ES2906117T3

ES2906117T3 - Conjugados de androstenodiona quimioluminiscente

Info

Publication number: ES2906117T3
Application number: ES18758127T
Authority: ES
Inventors: Yi Feng Zheng; Lauren Parker; John Driscoll; Zhijian Zhao; Patrick Donovan
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2017-02-23
Filing date: 2018-02-23
Publication date: 2022-04-13
Anticipated expiration: 2038-02-23
Also published as: CN116693587A; CN110603059B; EP3585438A1; EP3585438B1; KR20190120288A; CN110603059A; KR102285253B1; JP7003144B2; JP2020511431A; EP3585438A4; US20210003596A1; WO2018156925A1; JP2023175753A; JP2022008971A

Abstract

Un conjugado detectable de androstenodiona que comprende un compuesto de androstenodiona conjugado con una porción de acridinio quimioluminiscente, este conjugado tiene la estructura de la fórmula (I): A-L-Ψ (I) donde A es androstenodiona o un derivado de la misma; L es un ligador; y Ψ es una etiqueta de acridinio quimioluminiscente, donde este compuesto de androstenodiona (A) se une covalentemente a L a través de cualquiera de los carbonos 3, 6, 7, 17 o 19 de este sistema de anillo de androstenodiona, donde los derivados de androstenodiona son 4-androsten-3,17-diona; 4-androsten-3,17-diona 3-O-carboximetiloxima; 4- androsten-3,17-diona 17-O-carboximetiloxima y 19-hidroxi-4-androsten-3,17-diona.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados de androstenodiona quimioluminiscente

Campo de la invención

La presente invención se refiere a conjugados de androstenodiona quimioluminiscente. Estos conjugados de androstenodiona quimioluminiscente se utilizan como trazadores quimioluminiscentes en inmunoensayos para la cuantificación e identificación de analitos específicos en una muestra.

Antecedentes de la invención

La concentración de varios andrógenos en el suero circulante está directamente relacionada con una variedad de sistemas fisiológicos y de comportamiento. Específicamente, la concentración en suero del andrógeno androstenodiona se mide con frecuencia para la detección de tumores secretores de andrógeno de origen ovárico y suprarrenal, evaluación de errores congénitos del metabolismo de los esteroides sexuales o trastornos de la pubertad. Los niveles elevados de androstenodiona se asocian con enfermedades tal como hiperplasia suprarrenal virilizante y síndrome de ovario polisístico. Además, la medición de androstenodiona en muestras proporciona una mayor exactitud de detección de la enfermedad que otros andrógenos como la 17-hidroxiprogesterona. Además, androstenodiona está prohibida por la Agencia Mundial Antidopaje y de los Juegos Olímpicos. Por consiguiente, la medición de los andrógenos séricos es importante en una variedad de pacientes, incluidos pacientes adultos, pacientes geriátricos, pacientes endocrinológicos pediátricos y pacientes oncológicos.

La estructura de la hormona 4-androstenodiona endógena ("A4") se ilustra a continuación con cada uno de sus 19 carbonos etiquetados.

Otras androstenodionas incluyen las prohormonas 5-androstenodiona y 1-androstenodiona, que también están incluidas en la lista de sustancias prohibidas de la Agencia Mundial Antidopaje. Se entenderá que la referencia a androstenodiona incluye androstenodionas que incluyen A4, 5-androstenodiona y 1-androstenodiona.

Se han desarrollado varias técnicas para detectar la concentración de androstenodiona en muestras. Los métodos analíticos pueden utilizar espectrometría de masas (MS) junto con cromatografía de gases (GC) o cromatografía líquida (LC). Por ejemplo, un ensayo de cromatografía líquida-espectroscopia de masas en tándem ("LC-MS/MS") para la androstenodiona y otros esteroides se describe en Kushnir, M., et al., Clin. Chem. 56, 1138 (2010). Sin embargo, debido al equipo costoso y los tiempos de ejecución más largos requeridos para estos métodos, su utilidad para las mediciones de muestras múltiples es limitada. También se han medido las concentraciones de androstenodiona con inmunoensayos que proporcionan una alternativa rentable, simplista y rápida a los análisis basados en MS. Estos ensayos, como el Ensayo de Androstenodiona IMMULITE 2000 u otros ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzimas ("ELISA"), operan en un formato de unión competitivo donde la androstenodiona en la muestra a medir compite con la androstenodiona conjugada con enzimas para unirse a un número limitado de anticuerpos. Habitualmente, la androstenodiona se conjuga a fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Después de la formación de un complejo de unión a una fase sólida que comprende una cantidad limitada de sitios capaces de conjugarse con la androstenodiona o la androstenodiona unida a enzimas, el complejo de unión se puede separar y someter a un cambio medible (por ejemplo, color). Una vez que se remueve la fase sólida y se observa el cambio medible, se puede inferir la concentración de androstenodiona en la muestra. Sin embargo, como se muestra en Fanelli, F., et al., Steroids 76, 244 (2011), las comparaciones de los ensayos de LC-MS/MS con los ensayos de ELISA indican que las concentraciones de androstenodiona medidas mediante métodos de ELISA dan como resultado un aumento de casi 2.5 veces en las concentraciones de androstenodiona medidas en comparación con LC-MS/MS. Tal sobreestimación se ha atribuido a un error de calibración y reactividad cruzada de los conjugados de androstenodiona unidos a enzimas utilizados en el inmunoensayo, lo que resulta en baja sensibilidad y exactitud para el ensayo ELISA.

WO-A-2009/100327 y CN-A-107 652 344 describen conjugados de esteroides (que incluyen, entre otros, androstenodiona) con etiquetas (que incluyen, entre otros, etiquetas de acridinio) para su uso en ensayos.

Existe una necesidad continua en la técnica de inmunoensayos de androstenodiona mejorados. Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar compuestos quimioluminiscentes conjugados con androstenodiona capaces de ser utilizados en inmunoensayos que proporcionan mediciones precisas y precisas de la concentración de androstenodiona en una muestra.

Breve descripción

Se ha encontrado que los compuestos de acridinio quimioluminiscentes se pueden conjugar con androstenodiona para proporcionar resultados más precisos en un inmunoensayo que las mediciones de ELISA. En la presente se proporcionan conjugados detectables y métodos para usar conjugados detectables de androstenodiona.

En un aspecto de la invención, se proporciona un conjugado detectable de androstenodiona que comprende una porción de androstenodiona conjugado con una porción quimioluminiscente que tiene la estructura: A-L-Y (I)

donde A es androstenodiona o un derivado de la misma;

L es un ligador; y

Y es una etiqueta de acridinio quimioluminiscente, donde este compuesto de androstenodiona (A) se une covalentemente a L a través de cualquiera de los carbonos 3, 6, 7, 17 o 19 de este sistema de anillo de androstenodiona y donde los derivados de androstenodiona son 4-androsteno-3,17-diona; 4-androsteno-3,17-diona 3-O-carboximetiloxima; 4-androsteno-3,17-diona 17-O-carboximetiloxima y 19-hidroxi-4-androsten-3,17-diona.

En algunas realizaciones, Y puede ser un éster de acridinio o una sulfonamida de acridinio. En algunas realizaciones, A es un radical androstenodiona monovalente. En realizaciones preferidas, A puede ser un radical de 4-androstenodiona ("A4").

En la mayoría de las realizaciones, L tiene la estructura —LC—(ZL)z— donde

"z " es 0 o 1;

LC es un radical C^1-35alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o arilalquilo divalente, opcionalmente sustituido con 1 a 20 heteroátomos; y

ZL es un grupo ligador zwitteriónico que tiene la estructura:

"m" es 0 (es decir, es un enlace) o 1;

"n" y "p” son independientemente en cada ocurrencia un número entero de 0 (es decir, es un enlace) a 10;

Xa es un grupo aniónico;

RL es un radical hidrocarburo bivalente C^1-20(por ejemplo, alquilo, alquenilo, arilo, alquinilo, arilalquilo, etc.), opcionalmente sustituido con 1-10 heteroátomos (por ejemplo, N, O, S, Cl, F, Br, etc.); y

R' es hidrógeno o un C^1-10alquilo.

Habitualmente, ^ tiene la estructura de la fórmula (II):

donde Q es CH, O o N;

Y se selecciona de -R o —RL—Z, o en el caso en que Q sea O, entonces Y está ausente;

Y' está ausente (es decir, es un enlace), o se selecciona de —Li—, —RL—, —RL—Li-------L¹—L¹—, —Li— RL—, —Li—RL—Li, o —RL—Li—RL—; e Y' comprende uno o más enlaces a LC o ZL;

Ri es hidrógeno, —R, -X, —RL—X, —Li—R, —Li—X, —Z, —RL—Z, —Li—Z, o —RL—Li—RL—Z;

R²y R³se seleccionan independientemente de hidrógeno, -R, un grupo donante de electrones o -Z;

Z es un grupo zwitteriónico que tiene la estructura:

donde "q" y 7' son independientemente 0 o i;

V es independientemente un número entero de 0 a i0;

Li es independientemente en cada ocurrencia -O-, -S-, -NH-, -N(RN)-, -(CH²)i-io-, -S(=O)i^-2-, -C=C-, -C=C-(CH²)i-³- , -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-(CH2)i-4-, -(CH2)i-4-C(O)-, -C(O)- O-, -C(O)-N(RN)-, -C(O)-NH-, -N(RN)--NH-C(O)-, -C(O)-N(RN)-(CH2)i-3-, -(CH2)i-3-C(O)-N(RN)-, -NH-S(O)i-2-, -N(RN)-S(O)i-2-, -S(O)i-2-N(RN)-, -S(O)i-²- NH-, -(CH2)i-3-NH-S(O)i-2-, -(CH2)i-3-N(RN)-S(O)i-2-, -(CH2)i-3-S(O)i-2-N(RN)-, -(CH2)i-3-S(O)i-2-NH-, -O-(CH²)i-4- , -(CH²) i ^-4-O-, -S-(CH2)i-4-, -(CH²) i ^-4-S-, -NH-(CH2)i-4-, -N(RN)-(CH2)i-4-, -(CH²)i^-4-N(RN)-, -(OCH²)i-io-, -(CH²O)i-io-, -(OCH²CH²)i-io-, o -(CH²CH²O)i-io-;

RL es independientemente en cada aparición un radical hidrocarburo bivalente Ci-²o (por ejemplo, alquilo, alquenilo, arilo, fenilo, fenilo sustituido con monoalquilo, fenilo sustituido con dialquilo, alquinilo, arilalquilo, etc.), opcionalmente sustituido con i- io heteroátomos;

R es independientemente en cada aparición un radical hidrógeno o Ci^-35hidrocarburo (por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo), opcionalmente sustituido con i-2o heteroátomos;

R' y R" son independientemente en cada aparición hidrógeno o un Ci-io alquilo;

Xb es independientemente en cada aparición un grupo aniónico; y

RN se selecciona independientemente en cada aparición de hidrógeno o Ci^-5alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, propilo,

etc.).

En otro aspecto de la invención, se proporciona un reactivo para la detección de un analito que comprende un conjugado detectable de androstenodiona unido a un acridinio quimioluminiscente de acuerdo con la invención. El conjugado detectable puede comprender uno o más grupos funcionales zwitteriónicos (por ejemplo, uno, dos, etc.). El reactivo puede comprender una concentración de conjugado detectable de 10 a 30 ng/mL.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un ensayo para la detección o cuantificación de un analito en una muestra que comprende:

(a) proporcionar un conjugado detectable que tiene la estructura de la fórmula (I);

(b) proporcionar un soporte sólido que tiene inmovilizado en el mismo una molécula capaz de formar un complejo de unión con este analito y capaz de formar un complejo de unión con este conjugado detectable;

(c) mezclar este compuesto, este soporte sólido y esta muestra;

(d) separar este soporte sólido de esta mezcla;

(e) activar la quimioluminiscencia de cualquier etiqueta de acridinio formando complejos con esta fase sólida;

f) medir la cantidad de emisión de luz con un luminómetro, y

(g) detectar la presencia o calcular la concentración de este analito mediante la comparación de la cantidad de luz emitida con una curva de respuesta a la dosis estándar que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentración conocida del analito.

En algunas realizaciones, el compuesto se proporciona en un reactivo que comprende además un amortiguador. Habitualmente, el analito detectado o cuantificado es androstenodiona (por ejemplo, 4-androstenodiona, etc.). En algunas realizaciones, la muestra es suero.

