MLP) de un proveedor comercial (Dynal™). Las dos partfculas difieren en su composicion intrmseca. Las PMP se componen principalmente de partfculas de oxido de hierro con un recubrimiento de silano que contiene aminas. Las aminas se usan para reticular protemas en la superficie de las partfculas usando reactivos tales como glutaraldelddo. Por otra parte, las MLP se componen de poliestireno poroso con dopado de magnetita para permitir la separacion magnetica. La PMP usada en la presente evaluacion se recubrio con un anticuerpo anti- TSH en la superficie de las partfculas usando qrnmica de acoplamiento de glutaraldelddo (fase solida “PMP”). Las MLP usadas para la presente evaluacion (anticuerpo policlonal anti-PTH de cabra biotinilado unido a estreptavidina- Dynal M280 (fase solida “M280”) y anticuerpo monoclonal anti-cTnl de raton biotinilado unido a estreptavidina-Dynal M270 (fase solida “M270”)) teman estreptavidina inmovilizada sobre las superficies que se usaron entonces para inmovilizar adicionalmente anticuerpos marcados con biotina que pueden unirse a los analitos PTH (hormona paratiroidea) o cTNI (troponina cardiaca I). La interaccion de union estreptavidina-biotina se conoce bien y se usa comunmente en ensayos. Los dos tipos de partfculas (PMP y MLP) se mezclaron con disoluciones de los conjugados durante un periodo de tiempo espedfico y luego se separaron magneticamente las partfculas, se lavaron una vez y luego se midio la quimioluminiscencia asociada con las partfculas. (Pueden encontrarse los detalles experimentales en el ejemplo 18.) La razon de este valor de quimioluminiscencia en comparacion con la entrada de quimioluminiscencia total se denomina union no espedfica fraccionaria (fNSB). Los conjugados con baja union no espedfica tendran por tanto bajos valores de fNSB y estos valores de realizaciones a modo de ejemplo de los compuestos de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion (descritos adicionalmente a continuacion), junto con los compuestos de control, se tabulan a continuacion en la tabla 1.

Tabla 1.

Compuestos de acridinio

N.° de marcadores en el conjugado Fase solida

PMP

M280 M270

Controles

NSP-DMAE-HEG 5 4,0 x 10-5 5,2 x 10-4 4,6 x 10-4

HQYAE

6 1,6 x 10-5 1,5 x 10-4 1,3 x 10-4

1d

ZC3-AE 7 2,0 x 10-5 1,6 x 10-5 1,5 x 10-5

5d

ZC3M-AE 7 3,4 x 10-5 2,2 x 10-5 1,7 x 10-5

2d

ZC6-AE 5 2,8 x 10-5 1,9 x 10-5 1,6 x 10-5

6d

ZC6M-AE 5 3,3 x 10-5 1,7 x 10-4 1,8 x 10-4

3d

ZC8-AE 6 3,7 x 10-5 3,4 x 10-5 3,3 x 10-5

7d

ZC8M-AE 2,4 x 10-5 3,2 x 10-5 2,7 x 10-5

4e

ZC12-AE 7 3,9 x 10-5 5,7 x 10-5 3,9 x 10-5

11f

NSP-DMAE-Z 5 1,3 x 10-5 1,6 x 10-5 1,3 x 10-5

10f

NSP-2Z-DMAE 6 1,3 x 10-5 1,2 x 10-5 1,1 x 10-5

8d

AZC3-AE 6 6,2 x 10-6 2,0 x 10-5 1,6 x 10-5

9d

AZC6-AE 5 1,0 x 10-5 1,4 x 10-5 1,5 x 10-5

PMP = anticuerpo anti-TSH-PMP

M280 = anticuerpo policlonal anti-PTH de cabra biotinilado unido a estreptavidina-Dynal M280 M270 = anticuerpo monoclonal anti-cTnl de raton biotinilado unido a estreptavidina-Dynal M270

Los conjugados de NSP-DMAE-HEG y HQYAE en PMP tienen valores de fNSB de 4 x 10-5 y 1,6 x 10'5 respectivamente. Todos los demas conjugados preparados usando los esteres de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion tienen valores de fNSB que son comparables a o menores que estos valores. Por ejemplo, los conjugados derivados de NSP-DMAE-Z y ZC6MAE tienen valores de fNSB de 1,3 x 10'5 y 3,7 x 10'5 respectivamente. El primer ester de acridinio contiene el zwitterion unido al fenol, mientras que el ultimo compuesto contiene un zwitterion en el anillo de acridinio. Ambos tipos de modificacion zwitterionica son por tanto eficaces en la reduccion de fNSB a partfculas de PMP. En las MLP Dynal con el anticuerpo anti-PTH en la superficie de las partfculas, los conjugados de NSP-DMAE-HEG y HQYAE tienen valores de fNSB de 5,2 x 10'4 y 1,5 x 10'4 respectivamente. Todos los demas conjugados derivados de los esteres de acridinio que contienen zwitteriones tienen valores de fNSB que son sustancialmente menores con la excepcion de ZC12-AE cuya fNSB (1,7 x 10'4) es comparable a la del conjugado de HQYAE. Se observa un resultado similar en las MLP Dynal con el anticuerpo anti- cTNI inmovilizado en su superficie. Por tanto, los conjugados de ester de acridinio que contienen zwitteriones tienen valores significativamente menores de fNSB en las MLP que se sometieron a prueba en ese momento y, ofrecen el potencial de mejorar la sensibilidad del ensayo reduciendo la senal del fondo tal como se comento previamente.

Los conjugados de ester de acridinio de NSP-DMAE-Z y NSP-2,7-DMG-DMAE-Z (DMG = dimetoxigliceriloxilo) con zwitteriones unidos al fenol tambien presentan inesperadamente una emision de luz mas rapida en comparacion con los conjugados analogos derivados de NSP-DMAE-HEG y HQYAE respectivamente tal como se ilustra en los graficos en las figuras 3 y 4. El ester de acridinio, NSP-DMAE-Z-NHS es analogo a NSP-DMAE-HEG-glutarato-NHS en que ambos esteres de acridinio contienen el mismo anillo de acridinio pero diferentes grupos funcionales unidos

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al fenol. El primer compuesto contiene un zwitterion unido al fenol mientras que el ultimo compuesto contiene un derivado de hexa(etilen)glicol. El compuesto que contiene zwitteriones NSP-2,7-DMG-DMAE-Z-NHS, ademas de contener el zwitterion unido al fenol tambien tiene grupos funcionales dimetoxigliceriloxilo (DMG) electrodonadores en el anillo de acridinio. La produccion de luz desde este compuesto es similar a la de HQYAE debido a los dos grupos electrodonadores y, es mayor que la de NSPDMAE-HEG.

Se realizaron mediciones de luz en un luminometro y se midio la luz emitida desde cada conjugado (expresada como URL; unidades relativas de luz) en diversos intervalos de tiempo. Se uso entonces la luz emitida total desde cada conjugado para calcular el porcentaje de luz emitida (% de URL) en cada intervalo de tiempo. Tal como resulta evidente a partir de la figura 4, el conjugado de AcM anti-TSH (AcM = anticuerpo monoclonal) de NSP-DMAE-HEG requiere >4 segundos para la emision de luz completa mientras que para el conjugado de NSP-DMAE-Z, la emision de luz es completa en el plazo de dos segundos. Una comparacion similar de los conjugados de BSA (BSA = albumina serica bovina), de los dos esteres de acridinio indica una emision de luz significativamente mas rapida para el ester de acridinio que contiene zwitteriones.

La emision de luz desde conjugados de anticuerpo de los esteres de acridinio de alta produccion de luz HQYAE y NSP-2,7-DMGDMAE con dos anticuerpos diferentes, AcM anti-TSH y AcM anti-HBsAg (HBsAg = antfgeno de superficie de la hepatitis), se comparan en la figura 5. En este caso tambien, el compuesto que contiene zwitteriones presenta una emision de luz significativamente mas rapida con emision de luz total completa en <2 segundos mientras que los conjugados derivados de HQYAE tardan ~4 segundos para la emision de luz completa. Ademas, se observo que la quimioluminiscencia relativa (QL rel.) de los dos esteres de acridinio era igual en los dos anticuerpos diferentes. Por tanto, la introduccion de zwitteriones en el fenol acelera la emision de luz pero no compromete la produccion de luz global del ester de acridinio.

Los compuestos de acridinio son marcadores quimioluminiscentes extremadamente utiles especialmente en instrumentos de inmunoqmmica automatizados tales como Centaur™ y ACS: 180™ (Siemens Healthcare Diagnostics) que usan los esteres de acridinio NSP-DMAE-HEG y HQYAE. Estos dos instrumentos tienen alto rendimiento, lo que significa que pueden ejecutar la realizacion de un gran numero de pruebas de inmunoensayo, 240 y 180 pruebas respectivamente, cada hora respectivamente. Los reactivos derivados de NSP-DMAE normalmente emiten luz a lo largo de un periodo de cinco segundos cuando se desencadena su quimioluminiscencia con la adicion de acido mtrico 100 mM que contiene hidrogeno peroxido al 0,5% seguido por una segunda disolucion de hidroxido de sodio 0,25 N mas tensioactivo. Los compuestos de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion, en los que el zwitterion esta ubicado en el fenol, en virtud de su rapida emision de luz (< 2 segundos para > 90% de luz emitida total) pueden usarse en instrumentos de inmunoqmmica automatizados tales como ADVIA:Centaur™ para aumentar su rendimiento, en comparacion con las pruebas por lo demas identicas que emplean los esteres de acridinio NSP-DMAE-HEG y HQYAE.

Finalmente en la figura 6, la cinetica de emision de luz desde los conjugados de AcM anti-TSH de los esteres de acridinio que contienen zwitteriones ZC6M-AE, ZC8M-AE (cuyas estructuras se muestran en la figura 1) y NSP- DMAE-Z-NHS se comparan con la de NSP-DMAE-HEG. Mientras que el conjugado de NSP-DMAE-Z, con la modificacion zwitterionica en el fenol, presenta emision de luz mas rapida que NSP-DMAE-HEG tal como se indico anteriormente, los dos conjugados de ester de acridinio de ZC6M-AE y ZC8M-AE en los que el zwitterion esta ubicado en el anillo de acridinio, muestran una cinetica de emision comparable a NSP-DMAE-HEG. Por tanto, la introduccion de zwitteriones en el anillo de acridinio tampoco es perjudicial para la cinetica de emision tal como se observa en estos dos casos. Tambien se observo que la produccion de luz total desde los conjugados de AcM anti- TSH y de AcM anti-HBsAg de los tres compuestos que contienen zwitteriones ZC6M-AE, ZC8M-AE y NSP-DMAE-Z era similar y comparable a la de NSP-DMaE-HEG.