Estos y otros aspectos de la invención se entenderán mejor por referencia a la siguiente descripción detallada que incluye las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra un ejemplo de un inmunoensayo de androstenodiona competitivo usando conjugados de androstenodiona quimioluminiscente. Una muestra con concentración de androstenodiona desconocida ("1") se mezcla con un reactivo que comprende conjugados de androstenodiona quimioluminiscente ("2", en la presente como conjugados de éster de acridinio de androstenodiona-zwitteriónico ("A4-ZAE")) y se permite que interactúe con una fase sólida ("3", "SP"). La fase sólida tiene anticuerpos capaces de formar un complejo de unión recubierto sobre la misma. Cada anticuerpo es capaz de formar un complejo de unión con androstenodiona de la muestra o los conjugados A4-ZAE. Después de que se han formado los complejos de unión, se remueve la fase sólida de la muestra y se lava. Mediante el uso de agentes desencadenantes de quimioluminiscencia (en la presente, ácido/base), se mide la salida de luz quimioluminiscente de la fase sólida combinada con conjugados A4 y A4. La intensidad de la salida de luz se correlaciona con el número de porciones quimioluminiscentes (en círculo). Por consiguiente, la cantidad de androstenodiona en la muestra se puede inferir por la cantidad de salida de luz.

Las figuras 2A-2D ilustran cada uno la salida de luz de inmunoensayos utilizando varios conjugados A4 para anticuerpos 3C3, 3H10 y 4G8 que forman complejos de unión con 4-androstenodiona. La figura 2E muestra la salida de luz del conjugado A4(6p)-hemisuccinato inicialmente y 28 días después del almacenamiento en una solución amortiguadora. Las figuras 3A y 3B muestran la salida de luz de inmunoensayos para muestras que contienen diversas concentraciones de androstenodiona donde el inmunoensayo comprende conjugados A4 conjugados en la posición 7 de la porción A4. En los inmunoensayos medidos para la Figura 3A, la porción de éster de acridinio en cada conjugado es el mismo (-Z-NSPDMAE). En los inmunoensayos medidos para la Figura 3B, se alteran los ligadores y la porción de éster de acridinio.

La figura 4 muestra una comparación de un ensayo LC-MS/MS de muestras de androstenodiona con un ensayo competitivo que utiliza conjugados de androstenodiona quimioluminiscente. Los resultados para cada ensayo se presentan en términos de la concentración medida de androstenodiona. La línea punteada representa el análisis de regresión de Passing-Bablok para los datos que comparan cada método de ensayo (pendiente = 1.02, intersección = -0.01).

Descripción detallada de la invención

Por conveniencia, ciertos términos empleados en la especificación, incluidos los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas, se recogen aquí. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como comúnmente se entiende por un experto en la técnica a la cual se refiere la presente divulgación.

A menos que se defina explícitamente lo contrario, se pretende que los siguientes términos y frases tengan los siguientes significados a lo largo de la presente divulgación:

Todos los porcentajes proporcionados en la presente se refieren a los porcentajes en peso de un componente particular con respecto a toda la composición, que incluye el portador, a menos que se indique lo contrario. Se entenderá que la suma de todos los % en peso de los componentes individuales dentro de una composición no excederá el 100%.

Los términos "un" o "una", como se usan en la presente, significan uno o más. Como se usa en la presente, el término "que consiste esencialmente en" pretende limitar la invención a los materiales o pasos especificados y aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la invención reivindicada, tal como se entiende a partir de una lectura de la presente especificación.

Se utilizan las siguientes definiciones de varios grupos o sustituyentes, a menos que se describa lo contrario. Los valores específicos y generales listados a continuación para radicales, sustituyentes e intervalos son solo para ilustración; no excluyen otros valores definidos u otros valores dentro de intervalos definidos para los radicales y sustituyentes. A menos que se indique lo contrario, los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi y similares denotan grupos rectos, ramificados y cíclicos, así como cualquier combinación de los mismos.

El término "hidrocarburo" se refiere a un radical o grupo que contiene átomos de carbono e hidrógeno. Los ejemplos de radicales hidrocarburo incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aril-alquilo, alquil-arilo y cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, alquil-aril-alquilo, etc.). Como se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, los hidrocarburos pueden ser radicales de hidrocarburos monovalentes o multivalentes (por ejemplo, divalentes, trivalentes, etc.). Un radical de la forma -(CH²)n—, que incluye un radical metileno, es decir, —CH²—, se considera un radical alquilo si no tiene enlaces insaturados entre átomos de carbono. A menos que se especifique lo contrario, todos los radicales hidrocarbonados (que incluyen alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aril-alquilo, alquil-arilo, etc. sustituidos e insustituidos) pueden tener de 1 a 35 átomos de carbono. En otras realizaciones, los hidrocarburos tendrán de 1-20 o de 1-12 o de 1-8 o de 1-6 o de 1-3 átomos de carbono, que incluyen, por ejemplo, realizaciones que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez átomos de carbono. Los hidrocarburos pueden tener de aproximadamente 2 a aproximadamente 70 átomos o de 4 a aproximadamente 40 átomos o de 4 a aproximadamente 20 átomos.

Un hidrocarburo "sustituido" puede tener como sustituyente uno o más radicales de hidrocarburos, radicales de hidrocarburos sustituidos o puede comprender uno o más heteroátomos. Cualquier sustituyente de hidrocarburo descrito en la presente puede incluir opcionalmente de 1-20 (por ejemplo, 1-10, 1-5, etc.) heteroátomos. Los ejemplos de radicales hidrocarburos sustituidos incluyen, sin limitación, heterociclos, tales como heteroarilos. A menos que se especifique lo contrario, un hidrocarburo sustituido con uno o más heteroátomos comprenderá de 1-20 heteroátomos. En otras realizaciones, un hidrocarburo sustituido con uno o más heteroátomos comprenderá de 1-12 o de 1-8 o de 1-6 o de 1-4 o de 1-3 o de 1-2 heteroátomos. Los ejemplos de heteroátomos incluyen, pero no se limitan a, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, halógeno (F, Cl, Br, I, etc.), boro, silicio, etc. En algunas realizaciones, los heteroátomos se seleccionarán del grupo que consiste de oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y halógeno (F, Cl, Br, I, etc.). En realizaciones preferidas, los heteroátomos se pueden seleccionar de O, N o S. En algunas realizaciones, un heteroátomo o grupo puede sustituir un carbono. En algunas realizaciones, un heteroátomo o grupo puede sustituir un hidrógeno. En algunas realizaciones, un hidrocarburo sustituido puede comprender uno o más heteroátomos en la estructura principal o cadena de la molécula (por ejemplo, interpuesto entre dos átomos de carbono, como en "oxa"). En algunas realizaciones, un hidrocarburo sustituido puede comprender uno o más heteroátomos colgantes de la estructura principal o cadena de la molécula (por ejemplo, unidos covalentemente a un átomo de carbono en la cadena o estructura principal, como en "oxo").

Además, la frase "sustituido con un[n]", tal como se usa en la presente, significa que el grupo especificado se puede sustituir con uno o más de cualquiera o todos los sustituyentes nombrados. Por ejemplo, cuando un grupo, tal como un grupo alquilo o heteroarilo, está "sustituido con un C¹-C²⁰alquilo insustituido, o heteroalquilo de 2 a 20 miembros insustituido," el grupo puede contener uno o más C¹-C²⁰alquilos insustituidos, y/o uno o más heteroalquilos de 2 a 20 miembros insustituidos. Además, cuando una porción se sustituye con un sustituyente R, el grupo se puede referir como "sustituido con R". Cuando una porción se sustituye con R, la porción se sustituye con al menos un sustituyente R y cada sustituyente R es opcionalmente diferente.

A menos que se especifique lo contrario, cualquier compuesto descrito en la presente que tenga uno o más centros quirales puede estar en la forma de una mezcla racémica con respecto a cada centro quiral, o puede existir como puro o sustancialmente puro (por ejemplo, mayor que aproximadamente 98% ee) de enantiómeros R o S con respecto a cada centro quiral, o puede existir como mezclas de enantiómeros R y S con respecto a cada centro quiral, donde la mezcla comprende un exceso enantiomérico de una u otras configuraciones, por ejemplo, un exceso enantiomérico (de R o S) de más del 60% o más del 70% o más del 80% o más del 90%, o más del 95%, o más del 98% o más del 99% de exceso enantiomérico. En algunas realizaciones, cualquier centro quiral puede estar en las configuraciones "S" o "R". En realizaciones preferidas, el centro quiral a través del cual se conjuga la androstenodiona puede estar en una única configuración. En realizaciones preferidas, la posición de carbono indicada (por ejemplo, carbono 3, 6, 7, 17, 19, etc.), se conjuga solo a través de la orientación a (por ejemplo, A(3a), A(6a), A(7a), A(17a), A(19a), etc.) o p (por ejemplo., A(3p), A(6p), A(7p), A(17a), A(19a), etc.).

Se entenderá que la descripción de compuestos en la presente se limita por principios de enlace químico conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, donde un grupo se puede sustituir por uno o más de varios sustituyentes, estas sustituciones se seleccionan para cumplir con los principios de enlace químico con respecto a las valencias, etc., y para dar compuestos que no son inherentemente inestables. Por ejemplo, cualquier átomo de carbono estará unido a otros dos, tres o cuatro átomos, consistentes con los cuatro electrones de valencia de carbono.

En general, y a menos que se indique lo contrario, los nombres de prefijo de sustituyente (radical) se derivan del hidruro principal ya sea (i) reemplazando el "ano" o en el hidruro principal con los sufijos "ilo", "diilo", "triilo", "tetrailo", etc.; o (ii) reemplazando la "e" en el hidruro principal con los sufijos "ilo", "diilo", "triilo", "tetrailo", etc. (aquí el átomo o átomos con la valencia libre, cuando se especifica, se dan números tan bajos como sea consistente con cualquier numeración establecida del hidruro principal). Los nombres contratados aceptados, por ejemplo, adamantilo, naftilo, antrilo, fenantrilo, furilo, piridilo, isoquinolilo, quinolilo y piperidilo, y los nombres triviales, por ejemplo, vinilo, alilo, fenilo y tienilo también se utilizan en la presente. Los radicales de esteroides también se pueden designar con los sufijos "ilo", "diilo", "triilo", "tetrailo", etc. Los esteroides contraídos aceptados incluyen androstenodionilo, 4-androstenodionilo, androstendion-7-ilo, etc. Los sistemas de numeración/letras convencionales también se adhieren para la numeración de sustituyentes y la nomenclatura de anillos fusionados, espiro, bicíclicos, tricíclicos, policíclicos.

El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo saturado que puede ser una cadena recta o cadena ramificada, que contiene la cantidad indicada de átomos de carbono. Por ejemplo, C¹-C⁶alquilo indica que el grupo puede tener de 1 a 6 átomos de carbono (inclusive) en él. Cualquier átomo puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, npropilo, /sopropilo, y ferc-butilo. Cualquier grupo alquilo al que se hace referencia en la presente (por ejemplo, R, R', R", R¹, R², R³, R⁴, R⁵, etc.) puede tener de 1 a 35 átomos de carbono. En otras realizaciones, los grupos alquilo tendrán de 1-20 o de 1-12 o de 1-8 o de 1-6 o de 1-3 átomos de carbono, incluyendo, por ejemplo, realizaciones que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez átomos de carbono.

El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo, en el que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por halo. En algunas realizaciones, más de un átomo de hidrógeno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14, etc.), se reemplazan por halo. En estas realizaciones, los átomos de hidrógeno se pueden reemplazar cada uno por el mismo halógeno (por ejemplo, fluoro) o los átomos de hidrógeno se pueden reemplazar por una combinación de diferentes halógenos (por ejemplo, fluoro y cloro). "Haloalquilo" también incluye porciones alquilo en los que todos los hidrógenos se han reemplazado por halo (a veces referido en la presente como perhaloalquilo, por ejemplo, perfluoroalquilo, tal como trifluorometilo). Cualquier átomo puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más sustituyentes.

Como se menciona en la presente, el término "alcoxi" se refiere a un grupo de fórmula -O(alquilo). Alcoxi puede ser, por ejemplo, metoxi (-OCH³), etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi, pentoxi, 2-pentoxi, 3-pentoxi o hexiloxi. Asimismo, el término "tioalcoxi" se refiere a un grupo de fórmula -S(alquilo). Finalmente, los términos "haloalcoxi" y "halotioalcoxi" se refieren a -O(haloalquilo) y -S(haloalquilo), respectivamente. El término "sulfhidrilo" se refiere a -SH. Como se usa en la presente, el término "hidroxilo", empleado solo o en combinación con otros términos, se refiere a un grupo de fórmula -OH. Cualquier grupo alcoxi, tioalcoxi o haloalcoxi al que se hace referencia en la presente (por ejemplo, R, R', R", R¹, R², R³, R⁴, R⁵, etc.) puede tener de 1-35 átomos de carbono. En otras realizaciones, los grupos alcoxi, tioalcoxi o haloalcoxi tendrán de 1-20 o de 1-12 o de 1-8 o de 1-6 o de 1-3 átomos de carbono, que incluyen, por ejemplo, realizaciones que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez átomos de carbono.

El término "aralquilo" se refiere a una porción alquilo en el que un átomo de hidrógeno alquilo se reemplaza por un grupo arilo. Uno de los carbonos de la porción de alquilo sirve como el punto de unión del grupo aralquilo a otra porción. Cualquier anillo o átomo de cadena puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Los ejemplos no limitantes de "aralquilo" incluyen grupos bencilo, 2-feniletilo y 3-fenilpropilo.

El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que contiene la cantidad indicada de átomos de carbono y que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. Cualquier átomo puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Los grupos alquenilo pueden incluir, por ejemplo, vinilo, alilo, 1 -butenilo y 2-hexenilo. Uno de los carbonos de enlace doble puede ser opcionalmente el punto de unión del sustituyente alquenilo. Cualquier grupo alquenilo al que se hace referencia en la presente (por ejemplo, R, R', R", R¹, R², R³, R⁴, R⁵, etc.) puede tener de 1 a 35 átomos de carbono. En otras realizaciones, los grupos alquenilo tendrán de 1-20 o de 1-12 o de 1-8 o de 1-6 o de 1-3 átomos de carbono, que incluyen, por ejemplo, realizaciones que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez átomos de carbono.

El término "alquinilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo recta o ramificada que contiene la cantidad indicada de átomos de carbono y que tiene uno o más enlaces triples carbono-carbono. Los grupos alquinilo pueden estar sustituidos opcionalmente, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Los grupos alquinilo pueden incluir, por ejemplo, etinilo, propargilo y 3-hexinilo. Uno de los carbonos de enlace triple puede ser opcionalmente el punto de unión del sustituyente alquinilo.

El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico, tricíclico u otro policíclico completamente saturado, parcialmente saturado o aromático que tiene uno o más átomos de anillo heteroátomo constituyentes seleccionados independientemente de O, N (se entiende que uno o dos grupos adicionales (por ejemplo, RN) pueden estar presentes para completar la valencia de nitrógeno y/o formar una sal), o S. El heteroátomo o carbono de anillo puede ser el punto de unión del sustituyente heterociclilo a otra porción. Cualquier átomo se puede sustituir opcionalmente, por ejemplo, con uno o más sustituyentes (por ejemplo, heteroátomos o grupos X). Los grupos heterociclilo pueden incluir, por ejemplo, tetrahidrofurilo, tetrahidropiranilo, piperidilo (piperidino), piperazinilo, morfolinilo (morfolino), pirrolinilo y pirrolidinilo. A modo de ejemplo, la frase "anillo heterocíclico que contiene de 5-6 átomos de anillo, donde de 1-2 de los átomos de anillo se selecciona independientemente de N, NH, N(C¹-C⁶alquilo), NC(O)(C¹-C⁶alquilo), O y S; y donde este anillo heterocíclico se sustituye opcionalmente con de R" seleccionado independientemente de 1-3 incluye (pero no se limita a) tetrahidrofurilo, tetrahidropiranilo, piperidilo (piperidino), piperazinilo, morfolinilo (morfolino), pirrolinilo y pirrolidinilo.

El término "heterocicloalquenilo" se refiere a grupos hidrocarburo monocíclicos, bicíclicos, tricíclicos u otros policíclicos parcialmente insaturados que tienen uno o más (por ejemplo, 1-4) átomos de anillo heteroátomo seleccionados independientemente de O, N (se entiende que uno o dos grupos adicionales pueden estar presentes para completar la valencia de nitrógeno y/o formar una sal), o S. Un carbono de anillo (por ejemplo, saturado o insaturado) o heteroátomo puede ser el punto de unión del sustituyente heterocicloalquenilo. Cualquier átomo puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Los grupos heterocicloalquenilo pueden incluir, por ejemplo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo, dihidropiranilo, 4,5-dihidrooxazolilo, 4,5-dihidro-1 H-imidazolilo, 1,2,5,6-tetrahidropirimidinilo, y 5,6-dihidro-2H-[1,3]oxazinilo.

El término "cicloalquilo" se refiere a grupos de hidrocarburo monocíclico, bicíclico, tricíclico u otro policíclico completamente saturados. Cualquier átomo puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Un carbono de anillo sirve como el punto de unión de un grupo cicloalquilo a otra porción. Las porciones cicloalquilo pueden incluir, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, adamantilo y norbornilo (biciclo[2.2.1]heptilo).

El término "cicloalquenilo" hace referencia a grupos hidrocarburo monocíclicos, bicíclicos, tricíclicos u otros policíclicos parcialmente insaturados. Un carbono de anillo (por ejemplo, saturado o insaturado) es el punto de unión del sustituyente cicloalquenilo. Cualquier átomo puede estar opcionalmente sustituido, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Las porciones de cicloalquenilo pueden incluir, por ejemplo, ciclohexenilo, ciclohexadienilo o norbomenilo. Como se usa en la presente, el término "cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo monocíclico divalente que tiene la cantidad indicada de átomos en el anillo.

Como se usa en la presente, el término "heterocicloalquileno" se refiere a un grupo heterociclilo monocíclico divalente que tiene la cantidad indicada de átomos en el anillo.

El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos de hidrocarburos aromáticos monocíclicos, bicíclicos (2 anillos fusionados), o tricíclicos (3 anillos fusionados), o policíclicos (> 3 anillos fusionados). Uno o más átomos de anillo pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Las porciones de arilo incluyen, por ejemplo, fenilo y naftilo.

El término "heteroarilo" se refiere a grupos hidrocarburo aromáticos monocíclicos, bicíclicos (2 anillos fusionados), tricíclicos (3 anillos fusionados) o policíclicos (> 3 anillos fusionados) que tienen uno o más átomos de anillo heteroátomo seleccionados independientemente de O, N (se entiende que uno o dos grupos adicionales pueden estar presentes para completar la valencia de nitrógeno y/o formar una sal), o S en el anillo. Uno o más átomos de anillo pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, por uno o más sustituyentes. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, 2H-pirrolilo, 3H-indolilo, 4H-quinolizinilo, acridinilo, benzo[b]tienilo, benzotiazolilo, pcarbolinilo, carbazolilo, coumarinilo, cromenilo, cinolinilo, dibenzo[b,d]furanilo, furazanilo, furilo, imidazolilo, imidizolilo, indazolilo, indolilo, isobenzofuranilo, isoindolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, naftiridinilo, oxazolilo, perimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenarsazinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatiinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, quinoxalinilo, tiadiazolilo, tiantrenilo, tyiazolilo, tienilo, triazolilo y xantenilo.

En general, cuando una definición para una variable particular incluye posibilidades tanto de hidrógeno como no de hidrógeno (halo, alquilo, arilo, etc.), el término "sustituyente(s) distinto(s) de hidrógeno" se refiere colectivamente a las posibilidades no de hidrógeno para esa variable particular.

En general, los límites (puntos finales) de cualquier intervalo mencionado en la presente se encuentran dentro del alcance de la invención y se entenderá que son realizaciones descritas. Además, también se contempla cualquier valor medio integral dentro de ese intervalo. Por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 0 a 4 describe expresamente 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 y cualquier subconjunto dentro de ese intervalo (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 2.5). El término "sustituyente" se refiere a un grupo "sustituido" en, por ejemplo, un grupo alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, heterocicloalquenilo, cicloalquenilo, arilo o heteroarilo en cualquier átomo de ese grupo, reemplazando uno o más átomos de hidrógeno en este. En un aspecto, los sustituyentes en un grupo son independientemente cualquier uno solo, o cualquier combinación de dos o más de los átomos o grupos de átomos permitidos delineados para ese sustituyente. En otro aspecto, un sustituyente en sí mismo puede estar sustituido con cualquiera de los sustituyentes anteriores. Además, como se usa en la presente, la frase "opcionalmente sustituido" significa insustituido (por ejemplo, sustituido con una H) o sustituido. Se entiende que la sustitución en un átomo dado se limita por la valencia. Los sustituyentes comunes incluyen halo (por ejemplo, F), C^1-12alquilo de cadena recta o cadena ramificada, C^2-12alquenilo, C^2-12alquinilo, C^3-12cicloalquilo, C^6-12arilo, C^3-12heteroarilo, C^3-12heterociclilo, C^1-12alquilsulfonilo, nitro, ciano, -COOR, —C(O)NRR', -OR, -SR, -NR^r', y oxo, tal como mono- o di- o tri-sustituciones con porciones tales como trifluorometoxi, cloro, bromo, flúor, metilo, metoxi, piridilo, furilo, triazilo, piperazinilo, pirazoilo, imidazoilo, y similares, cada uno contiene opcionalmente uno o más heteroátomos tales como halo, N, O, S, y P, R y R' son independientemente hidrógeno, C^1-12alquilo, C^1-12haloalquilo, C^2-12alquenilo, C^2-12alquinilo, C^3-12cicloalquilo, C^4-24cicloalquilalquilo, C^6-12arilo, C^7-24aralquilo, C^3-12heterociclilo, C^3-24heterociclilalquilo, C^3-12heteroarilo, o C^4-24heteroarilalquilo. A menos que se indique lo contrario, todos los grupos descritos en la presente contienen opcionalmente uno o más sustituyentes comunes, en la medida permitida por la valencia. Además, como se usa en la presente, la frase "opcionalmente sustituido" significa insustituido (por ejemplo, sustituido con una H) o sustituido. Como se usa en la presente, el término "sustituido" significa que un átomo de hidrógeno y/o carbono se remueve y reemplaza por un sustituyente (por ejemplo, un sustituyente común). Se entiende que el uso de nombres de prefijo de sustituyente (radical) tales como alquilo sin el modificador "opcionalmente sustituido" o "sustituido" significa que el sustituyente particular no está sustituido. Sin embargo, aún se entiende que el uso de "haloalquilo" sin el modificador "opcionalmente sustituido" o "sustituido" significa un grupo alquilo, en el que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por halo.

Por "conjugado a través de" con referencia a un carbono especificado indica que se forma un enlace al carbono especificado donde un átomo del grupo ligador L se une covalentemente al carbono especificado. En algunas realizaciones, el enlace entre el Carbono 17 o el Carbono 3 de androstenodiona y el ligador comprenderá un enlace doble tal como una oxima o una imina en cualquier configuración geométrica.

Por "estabilidad" de compuestos quimioluminiscentes, se entiende una pérdida mínima de actividad quimioluminiscente medida por la pérdida de unidades de luz relativa ("RLU") cuando los compuestos o conjugados se almacenan en una solución acuosa habitualmente, en el intervalo de pH de 6-9, que está dentro del pH fisiológico. Una mayor "inestabilidad" de un compuesto quimioluminiscente en comparación con otro compuesto tendrá una mayor pérdida de actividad quimioluminiscente.

El objetivo principal de la presente invención es divulgar etiquetas detectables de androstenodiona. Estos compuestos se pueden usar en un inmunoensayo para la identificación o cuantificación de un analito. Los compuestos de la invención tienen la estructura de la fórmula (I)

A-L-Y (I)

donde A, L y ^ son como se definió anteriormente y en las reivindicaciones. Se contempla que esta unión permite una mejor detección del analito de androstenodiona correspondiente en una muestra. Habitualmente, el analito es 4-androstenodiona.

En algunas realizaciones, Y es un acridinio quimioluminiscente que tiene la estructura:

donde Q es CH, O o N;

Y' está ausente (es decir, es un enlace), o se selecciona de —Li—, —RL—, —RL—Li-------Li—Li—, —Li— RL—, —Li—RL—Li, o —RL—Li—RL—; e Y' comprende uno o más enlaces a LC o ZL;

Z es un grupo zwitteriónico que tiene la estructura:

donde "q" y 'T son independientemente 0 o i;

V es independientemente un número entero de 0 a i0;

Li es independientemente en cada ocurrencia -O -, -S -, -NH-, -N(RN)-, -(CH²)i-io-, -S(=O)i^-2-, -C=C-, -C=C-(CH²)i-³- , -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-(CH2)i-4-, -(CH2)i-4-C(O)-, -C(O)- O-, -C(O)-N(RN)-, -C(O)-NH-, -N(RN)-C(O)-, -NH-C(O)-, -C(O)-N(RN)-(CH2)i-3-, -(CH2)i-3-C(O)-N(RN)-, -NH-S(O)i-2-, -N(RN)-S(O)i-2-, -S(O)i-2-N(RN)-, -S(O)i-²- NH-, -(CH2)i-3-NH-S(O)i-2-, -(CH2)i-3-N(RN)-S(O)i-2-, -(CH2)i-3-S(O)i-2-N(RN)-, -(CH2)i-3-S(O)i-2-NH-, -O-(CH²)i-4- , -(CH²) i ^-4-O -, -S-(CH2)i-4-, -(CH²) i ^-4-S -, -NH-(CH2)i-4-, -N(RN)-(CH2)i-4-, -(CH²) i ^-4-N(RN)-, -(OCH²)i-io-, -(CH²O)i-io-, -(OCH²CH²)i-io-, o -(CH²CH²O)i-io-;

RL es independientemente en cada aparición un radical hidrocarburo bivalente Ci-2o (por ejemplo, alquilo, alquenilo, arilo, fenilo, fenilo sustituido con monoalquilo, fenilo sustituido con dialquilo, alquinilo, arilalquilo, etc.), opcionalmente sustituido con i- io heteroátomos;

Xb es independientemente en cada aparición un grupo aniónico; y

RN se selecciona independientemente en cada aparición de hidrógeno o Ci^-5alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, etc.).