La estabilidad potenciada de los esteres de acridinio tal como se describio originariamente por Law et al. para DMAE, es otra caractenstica importante de estos compuestos que facilita su utilidad en inmunoanalizadores comerciales, automatizados. Por “estabilidad,” quiere decirse una actividad de quimioluminiscencia con perdida minima tal como se mide mediante la perdida de URL cuando los compuestos o conjugados se almacenan en una disolucion acuosa normalmente, en el intervalo de pH de 6-9, que esta dentro del pH fisiologico. Desde un punto de vista mecamstico, la hidrolisis del ester fenolico es la ruta principal mediante la cual los esteres de acridinio quimioluminiscentes se vuelven no quimioluminiscentes. Los conjugados estables garantizan una larga vida util para los reactivos de ester de acridinio y tambien garantizan que el rendimiento del ensayo no vana mucho a lo largo de un periodo de tiempo dado. La estabilidad de diversos conjugados de ester de acridinio (descritos adicionalmente a continuacion) del anticuerpo anti-TSH de la presente invencion se enumera en la tabla 2. Se almacenaron disoluciones acuosas de los conjugados o bien a 4°C, que son tfpicas para instrumentos automatizados comerciales tales como Centaur™, o bien a 37°C en un tampon acuoso a pH 7,7. Las condiciones de almacenamiento mas duras a 37°C en las que se espera que se acelere la hidrolisis del ester de acridinio, permitieron una comparacion equitativa de las estabilidades relativas de los diversos esteres de acridinio. Se registro periodicamente la luz como URL usando un luminometro para todos los conjugados. A las URL que se midieron en el punto de tiempo inicial, tambien denominado dfa 1, se les asigno un valor del 100%. Las uRl residuales de cada conjugado despues de cuatro semanas se enumeran en la tabla 2. Pueden encontrarse otros detalles pertenecientes a estas mediciones en el ejemplo 19.

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Tabla 2.

Compuestos de acridinio

Estabilidad de quimioluminiscencia (% de URL) a las cuatro (4) semanas

4°C

37°C

Controles

NSP-DMAE-HEG 98 75

HQYAE

92 58

1d

ZC3-AE 106 64

5d

ZC3M-AE 99 67

2d

ZC6-AE 93 52

6d

ZC6M-AE 99 68

7d

ZC8M-AE 98 66

11f

NSP-DMAE-Z 88 73

10f

NSP-2Z-DMAE 118 94

8d

AZC3-AE 100 60

9d

AZC6-AE 100 56

A partir de la tabla 2, las estabilidades de quimioluminiscencia de diversos conjugados de ester de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion son comparables a las de NSP-DMAE-HEG y HQYAE. A 37°C, despues de 4 semanas, los conjugados de estos dos esteres de acridinio conservan el 75% y el 58% de su actividad de quimioluminiscencia respectivamente. Todos conjugados de otros esteres de acridinio que contienen zwitteriones muestran una estabilidad comparable que oscila entre el 52% para el conjugado de ZC6-AE y el 94% para el conjugado de NSP-2Z-DMAE. A 4°C, despues de 4 semanas, todos los conjugados de ester de acridinio mostraron una perdida minima de actividad de quimioluminiscencia.

Los compuestos de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion son utiles como marcadores en ensayos para la determinacion o cuantificacion de analitos. Los analitos que se miden normalmente en tales ensayos son a menudo sustancias de cierta relevancia clmica y pueden abarcar una amplia gama de moleculas, desde grandes macromoleculas tales como protemas, acidos nucleicos, virus, bacterias, etc. hasta pequenas moleculas tales como etanol, vitaminas, esteroides, hormonas, farmacos terapeuticos, etc. Un inmunoensayo de tipo “sandwich” implica normalmente la deteccion de una molecula grande, tambien denominada analito macromolecular, usando dos moleculas de union tales como anticuerpos. Se inmoviliza un anticuerpo o se une a una fase solida tal como una partmula, perla, membrana, placa de microtitulacion o cualquier otra superficie solida. Se conocen bien en la tecnica metodos para la union de moleculas de union tales como anticuerpos a fases solidas. Por ejemplo, un anticuerpo puede unirse covalentemente a una partmula que contiene aminas en su superficie usando una molecula de reticulacion tal como glutaraldefndo. La union tambien puede ser no covalente y puede implicar una simple adsorcion de la molecula de union a la superficie de la fase solida, tal como perlas de poliestireno y placa de microtitulacion. El segundo anticuerpo se une a menudo covalentemente con una molecula quimioluminiscente o fluorescente denominada a menudo marcador. El marcaje de moleculas de union tales como anticuerpos y otras protemas de union tambien se conocen bien en la tecnica y se denominan comunmente reacciones de conjugacion y el anticuerpo marcado se denomina a menudo conjugado. Normalmente, un resto reactivo con amina en el marcador reacciona con una amina en el anticuerpo para formar un enlace amida. Tambien se conocen otros enlaces tales como tioeter, ester, carbamato, y similares, entre el anticuerpo y el marcador. En el ensayo, los dos anticuerpos se unen a diferentes regiones del analito macromolecular. El analito macromolecular puede ser, por ejemplo, protemas, acidos nucleicos, oligosacaridos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, celulas, virus, receptores o polfmeros sinteticos. Las moleculas de union pueden ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos, peptidos, protemas de union o polfmeros de union sinteticos. Por ejemplo la protema de union a folato (“FBP”) se une al analito folato. Tambien se dan a conocer moleculas de union sinteticas que pueden unirse a una variedad de analitos por Mossbach et al. Biotechnology vol. 14, pags. 163-170 (1995).

Cuando la fase solida con el anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo marcado se mezcla con una muestra que contiene el analito, se forma un complejo de union entre el analito y los dos anticuerpos. Este tipo de ensayo se denomina a menudo ensayo heterogeneo debido a la participacion de una fase solida. Puede medirse entonces la senal quimioluminiscente o fluorescente asociada con el complejo de union y deducirse la presencia o ausencia del analito. Habitualmente, el complejo de union se separa del resto de los componentes de la reaccion de union tales como anticuerpo marcado en exceso, antes de la generacion de senales. Por ejemplo, si el complejo de union esta asociado con una perla magnetica, puede usarse un iman para separar el complejo de union asociado con la perla de la disolucion en masa. Usando una serie de “patrones”, es decir, concentraciones conocidas del analito, puede generarse una curva de “dosis-respuesta” usando los dos anticuerpos. Por tanto, la curva de dosis-respuesta correlaciona con una determinada cantidad de senal medida con una concentracion espedfica de analito. En un ensayo de tipo sandwich, a medida que aumenta la concentracion del analito, tambien aumenta la cantidad de senal. Entonces puede calcularse la concentracion del analito en una muestra desconocida comparando la senal generada por una muestra desconocida que contiene el analito macromolecular, con la curva dosis-respuesta.

Del mismo modo, los dos componentes de union tambien pueden ser acidos nucleicos que se unen o hibridan con diferentes regiones de un analito de acido nucleico. Entonces puede deducirse la concentracion del acido nucleico

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analito de manera similar.

Otra clase de inmunoensayos para analitos de molecula pequena tales como esteroides, vitaminas, hormonas, farmacos terapeuticos o peptidos pequenos emplea un formato de ensayo que se denomina comunmente ensayo competitivo. Normalmente, en un ensayo competitivo, se prepara un conjugado del analito de interes y un marcador quimioluminiscente o fluorescente uniendo covalentemente las dos moleculas. El analito de molecula pequena puede usarse tal cual o puede alterarse su estructura antes de la conjugacion con el marcador. El analito con la estructura alterada se denomina analogo. A menudo es necesario usar un analogo estructural del analito para permitir la qmmica para la union del marcador con el analito. A veces se usa un analogo estructural de un analito para atenuar o potenciar su union a una molecula de union tal como un anticuerpo. Tales tecnicas se conocen bien en la tecnica. El anticuerpo o una protema de union al analito de interes se inmoviliza a menudo en una fase solida o bien directamente o bien a traves de una interaccion de union secundaria tal como el sistema biotina-avidina.

Puede deducirse la concentracion del analito en una muestra en un ensayo competitivo permitiendo que la muestra que contiene el analito y el conjugado analito-marcador compitan por una cantidad limitada de molecula de union inmovilizada en la fase solida. A medida que aumenta la concentracion de analito en una muestra, disminuye la cantidad de conjugado analito-marcador capturado por la molecula de union en la fase solida. Empleando una serie de “patrones”, es decir, concentraciones conocidas del analito, puede construirse una curva de dosis-respuesta en la que la senal del conjugado analito-marcador capturado por la molecula de union en la fase solida se correlaciona de manera inversa con la concentracion de analito. Una vez que se ha disenado una curva de dosis-respuesta de esta manera, puede deducirse la concentracion del mismo analito en una muestra desconocida comparando la senal obtenida de la muestra desconocida con la senal en la curva dosis-respuesta.

Otro formato del ensayo competitivo para analitos de moleculas pequenas implica el uso de una fase solida que se inmoviliza con el analito de interes o un analogo de analito y un anticuerpo o una protema de union espedfica para el analito que se conjuga con un marcador quimioluminiscente o fluorescente. En este formato, el conjugado anticuerpo-marcador se captura sobre la fase solida a traves de la interaccion de union con el analito o el analogo de analito en la fase solida. El analito de interes presente en una muestra se une entonces “de manera competitiva” al conjugado anticuerpo-marcador y, por tanto, inhibe o sustituye la interaccion del conjugado anticuerpo-marcador con la fase solida. De este modo, la cantidad de senal generada a partir del conjugado anticuerpo-marcador capturado sobre la fase solida se correlaciona con la cantidad del analito en muestra.

Los reactivos para su uso en relacion con estos metodos tambien se proporcionan por la invencion y comprenden normalmente un compuesto de acridinio quimioluminiscente que tiene una formula tal como se muestra en la formula I anterior unido a un analito, analogo de analito o pareja de union para un analito.

Segun lo anterior, un ensayo para la deteccion o cuantificacion de un analito macromolecular comprende, segun una realizacion de la invencion, las siguientes etapas:

(a) proporcionar un conjugado que comprende: (i) una molecula de union espedfica para un analito; y (ii) cualquiera de los compuestos de ester de acridinio que contienen zwitteriones de la invencion;

(b) proporcionar un soporte solido que tiene inmovilizada sobre el mismo una segunda molecula de union espedfica para dicho analito;

(c) mezclar el conjugado, la fase solida y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union;

(d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido;

(e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de la etapa (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia;

(f) medir la cantidad de emision de luz con un luminometro; y

(g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

En otra realizacion, un ensayo para la deteccion o cuantificacion de un analito de molecula pequena se proporciona que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un conjugado de un analito con cualquiera de los compuestos de ester de acridinio que contienen zwitteriones de la invencion;

(b) proporcionar un soporte solido inmovilizado con una molecula de union espedfica para el analito;

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(c) mezclar el conjugado, el soporte solido y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union;

(d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido;

(e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de la etapa (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia;

(f) medir la cantidad de luz con un luminometro; y

(g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

En un formato de ensayo alterno, los compuestos de acridinio que contienen zwitteriones de la presente invencion tambien son utiles para la deteccion de analitos de molecula pequena en ensayos que comprenden las siguientes etapas;

a) proporcionar un soporte solido inmovilizado con un analito o un analogo de analito;

b) proporcionar un conjugado de una molecula de union espedfica para el analito con un compuesto de ester de acridinio que contiene zwitteriones de la presente invencion;

c) mezclar la fase solida, el conjugado y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union;

d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido;

e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia;

f) medir la cantidad de luz con un luminometro; y

g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

Los reactivos que desencadenan luminiscencia pueden ser o bien peroxido de hidrogeno o bien sales de peroxido.

Los analitos macromoleculares puede ser protemas, acidos nucleicos, oligosacaridos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, celulas, virus, polfmeros sinteticos, y similares.

Los analitos de molecula pequena pueden ser esteroides, vitaminas, hormonas, farmacos terapeuticos, peptidos pequenos, y similares.

Las moleculas de union en los ensayos pueden ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una protema de union, un acido nucleico, un peptido, un receptor o una molecula de union sintetica.