Habitualmente, L tiene la estructura —LC—(ZL)z— donde "z " es o o i;

io

ZL es un grupo ligador zwitteriónico que tiene la estructura:

"m" es 0 (es decir, es un enlace) o 1;

Xa es un grupo aniónico;

RL es un radical hidrocarburo bivalente C^1-20(por ejemplo, alquilo, alquenilo, arilo, alquinilo, arilalquilo, etc.), opcionalmente sustituido con 1-10 heteroátomos; y

R' es hidrógeno o un C^1-10alquilo.

En las realizaciones preferidas, ^ tiene la estructura de la fórmula (IIa)

Generalmente, el grupo aniónico (Xa y/o Xb) puede proporcionar una carga aniónica para contrarrestar cualquier carga catiónica directa o indirectamente unida covalentemente y para formar un zwitterión. En algunas realizaciones, Xa y Xb son independientemente en cada aparición carboxilato (—C(O)0_), sulfonato1 ^ 3 >, sulfatô fosfato (—OP(O)(ORP)O-), u óxido (—O-), y RP es hidrógeno o C^1-12hidrocarburo opcionalmente sustituido con hasta 10 heteroátomos.

El grupo R¹unido al nitrógeno cargado positivamente del núcleo de acridinio está opcionalmente sustituido con hasta 20 heteroátomos (por ejemplo, N, O, S, P, Cl, Br, F, etc.) y, por lo tanto, en combinación con el átomo de nitrógeno de acridinio cargado positivamente, puede constituir un grupo zwitteriónico. Por ejemplo, un grupo sulfopropilo o sulfobutilo unido al nitrógeno de acridinio puede formar un par zwitteriónico. El grupo R¹también puede ser neutral (por ejemplo, metilo) o por sí mismo ser zwitteriónico (por ejemplo., R¹es —Z, —RL—Z, —L8—Z, o —RL—L8—RM—Z). En algunas realizaciones, R¹tiene la estructura:

Cuando se carga el compuesto (por ejemplo., Ri tiene una carga neutral neta, etc.), el compuesto puede incluir opcionalmente un contraión para equilibrar el nitrógeno cargado positivamente del núcleo de acridinio. Si bien esencialmente no hay limitación en la selección del contraión, en algunas realizaciones el contraión se selecciona de CH³SO⁴-, FSO³-, CF³SO⁴-, C⁴F⁹SO⁴-, CH³C⁶H⁴SO³-, haluro (por ejemplo., Cl-, F-, Br-, etc.), CF³COO-, CH³COO-, o NO³-. En algunas realizaciones, R¹es metilo, etilo, propilo o isopropilo. En otras realizaciones, R¹comprende —RL—X y —X es sulfonato*- ^ ^ ). En algunas realizaciones, R¹es —RL—X y -X es sulfonato1 *^-*3 ^. En algunas realizaciones, R¹es —RL—X o —1_8—Z. En algunas realizaciones, Ls es —S(0)2 — NH— o —(CH2)i -3 —S(0)2—NH—. R¹puede comprender un grupo sulfopropiloc-t<- 11:) -S 03) una realización preferida, R¹es sulfopropilo.

La naturaleza del acridinio quimioluminiscente no está particularmente restringida e incluye ésteres de acridinio quimioluminiscentes y sulfonamidas sin limitación. En las implementaciones preferidas, el acridinio quimioluminiscente ^ es un éster de acridinio. Por ejemplo, ^ puede tener la estructura:

En realizaciones preferidas, ^ tiene la estructura de la fórmula (IIb):

donde R⁵-R⁷son independientemente hidrógeno o C^1-35alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alcoxi, alquiltio o amino; y donde L¹está unido covalentemente a L (por ejemplo, a LC o ZL). En algunas realizaciones, L¹en la fórmula (IIa) es —C(O)—NH—. En algunas realizaciones, R⁵y R6 son cada uno metilo y R⁷y R8 son cada uno hidrógeno.

Una persona de habilidad ordinaria reconocería que los sustituyentes en el éster de acridinio quimioluminiscente pueden modificarse para variar la velocidad y el rendimiento de la emisión de luz, para reducir la unión no específica, aumentar la estabilidad o aumentar la hidrofilicidad, pero lo que es importante para la presente invención es que el éster de acridinio quimioluminiscente no interfiera sustancialmente con la unión del compuesto de androstenodiona (A) con un anticuerpo, y específicamente para el compuesto de androstenodiona no conjugado correspondiente. Los ejemplos de variabilidad de sustituyente se describen en Natrajan et al. en la patente de Estados Unidos No. 7,309,615, que describe compuestos de acridinio de alto rendimiento cuántico que contienen grupos alcoxi (OR*) en C2 y/o C7, donde R* es un grupo que comprende una porción sulfopropilo o porcioness etilenglicol o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, R²y/o R³pueden ser grupos alcoxi (por ejemplo, OR y/u OR*.). Natrajan et al. en Publicación Internacional No. WO2015/006174, también describe ésteres de acridinio quimioluminiscentes de alto rendimiento cuántico hidrofílicos que poseen ciertos grupos funcionales donadores de electrones en las posiciones C2 y/o C7 también. Estos grupos de donación de electrones en R¹y/o R²pueden tener la estructura:

donde R⁹-R¹⁴se selecciona independientemente en cada aparición un grupo metilo o un grupo - (CH2CH2O)aCH3, donde a es un número entero de 1 a 5. En algunas realizaciones, R²y R³son independientemente en cada aparición hidrógeno, alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, etc.), o alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi o isopropoxi, etc.). En algunas realizaciones, R²y R³son cada uno hidrógeno. En otras realizaciones, R²o R³es hidrógeno y el otro de R²o R³es alcoxi o un grupo donante de electrones.

El conjugado detectable puede comprender una sulfonamida de acridinio quimioluminiscente. Por ejemplo, ^ puede tener la estructura de la fórmula (IIc):

donde Y" está ausente o es —Li—, —RL— o — RL —Li—, donde Y" está unido covalentemente a L (por ejemplo, a LC o ZL).

En algunas realizaciones, RL es un hidrocarburo aromático bivalente de cinco o seis miembros opcionalmente sustituido. Por ejemplo, cualquier RL puede tener la estructura:

donde R¹⁴es independientemente en cada ocurrencia hidrógeno, halógeno, o R. En algunas realizaciones, RL tiene la estructura:

donde R⁵-R⁷son independientemente C^1-35alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alcoxi, alquiltio o amino. En algunas realizaciones, R⁷y R8 son cada uno hidrógeno y R⁵y R6 son cada uno metilo. En algunas realizaciones, ^ comprende dos grupos metilo flanqueantes en un éster fenólico para estabilizar el enlace como se describe en Law et al. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 4: 88-89 (1989). En algunas realizaciones, ^ tiene la estructura:

A, L y ^ están cada uno ligado covalentemente. Las porciones del enlace covalente entre A y ^ se pueden formar de un grupo funcional reactivo para formar enlaces covalentes con un péptido, una proteína o una macromolécula, donde el grupo funcional comprende un grupo electrófilo, un grupo nucleófilo o un grupo fotorreactivo. El grupo funcional reactivo puede ser un grupo reactivo a amina, un grupo reactivo a tiol, un grupo reactivo a carboxilo, un grupo reactivo a maleimidilo o un grupo reactivo a carbohidratos. Por ejemplo, el enlace se puede formar de un grupo reactivo seleccionado de:

HALURO

NCS, -NCO,

SO²CI, —N³, - N ²+CI-,

—Cl, —Br, —I o —COOH. En algunas realizaciones, el compuesto comprende un grupo ligador que tiene la estructura -NH-C(O)- o —C(O)—NH—. En una realización preferida, el compuesto (por ejemplo, LC, etc.), comprende al menos un grupo ligador —NH — C(O) — o — C(O) — N^h.

El enlace covalente entre A y ^ (por ejemplo, L) puede comprender un radical C^1-20alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o arilalquilo divalente, opcionalmente sustituido con hasta 20 heteroátomos (por ejemplo, N, O, S, P, Cl, F, Br, etc.). En algunas realizaciones, L comprende un ligador zwitteriónico. L puede tener la estructura —LC—(ZL)z—, donde z es 0 o 1. LC puede tener la estructura

-(Xl)0-1-(RL)0-5-(X2)0-1-(RL)0-5-(X3)0-1-(RL)0-5-(X4)0-1-(RL)0-5-donde Xi se selecciona de =N—, —O—, —S— o —NRN—;

X²—X⁴se seleccionan independientemente de —O—, —S—, —NRN—, -C(O)-, —NRN—C(O)—, —C(O)— NRN—, —O—C(O)—, o —C(O)—O—, —S—C(O)—, o —C(O)—S—; y

RL se selecciona independientemente en cada ocurrencia de

—(CH²CH²O)— o — OCH²CH²)—;

con la condición de que LC comprende al menos un átomo (o al menos dos átomos) en la cadena entre A y ^ (o entre A y ZL).

En algunas realizaciones, L y/o ^ comprende —C(O)—NH—. En algunas realizaciones, LC tiene la estructura:

El conjugado detectable puede tener la estructura:

o

La etiqueta detectable puede comprender una porción de éster de dimetil acridinio (DMAE) y un ligador zwitteriónico que comprende un ligador zwitteriónico o un ligador derivado de polietilenglicol para mejorar las propiedades del compuesto de androstenodiona (A). Tales propiedades tales como unión inespecífica, hidrofilicidad o estabilidad del compuesto pueden mejorarse cuando ^ comprende un ligador zwitteriónico o un ligador derivado de polietilenglicol o un éster de dimetilfenilo. En algunas realizaciones, ZL tiene la estructura:

En la mayoría de las realizaciones, R' es hidrógeno o alquilo inferior (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, etc.)

En algunas realizaciones, los conjugados detectables pueden tener la estructura de la fórmula (111):

El conjugado detectable puede comprender una porción de éster de dimetil acridinio (DMAE) y un ligador zwitteriónico que tiene la estructura de la fórmula (Illa):

En algunas realizaciones, la estructura en la fórmula (Illa) no comprende un ligador zwitteriónico (por ejemplo, L es LC). En algunas realizaciones, L es LC y LC comprende —(CH2CH20)^mc— (por ejemplo, —(CH2CH2O)5—, etc.), o —(OCH²CH²K ¹⁰— (por ejemplo, —(OCH2CH2)5—, etc.).

En algunas realizaciones, el compuesto tiene la estructura de la fórmula (lllb)

La androstenodiona de la etiqueta detectable es habitualmente un radical monovalente de androstenodiona (por ejemplo, 4-androstenodionilo). Cuando el punto de conjugación se encuentra en los carbonos 3 o 17, el =O unido a este se puede reemplazar por un =N para formar un grupo oxima. El grupo oxima puede estar en configuración geométrica (es decir, E o Z) o una mezcla de los dos. De acuerdo con la invención, la androstenodiona se conjuga con el compuesto a través de cualquiera de los carbonos 3, 6, 7, 19 o 17 de la porción de androstenodiona. En realizaciones preferidas, la androstenodiona se conjuga a través de la androstenodiona de carbono 6 o 7. En algunas realizaciones, el A4 se conjuga a través de la posición a del carbono especificado (por ejemplo, 6a, 7a., etc.). En algunas realizaciones, el A4 se conjuga a través de la posición p del carbono especificado (por ejemplo, 6p, 7p., etc.). En algunas realizaciones, el compuesto se proporciona como una mezcla racémica de configuraciones a y p.

Los ejemplos de compuestos se describen en la Tabla 1. Tal como se usa para describir los conjugados, "Z" se refiere a un ligador zwitteriónico, "CMO" se refiere a un ligador carboximetil oxima, "CME" se refiere a un ligador carboximetil éter, "CETE" se refiere a un carboxietil tioéter, "ZAE" se refiere a un éster de acrinidio zwitteriónico (que es habitualmente un éster de N-sulfopropil dimetil acridinio en los ejemplos mostrados ("NSP-DMAE")), "ISODIZAE" se refiere a un núcleo de acridinio con un grupo funcional isopropoxi unido a este y un grupo zwitteriónico completo (que comprende N+ y X-) unido al N positivo del núcleo de acridinio.

Tabla 1

Los compuestos se pueden preparar a partir de materiales de inicio comercialmente disponibles, compuestos conocidos en la literatura o compuestos intermedios fácilmente preparados, al emplear métodos y procedimientos estándares de síntesis conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos y procedimientos estándar de síntesis para la preparación de moléculas orgánicas y transformaciones y manipulaciones de grupos funcionales se pueden obtener fácilmente de la literatura científica relevante o de libros estándar de texto en el campo. Se apreciará que cuando se dan condiciones de proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, solventes, presiones, etc.), también se pueden usar otras condiciones de proceso a menos que se indique lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos particulares o solvente utilizado, pero estas condiciones pueden ser determinadas por un experto en la técnica mediante procedimientos de optimización de rutina. Los expertos en la técnica de síntesis orgánica reconocerán que la naturaleza y el orden de los pasos sintéticos presentadas se pueden variar con el fin de optimizar la formación de los compuestos descritos en la presente.

Las transformaciones de química sintética (que incluyen metodologías de grupos protectores) útiles para sintetizar los compuestos descritos en la presente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, 2d. Ed., Wiley-VCH Publishers (1999 ); P.G.M. Wuts y T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, 4a Ed., John Wiley and Sons (2007 ); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser 's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994 ); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reactives for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995 ), y ediciones posteriores de los mismos.

Los procesos descritos en la presente se pueden monitorear de acuerdo con cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la formación del producto se puede monitorear por medios espectroscópicos, tal como espectroscopía de resonancia magnética nuclear (por ejemplo, 1H o 13C), espectroscopía infrarroja (FT-IR), espectrofotometría (por ejemplo, visible por UV) o espectrometría de masas (MS), o por cromatografía tal como cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o cromatografía de capa delgada (TLC).

La preparación de los compuestos puede implicar la protección y desprotección de varios grupos químicos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la necesidad de protección y desprotección y la selección de grupos protectores adecuados. La química de los grupos protectores se puede encontrar, por ejemplo, en Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991.

Las reacciones de los procesos descritos en la presente se pueden llevar a cabo en solventes adecuados que se pueden seleccionar fácilmente por un experto en la técnica de síntesis orgánica. Los solventes adecuados pueden ser sustancialmente no reactivos con los materiales de inicio (reactivos), los intermedios o productos a las temperaturas a las que se llevan a cabo las reacciones, es decir, temperaturas que pueden variar desde la temperatura de congelación del solvente hasta la temperatura de ebullición del solvente. Una reacción dada se puede llevar a cabo en un solvente o una mezcla de más de un solvente. Dependiendo del paso de reacción particular, se pueden seleccionar solventes adecuados para un paso de reacción particular.

La resolución de mezclas racémicas de compuestos se puede llevar a cabo mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la configuración absoluta de los estereoisómeros se puede determinar mediante técnicas de RMN 1D y 2D tales como COSY, NOESY, HMBC y HSQC. Implementaciones específicas de estas técnicas de RMN se pueden encontrar en Hauptmann, H et al., Bioconjugate Chem. 11 (2000): 239-252 o Bowler, J. Steroids 54/1 (1989): 71-99. Otro método de ejemplo incluye la preparación del éster de Mosher o derivado de amida del alcohol o amina correspondiente, respectivamente. La configuración absoluta del éster o amida se determina luego mediante espectroscopía de RMN de protones y/o 19 F. Un método de ejemplo incluye la recristalización fraccionada usando un "ácido de resolución quiral" que es un ácido orgánico ópticamente activo que forma sal. Los agentes de resolución adecuados para los métodos de recristalización fraccionada son, por ejemplo, ácidos ópticamente activos, tal como las formas D y L de ácido tartárico, ácido diacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido málico, ácido láctico o los diversos ácidos alcanforsulfónicos ópticamente activos. La resolución de mezclas racémicas también se puede llevar a cabo por elución en una columna rellena con un agente de resolución ópticamente activo (por ejemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). Las composiciones de solvente de elución adecuadas pueden ser determinadas por un experto en la técnica.

Se pueden obtener materiales de inicio derivados de androstenodiona de ejemplo de Steraloids, Inc. (Newport, RI). A continuación se muestran cuatro derivados de androstenodiona utilizados en la síntesis (el enlace ondulado designa un isómero de configuración o una combinación de cada isómero):

4-androsicn-.?.17 -á lona _{4-íttidrosten-J J 7-chona .7-0}

CAS 63-05-S cai boMJinell loxima. sal sód sa

Ste/ídoidfis (A603 ^íM>(H>) Slemloides (A6035-000)

También se proporcionan en la presente, pero no forman parte de la invención reivindicada en la presente, conjugados de androstenodiona útiles para sintetizar los conjugados detectables. Estos conjugados pueden tener la estructura:

Habitualmente, los ésteres de acridinio zwitteriónicos ("ZAE") que comprenden un grupo funcional reactivo para formar enlaces covalentes como se describe en las Patentes de Estados Unidos No. 6,664,043 a Natrajan et al., 7,309,615 a Natrajan et al., 9,575,062 a Natrajan et al., o 9,487,480 a Natrajan, y en particular con respecto a los ésteres de acridinio zwitteriónicos descritos en el mismo y sus síntesis, se pueden utilizar para sintetizar los compuestos de la invención. Por ejemplo, los materiales de inicio de éster de acridinio zwitteriónico pueden comprender un grupo N-sulfopropilo ("NSP") en una porción zwitteriónica y/o comprender un átomo de nitrógeno cargado conectado al núcleo de acridinio cargado ("DIZAE") y/o comprender un éster de dimetil acridinio estabilizado estéricamente ("DMAE") y/o comprender un núcleo de aciridinio funcionalizado con isopropoxi ("ISO") y/o comprender una porción de enlace zwitteriónico ("Z") y/o derivado de hexa(etileno) glicol ("HEG") y/o derivado de glutarato (por ejemplo, —C(O)—(CH²)³—C(O)—) entre el éster de acridinio y el grupo funcional reactivo. El grupo funcional reactivo puede ser por NH²o éster de N-hidroxisuccinimidilo ("NHS"). Los ejemplos de ésteres de acridinio que se pueden utilizar como materiales de inicio se proporcionan a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2

Los conjugados de androstenodiona quimioluminiscente también se pueden sintetizar a través del uso de reactivos de sulfonamida de acridinio. Por ejemplo, las sulfonamidas de acridinio descritas en la Patente de Estados Unidos No.

5,543,524 a Mattingly et al., son materiales de inicio útiles para la preparación de los conjugados de quimioluminiscente y rostenediona descritos en la presente.

Los conjugados de androstenodiona quimioluminiscente son útiles como etiquetas en ensayos para la determinación o cuantificación de ciertos analitos capaces de competir por la unión a un compañero de unión con androstenodiona. Más habitualmente, el analito a medir es 4-androstenodiona.

El ensayo puede ser, por ejemplo, un inmunoensayo "competitivo" que habitualmente implica la detección de una molécula grande, también denominada analito macromolecular, usando moléculas de unión tales como anticuerpos. El anticuerpo se inmoviliza o se une a una fase sólida tal como una partícula, perla, membrana, placa de microtitulación o cualquier otra superficie sólida. Un esquema de un ensayo competitivo para androstenodiona usando los compuestos descritos en la presente se ilustra en la figura 1.

En un ejemplo de un ensayo heterogéneo competitivo, un soporte que tiene un anticuerpo para un analito (por ejemplo, anticuerpos monoclonales bovinos 3C3, 3H10, 4G8) unido a este se pone en contacto con un medio que contiene una muestra que se sospecha que contiene el analito y los conjugados de androstenodiona quimioluminiscente (o "análogos marcados") descritos en la presente. El analito de la muestra compite por la unión al anticuerpo del analito con el análogo etiquetado. Después de separar el soporte y el medio, la actividad de la etiqueta del soporte o el medio se determina mediante técnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de analito en la muestra. En una variación del ensayo heterogéneo competitivo anterior, el soporte comprende el análogo de analito, que compite con el analito de la muestra para unirse a un reactivo de anticuerpo de acuerdo con los principios descritos en la presente. El análogo de analito marcado se puede unir de forma covalente con una molécula quimioluminiscente o fluorescente que a menudo se denomina marcador o marcador.

Cuando la fase sólida con el anticuerpo inmovilizado se mezcla con una muestra que contiene el analito y el analito marcado, se forma un complejo de unión entre el analito o el analito marcado. Este tipo de ensayo a menudo se denomina ensayo heterogéneo debido a la participación de una fase sólida. Luego se puede medir la señal quimioluminiscente asociada con el complejo de unión y se puede inferir la presencia o ausencia del analito en la muestra. Por lo general, el complejo de unión se separa del resto de los componentes de reacción de unión tales como exceso, analito etiquetado, antes de la generación de señal. Por ejemplo, si el complejo de unión se asocia con una perla magnética, se puede usar un imán para separar el complejo de unión asociado con la perla de la solución a granel.

Mediante el uso de una serie de "estándares", es decir, concentraciones conocidas del analito, se puede generar una curva de "dosis-respuesta" para el analito etiquetado conocido. Por lo tanto, la curva dosis-respuesta correlaciona una cierta cantidad de señal medida con una concentración específica de analito. En un ensayo competitivo, a medida que aumenta la concentración del analito, la cantidad de señal disminuye si se mide la quimioluminiscencia del complejo de unión. La concentración del analito en una muestra desconocida se puede calcular comparando la señal generada por una muestra desconocida que contiene el analito macromolecular, con la curva dosis-respuesta.

La metodología de la unión de moléculas de unión tales como anticuerpos a fases sólidas, es bien conocida en la técnica anterior. Por ejemplo, un anticuerpo se puede unir de forma covalente a una partícula que contiene aminas en su superficie mediante el uso de una molécula de reticulación tal como glutaraldehído. La unión también puede ser no covalente y puede implicar la adsorción simple de la molécula de unión a la superficie de la fase sólida, tal como perlas de poliestireno y placa de microtitulación. El etiquetado de moléculas de unión tales como anticuerpos y otras proteínas de unión también son bien conocidos en la técnica anterior y comúnmente se denominan reacciones de conjugación y el anticuerpo marcado a menudo se llama un conjugado. Habitualmente, una porción reactiva a amina en la etiqueta reacciona con una amina en el anticuerpo para formar un enlace amida. Otros enlaces, tal como tioéter, éster, carbamato y similares entre el anticuerpo y la etiqueta también son bien conocidos en la técnica anterior.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un reactivo para la detección de un analito que comprende un compuesto de acridinio quimioluminiscente unido a androstenodiona. El reactivo puede comprender de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 ng/mL del compuesto de acridinio quimioluminiscente o de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 ng/mL del compuesto de acridinio quimioluminiscente o de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 ng/mL del compuesto de acridinio quimioluminiscente. En algunas realizaciones, el compuesto se proporciona en un reactivo que comprende además un amortiguador.

Habitualmente, el ensayo para la detección o cuantificación de un analito en una muestra comprende:

(a) proporcionar un conjugado detectable de la presente invención;

(c) mezclar este compuesto, este soporte sólido y esta muestra;

(d) separar este soporte sólido de esta mezcla;

f) medir la cantidad de emisión de luz con un luminómetro, y

En el contexto de la presente invención, el analito detectado o cuantificado es androstenodiona (por ejemplo, 4-androstenodiona, etc.). En algunas realizaciones, la muestra deriva de un mamífero (por ejemplo, humano). En algunas realizaciones, la muestra comprende saliva y/o sangre y/o suero. En algunas realizaciones, la muestra es saliva y/o sangre y/o suero.

En algunos ensayos, la muestra a analizar se somete a un pretratamiento para liberar analito de sustancias de unión endógena tales como, por ejemplo, proteínas plasmáticas o séricas que se unen al analito. La liberación del analito de sustancias de unión endógena puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la adición de un agente de digestión o un agente de liberación o una combinación de un agente de digestión y un agente de liberación utilizado secuencialmente. El agente de digestión es uno que descompone las sustancias de unión endógena para que ya no puedan unirse al analito.