Ejemplo 1

Sintesis de ZC3-AE-NHS, compuesto 1d

a) Compuesto 1a

Se trato una disolucion de ester metilico de 2,7-dihidroxi-acridina, (0,1 g, 0,24 mmol), (patente estadounidense n.° 7.309.615), 3-dimetilaminopropanol (0,112 ml, 4 equivalentes) y trifenilfosfina (0,252 g, 4 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (10 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (0,188 ml, 4 equivalentes) bajo una atmosfera de nitrogeno. Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante 16 horas. El analisis mediante CCF sobre sflice usando acetato de etilo como eluyente no mostro material de partida y usando el 75% de acetato de etilo, el 24% de metanol y el 1% de trietilamina, se observo un producto polar (Rf ~0,15). Despues se elimino el disolvente a presion reducida y se repartio el residuo entre HCl 1 N (25 ml) y acetato de etilo (25 ml). Se extrajo la fase acuosa que contema producto dos veces mas con acetato de etilo (2 x 25 ml). Despues se trato la fase acuosa acida con hidroxido de sodio acuoso al 2,5% gota a gota hasta que se formo una suspension de color amarillo brillante. Se extrajo esta suspension con acetato de etilo (3 x 25 ml). Entonces se analizo una pequena porcion de esta disolucion mediante HPLC usando una columna Phenomenex, C-is de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de

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1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 25 minutos y que era el componente mayoritario. Se seco la disolucion en acetato de etilo sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida para producir un solido pegajoso de color amarillo. Rendimiento = 126 mg (89%); EM MALDI-TOF 588,3 observado.

b) Compuesto 1c

Se calento una mezcla del compuesto 1a (0,126 g, 0,215 mmol), 1,3-propano-sultona destilada (0,785 g, 30 equivalentes) y 2,6-di-terc-butilpiridina (0,470 ml, 10 equivalentes) en el lfquido ionico [BMIM][PF6] (1-2 ml) a 150°C bajo una atmosfera de nitrogeno durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente. Se retiro una pequena porcion (1-2 |il) de la mezcla de reaccion, se diluyo con metanol (0,1 ml) y se analizo mediante HPLC analttica usando el gradiente descrito anteriormente en la seccion (a). Se observo un producto mayoritario que elrna a Rt = 18 minutos que mediante analisis de EM MALDI-TOF (953,5 observado) correspondfa al producto de ester de acridinio trialquilado 1b. Se repartio la mezcla de reaccion en bruto entre acetato de etilo (30 ml) y agua (30 ml). Se extrajo la fase acuosa que contema producto tres veces mas con acetato de etilo (3 x 30 ml). Se concentro la fase acuosa a presion reducida para producir ester de acridinio 1b en bruto. Se disolvio este material en HCl 1 N (15 ml) y se sometio a reflujo bajo nitrogeno durante 1,5 horas y despues se enfrio hasta temperatura ambiente. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion indico hidrolisis limpia del ester metilico con el producto 1c que elrna a Rt = 16 minutos. Se concentro la mezcla de reaccion hasta ~10 ml y se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C-is de 30 x 300 mm y el mismo gradiente descrito en la seccion (a) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron y se concentraron las fracciones de HPLC que conteman producto a presion reducida. Rendimiento = 116 mg (57% global); EM MALDI-TOF 941,2 observado.

c) Compuesto 1d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion parcial de acido acridinio-carboxflico 1c (30 mg, 32 |imol) en DMF (3 ml) y agua (0,3 ml) con diisopropiletilamina (7 ml, 1,5 equivalentes) y TSTU (19 mg, 2 equivalentes). Se agito vigorosamente la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 24 horas, el analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion usando el gradiente descrito en la seccion (a) mostro producto (~20% de conversion) que elrna a Rt = 17,5 minutos. Despues se diluyo la reaccion con agua (2,7 ml) lo que dio una disolucion transparente y entonces se trato con diisopropiletilamina (10 |il, 2 equivalentes) y TSTU (50 mg, 5 equivalentes) adicionales. Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante 0,5 horas y entonces se analizo mediante HPLC que indico ~40% de conversion. Despues se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando el gradiente y la columna descritos en la seccion (b). Se congelaron las fracciones de HPLC que conteman producto a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad para producir un polvo de color amarillo brillante. Rendimiento = 11 mg (33%); EM MALDI-TOF 1037,4 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de ZC3-AE-NHS, compuesto 1d.

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Sintesis de ZC6-AE-NHS, compuesto 2d

a) Compuesto 2a

Se trato una disolucion de ester metilico de 2,7-dihidroxi-acridina, (30 mg, 72 ^.mol), 6-dimetilamino-1-hexanol (42mg, 4 equivalentes) y trifenilfosfina (75 mg, 4 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (5 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (0,06 ml, 5equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente bajo una atmosfera de nitrogeno durante 16 horas. El analisis mediante CCF sobre sflice usando el 70% de acetato de etilo, el 28% de metanol, el 2% de trietilamina mostro la conversion limpia en un producto polar. Se realizo el analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elma a Rt = 25 minutos y que era el componente mayoritario. Se aislo el producto tal como se describe en el ejemplo 1, seccion (a). Rendimiento = 36 mg (75%).

b) Compuesto 2c

Se calento una mezcla del compuesto 2a (36 mg, 54 ^mol), 1,3-propano-sultona destilada (0,2 g, 30 equivalentes) y 2,6-di-terc-butilpiridina (0,120 ml, 10 equivalentes) en el Kquido ionico [BMIM][PF6] (1 g) a 150°C bajo una atmosfera de nitrogeno durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se repartio entre acetato de etilo (30 ml) y agua (50 ml). Se separo la fase acuosa que contema producto y se lavo dos veces con acetato de etilo (2 x 30 ml). El analisis mediante HPLC de la disolucion acuosa usando el gradiente descrito en la seccion (a) indico >80% de conversion en el producto trialquilado que elma a Rt = 19 minutos con ~20% de producto dialquilado que elma a Rt = 24 minutos. Se concentro la fase acuosa que contema el producto de ester de acridinio 2b en bruto a presion reducida. Se disolvio el residuo en HCl 1 N (10 ml) y se sometio a reflujo bajo una atmosfera de nitrogeno durante 2 horas. Entonces se enfrio la mezcla de reaccion hasta temperatura ambiente y se analizo mediante HPLC que indico la conversion limpia en el acido acridinio-carboxHico que elma a Rt = 17 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y el mismo

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gradiente descrito en la seccion (a) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que contenian producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 2c. Rendimiento = 39,4 mg (71% global); EM MALDI-TOF 1025,1 observado.

c) Compuesto 2d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 2c (39mg, 38 pmol) en agua al 15%/DMF (4 ml) con diisopropiletilamina (0,033 ml, 5 equivalentes) y TSTU (57 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante 15 minutos y se analizo mediante HpLC tal como se describe en la seccion (a). Se observo la conversion completa en el producto de ester de NHS 2d que eluia a Rt = 18,4 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y el mismo gradiente descrito en la seccion (a) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que contenian producto, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad para dar el compuesto 2d. Rendimiento = 28 mg (66%); EM MALDI-TOF 1120,8 observado.

Las siguientes reacciones describen la sintesis de ZC6-AE-NHS, compuesto 2d.

imagen17

Sintesis de ZC8-AE-NHS, compuesto 3d

a) Compuesto 3a

Se trato una disolucion de ester metilico de 2,7-dihidroxi-acridina, (30 mg, 72 pmol), 8-dimetilamino-1-octanol (50 mg, 4 equivalentes) y trifenilfosfina (75 mg, 4 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (5 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (0,06 ml, 5 equivalentes). Se agito la reaccion bajo una atmosfera de nitrogeno durante 16 horas. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que eluia a Rt = 22,5 minutos y que era el componente mayoritario. Se aislo el

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producto 3a tal como se describe en el ejemplo 1, seccion (a). Rendimiento = 58 mg (cuantitativo), EM MALDI-TOF 728,6 observado.

b) Compuesto 3c

Se calento una mezcla del compuesto 3a (58 mg, 80 |imol), 1,3-propano-sultona destilada (0,291 g, 30 equivalentes) y 2,6-di-terc-butilpiridina (0,175 ml, 10 equivalentes) en el lfquido ionico [BMIM][PF6] (l g) a 150°C bajo una atmosfera de nitrogeno durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se repartio entre acetato de etilo (30 ml) y agua (30 ml). Se separo la fase acuosa que contema producto y se lavo dos veces con acetato de etilo (2 x 30 ml). El analisis mediante HPLC de la disolucion acuosa usando el gradiente descrito en la seccion (a) indico el producto de ester de acridinio 3b que elrna a Rt = 1,5 min (EM MALDI-TOF 1094 observado). Se concentro la fase acuosa a presion reducida y se sometio a reflujo el aceite marron recuperado en HCl 1 N (10 ml) bajo nitrogeno. Despues de 2 horas, se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se analizo mediante HPLC que indico un producto que elrna a Rt = 16minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C-is de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentro a presion reducida para dar el compuesto 3c. Rendimiento = 30 mg (39% global); EM MALDI-TOF 1082,4 observado.

c) Compuesto 3d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 3c (23 mg, 21,3 |imol) en agua al 15%/DMF (2 ml) con diisopropiletilamina (18,6 |il, 5 equivalentes) y TSTU (32 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C-is de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 29 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad para dar el producto 3d. Rendimiento = 15 mg (60%); EM MALDI-TOF 1178,8 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de ZC8-AE-NHS, compuesto 3d.

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Sintesis de ZC12-AE-NHS, compuesto 4e

a) 12-dimetilamino-1-dodecanol, 4a

Se trato una disolucion de 12-bromo-1-dodecanol (1g, 3,8mol) en tetrahidrofurano anhidro (10 ml) con una disolucion de dimetilamina en tetrahidrofurano 2,0 M (10 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante

3 dfas. El analisis mediante CCF sobre sflice usando el 25% de acetato de etilo, el 75% de hexanos como eluyente mostro la formacion de un producto polar con poca cantidad de material de partida. Se diluyo la reaccion con acetato de etilo (75 ml) y se lavo dos veces con bicarbonato de sodio acuoso y agua. Entonces se seco la disolucion en acetato de etilo sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. Rendimiento = 1,2g (cera). El analisis mediante CCF sobre sflice (el 25% de metanol, el 75% de acetato de etilo) mostro un producto en franjas con Rf -0,1. Este producto 4a, se uso sin purificacion.

b) Compuesto 4b

Se trato una disolucion de ester metflico de 2,7-dihidroxi-acridina, (30mg, 72 ^mol), 12-dimetilamino-1-dodecanol (66 mg, 4 equivalentes) y trifenilfosfina (75 mg, 4 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (5 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (0,06 ml, 5 equivalentes). Despues de 2 horas, se trato la reaccion con

4 equivalentes de trifenilfosfina y 5 equivalentes de azodicarboxilato de diisopropilo adicionales. Despues de 30 minutos, se analizo una pequena porcion mediante HPLC usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y detection UV a 260 nm. Se observo un producto que elufa a Rt = 30 minutos y que era el componente mayoritario. Se aislo el producto 4b tal como se describe en el ejemplo 1, section (a). Rendimiento = 57 mg (95%), EM MALDI-TOF 840,3 observado.

c) Compuesto 4d

Se calento una mezcla del compuesto 4b (57 mg, 68 p,mol), 1,3-propano-sultona (0,250 g, 30 equivalentes) y 2,6-di-

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terc-butilpiridina (0,15 ml, 10 equivalentes) en el Ifquido ionico [BMIM][PF6] (1 ml) a 150°C bajo nitrogeno durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se proceso tal como se describe en el ejemplo 2, seccion (b). El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion en bruto usando el gradiente descrito en la seccion (a) indico el producto de ester de acridinio 4c que elma a Rt = 24 minutos (EM MALDI-TOF 1206,2 observado). Se sometio a reflujo el producto 4c en bruto en HCl 1 N (10 ml) durante 4 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se analizo mediante HPLC que indico ~70% de conversion en el producto 4d que elma a Rt = 21 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 4d. Rendimiento = 22 mg (27% global); eM MALDI-ToF 1193,4 observado.

d) Compuesto 4e (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 4d (22 mg, 18,4 |imol) en DMF (3,4 ml) y agua (0,6 ml) con diisopropiletilamina (16 |il, 5 equivalentes) y TSTU (28 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elma a Rt = 22 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 1000% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad para dar el producto 4e. Rendimiento = 15,4 mg (64%); EM MALDI-TOF 1290,6 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de ZC12-AE-NHS, compuesto 4e.