Las condiciones para llevar a cabo un ensayo en una porción de una muestra de acuerdo con los principios descritos en la presente pueden incluir llevar a cabo el ensayo en un medio amortiguador acuoso a un pH moderado, generalmente el que proporciona una sensibilidad de ensayo óptima. El medio acuoso puede ser únicamente agua o puede incluir de 0.1 a aproximadamente 40 % en volumen de un cosolvente. El pH para el medio puede estar en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, o aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.5. Por lo general, el valor de pH de la solución será un compromiso entre la unión óptima de los miembros de unión de cualquier par de unión específica, el pH óptimo para otros reactivos del ensayo tales como miembros del sistema de producción de señal, y así sucesivamente. Se pueden usar varios amortiguadores para lograr el pH deseado y mantener el pH durante el ensayo. Los amortiguadores ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, TRIS, barbital, PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS y BICINE, por ejemplo.

Se pueden emplear diversos materiales auxiliares en los métodos de ensayo. Por ejemplo, además de amortiguadores, el medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los reactivos empleados. En algunas realizaciones, el medio puede comprender proteínas (por ejemplo, albúminas), solventes orgánicos (por ejemplo, formamida), sales de amonio cuaternario, polianiones (por ejemplo, sulfato de dextrano), potenciadores de unión (por ejemplo, polialquilenglicoles), polisacáridos (por ejemplo, dextrano, trehalosa, etc.) y combinaciones de los mismos.

La activación de la quimioluminiscencia de los análogos se puede realizar por la adición de una cantidad conocida de reactivos de activación quimioluminiscentes. Los reactivos desencadenantes quimioluminiscentes pueden ser ácidos o básicos. Se pueden adicionar múltiples reactivos desencadenantes quimioluminiscentes secuencialmente. Por ejemplo, primero se puede agregar una solución ácida seguida por una solución básica. En algunas realizaciones, los reactivos activadores quimioluminiscentes comprenden peróxido de hidrógeno, sales de peróxido de hidrógeno, ácido nítrico, sales de ácido nítrico, hidróxido de sodio, sales de amonio o combinaciones de los mismos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la síntesis de una cantidad representativa de compuestos y el uso de estos compuestos en la medición de muestras de androstenodiona en un ensayo competitivo heterogéneo. Por consiguiente, se pretende que los Ejemplos ilustren pero no limiten la divulgación. Los compuestos adicionales no específicamente ejemplificados se pueden sintetizar usando métodos convencionales en combinación con los métodos descritos en la presente.

Ejemplo 1: Síntesis del intermedio de A4-ácido 7-propiónico

Se adicionó (3-Bromopropoxi)-terc-butildimetilsilano (1654 mg, 6.53 mmol) a un matraz de fondo redondo (RBF) cargado con una barra de agitación, virutas de magnesio (164 mg, 6.82 mmol) y THF anhidro (6 mL) con agitación a 40°C. La mezcla resultante se agitó a 40°C hasta que la mayoría de las virutas de magnesio desaparecieron. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente (RT). Se adicionó más THF (10 mL) para disolver cualquier precipitado para formar una solución de reactivo de Grignard homogénea. Esta solución de reactivo de Grignard (16 mL) se adicionó a una suspensión de CuI (597 mg, 3.14 mmol) en THF (10 mL) a -40°C a -30°C durante 15 min. La mezcla resultante se agitó durante 10 min a -40°C a -30°C para formar una solución de organocuprato. Luego se adicionó 4,6-androstadien-3,17-diona (150 mg en 1 mL de solución de THF, 0.53 mmol) a la solución de organocuprato. La mezcla resultante se agitó durante 1 h a -40°C a - 30°C. Se adicionó ácido acético glacial (AcOH, 2 mL) a la reacción a -40°C a -30°C con agitación. La mezcla resultante se agitó durante 30 min. Se adicionó solución de NH4Cl (30 mL) y se agitó 20 minutos más a TA. La mezcla resultante se extrajo tres veces con metil-t-butil-éter (MTBE). La solución de extractos de MTBE combinada se lavó con salmuera saturada (2x), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para dar el producto crudo. Este producto crudo se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (hexanos/acetato de etilo) para dar el producto puro deseado A4-7-PrOTBS como una mezcla de a y p (181 mg, 74%). MS (M+H, 459.3).

Se adicionó solución de THF de 1.0 M (1.5 mL, 1.5 mmol) a una solución de A4-7-PrOTBS (176 mg, 0.384 mmol) en THF (2 mL) con agitación a 0°C (baño de hielo). La mezcla resultante se retiró del baño de hielo y se agitó a TA durante 1 h. Se adicionó salmuera saturada (8 mL) a la reacción. La solución de extractos de MTBE combinada se lavó con salmuera saturada (2x), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para dar el producto crudo. La solución de extractos de EtOAc combinada se lavó con salmuera saturada (2x), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para dar el producto crudo. Este producto crudo se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (Hexanos/EtOAc) para dar el producto puro deseado A4-7-PrOH como una mezcla de a y p (92.9 mg, 70%). MS (M+Na, 367.2).

Se disolvió A4-7-PrOH (87.5 mg, 0.255 mmol) en MeCN (3 mL). Se disolvió perrutenato de tetrapropilamonio ("TPAP", 18.9 mg, 0.0538) en MeCN (2 mL). La solución de TPAP MeCN se adicionó a N-óxido de N-metilmorfolina ("NMO") monohidrato (366 mg, 2.71) con agitación para disolver todos los sólidos. La solución de NMO-TPAP se agregó luego a la solución de A4-7-PrOH con agitación. La mezcla resultante se agitó durante 1h a TA. Después de 1h, se adicionó 2-PrOH (1 mL) a la solución de mezcla y se agitó durante 1h para apagar el exceso de NMO. La solución de mezcla de reacción se cargó directamente en un cartucho de gel de sílice seco. Se lavó el cartucho de gel de sílice con 5% de HOAc en EtOAc. El 5% HOAc recolectado en solución EtOAc se concentró para dar el producto crudo Este crudo se purificó por HPLC (0.05% TFA en agua/0.05% TFA en MeCN) para dar el producto puro deseado A4-7-ácido propiónico como una mezcla de a y p (51.6 mg, 57%). MS (M+Na, 367.2).

Ejemplo 2: Síntesis del conjugado A4(3) -CMO-Z1-ZAE

La síntesis del conjugado A4(3) -carboximetil-oxima ("CMO'')-Z-ZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

El conjugado A4(3)-CMO-Z-ZAE también se sintetizó haciendo reaccionar 3-O-carboximetiloxima de 4-androsten-3,17-diona, sal de sodio con NSP-DMAE-Z-NH ²en presencia de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio ("BOP"), N,N-diisopropiletilamina ("(iPR)²NEt") y N,N-dimetilformamida ('DMF"). Se preparó una solución de 10% de H2O:90% de DMF (vol:vol) mezclando 100 ^L de H²O con 900 ^L de DMF. Se adicionó una mezcla de 3-O-carboximetiloxima de 4-androsten-3,17-diona, sal de sodio (1.1 mg, 2.9 ^mol), NSP-DMAE-Z-NH ²(1.3 mg, 1.7 ^mol) y BOP (1.7 mg, 3.8 ^mol) a 333 ^L de la solución de H²O:DMF. La solución se mezcló completamente y se adicionó (iPr)²NEt (0.9 ^L, 0.7 mg, 5.4 ^mol). Tras la adición de la base (iPr)²NEt, la solución se convirtió de amarillo a incoloro. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche durante 19.1 horas.

Después de la agitación durante la noche, se realizó una cromatografía líquida de alta presión analítica ("HPLC") en la mezcla de reacción usando una columna Phenomenex Bondclone C¹⁸, 10^m, 300 * 3.9 mm y un gradiente de múltiples pasos (0%^39%B en 39 minutos; 39%^100%B en 1 minuto; mantener a 100% B durante 6 minutos) de eluyentes (A=agua con TFA trifluoracético al 0.05%; B=acetonitrilo con TFA al 0.05%) a una velocidad de flujo de 1.0 mL/minuto, un tamaño de bucle de inyección de 250 ^L y una longitud de onda de detección de 260 nm. HPLC analítica mostró una conversión del 90% al producto. La mezcla se almacenó a -70°C durante 72 horas. Se realizó la purificación con HPLC semipreparativa en la mezcla de reacción. La HPLC preparativa se realizó en la mezcla de reacción usando una columna YMC-Pack ODS-A, No. 3025000136 (W), Ci8 10^m 250 * 30 mm y un gradiente de eluyentes de 10%B^70%B durante 50 minutos (A=agua con TFA trifluoracético al 0.05%; B=acetonitrilo con TFA al 0.05%) a una velocidad de flujo de 20.0 mL/minuto, un tamaño de bucle de inyección de 5 mL y una longitud de onda de detección de 262 nm. El producto se eluyó como dos picos isoméricos en tiempos de retención de 34.1-34.9 min. Las fracciones de pico se recolectaron, se congelaron a - 70°C y se liofilizaron para producir dos polvos amarillos separados (65% de rendimiento total). Se utilizaron HPLC y desorción/ionización por láser asistida por matriz TOF-MS ("MALDI TOF-MS") para caracterizar cada fracción. Para el análisis MALDI TOF-MS, cada muestra se disolvió en acetonitrilo 1:1 ácido trifluoroacético al 0.05%: agua ácido trifluoroacético al 0.05% a una concentración de 0.05 - 2.00 mg/mL. Esta mezcla se mezcló en una relación aproximadamente 1:1 con una solución de matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico ("HCCA") y se colocó en la placa objetivo. Las concentraciones se ajustaron según fuera necesario para generar una buena señal de ruido. El MALDI TOF-MS se ejecutó en modos lineales o reflectantes de iones positivos. La fracción con un tiempo de retención de 34.15 minutos (93.54% puro) tuvo un pico MALDI TOF-MS de 1085.426 (modo positivo lineal) y 1084.990 (modo positivo reflector). La fracción con un tiempo de retención de 34.05 minutos (89.63% puro) tuvo un pico MALDI T^oF-MS de 1084.782 (modo positivo lineal) y 1084.704 (modo positivo reflector).

Ejemplo 3: Síntesis del conjugado A4(17)-CMO-Z-ZAE

La síntesis del conjugado A4(17)-CMO-Z-ZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

El conjugado A4(17)-CMO-Z-ZAE también se sintetizó al hacer reaccionar 4-androsten-3,17-diona 17-carboximetoxiloxima con NSP-DMAE-Z-NH²en presencia de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio ("BOP"), N,N-diisopropiletilamina ("(iPR)²NEt") y N,N-dimetilformamida ("DMF''). Se preparó una solución de 10% de H2O:90% de DMF (vol:vol) mezclando 100 ^L de H²O con 900 ^L de DMF. Se adicionó una mezcla de 4-androsten-3,17-diona 17-carboximetoxiloxima (1.1 mg, 3.1 ^mol), NSP-DMAE-Z-NH²(1.3 mg, 1.7 ^mol) y BOP (1.9 mg, 4.3 ^mol) a 333 ^L de la solución de H²O:DMF. La solución se mezcló completamente y se adicionó (iPr)²NEt (0.9 ^L, 0.7 mg, 5.4 ^mol). Tras la adición de la base (iPr)²NEt, la solución se convirtió de amarillo a incoloro. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche durante 20.2 horas.

Después de la agitación durante la noche, se realizó una cromatografía líquida de alta presión analítica ("HPLC") en la mezcla de reacción usando una columna Phenomenex Bondclone C¹⁸, 10^m, 300 * 3.9 mm y un gradiente de múltiples pasos (0%B durante 1 minuto; 0%^60%B en 60 minutos; 60%^100%B en 3 minutos; mantener a 100% B durante 6 minutos) de eluyentes (A=agua con TFA trifluoracético al 0.05%; B=acetonitrilo con TFA al 0.05%) a una velocidad de flujo de 1.0 mL/minuto, un tamaño de bucle de inyección de 250 ^L y una longitud de onda de detección de 260 nm. HPLC analítica mostró una conversión del 65% al producto. La mezcla se almacenó a -70°C durante 72 horas. Se realizó la purificación con HPLC semipreparativa en la mezcla de reacción. La HPLC preparativa se realizó en la mezcla de reacción usando una columna YMC-Pack ODS-A, No. 3025000136 (W), C¹⁸10^m 250 * 30 mm y un gradiente de eluyentes de 10%B^-70%B durante 50 minutos (A=agua con TFA trifluoracético al 0.05%; B=acetonitrilo con TFA al 0.05%) a una velocidad de flujo de 20.0 mL/minuto, un tamaño de bucle de inyección de 5 mL y una longitud de onda de detección de 262 nm. El producto eluyó un pico a tiempos de retención de 32.7-34.0 min. La fracción de pico se recolectó, congeló a -70°C y liofilizó para producir un polvo amarillo (1.2 mg, 65% de rendimiento total). Se usaron HPLC y MALDI TOF-MS para caracterizar la fracción. La fracción tuvo un pico MALDI TOF-MS de 1084.718 (modo positivo lineal) y 1084.722 (modo positivo reflector).