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imagen19

Sintesis de ZC3M-AE-NHS, compuesto 5d

a) Compuesto 5a

Se trato una disolucion de ester 2,6-dimetil-4-metiloxicarbonilfemlico del acido 2-hidroxi-acridin-9-carboxilico (25 mg, 62,3 pmol) (sintetizado de manera similar al derivado de dihidroxilo en la patente estadounidense n.° 7.309.615), 3- dimetilamino-1-propanol (15 pl, 2 equivalentes) y trifenilfosfina (33 mg, 2 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (3 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (25 pl, 2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente bajo nitrogeno. Despues de 1 hora, el analisis mediante CCF sobre silice usando acetato de etilo/metanol 1:1 como eluyente mostro la formacion limpia de un producto polar de Rf -0,2. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que eluia a Rt = 25,2 minutos y que era el componente mayoritario. Se diluyo la reaccion con acetato de etilo (25 ml) y HCl 1 N (25 ml). Se separo la fase de HCl con producto y se lavo dos veces con acetato de etilo (2 x 25 ml). Entonces se enfrio la fase de HCl en hielo y se trato con KOH acuoso al 5% hasta que se formo una suspension. Se extrajo esta suspension con acetato de etilo (2 x 25 ml). Se lavaron los extractos de acetato de etilo combinados con agua (25 ml). Entonces se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 5a. Rendimiento 24,5 mg (82%); EM MALDI-TOF 487,5 observado.

b) Compuesto 5c

Se calento una mezcla del compuesto 5a (24,5 mg, 51,3 pmol), 1,3-propano-sultona (125 mg, 20 equivalentes) y 2,622

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di-terc-butilpiridina (79 |il, 7 equivalentes) en el Ifquido ionico [BMIM][PF6] (0,5 ml) a 150°C durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se retiro una pequena porcion (1-2 |il), se diluyo con metanol y se analizo mediante HPLC tal como se describe en la seccion (a). Se observo el producto de ester de acridinio 5b que elma a Rt = 18 minutos (>80% de conversion; EM MALDI-TOF 731,04 observado). Se repartio la reaccion entre acetato de etilo (25 ml) y agua (25 ml). Se separo la fase acuosa que contema producto y se lavo una vez con acetato de etilo (50 ml). Entonces se concentro a presion reducida. Se sometio a reflujo el residuo en 10 ml de HCl 1 N durante 2 horas bajo nitrogeno y se enfrio hasta temperatura ambiente. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion indico la formacion limpia del producto 5c que elma a Rt = 15 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 5c. Rendimiento = 32 mg (89% global); EM MALDI-TOF 717,1 observado.

c) Compuesto 5d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 5c (32 mg, 44,6 |imol) en DMF (3,4 ml) y agua (0,6 ml) con diisopropiletilamina (39 |il, 5 equivalentes) y TSTU (67 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elma a Rt = 17 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (a = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 5d, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 25 mg (69%); EM MALDI-TOF 814,1 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de ZC3M-AE-NHS, compuesto 5d.

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imagen20

Sintesis de ZC6M-AE-NHS, compuesto 6d

a) Compuesto 6a

Se trato una disolucion de ester metflico de 2-hidroxi-acridina (25 mg, 62,3 |imol), 6-dimetilamino-1-hexanol (18 mg, 2 equivalentes) y trifenilfosfina (33 mg, 2 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (3 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (25 |il, 2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente bajo nitrogeno durante 1 hora y entonces se sometio a tratamiento final tal como se describe en la seccion (a), ejemplo 5. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 22 minutos y que era el componente mayoritario. Rendimiento 33,5 mg (cuantitativo); EM MALDI-TOF 529,5 observado.

b) Compuesto 6c

Se calento una mezcla del compuesto 6a (33,5 mg, 63,3 |imol), 1,3-propano-sultona (155 mg, 20 equivalentes) y 2,6- di-terc-butilpiridina (97 |il, 7 equivalentes) en el lfquido ionico [BMIM][PF6] (0,5 ml) a 150°C durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se retiro una pequena porcion (1-2 |il), se diluyo con metanol y se analizo mediante HPLC tal como se describe en la seccion (a). Se observo el producto de ester de acridinio 6b que elrna a Rt = 16 minutos (>80% de conversion; EM MALDI-TOF 773,5 observado). Se sometio la mezcla de reaccion a tratamiento final tal como se describe en la seccion (b), ejemplo 5. Se sometio a reflujo el ester

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de acridinio 6b en 10 ml de HCl 1 N durante 2 horas bajo nitrogeno y se enfrio hasta temperatura ambiente. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion indico la formacion limpia del producto 6c que elma a Rt = 14 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 6c. Rendimiento = 26,8 mg (56% global).

c) Compuesto 6d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 6c (26,9 mg, 35,3 |imol) en DMF (3,4 ml) y agua (0,6 ml) con diisopropiletilamina (31 |il, 5 equivalentes) y TSTU (53 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elma a Rt = 15,4 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 6d, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 19,3 mg (63%); Em MALDI-TOF 856,2 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de ZC6M-AE-NHS, compuesto 6d.

imagen21

DIAD, THF

COOMe

COOMe

[BMIM] [PF6]

COOMe

SO

SO

o.s

TSTU. DIPEA

-+x->ro

DMF/agua

COOH

5

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25

30

35

40

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Ejemplo 7

Sintesis de ZC8M-AE-NHS, compuesto 7d

a) Compuesto 7a

Se trato una disolucion de ester metflico de 2-hidroxi-acridina (30 mg, 75 |imol), 8-dimetilamino-1-octanol (26 mg, 2 equivalentes) y trifenilfosfina (40 mg, 2 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (5 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (30 |il, 2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente bajo nitrogeno durante 1 hora y entonces se sometio a tratamiento final tal como se describe en la seccion (a), ejemplo 5. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 24 minutos y que era el componente mayoritario. Rendimiento 13 mg (31%); EM MALDI-TOF 557,1 observado.

b) Compuesto 7c

Se calento una mezcla del compuesto 7a (13 mg, 23,3 |imol), 1,3-propano-sultona (57 mg, 20 equivalentes) y 2,6-di- terc-butilpiridina (36 |il, 7 equivalentes) en el lfquido ionico [BMIM][PF6] (0,2 ml) a 150°C durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se retiro una pequena porcion (1-2 |il), se diluyo con metanol y se analizo mediante HPLC tal como se describe en la seccion (a). Se observo el producto de ester de acridinio 7b que elrna a Rt = 17,4 minutos (>80% de conversion; EM MALDI-TOF 800,8 observado). Se sometio la mezcla de reaccion a tratamiento final tal como se describe en la seccion (b), ejemplo 5. Se sometio a reflujo el ester de acridinio 7b en 5 ml de HCl 1 N durante 2 horas bajo nitrogeno y se enfrio hasta temperatura ambiente. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion indico la formacion limpia del producto 7c que elrna a Rt = 15,3 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 7c. Rendimiento = 6,8 mg (37% global); EM MALDI-TOF 787,8 observado.

c) Compuesto 7d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 7c (6,8 mg, 8,6 |imol) en DMF (1,7 ml) y agua (0,3 ml) con diisopropiletilamina (7,5 |il, 5 equivalentes) y TSTU (13 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 16,5 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 7d, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 5 mg (66%); EM MALDI-TOF 885,0 observado.

Las siguientes reacciones describen la sintesis de ZC8M-AE-NHS, compuesto 7d.

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Sintesis de AZC3-AE-NHS, compuesto 8d

a) Compuesto 8a

Se sintetizo el compuesto de ester metflico de 2-hidroxi-7-metoxi-acridina a partir de acido 2-benciloxi-7-metoxi- acridin-9-carbox^lico y 2,6-dimetil-4-hidroxibenzoato de metilo usando las reacciones descritas en la patente estadounidense n.° 7.319.041 B2. Se trato una disolucion de ester metflico de 2-hidroxi-7-metoxi-acridina (25 mg, 0,058 mmol), 3-dimetilamino-1-propanol (13,6 |il, 2 equivalentes) y trifenilfosfina (30 mg, 2 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (5 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (23 |il, 2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente bajo nitrogeno. Despues de 1 hora, se sometio a tratamiento final tal como se describe en la seccion (a), ejemplo 5. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 20 minutos y que era el componente mayoritario. Rendimiento 27 mg (90%); EM MALDI-TOF 517,9 observado.

b) Compuesto 8c

Se calento una mezcla del compuesto 8a (27 mg, 52,2 |imol), 1,3-propano-sultona (128 mg, 20 equivalentes) y 2,6- di-terc-butilpiridina (80 |il, 7 equivalentes) en el lfquido ionico [BMIM][PF6] (0,5 ml) a 150°C durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se retiro una pequena porcion (1-2 |il), se diluyo con metanol y se analizo mediante HPLC tal como se describe en la seccion (a). Se observo el producto de ester de

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acridinio 8b que elma a Rt = 15,2 minutos. Se sometio la mezcla de reaccion a tratamiento final tal como se describe en la seccion (b), ejemplo 5. Se sometio a reflujo el ester de acridinio 8b en 10 ml de HCl 1 N durante 2 horas bajo nitrogeno y se enfrio hasta temperatura ambiente. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion indico la formacion limpia del producto 8c que elma a Rt = 13,5 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C-is de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 8c. Rendimiento = 22 mg (56% global); EM MALDI-TOF 747,4 observado.

c) Compuesto 8d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 8c (22 mg, 29,5 |imol) en DMF (3,6 ml) y agua (0,4 ml) con diisopropiletilamina (26 |il, 5 equivalentes) y TSTU (44 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elma a Rt = 14,6 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C-ia de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 8d, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 17,6 mg (70%); EM MALDI-TOF 843,9.0 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de AZC3M-AE-NHS, compuesto 8d.