Ejemplo 4: Síntesis del conjugado A4(19)-CME-Z-ZAE

La síntesis del conjugado A4(19)-carboxi metil éter ("CME")-Z-ZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

El conjugado A4(17)-CMO-Z-ZAE también se sintetizó mediante la reacción de 3,17-dioxo-4-androsten-19-il carboximetil éter con NSP-DMAE-Z-NH ²en presencia de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris (dimetilamino)fosfonio ("BOP"), N,N-diisopropiletilamina ("(iPR)²NEt") y N,N-dimetilformamida ("DMF"). Se sintetizó éter de carboximetilo de 3,17-dioxo-4-androsten-19-ilo como se describe en RA4, Pemmaraju Narasimha, et al. Journal of Steroid Biochemistry 17(5), 523-527 (1982 ), y con respecto a la síntesis de conjugados de androstenodiona. Se preparó una solución de 10% de H2O:90% de DMF (vol:vol) mezclando 100 ^L de H²O con 900 ^L de DMF. Se adicionó una mezcla de 3,17-dioxo-4-androsten-19-il carboximetil éter (6.8 mg, 1.9 ^mol), NSP-DMAE-Z-NH²(13.8 mg, 18.6 ^mol) y BOP (13.3 mg, 30.1 ^mol) a 952 ^L de la solución de H²O:DMF. La solución se mezcló completamente y se adicionó (iPr)²NEt (9.6 ^L, 7.1 mg, 5.5 ^mol). Tras la adición de la base (iPr)²NEt, la solución se convirtió de amarillo a incoloro.

Después de 1.5 horas, la HPLC analítica mostró una conversión del 94% al producto. La HPLC analítica se realizó en la mezcla de reacción usando una columna Phenomenex Bondclone C¹⁸, 10^m, 300 * 3.9 mm y un gradiente de múltiples pasos (0%B durante 1 minuto; 0%^100%B en 30 minutos; mantener a 100%B durante 6 minutos) de eluyentes (A=agua con TFA trifluoracético al 0.05%; B=acetonitrilo con TFA al 0.05%) a una velocidad de flujo de 1.0 mL/minuto, un tamaño de bucle de inyección de 250 ^L y una longitud de onda de detección de 260 nm. HPLC analítica mostró una conversión del 94% al producto. La mezcla se almacenó a -70°C durante 24 horas. Se realizó la purificación con HPLC semipreparativa en la mezcla de reacción. La HPLC preparativa se realizó en la mezcla de reacción en dos inyecciones usando una columna YMC-Pack ODS-A, No. 3025000136 (W), C¹⁸10^m 250 * 30 mm y un gradiente de eluyentes de 10%B^70%B durante 50 minutos (A=agua con TFA trifluoracético al 0.05%; B=acetonitrilo con TFA al 0.05%) a una velocidad de flujo de 20.0 mL/minuto, un tamaño de bucle de inyección de 5 mL y una longitud de onda de detección de 261 nm. El producto eluyó un pico a tiempos de retención de 21.9-23.8 min. La fracción de pico se recolectó, congeló a -70°C y liofilizó para producir un polvo amarillo (7.0 mg, 35% de rendimiento total). Se usaron HPLC y MALDI TOF-MS para caracterizar la fracción. La fracción tuvo un pico MALDI TOF-MS de 1085.400 (modo positivo lineal) y 1085.382 (modo positivo reflector).

Ejemplo 5: Síntesis del Conjugado A4(6P)-hemisuccinato-Z-ZAE

La síntesis del conjugado A4(6p)-hemisuccinato-Z-ZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

Ejemplo 6: Síntesis del Conjugado A4(6p)-carbamato-Z1-ZAE

La síntesis del conjugado A4(6p)-carbamato-Z-ZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

Ejemplo 7: Síntesis del Conjugado A4(7a)-CETE-ZAE

La síntesis del conjugado A4(7a)-carboxietiltio éter ("CETE")-NH-ZZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

Ejemplo 8: Síntesis del conjugado A4(7)-propionamida-Z-ZAE

La síntesis del conjugado A4(7)-propionamida-Z-ZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

Se adicionaron solvente en mezcla de agua-DMF (9/1,0.6 mL) y N,N-diisopropiletilamina ("DIPEA", 4.7 ^L, 26.9 ^mol) a un vial cargado con NSP-DMAE-Z-NH ²(5.0 mg, 6.73 ^mol), A4-ácido 7-propiónico (2.51 mg, 7.01 ^mol) y hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio ("BOP", 5.97 mg, 13.5 ^mol) con agitación. La mezcla resultante se agitó durante 4 horas a TA. Esta mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC (TFA al 0.05% en agua/TFA al 0.05% en MeCN) para dar el producto puro deseado de A4-ácido 7-propiónico como una mezcla de a y p (4.36 mg, 60%). MS (M+Na, 1105.5).

Ejemplo 9: Síntesis de conjugados A4(7)-propionamida-HEG-ZAE

La síntesis del conjugado A4(7)-propionamida-HEG-Z-ZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

Ejemplo 10: Síntesis del conjugado A4(7)-propionamida-et-NH-glutarato-NH-Z-ISODIZAE

Se adicionaron DMSO (1.0 mL) y TEA (30^L) a un vial cargado con NSP-DMAE-HEG-NH²(1.5 mg, 1.98 emoles), 7 ácido 7-propiónico (5.4 mg, 14 emoles) y hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi) tripirrolidino-fosfonio ("PyA4P", 23.1 mg, 44.3 emoles) con agitación. La mezcla resultante se agitó durante 4 horas a TA. Esta mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC (TFA al 0.05% en agua/TFA al 0.05% en MeCN) para dar el producto puro deseado de A4-ácido 7-propiónico como una mezcla de a y p (1.55 mg, 40%). MS (M+Na, 1118.6).

La síntesis del conjugado A4(7)-propionamida-et-NH-glutarato-NH-Z-ISODIZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

Ejemplo 11: Síntesis del conjugado A4(7)-et-NH-glutarato-NH-Z-ISODIZAE

La síntesis del conjugado A4(7)-et-NH-glutarato-NH-Z-ISODIZAE se realizó usando el esquema sintético descrito a continuación.

Ejemplo 12: Evaluación de Conjugados de A4-AE

La evaluación de los conjugados de A4-AE se realizó usando la familia de analizadores de inmunoensayo ADVIA Centaur (disponible en Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY) usando un formato de ensayo competitivo que utiliza un reactivo de fase sólida y un reactivo ligero. El reactivo ligero comprende 20 ng/mL de un compuesto trazador A4-AE. El reactivo sólido comprende perlas superparamagnéticas (Dynabeads® M-270 Streptavidin disponible de ThermoFisher Scientific) etiquetadas con anticuerpo monoclonal anti-A4 biotinilado. Los anticuerpos de androstenodiona monoclonal de oveja biotinilada 3C3, 3H10 o 4G8 (disponibles en Bioventix, Reino Unido) se introducen en las perlas superparamagnéticas recubiertas con estreptavidina para producir partículas de fase sólida unidas al anticuerpo. Las partículas de fase sólida mezcladas con A4-AE en ausencia de A4, dan como resultado complejos de unión a fase sólida con los compuestos de A4-AE. Cuando el reactivo ligero comprende androstenodiona, la competencia por la formación de un complejo de unión en cada anticuerpo se produce entre los conjugados A4 y A4-AE. Como se puede ver en la Figura 1, una partícula de fase sólida ("SP") con más complejos de unión a androstenodiona comprenderá menos porciones de acridinio quimioluminiscentes (encerrados en un círculo en la Figura 1). Por lo tanto, un aumento en la concentración de androstenodiona en las muestras medidas se correlaciona con una disminución en la quimioluminiscencia de los complejos de unión de partículas de fase sólida separados y lavados. La quimioluminiscencia de los complejos de unión a partículas de fase sólida separados se induce mediante la adición de una solución ácida (0.5% de peróxido/0.45% de ácido nítrico (vol/vol)) seguida por una solución básica (0.25N NA4H/0.45% ARQUAD® 16-50 (p/v)) y se mide. Los volúmenes de reactivo, las concentraciones y los parámetros de ensayo fueron de otra manera idénticos en cada experimento que no fuera la variación del conjugado trazador A4-AE medido. Las muestras de androstenodiona utilizadas en el reactivo ligero se prepararon usando una matriz a base de albúmina sérica humana (disponible de Bioresource Technology, Inc.) con las concentraciones de muestra de androstenodiona que se muestran en las Figuras 2A-2D (ng/mL).

Se monitoreó la quimioluminiscencia para una variedad de conjugados de A4-AE. La Tabla 2 a continuación y las Figuras correspondientes. 2A-2D resumen los resultados de experimentos de quimioluminiscencia en varios conjugados de A4-AE que se pueden sintetizar como se describe en el número de ejemplo indicado. En la Tabla 3, un "+" indica una unión apreciable del conjugado de A4-AE especificado al anticuerpo especificado y un "-" indica que no se observó una unión apreciable.

Tabla 3

Como se puede ver, la conjugación en las posiciones 6 o 17 de la porción de androstenodiona ("A4-6-AE" o "A4-17-AE", respectivamente) con la porción de enlace de carbamato (-OC(O)NH-) no mostró unión apreciable. El A4-3-AE conjugado con una porción de unión a carboximetil oxima ("CME," =NO—CH²—C(O)—NH—) unido a los anticuerpos 3C3 y 3H10, pero con baja afinidad cada anticuerpo (como se determina por separación de señales y se muestra en la Figura 2A). Los marcadores con conjugación en la posición 19 fuertemente unidos a anticuerpos 3H10 y 4G8 sin ninguna unión apreciable al anticuerpo 3C3 como se muestra en Figura 2B. La conjugación en las posiciones 6p o 7a con porciones de enlace de hemisuccinato (—OC(O)CH²CH²C(O)NH—) o carboxietil tio éter ("CETE", —SCH²CH²C(O)NH—) mostró una fuerte afinidad de unión para los tres anticuerpos. Además, estas porciones de unión en estas posiciones tienen diferentes ordenamientos de afinidades para cada complejo de anticuerpo/A4-AE. Como se puede ver, la posición del conjugado y la porción de unión del trazador A4-AE se relaciona con la afinidad de unión de ese trazador a un anticuerpo específico. Por ejemplo, los conjugados A4-6-AE que comprenden una porción de unión a carbamato no muestran una unión apreciable, mientras que los conjugados A4-6-AE que comprenden una porción de unión a hemisuccinato muestran afinidad por dos de los tres anticuerpos medidos.

Las soluciones acuosas de los marcadores se almacenaron a 4°C en un amortiguador acuoso a pH 6.5 durante 28 días y el inmunoensayo se volvió a ejecutar para determinar la estabilidad de los compuestos mediante mediciones del cambio en la quimioluminiscencia después del almacenamiento. Estas condiciones son típicas para instrumentos automatizados comerciales como la familia de analizadores de inmunoensayo ADVIA Centaur. Como se muestra en la figura 2E, los ensayos con marcadores A4-AE que comprenden conjugación en la posición 6p con un ligador de hemisuccinato mostraron una disminución de la salida de luz medida cuando el ensayo se ejecutó nuevamente 28 días después del ensayo inicial. Como se puede ver, los marcadores A4-AE que comprenden conjugación en la posición 6p muestran pérdida sustancial de quimioluminiscencia después de 28 días en el sistema amortiguador. Las mediciones realizadas en androstenodiona conjugada en la posición 7 (A4-7-AE) no mostraron una inestabilidad similar.

Ejemplo 13: Formas de curva de los conjugados A4-7-AE

Las formas de curva de quimioluminiscencia para varios conjugados de A4-7-AE se evaluaron adicionalmente usando el anticuerpo 3C3. Se midió el efecto de varias porciones de enlace en la forma de curva de la salida de luz en función de la androstenodiona (ng/mL). Las formas de la curva se generaron a partir de ensayos que utilizaron trazadores A4-AE con conjugación de androstenodiona en la posición siete con —SCH²CH²C(O)NH— o —CH²CH²C(O)NH— porciones de enlace. La figura 3A ilustra la señal resultante generada por ensayos que utilizan tres conjugados A4-AE diferentes medidos normalizados como un porcentaje de señal generada a partir de un reactivo ligero sin androstenodiona. En estos experimentos, se eligió [A4]=10 ng/mL como salida de luz al 0%. Como se puede ver, estos conjugados A4-7-AE demostraron formas de curva equivalentes con conjugación en las posiciones 7a y 7p y con cada uno de las porciones de enlace medidas.