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Sintesis de AZC6-AE-NHS, compuesto 9d

a) Compuesto 9a

Se trato una disolucion de ester metflico de 2-hidroxi-7-metoxi-acridina (25 mg, 0,058 mmol), 6-dimetilamino-1- hexanol (17 mg, 2 equivalentes) y trifenilfosfina (30 mg, 2 equivalentes) en tetrahidrofurano anhidro (3 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (23 |il, 2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente bajo nitrogeno. Despues de 2 horas, se sometio a tratamiento final tal como se describe en la seccion (a), ejemplo 5. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 22,5 minutos y que era el componente mayoritario. Rendimiento 20 mg (63%); EM MALDl-TOF 559,8 observado.

b) Compuesto 9c

Se calento una mezcla del compuesto 9a (20 mg, 35,9 |imol), 1,3-propano-sultona (87 mg, 20 equivalentes) y 2,6-di- terc-butilpiridina (59 |il, 7 equivalentes) en el lfquido ionico [BMIM][PF6] (0,5 ml) a 150°C durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se retiro una pequena porcion (1-2 |il), se diluyo con metanol y se analizo mediante HPLC tal como se describe en la seccion (a). Se observo el producto de ester de acridinio 9b que elrna a Rt = 15,7 minutos (EM MALDl-TOF 803,9 observado). Se sometio la mezcla de reaccion a tratamiento final tal como se describe en la seccion (b), ejemplo 5. Se sometio a reflujo el ester de acridinio 9b en 10 ml de HCl 1 N durante 2 horas bajo nitrogeno y se enfrio hasta temperatura ambiente. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion indico la formacion limpia del producto 9c que elrna a Rt = 14,9 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 9c. Rendimiento = 18,3 mg (65% global); EM MALDl-TOF 790,4 observado.

c) Compuesto 9d (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 9c (18,3 mg, 23,2 |imol) en DMF (3,6 ml) y agua (0,4 ml) con diisopropiletilamina (20 |il, 5 equivalentes) y TSTU (35 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 16 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 9d, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 14 mg (68%); EM MALDl-TOF 887,6 observado.

Las siguientes reacciones describen la sintesis de AZC6M-AE-NHS, compuesto 9d.

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Sintesis de NSP-2Z-DMAE-NHS, compuesto 10f

a) Compuesto 10a

Se trato una disolucion de bromuro de 4-bromobencilo (2 g, 8 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (10 ml) con una disolucion 2,0 M de dimetilamina (20 ml) ml) en tetrahidrofurano. Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante 3 d^as. Entonces se diluyo la mezcla de reaccion con acetato de etilo (75 ml) y se lavo con 100 ml de disolucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio. Se separo la fase de acetato de etilo y se seco sobre sulfato de magnesio anhidro. El analisis mediante CCF sobre silice usando acetato de etilo al 15% en hexanos, no mostro material de partida y sf la formacion de un producto polar de Rf = 0,1. Se seco la disolucion en acetato de etilo a presion reducida para producir un aceite de color amarillo claro. Rendimiento = 1,63 g.

b) Compuesto 10b

Se enfrio una disolucion de isatina (1,12 g, 7,6 mmol) en DMF anhidra (20 ml) en un bano de hielo bajo nitrogeno y se trato con hidruro de sodio (0,366 g, 1,2 equivalentes, dispersion al 60% en aceite mineral). Se agito la reaccion en el bano de hielo durante 30 minutos y entonces se anadio el compuesto 10a (1,63 g, 7,6 mmol) como una disolucion en DMF (5 ml) junto con yoduro de cobre (2,9 g, 2 equivalentes). Se calento la reaccion a 140°C bajo nitrogeno durante 24 horas. Entonces se enfrio hasta temperatura ambiente, se diluyo con acetato de etilo (30 ml) y se filtro. La CCF sobre sflice del filtrado usando metanol al 10% en acetato de etilo como eluyente mostro un producto polar de Rf ~0,1. Se concentro el filtrado a presion reducida. Se suspendio el residuo en 100 ml de KOH acuoso al 10% y se sometio a reflujo bajo nitrogeno durante 4 horas. Entonces se enfrio la mezcla de reaccion hasta temperatura ambiente y se acidifico con HCl 2 N hasta pH 5. Aparecio un precipitado amarillo que se recogio mediante filtracion y se seco a vado. Rendimiento = 0,6 g. Se uso este compuesto tal cual para la siguiente reaccion.

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c) Compuesto 10c

Se trato una suspension del compuesto 10b (0,2 g, 0,714 mmol) en piridina anhidra (15 ml) con cloruro de p- toluenosulfonilo (272 mg, 2 equivalentes) bajo nitrogeno. Despues de agitar brevemente durante 5 minutos, se anadio 2,6-dimetil-4-hidroxibenzoato de metilo (128 mg, 0,714 mmol). Se agito la reaccion resultante a temperatura ambiente durante 3 dfas. Despues se elimino el disolvente a presion reducida y se repartio el residuo entre acetato de etilo (40 ml) y HCl 1 N (50 ml). Se separo la fase de HCl que contema producto y se lavo dos veces con acetato de etilo (2 x 40 ml). Luego se enfrio la disolucion en HCl en un bano de hielo y se trato gota a gota con KOH acuoso al 5% hasta que se separo un precipitado amarillo (pH ~8). Se extrajo esta suspension con acetato de etilo (2 x 50 ml). Se lavaron los extractos de acetato de etilo combinados una vez con agua y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Despues se elimino el disolvente a presion reducida y se purifico el producto en bruto mediante cromatograffa ultrarrapida sobre sflice usando acetato de etilo como eluyente. Rendimiento = 95 mg (30%); EM MALDI-TOF 443,7 observado.

d) Compuesto 10e

Se calento una mezcla del compuesto 10c (22 mg, 49,5 |imol), 1,3-propanosultona (120 mg, 20 equivalentes) y 2,6- di-terc-butilpiridina (81,5 |il, 7,5 equivalentes) en el lfquido ionico [BMIM][PF6] (0,5 ml) a 150°C durante 24 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se retiro una pequena porcion (1-2 |il), se diluyo con metanol y se analizo mediante HPLC usando una columna Phenomenex, C-is de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el producto 10d que elrna a Rt = 17,2 minutos (~40% de conversion). Se sometio la mezcla de reaccion a tratamiento final tal como se describe en la seccion (b), ejemplo 5. Se sometio a reflujo el ester de acridinio 10d en 10 ml de HCl 1 N durante 2 horas bajo nitrogeno y se enfrio hasta temperatura ambiente. El analisis mediante HPLC de la mezcla de reaccion indico la formacion limpia del producto 10e que elrna a Rt = 14,0 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto 10e. Rendimiento = 14,5 mg (44 % global); eM MALDI-TOF 673,3 observado.

e) Compuesto 10f (que no es segun la invencion)

Se trato una disolucion del compuesto 10e (14,5 mg, 21,5 |imol) en DMF (1,8 ml) y agua (0,2 ml) con diisopropiletilamina (18,8 |il, 5 equivalentes) y TSTU (32 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 16,5 minutos y que era el componente mayoritario. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 10f, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 14 mg (85 %); EM MALDI-TOF 769,5 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de NSP-2Z-DMAE-NHS, compuesto 10f.

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Ejemplo 11

Sintesis de NSP-DMAE-Z-NHS, compuesto 11f

a) Compuesto 11a

Se trato una disolucion de N,N-bis(3-aminopropil)metilamina (1 g, 6,9 mmol) en cloroformo (40 ml) con benciloxicarbonilsuccinimida (3,78 g, 2,2 equivalentes). Se agito la reaction a temperatura ambiente durante 16 horas. El analisis mediante CCF sobre sflice de la mezcla de reaccion usando metanol al 15% en acetato de etilo mostro la formation de un producto polar en una reaccion limpia. Se diluyo la mezcla de reaccion con cloroformo (40 ml) y se lavo con disolucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio. Se seco entonces sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida para producir un aceite viscoso que solidifico tras su almacenamiento para dar un solido ceroso. Rendimiento = 3,2 g; EM MALDI-TOF 414,4 observado.

b) Compuesto 11b

Se trato una disolucion del compuesto 11a (1,2 g, 2,9 mmol) en DMF anhidra (15 ml) con 1,3-propanosultona (0,71 g, 2 equivalentes). Se calento la reaccion a 145°C bajo nitrogeno durante 1 hora. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena portion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, Ci8 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 1o ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y detection UV a 260 nm. Se observo un producto que elma a Rt = 19,6 minutos (~80% de conversion), eluyendo el material de partida a Rt = 21,6 minutos. Se concentro la mezcla de reaccion a presion reducida y se disolvio el aceite recuperado en metanol (20 ml). El analisis mediante CCF sobre sflice usando el 40% de metanol, el 60% de acetato de etilo indico la separation limpia del producto (Rf ~0,2) del material de partida (Rf ~0,3). Se repitio la reaccion anterior en la misma escala y se purifico la mezcla de reaccion combinada mediante cromatografia ultrarrapida sobre sflice usando el 40% de metanol, el 60% de acetato de etilo como eluyente. Rendimiento = 1,55 g (60%); espuma blanca; EM MALDI-TOF 536,4 observado.

c) Compuesto 11c

Se agito el compuesto 11b (0,8 g, 1,49 mmol) en 15 ml de HBr al 33%/AcOH a temperatura ambiente durante 24 horas. Entonces se anadio eter (100 ml) y se separo un solido granular blanco. Se permitio que sedimentase el

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producto y se decanto el eter. Se repitio este procedimiento dos veces con eter (2 x 50 ml). Finalmente, se seco el producto a vado. Se disolvio el aceite viscoso recuperado en 5-6 ml de agua, se congelo a -80°C y se liofilizo hasta sequedad para producir un solido vftreo. Rendimiento = 0,766 g (cuantitativo); EM MALDI-TOF 268,2 observado. El analisis mediante CCF sobre sflice usando el 25% de amoniaco, el 75% de metanol y ninhidrina para visualizacion mostro una unica mancha de Rf ~0,2.

d) Compuesto 11d

Se trato una disolucion de NSP-DMAE (30 mg, 61 |imol, patente estadounidense n.° 6.664.043 B2) en DMF (3 ml) con diisopropiletilamina (16 |il, 1,5 equivalentes) y TSTU (22 mg, 1,2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C-is de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 20 minutos y que era el componente mayoritario. Se anadio gota a gota la mitad de esta disolucion en DMF (1,5 ml) del ester de NHS a una disolucion del compuesto 11c (50 mg, 0,187 mmol, forma de amina libre) disuelto en DMF (1 ml) y bicarbonato de sodio 0,15 M (1 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 3 horas, el analisis mediante HPLC mostro la conversion limpia en el producto 11d, que eluyo a 12,4 minutos. Usando un gradiente del 10 ^ 40% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%), el producto eluyo a Rt = 19,2 minutos.

Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 40% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 11d y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 19 mg (83 %); EM MALDl-TOF 743,2 observado.

e) Compuesto 11f

Se trato una disolucion del compuesto 11d (45 mg, 60,6 |imol) en metanol (3,6 ml) y agua (0,4 ml) con diisopropiletilamina (53 |il, 5 equivalentes) y anlmdrido glutarico (35 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de

1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el producto 11e que elrna a Rt = 14 minutos y que era el componente mayoritario. Despues se elimino el disolvente a presion reducida. Se disolvio el residuo en DMF (3,6 ml) y agua (0,4 ml). Se trato esta disolucion con diisopropiletilamina (106 |il, 10 equivalentes) y TSTU (182 mg, 10 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 10 minutos, el analisis mediante HPLC mostro la conversion completa en el producto 11f que elrna a Rt = 15,3 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 40% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 11f, se congelaron a -80°C y liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 28,7 mg (50 %); EM MALDI-TOF 955,2 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de NSP-DMAE-Z-NHS, compuesto 11f.

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imagen26

1. TSTU, DIPEA

COOH

TSTU, DIPEA

CHC1

PEN

NH

DMF

(X°y°-n^

HBr al 33%/AcOH

H,N N NH, 2HBr

lib

so3_ y-o

O DIPEA

DMF

MeOH/agua

2.11c, DMF/NaHCO

lid

DMF/agUa

OH

Ejemplo 12

Sintesis de NSP-2,7-DMG-DMAE-Z-NHS, compuesto 12h

a) 1,3-Dimetoxiglicerol, compuesto 12a

Se trato metanol anhidro (100 ml) con granulos de hidroxido de potasio (25 g, 0,446 mol) y se la suspension agito a temperatura ambiente hasta que se hubo disuelto toda la base. Entonces se enfrio esta disolucion en un bano de hielo y se anadio gota a gota epiclorhidrina (0,223 mol, 20,6 g). Despues de completarse la adicion, se calento la reaccion hasta temperatura ambiente y se calento en un bano de aceite a 75-80°C bajo nitrogeno durante 16 horas. Entonces se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente y se filtro. Se concentro el filtrado a presion reducida. Se disolvio el aceite recuperado en acetato de etilo (150 ml) y se filtro de nuevo y se concentro entonces a presion reducida. Se recupero un aceite incoloro (21,5 g) que se purifico mediante destilacion al vado para producir 12,9 g (50%) de 1,3-dimetoxiglicerol, compuesto 12a.

b) Compuesto 12b

Se trato una disolucion de 1,3-dimetoxiglicerol, compuesto 12a (1 g, 8,3 mmol) en piridina anhidra (20 ml) con cloruro de p-toluenosulfonilo (2,38 g, 1,5 equivalentes) y 4-dimetilaminopiridina (0,253 g, 0,25 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente bajo nitrogeno durante 3 dias. Despues se elimino el disolvente a presion reducida y se repartio el residuo entre acetato de etilo (100 ml) y HCl 1 N (50 ml). Se separo la fase de acetato de etilo y se lavo una vez con HCl 1 N (50 ml), seguido por bicarbonato de sodio acuoso (3 x 50 ml). Se seco entonces sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. Se purifico el producto en bruto (2,5 g) mediante cromatograffa ultrarrapida sobre sflice usando acetato de etilo al 20% en hexanos como eluyente. Rendimiento = 1,79 g (65%).

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c) Compuesto 12c

Se calento una disolucion de ester metflico de 2,7-dihidroxiacridina (0,1 g, 0,24 mmol), compuesto 12b (0,4 g, 1,45 mmol) y carbonato de cesio (0,2 g, 2,5 equivalentes) en DMF anhidra (6 ml) en un bano de aceite a 90-100°C bajo nitrogeno. Despues de 5 horas, se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 26,5 minutos y que era el componente mayoritario. Despues se elimino el disolvente a presion reducida y se repartio el residuo entre acetato de etilo (50 ml) y agua (50 ml). Se separo la fase de acetato de etilo y se lavo dos veces con agua (2 x 50 ml). Se seco entonces sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. Se purifico el producto en bruto (0,37 g) mediante CCF preparativa sobre sflice usando acetato de etilo/hexanos 1:1. Rendimiento purificado = 58 mg (40%); EM MALDI-TOF 623,1 observado.

d) Compuesto 12e

Se calento una mezcla del compuesto 12c (58 mg, 93,25 mmol), 1,3-propanosultona destilada (1,14 g, 100 equivalentes) y bicarbonato de sodio (78 mg, 10 equivalentes) a 140-150°C. Despues de 2 h, se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el producto 12d que elrna a Rt = 20 minutos y que era el componente mayoritario. Se trato la mezcla de reaccion con 20 ml de acetato de etilo/hexanos 1:1 y se sonico la mezcla brevemente para dispersar la goma. Se permitio que sedimentase el producto, y se elimino el disolvente mediante decantacion. Se seco el producto en bruto a vacfo y se suspendio entonces en 10 ml de HCl 1 N y se sometio a reflujo bajo nitrogeno durante 3 horas. Entonces se enfrio hasta temperatura ambiente y se analizo mediante HPLC que indico hidrolisis completa del ester metflico con el producto 12e, que eluyo a Rt = 17,0 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 100% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 12e y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 56 mg (82 %); EM MALDI-TOF 730,9 observado.

e) Compuesto 12f

Se trato una disolucion del compuesto 12e (55 mg, 75,3 |imol) en DMF (3 ml) con diisopropiletilamina (20 |il, 1,5 equivalentes) y TSTU (27 mg, 1,2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 10 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el ester de NHS que elrna a Rt = 18 minutos y que era el componente mayoritario. Entonces se anadio gota a gota la disolucion en DMF del ester de NHS a una disolucion del compuesto 11c (168 mg, 0,376 mmol, sal de 2HBr) disuelto en agua (1,68 ml) y bicarbonato de sodio 0,5 M (1,68 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, el analisis mediante HPLC mostro la conversion limpia en el producto 12e, que eluyo a 12,4 minutos.

Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 100% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 12f y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 63,8 mg (86%); MALDI-TOF 979,1MS observado.

f) Compuesto 12h

Se trato una disolucion del compuesto 12f (63,8 mg, 65,2 |imol) en metanol (4,0 ml) con diisopropiletilamina (57 |il, 5 equivalentes) y anhfdrido glutarico (74 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 100% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el producto 12g que elrna a Rt = 13,5 minutos y que era el componente mayoritario. Despues se elimino el disolvente a presion reducida. Se disolvio el residuo en DMF (5,4 ml) y agua (0,6 ml). Se trato esta disolucion con diisopropiletilamina (114 |il, 10 equivalentes) y TSTU (200 mg, 10 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, el analisis mediante HPLC mostro la conversion completa en el producto 12h que elrna a Rt = 14,3 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 70% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las

fracciones de HPLC que conteman el producto 12h, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 49,3 mg (63 %); EM MALDI-TOF 1188,9 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de NSP-2,7-DMG-DMAE-Z-NHS, compuesto 12h.

5

imagen27

Ejemplo 13

10 Smtesis de NSP-DMAE-Z2-NHS, compuesto 13e

a) Compuesto 13a

Se enfrio una disolucion de cloruro de 2-cloroetanosulfonilo (0,126 ml, 1,2 mmol) en eter anhidro (5 ml) hasta -5°C en 15 un bano de hielo-sal bajo una atmosfera de nitrogeno y se trato con 2,6-lutidina (0,14 ml, 1,2 mmol) en una porcion. Se agito la reaccion a -5°C durante 30 minutos, se calento entonces hasta temperatura ambiente. Entonces se filtro la reaccion a traves de lana de vidrio en una disolucion con agitacion de 11a (0,325 g, 0,79 mmol) disuelto en acido acetico (5 ml). Despues de 4-5 horas, se elimino el disolvente a presion reducida. Se suspendio el residuo en

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tolueno (5 ml) y se concentro a presion reducida. Se repartio el producto en bruto entre agua (50 ml) y acetato de etilo (50 ml). Se separo la fase acuosa y se lavo una vez con cloroformo (50 ml). Se ajusto el pH de la fase acuosa a

9 con hidroxido de amonio y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 ml). Entonces se concentro la fase acuosa a presion reducida para producir un solido blanco. Rendimiento = 0,18 g, (43%); EM MALDI-TOF 522,8 observado).

Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion del producto usando una columna Phenomenex PRODIGY, C18 de 10 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 4,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto limpio que elrna a Rt = 21 min sin material de partida.

b) Compuesto 13b

Se agito el compuesto 13a (78 mg, 0,15 mmol) en 5 ml de HBr al 33%/AcOH a temperatura ambiente durante 24 horas. Entonces se anadio eter (75 ml) y se separo un solido granular blanco. Se permitio que sedimentase el producto y se decanto el eter. Se repitio este procedimiento dos veces con eter (2 x 50 ml). Finalmente, se seco el producto a vado. Rendimiento = 48 mg (77%). Se uso este material tal cual para la siguiente reaccion.

c) Compuesto 13c

Se trato una disolucion de NSP-DMAE (14 mg, 28,4 |imol, patente estadounidense n.° 6.664.043 B2) en DMF (1 ml) con diisopropiletilamina (7,4 |il, 1,5 equivalentes) y TSTU (10,3 mg, 1,2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C-is de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de

1.0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 20 minutos y que era el componente mayoritario. Se anadio gota a gota esta disolucion en DMF del ester de NHS a una disolucion del compuesto 13b (48 mg, 0,116 mmol, sal de HBr) disuelto en bicarbonato de sodio 0,25 M (3 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, el analisis mediante HPLC mostro la conversion limpia en el producto 13c, que eluyo a 12,4 minutos.

Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C-is de 30 x 300 mm y gradiente del

10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 13c y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 19 mg (90 %).

d) Compuesto 13e

Se trato una disolucion del compuesto 13c (19 mg, 26,1 |imol) en metanol (3,6 ml) y agua (0,4 ml) con diisopropiletilamina (22,8 |il, 5 equivalentes) y anlmdrido glutarico (15 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C-is de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de

1.0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el producto 13d que elrna a Rt = 14,6 minutos y que era el componente mayoritario (>80%). Despues se elimino el disolvente a presion reducida. Se disolvio el residuo en DMF (3,6 ml) y agua (0,4 ml). Se trato esta disolucion con diisopropiletilamina (45,6 |il, 10 equivalentes) y TSTU (79 mg, 10 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, el analisis mediante HPLC mostro la conversion completa en el producto 13e que elrna a Rt = 15,7 minutos. Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C-is de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 13e, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 15 mg (60 %).

Las siguientes reacciones describen la smtesis de NSP-DMAE-Z2-NHS, compuesto 13e.

imagen28

5 Sintesis de NSP-DMAE-ZCB-NHS, compuesto 14d

a) Compuesto 14a

Se trato una disolucion de 11a (0,6 g, 1,45 mmol) disuelto en MeCN (5 ml) con acido acnlico (1 ml, 1,45 mmol). Se 10 agito la reaccion a temperatura ambiente durante 36 horas. Despues se elimino el disolvente a presion reducida y se purifico el producto en bruto mediante cromatograffa ultrarrapida sobre silice usando MeOH:EtOAc 3:2 como eluyente. Se combinaron las fracciones que conteman producto y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 0,432 g, (61%); MALDITOF MS 486,1 observado).

15 b) Compuesto 14b

Se agito el compuesto 14a (0,43 g, 0,88 mmol) en 10 ml de HBr al 33%/AcOH a temperatura ambiente durante 24 horas. Entonces se anadio eter (100 ml) y se separo un solido granular blanco. Se permitio que sedimentase el producto y se decanto el eter. Se repitio este procedimiento cuatro veces con eter (4 x 50 ml). Finalmente, se seco el 20 producto a vado. Se disolvio entonces en agua (5 ml), se congelo y se liofilizo. Rendimiento = 0,35 g (cuantitativo); EM MALDI-TOF 218,3 observado.

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c) Compuesto 14c

Se trato una disolucion de NSP-DMAE (25 mg, 51,0 |imol, patente estadounidense n.° 6.664.043 B2) en DMF (2 ml) con diisopropiletilamina (11,3 |il, 1,5 equivalentes) y TSTU (18,3 mg, 1,2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se anadio gota a gota esta disolucion en DMF del ester de NHS a una disolucion del compuesto 14b (80 mg, 0,2 mmol, sal de HBr) disuelto en bicarbonato de sodio 0,25 M (0,8 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC usando una columna Phenomenex, C-is de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm, mostro la conversion limpia en el producto 14c, que eluyo a 12,0 minutos.

Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 14c y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 38 mg (cuantitativo); EM MALDl-TOF 692,9 observado.

e) Compuesto 14d

Se trato una disolucion del compuesto 14c (20 mg, 29 |imol) en DMF (1,0 ml) y DMSO (2,0 ml) con diisopropiletilamina (8,6 |il, 2 equivalentes) se anadio gota a gota a una disolucion con agitacion de glutarato de disuccinimidilo (38 mg, 0,117 mmol) en DMF (1 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 60 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el producto 14d que elrna a Rt = 15,0 minutos y que era el componente mayoritario (>70%). Se purifico el producto mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman el producto 14d, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 4 mg (15 %); EM MALDl-TOF 905,5 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de NSP-DMAE-ZCB-NHS, compuesto 14d.

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imagen29

COOH

COO

coo

l.TSTU, DIPEA

COO

COOH

MeCN

11a

HBral 33%/AcOH

NHo 2HBr

14b

DSG

DME

DMF/DMSO

2. 14b, DMF/NaHCO

oo

14d

Ejemplo 15

Slntesis de CN-NSP-DMAE-Z3-NHS, compuesto 15f

a) Compuesto 15a

Se calento una suspension de ester metllico de NSP-DMAE (0,223 g, 0,44 mmol) en cloruro de tionilo (5 ml) a 80°C bajo una atmosfera de nitrogeno con agitacion vigorosa. Despues de una hora, se formo una disolucion oscura que se enfrio hasta temperatura ambiente. Se anadio hexano (50 ml) y se separo un solido pegajoso de color marron oscuro. Se decanto el hexano y se enjuago el residuo una vez con hexano (25 ml) y se seco muy brevemente a vaclo. A este solido pegajoso se le anadio una disolucion de N,N-dimetiletilendiamina (10 ml, en exceso) en MeCN anhidro (10 ml). Se formo una disolucion de color marron oscuro que se agito a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 70% de B durante 30 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo el producto 15a que elula como un pico ancho a Rt = 19 minutos. Se concentro la mezcla de reaccion a presion reducida y se disolvio el residuo en metanol (5 ml), se diluyo con tolueno (15 ml) se concentro a presion reducida para producir una espuma pegajosa de color marron. Rendimiento en bruto = 0,46 g. Se purifico el producto mediante cromatografla ultrarrapida sobre sllice usando metanol como eluyente. Rendimiento = 0,22 g, (87%); EM MALDI-TOF 577,9 observado.

b) Compuesto 15b

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se calento una mezcla del compuesto 15a, (0,22 g, 0,38 mmol), 1,3-propanosultona destilada (0,465 g, 10 equivalentes y 2,6-di-tercbutilpiridina (0,42 ml, 5 equivalentes) en [BMIM][PF6] (3 ml) a 155°C durante 16 horas con agitacion vigorosa. Entonces se enfrio hasta temperatura ambiente y se anadio acetato de etilo (100 ml). Precipito el producto y se recogio mediante filtracion y se enjuago con acetato de etilo (25 ml) y metanol (20 ml). Entonces se transfirio el producto en bruto a un matraz de fondo redondo con 50 ml de agua/metanol 1:1. Se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion en bruto usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 40% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo un producto que elrna a Rt = 33 minutos (~90% de conversion). La evaporacion de la disolucion acuosa a presion reducida dio 0,35 g de un solido marron. EM MALDI-TOF 699,2 observado. Se uso este material tal cual para la siguiente reaccion.

c) Compuesto 15c

Se suspendio el compuesto 15 b (0,35 g, en bruto) en HCl 1 N (20 ml) y se calento a reflujo bajo una atmosfera de nitrogeno durante 1,5 horas. El analisis mediante HPLC tal como se indica en la seccion (b) mostro un producto que elrna a Rt = 27 minutos. Se enfrio la reaccion hasta temperatura ambiente. Se purifico el producto 15c mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 14 mg; EM MALDI-TOF 685,7 observado.

d) Compuesto 15d

Se trato una disolucion del compuesto 15c (14 mg, 20 |imol) en DMF (2 ml) con diisopropiletilamina (6 |il, 2 equivalentes) y TSTU (12,3 mg, 2 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 10 minutos, se realizo el analisis mediante HPLC de una pequena porcion de la mezcla de reaccion en bruto usando una columna Phenomenex, C18 de 4,6 mm x 25 cm y un gradiente del 10 ^ 40% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se observo la conversion completa en el ester de NHS que elrna a 22 minutos. Se anadio gota a gota esta disolucion en DMF a una disolucion con agitacion del compuesto 11c (46 mg, 5 equivalentes, sal de HBr) en bicarbonato de sodio 0,25 M (1 ml). Se agito la disolucion resultante a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, el analisis mediante HPLC indico un producto mayoritario que elrna a Rt = 14 minutos.

Se purifico el producto 15d mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto y se concentraron a presion reducida. Rendimiento = 18 mg (cuantitativo); EM MALDI-TOF 935,8 observado.

e) Compuesto 15f

Se trato una disolucion del compuesto 15d (18 mg, 19,2 |imol) en metanol (1,8 ml) y agua (0,2 ml) con diisopropiletilamina (26 |il, 5 equivalentes) y anlmdrido glutarico (17 mg, 5 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, el analisis mediante HPLC tal como se describe en la seccion (d) mostro la conversion completa en el derivado de glutarato 15e que elrna a Rt = 16,2 minutos. Se diluyo la reaccion con tolueno (5 ml) y se concentro a presion reducida. Se disolvio el residuo en DMF (1,8 ml) y agua (0,2 ml) y se trato con diisopropiletilamina (52 |il, 10 equivalentes) y TSTU (90 mg, 10 equivalentes). Se agito la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, el analisis mediante HPLC mostro la conversion completa en el producto que elrna a Rt = 19 minutos. Se purifico el producto 15f mediante HPLC preparativa usando una columna YMC, C18 de 30 x 300 mm y gradiente del 10 ^ 60% de B durante 40 minutos (A = agua con TFA al 0,05%, B = MeCN con TFA al 0,05%) a una velocidad de flujo de disolvente de 20 ml/minuto y deteccion UV a 260 nm. Se combinaron las fracciones de HPLC que conteman producto, se congelaron a -80°C y se liofilizaron hasta sequedad. Rendimiento = 6,5 mg (30%); EM MALDI-TOF 1146,6 observado.

Las siguientes reacciones describen la smtesis de CN-NSP-DMAE-Z3-NHS, compuesto 15f.

imagen30

5 Procedimiento general para el marcaje de AcM anti-TSH con ester de acridinio

Se diluyo una disolucion madre del anticuerpo (5 mg/ml, 200 |il, 1,0 mg, 6,7 nmoles) con carbonato de sodio 0,1 M pH 9 (250 ml) para dar una disolucion ~2,0 mg/ml. A esta disolucion se le anadieron 10 equivalentes del ester de NHS de acridinio como una disolucion o bien en disolucion de DMF/agua 1:1 o bien en DMSO. Por ejemplo, usando 10 NSP-DMAE-Z-NHS, 11f esto conllevo la adicion de 64 microgramos anadidos a partir de una disolucion 5 mg/ml (12,8 |il) del ester de acridinio. Se agitaron suavemente las reacciones de marcaje a 4°C durante 16 horas y luego se diluyeron con agua desionizada hasta 4 ml. Entonces se transfirieron estas disoluciones diluidas a filtros Centricon™

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de 4 ml (punto de corte de PM de 30.000) y se centrifugaron a 4000 G para reducir el volumen hasta ~0,2 ml. Se repitio este procedimiento tres veces mas. Finalmente se diluyeron los conjugados filtrados en un volumen total de 250 |il de agua para el analisis del espectro de masas y mediciones de URL.

Se registraron los espectros de masas en un espectrometro de masas MALDI-TOF Voyager DE y se uso el anticuerpo sin marcar como referencia. Se mezclaron aproximadamente 2 |il de la disolucion de conjugado con 2 |il de disolucion de matriz de acido sinapmico (HP) y luego se aplicaron a una placa para MALDI. Despues del secado completo, se registraron los espectros de masas. A partir de la diferencia en los valores de masa para el anticuerpo sin marcary los conjugados, pudo medirse la extension de incorporacion de AE. Normalmente, en estas condiciones de marcaje, se incorporaron ~5 marcadores de AE en el anticuerpo.

Ejemplo 17

Mediciones de quimioluminiscencia

Se diluyo cada anticuerpo marcado con ester de acridinio hasta una concentracion de 0,2 nanomolar en un tampon que consistfa en fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M, azida de sodio 6 mM y albumina serica bovina (BSA) 1 g/l. se integro la cinetica de quimioluminiscencia para 10 microlitros de cada conjugado de ester de acridinio-anticuerpo sometido a prueba a intervalos de 0,1 segundos durante 10 segundos en condiciones convencionales en un luminometro Autolumat LB953 de Berthold Technolgies con la adicion secuencial de 300 microlitros de cada uno de reactivo 1 (acido mtrico 0,1 M y peroxido de hidrogeno al 0,5%) y reactivo 2 (hidroxido de sodio 0,25 M y cloruro de cetiltrimetilamonio al 0,05%). Se comparo la cinetica de quimioluminiscencia de los compuestos de acridinio sometidos a prueba para determinar la tasa relativa de emision de luz asf como la produccion de luz total.

Ejemplo 18

Medicion de union no espedfica

Se sometieron a prueba compuestos de acridinio zwitterionicos como marcadores en un inmunoensayo para la comparacion con compuestos de acridinio de control usados por separado como marcadores en el mismo inmunoensayo. El ensayo TSH3 de ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics es uno de una serie de inmunoensayos vendidos comercialmente por Siemens Healthcare Diagnostics para la aplicacion en ACS:180®. El ensayo TSH3 es un inmunoensayo de tipo sandwich que usa un compuesto de acridinio quimioluminiscente de un anticuerpo anti-TSH para la medicion del analito TSH (hormona estimulante del tiroides) en una muestra.

El ensayo TSH3 tiene dos anticuerpos, uno de los cuales es un anticuerpo de raton unido al compuesto de acridinio, denominandose la combinacion el trazador, mientras que el otro anticuerpo se une a partfculas paramagneticas (PMP), en el que esta combinacion se denomina fase solida. En este ensayo de ejemplo, tanto los compuestos de acridinio zwitterionicos como tambien los compuestos de control de acridinio se unieron cada uno al mismo anticuerpo en partes separadas. En este ensayo de ejemplo, solo se midio la union no espedfica cuando se sometieron a prueba conjugados de ester de acridinio o trazadores en ausencia del analito TSH en la muestra. Se diluyeron los trazadores hasta una concentracion de 2,2 nM en un tampon que contema acido N-2- hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfonico (HEPES) 0,15 M, cloruro de sodio 0,15 M, azida de sodio 7,7 mM, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) 1,0 mM, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) 12 mM, albumina serica bovina (BSA) 5 g/l, anfotericina B 0,20 g/l, sulfato de gentamicina 0,48 g/l, IgG de raton 1 g/l, IgG de oveja 10 mg/l, suero de raton 5,0 g/l, antiespumante B 0,05 g/l, pH 7,7. En este ensayo de ejemplo, se sometieron a prueba tres fases solidas con los compuestos de acridinio: fase solida del ensayo TSH3 de Siemens Healthcare Diagnostics, fase solida del ensayo de iPTH (hormona paratiroidea intacta) de Siemens Healthcare Diagnostics (anticuerpo policlonal anti-PTH de cabra biotinilado unido a estreptavidina-Dynal M280) y ultraensayo de Tnl (troponina I) de Siemens Healthcare Diagnostics) (anticuerpo monoclonal anti-Tnl de raton biotinilado unido a estreptavidina-Dynal M270).

ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics es un dispositivo robotico automatizado disenado para realizar una serie de inmunoensayos para diferentes analitos. Se inicio el procedimiento automatizado para el ensayo TSH3 de ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics con la dispensacion de 200 |il cada de muestra de suero que no contema analito TSH en cubetas separadas. Una cubeta es un recipiente opticamente transparente o translucido para mezclar el trazador, la muestra y la fase solida y en la que se mide la quimioluminiscencia. Las muestras no conteman el analito TSH. Se dispensaron entonces al ACS:180® 0,100 ml de trazador 2,2 nM (0,22 pmol) y 0,225 ml de fase solida 0,3 g/l (67 mg) en cada cubeta que contema las muestras, de tal manera que se usaron la misma cantidad de trazador y fase solida para todos los compuestos de acridinio sometidos a prueba. El primero de los dos reactivos de ensayo era una disolucion, que contema el anticuerpo anti-TSH conjugado con el compuesto de acridinio. Tanto los compuestos de acridinio zwitterionicos como los compuestos de acridinio de control se sometieron a prueba por separado como marcadores para los trazadores. Se prepararon los trazadores y se purificaron usando el procedimiento descrito previamente usando compuestos de acridinio y anticuerpo de raton de union a TSH. El numero de compuestos de acridinio por anticuerpo en cada trazador era aproximadamente igual para todos los compuestos de acridinio sometidos a prueba. Por tanto, cualquier diferencia en la union no espedfica

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medida para cada compuesto de acridinio pudo relacionarse con la estructura del compuesto de acridinio. Se calento la mezcla de trazador, muestra y fase solida en cada cubeta durante 5,0 minutes at 37°C. Se retiro el trazador no unido de la fase solida con separacion magnetica de la fase solida de la mezcla en la cubeta, seguido por la retirada de fluido de la cubeta y lavado de la fase solida en la cubeta con agua para retirar todo excepto la fase solida y cualquier cantidad de trazador unido a la misma.

Se inicio la quimioluminiscencia de compuestos de acridinio en la fase solida con la posterior emision de luz con adiciones secuenciales de 0,30 ml cada vez de reactivo 1 para ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics y reactivo 2 para ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics. El reactivo 1 para ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics era acido mtrico 0,1 My peroxido de hidrogeno al 0,5%. El reactivo 2 para ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics era hidroxido de sodio 0,25 M y cloruro de cloruro de cetiltrimetilamonio al 0,05%. Entonces se midio la quimioluminiscencia en cada cubeta como unidades relativas de luz (URL), correspondiendo cada cubeta a una unica muestra sometida a ensayo. Se midio la union no espedfica para compuesto de acridinio sometido a prueba como quimioluminiscencia en unidades de URL, midiendose el numero de URL mediante el ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics. La union no espedfica fraccionaria se define como la razon de la quimioluminiscencia de union no espedfica con respecto a la entrada de quimioluminiscencia total en cada cubeta a partir de trazador 0,22 pmol. La minimizacion de la union no espedfica fraccionaria maximiza la medicion de senal espedfica, mejorando por tanto la medicion de menores cantidades de analito y potenciando el rendimiento del inmunoensayo. En este ensayo de ejemplo, los compuestos de acridinio zwitterionicos tienen menor union no espedfica fraccionaria y se esperana por tanto que potenciasen el rendimiento del inmunoensayo.

Ejemplo 19

Medicion de la estabilidad de quimioluminiscencia del coniugado de acridinio

Se diluyeron los conjugados de compuestos de acridinio zwitterionicos y compuestos de acridinio de control NSP- DMAE-HEG y HQY-AE hasta una concentracion de 0,1 nM en un tampon que contema acido N-2- hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfonico (HEPES) 0,15 M, cloruro de sodio 0,15 M, azida de sodio 7,7 mM, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) 1,0 mM, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) 12 mM, albumina serica bovina (BSA) 5 g/l, anfotericina B 0,20 g/l, sulfato de gentamicina 0,48 g/l, IgG de raton 1 g/l, IgG de oveja 10 mg/l, suero de raton 5,0 g/l, antiespumante B 0,05 g/l, pH 7,7. Entonces se almacenaron todos los conjugados o bien a 4 o bien a 37°C durante cuatro semanas en frascos de polietileno sellados. Se retiraron periodicamente 10 |il de cada trazador almacenado o bien a 4 o bien a 37°C para la medicion de quimioluminiscencia en el quimioluminometro Bertholdt ALB953 que usaba el mismo metodo para la medicion de quimioluminiscencia que ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics usando los reactivos 1 y 2 para ACS:180® de Siemens Healthcare Diagnostics. Entonces se comparo la quimioluminiscencia como porcentaje con la determinada para cada trazador al comienzo del almacenamiento bien a 4 o bien a 37°C. Una estabilidad de quimioluminiscencia potenciada o equivalente con relacion a los compuestos de acridinio de control sena una propiedad deseable para nuevos compuestos de acridinio proporcionar que proporcionan una semivida mas larga o equivalente del producto y una reproducibilidad de los resultados dfa a dfa mejor o equivalente.

Claims (7)

1. 5

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   35

   REIVINDICACIONES

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente que tiene la siguiente estructura:

   imagen1

   en la que, n', m', y q' son independientemente un numero entero de 1-4,

   Ri es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo C1-35, cada uno de los cuales puede contener hasta 20 heteroatomos, o un grupo sulfopropilo o sulfobutilo, o R1 es un grupo -Ra-Z; en el que Ra es un radical divalente seleccionado del alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroatomos;

   R2 y R3 se seleccionan independientemente de (i) hidrogeno, (ii) un grupo electrodonador, o (iii) un grupo -Z;

   Z es un grupo zwitterionico de la forma:

   R’

   imagen2

   R"

   X se selecciona independientemente en cada aparicion de un enlace, -CH2-, oxfgeno, azufre, -NRN-, amida (-NRN(CO)-), carbamato (-NRNC(O)O-) o urea (-NRNC(O)NRN-);

   R' y R” se seleccionan independientemente en cada aparicion de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroatomos;

   Z1 es un grupo -Ra-Z2 en el que Z2 se selecciona de carboxilato (-COO'), sulfonato (-SO3'), sulfato (-OSO3'), fosfato (-OP(O)(OR)(O-)), u oxido (-O-); o, en el caso en el que Z2 es un oxido (-O-), Ra puede estar ausente;

   n es, seleccionado independientemente en cada aparicion, un numero entero de entre uno y 12; y

   R4 y R8 son iguales o diferentes y se seleccionan de hidrogeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR) o amino sustituido (-NR2) C1-35;

   R* se selecciona de hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35, conteniendo cada uno opcionalmente hasta 20 heteroatomos, o R* es un grupo -Ra-L, en el que L se selecciona del grupo que consiste en:

   5

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   20

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   imagen3

   R se selecciona independientemente en cada aparicion de grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35 que contienen cada uno hasta 20 heteroatomos; y

   RN se selecciona independientemente en cada aparicion de hidrogeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo C1-35 que contienen cada uno hasta 20 heteroatomos.

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 1, en el que uno de Ri, R2, y R3 comprende un grupo -L o -Ra-L.

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 1, en el que R' o R” comprende un grupo -Ra-L.

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 1, en el que R' o R” son, en una aparicion, un grupo -Ra-c(o)-CH2CH2CH2-C(O)-N-succinimidilo, -Ra-N-maleimido, -Ra-C(O)-CH2-Br o -Ra- C(O)-CH2-I.

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 1, en el que dichos grupos electrodonadores se seleccionan del grupo que consiste en (i) alcoxilo (-OR), (ii) un grupo -O-(CH2CH2-O)i- CH3 en el que l es un numero entero desde 1 hasta 12, y (iii) un grupo -O-G, y (vi) un grupo-Z; en los que G es un grupo ramificado seleccionado independientemente en cada aparicion de:

   (i)

   imagen4

   o;

   imagen5

   y en los que Rg, R10, R11 R12, R13 y R14 son independientemente en cada aparicion un grupo metilo o un grupo -(CH2CH2O)mCH3, en el que m es un numero entero desde 1 hasta 5.

   5
2. 6. Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 1, que tiene la siguiente estructura:

   10

   15
3. 7.

   20

   imagen6

   R16 se selecciona de (i) hidrogeno, (ii) -C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-N-succinimidilo, (iii) -R-N-maleimido en el que R es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo, cada uno de los cuales puede comprender opcionalmente hasta 20 heteroatomos, o (iv) -C(O)-CH2-X en el que X es bromo (Br) o yodo (I).

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 6, en el que:

   Ri se selecciona de grupos metilo, sulfopropilo (-CH2CH2CH2-SO3) o sulfobutilo (-CH2CH2 CH2CH2-SO3'); y

   R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno o un grupo -O-G, en el que G se define como en la reivindicacion 5.
4. 8.

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 1, que tiene la siguiente estructura:

   imagen7

   5 9. Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 8, en el que R2 y R3 se seleccionan

   independientemente de hidrogeno o un grupo -O-G, en el que G es tal como se define en la reivindicacion 5.
5. 10.

   10
6. 11.

   15
7. 12.

   20

   Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 8, en el que R2 y R3 son hidrogeno. Compuesto de acridinio quimioluminiscente segun la reivindicacion 1, que tiene la siguiente estructura:

   imagen8

   en el que el compuesto incluye opcionalmente un contraion A para equilibrar el nitrogeno cargado positivamente del nucleo de acridinio.

   Ensayo para la deteccion o cuantificacion de un analito macromolecular, que comprende:

   (a) proporcionar un conjugado que comprende un compuesto de acridinio quimioluminiscente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 unido a una molecula de union espedfica para un analito;

   (b) proporcionar un soporte solido que tiene inmovilizada sobre el mismo una segunda molecula de union espedfica para dicho analito;

   (c) mezclar el conjugado, la fase solida y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union;

   (d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido;

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   (e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de la etapa (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia;

   (f) medir la cantidad de emision de luz con un luminometro; y

   (g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

   Ensayo para la deteccion o cuantificacion de un analito de molecula pequena se proporciona que comprende las etapas de:

   (a) proporcionar un conjugado de un analito con un compuesto de acridinio quimioluminiscente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

   (b) proporcionar un soporte solido inmovilizado con una molecula de union espedfica para el analito;

   (c) mezclar el conjugado, el soporte solido y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union;

   (d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido;

   (e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de la etapa (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia;

   (f) medir la cantidad de luz con un luminometro; y

   (g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.

   Ensayo para la deteccion de un analito de molecula pequena que comprende:

   a) proporcionar un soporte solido inmovilizado con un analito o un analogo de analito;

   b) proporcionar un conjugado de una molecula de union espedfica para el analito con un compuesto de acridinio quimioluminiscente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

   c) mezclar la fase solida, el conjugado y una muestra sospechosa de contener el analito para formar un complejo de union;

   d) separar el complejo de union capturado sobre el soporte solido;

   e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de union de (d) anadiendo reactivos que desencadenan luminiscencia;

   f) medir la cantidad de luz con un luminometro; y

   g) detectar la presencia o calcular la concentracion del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reaccion con una curva patron de respuesta a la dosis que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentracion conocida del analito.