También se midieron AE y/o porciones de enlace con diversas propiedades químicas y salidas de luz para determinar el impacto en el rendimiento en el ensayo. Las porciones de enlace se conjugan con androstenodiona en la posición 7. Las porciones de conjugados de ZAE medidos tienen las estructuras mostradas a continuación en la Tabla 3. Además, también se comparó una porción AE con un ligador zwitteriónico reemplazado por un ligador HEG (HEG-ZAE). La figura 3B muestra la señal resultante generada a partir de ensayos que utilizan conjugados A4-7-AE que comprenden los conjugados A4-AE descritos en la Tabla 3.

Ejemplo 14: Unión no específica de los conjugados A4-7-AE

Se midió la interferencia de biotina en la unión no específica de conjugados A4-7-AE. Se realizó un ensayo ADVIA Centaur con una fase sólida que comprende el anticuerpo 3C3 en suero nativo que comprende aproximadamente 2.2 ng/mL de androstenodiona y varios conjugados A4-7-AE. La biotina puede alterar la unión de los conjugados a la fase sólida de ANDRO al alterar la superficie de las perlas recubiertas con estreptavidina. Por consiguiente, se midió un ensayo de otro modo idéntico para cada conjugado, donde la muestra de suero comprendía una concentración de biotina de 100 ng/mL y los resultados se compararon para determinar qué conjugados se ven más afectados por la presencia de biotina durante la medición. La Tabla 4 muestra la concentración medida del ensayo de androstenodiona utilizando las muestras con biotina y muestras enriquecidas con biotina. Los cambios en la concentración de androstenodiona entre la muestra sin biotina y la muestra con biotina son indicativos de interferencia de biotina en los conjugados de unión no específica A4-7-AE. Como se puede ver, los conjugados que comprenden un ligador CETE (—SCH²CH²C(⁰)NH—) tienen mayor unión inespecífica inducida por biotina que los conjugados sin la porción de enlace de azufre ("carbono;" —CH²CH²C(O)NH—). Esta tendencia se observa tanto en las configuraciones de conjugación 7a como 7p.

Tabla 4

_________ _________

Ejemplo 15: Mediciones de precisión de conjugados A4-7-AE

Se analizaron nueve muestras de suero que comprenden varias concentraciones de androstenodiona (así como otros analitos) con un ensayo de ADVIA Centaur que comprende el anticuerpo 3C3 para determinar la precisión de los conjugados de A4-7-AE en un intervalo de concentración de androstenodiona y períodos de prueba. Las muestras incluyeron dos niveles de materiales de control de calidad comercialmente disponibles suministrados en el Inmunoensayo Liquichek® Plus Quality Control ("QC2" y "QC3" disponibles de Bio-Rad, Hercules, CA). Otras siete muestras de pacientes nativos o en suero enriquecidas fueron proporcionadas por BioreclamationIVT. Se realizaron cinco mediciones repetidas de cada muestra en un día. Las cinco mediciones repetidas también se repitieron durante cinco días diferentes. La gran concentración media de A4 (de las 25 mediciones en cada muestra) con un A4-carbono-AE se muestra en la Tabla 5. Además, se muestran los parámetros ANOVA de desviación estándar ("SD") y porcentaje de covarianza ("%CV") dentro de cada cinco mediciones repetidas por día y dentro de las mediciones promedio durante cinco días. Como se puede ver, el conjugado A4-carbono-AE proporciona resultados altamente precisos en mediciones repetidas. Se obtuvieron resultados similares para los conjugados A4-7-ISO-DIZAE y A4-7-HEG-ZAE.

Tabla 5

Ejemplo 16: Rendimiento de linealidad en un ensayo que utiliza conjugados A4-7-AE

Se prepararon siete muestras diferentes con concentraciones conocidas de A4 que se analizarán con un ajuste lineal ponderado para determinar la desviación entre las concentraciones de androstenodiona observadas y esperadas para los conjugados de A4-7-AE. La concentración de A4 esperada, la concentración de A4 y el % de sesgo al modelo lineal se ajustan a cada concentración de androstenodiona esperada cuando se usa el conjugado A4-carbono-AE se muestra en la Tabla 6. Como se puede ver, la conjugación en la posición 7 da como resultado un ensayo con un sesgo bajo del modelo lineal en los rangos de concentración de androstenodiona medidos. Habitualmente, la concentración de androstenodiona de muestras derivadas de suero estará dentro de estos intervalos.

Tabla 6

Ejemplo 17: Sesgo del ensayo de conjugados A4-7-AE utilizando muestras de pacientes

También se midieron una serie de muestras de pacientes obtenidas de BioreclamationIVT para la concentración de androstenodiona usando el inmunoensayo ADVIA Centaur que comprende conjugado A4-carbono-AE para determinar el sesgo de la medición del ensayo en comparación con las mediciones cromatográficas líquidas/espectroscópicas de masa en tándem (LC-MS/MS) (ARUP Laboratories, Salt Lake City, Utah) de cada muestra. Las muestras de los pacientes eran nativas o se enriquecieron con androstenodiona adicional. El sesgo porcentual se informa como la diferencia entre la valoración y las mediciones de LC-MS/MS con respecto a la medición de LC-MS/MS. La Tabla 7 muestra los resultados de las mediciones. Los conjugados de A4-AE se pueden usar para determinar la concentración de androstenodiona en una muestra de paciente usando un inmunoensayo con bajo sesgo en todo el intervalo de concentraciones de androstenodiona medidas.

Tabla 7

La figura 4 ilustra la comparación de la concentración derivada del inmunoensayo usando el conjugado A4-AE con la concentración derivada del ensayo LC-MS/MS. Como se puede ver, los conjugados A4-AE son capaces de medir con mayor precisión la concentración de A4.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado detectable de androstenodiona que comprende un compuesto de androstenodiona conjugado con una porción de acridinio quimioluminiscente, este conjugado tiene la estructura de la fórmula (I):

A-L-y (I)

donde A es androstenodiona o un derivado de la misma;

L es un ligador; y

y es una etiqueta de acridinio quimioluminiscente,

donde este compuesto de androstenodiona (A) se une covalentemente a L a través de cualquiera de los carbonos 3, 6, 7, 17 o 19 de este sistema de anillo de androstenodiona,

donde los derivados de androstenodiona son 4-androsten-3,17-diona; 4-androsten-3,17-diona 3-O-carboximetiloxima; 4-androsten-3,17-diona 17-O-carboximetiloxima y 19-hidroxi-4-androsten-3,17-diona.

2. El conjugado detectable de la reivindicación 1, donde L tiene la estructura —Lc—(Zl)z— donde

"z " es 0 o 1;

ZL es un grupo ligador zwitteriónico que tiene la estructura:

"m" es 0 (es decir, es un enlace) o 1;

Xa es un grupo aniónico;

R' es hidrógeno o un C^1-10alquilo.

3. El conjugado detectable de la reivindicación 1 o 2, donde y tiene la estructura de la fórmula (IIa)

donde Q es CH, O o N;

Y' está ausente (es decir, es un enlace), o se selecciona de —Li—, —RL—, —RL—Li------ L¹—L¹—, —Li— RL—, —Li—RL—Li, o —RL—L¹—RL—; e Y' comprende uno o más enlaces a LC o ZL;

R¹es hidrógeno, —R, -X, —RL—X, —Li—R, —Li—X, —Z, —RL—Z, —Li—Z, o —RL—Li—RL—Z;

Z es un grupo zwitteriónico que tiene la estructura:

donde "q" y 7' son independientemente 0 o 1;

V es independientemente un número entero de 0 a 10;

Li es independientemente en cada ocurrencia -O-, -S-, -NH-, -N(RN)-, -(CH²)i-i⁰-, -S(=O)i^-2-, -C=C-, -C=C-(CH²)i-³- , -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-(CH2)i-4-, -(CH²) i^-4-C(O)-, -C(O)- O-, -C(O)-N(RN)-, -C(O)-NH-, -N(RN)--NH-C(O)-, -C(O)-N(RN)-(CH2)i-3-, -(CH2)i-3-C(O)-N(RN)-, -NH-S(O)i-2-, -N(RN)-S(O)i-2-, -S(O)i-2-N(RN)-, -S(O)i-²- NH-, -(CH2)i-3-NH-S(O)i-2-, -(CH2)i-3-N(RN)-S(O)i-2-, -(CH2)i-3-S(O)i-2-N(RN)-, -(CH2)i-3-S(O)i-2-NH-, -O-(CH²)i-4- , -(CH2)i-4-O-, -S-(CH2)i-4-, -(CH2)i-4-S-, -NH-(CH2)i-4-, -N(RN)-(CH2)i-4-, -(CH2)i-4-N(RN)-, -(OCH2)i-i0-, -(CH²O)i-i⁰-, -(OCH²CH²)i-i⁰-, o -(CH²CH²O)i-i⁰-,

RL es independientemente en cada aparición un radical hidrocarburo bivalente C^1-20(por ejemplo, alquilo, alquenilo, arilo, fenilo, fenilo sustituido con monoalquilo, fenilo sustituido con dialquilo, alquinilo, arilalquilo, etc.), opcionalmente sustituido con 1-10 heteroátomos;

R es independientemente en cada aparición un radical hidrógeno o C^1-35hidrocarburo (por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo), opcionalmente sustituido con 1-20 heteroátomos;

R' y R" son independientemente en cada aparición hidrógeno o un C^1-10alquilo;

Xb es independientemente en cada aparición un grupo aniónico; y

RN se selecciona independientemente en cada aparición de hidrógeno o C^1-5alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, etc.).

4. El conjugado detectable de la reivindicación 1 o 2, donde ^ tiene la estructura de la fórmula (IIb):

donde R⁵-R⁷son independientemente hidrógeno o C^1-35alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alcoxi, alquiltio o amino; y donde L¹está unido covalentemente a L (por ejemplo, a LC o ZL).

5. El conjugado detectable de la reivindicación 4, donde Li en la fórmula (IIa) es —C(O)—NH—.

6. El conjugado detectable de la reivindicación 4 o 5, donde R⁵y R6 son cada uno metilo y R⁷y R8 son cada uno hidrógeno.

7. El conjugado detectable de la reivindicación 1 o 2, donde ^ tiene la estructura de la fórmula (IIc):

donde Y" está ausente o es -Li-, —RL— o —RL —Li —, donde Y" está unido covalentemente a L (por ejemplo, a LC o ZL).

8. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde este compuesto de androstenodiona (A) está unido de forma covalente a L a través del carbono 6 o 7 de este sistema de anillo de androstenodiona.

9. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, donde LC tiene la estructura:

-(X1)q-1-(RL)q-5-(X2)ü-1-(RL)ü-5-(X3)ü-1-(RL)ü-5-(X4)q-1-(RL)0-5-donde Xi se selecciona de =N—, —O—, —S— o —NRN—;

RL se selecciona independientemente en cada ocurrencia de

—(CH²CH²O)— o — OCH²CH²)—;

con la condición de que Lc comprende al menos un átomo (o al menos dos átomos) en la cadena entre A y ^ (o entre A y ZL); o

donde Lc comprende —C(O)—NH— o -NH-C(O)-.

10. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, donde Lc tiene la estructura:

11. El conjugado detectable de acuerdo con la reivindicación 10 que tiene la estructura:

12. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-11, donde Xa y Xb son independientemente en cada aparición carboxilato (—C(O)O')1 ^ 3 J, sultanato^ sulfonato, fosfato (—OP(O)(ORP)O-) u óxido (—O-), y RP es hidrógeno o C^1-12hidrocarburo opcionalmente sustituido con hasta 10 heteroátomos.

13. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-12, donde R¹comprende- ^ 0

donde R¹comprende sulfopropilo, o

donde R¹es —S(O)²—NH—Z o —(CH2)1-3—S(O)2—NH—Z.

14. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13, donde R²y R³son independientemente en cada ocurrencia hidrógeno, alquilo o alcoxi (por ejemplo, isopropoxi), o

donde R²y R3 son cada uno hidrógeno, o

donde uno de R²o R³es hidrógeno y el otro de R²o R³es alcoxi (por ejemplo, isopropoxi).

15. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, donde X a en ZL es sulfonato \ me s 1, RL isopropilo, y n y p son cada uno 3, de manera que ZL tiene la estructura:

16. El conjugado detectable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde este conjugado detectable tiene la estructura de la fórmula (III)

donde este conjugado detectable tiene la estructura de la fórmula (IIIa):

donde este conjugado detectable tiene la estructura de la fórmula (IIIb):

17. Una composición de reactivo para la detección de un analito que comprende un conjugado detectable de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 en un medio amortiguado con pH.

18. Un ensayo para la detección o cuantificación de un analito en una muestra que comprende:

(a) proporcionar un conjugado detectable de androstenodiona o un derivado de la misma como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-16;

(c) mezclar este compuesto, este soporte sólido y esta muestra;

(d) separar este soporte sólido de esta mezcla;

f) medir la cantidad de emisión de luz con un luminómetro, y