CN107652344B - 化合物、缀合物、试剂盒及其在检测睾酮或其类似物中的用途 - Google Patents

化合物、缀合物、试剂盒及其在检测睾酮或其类似物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了化合物、缀合物、检测睾酮或其类似物的试剂盒及检测睾酮或其类似物的试剂盒在检测睾酮或其类似物中的用途。所述化合物具有式(1)所示的结构，其中，L表示连接臂，R1、R2、R3和R4分别独立地为氢基、羟基、C1～3烷基、C1～3烷氧基、C2～3烯基或C2～3炔基。本发明的化合物能够准确地对睾酮或其类似物进行检测。

Description

化合物、缀合物、试剂盒及其在检测睾酮或其类似物中的用途
技术领域
本发明涉及分析领域。具体地，本发明涉及化合物、缀合物、试剂盒及其在检测睾酮或其类似物中的用途。更具体地，本发明涉及化合物、缀合物、检测睾酮或其类似物的试剂盒及检测睾酮或其类似物的试剂盒在检测睾酮或其类似物中的用途。
背景技术
睾酮类似物是指与睾酮具有相似结构的物质，即具有如下母核结构单元。
Figure BDA0001058325150000011
目前，利用免疫法对睾酮或其类似物检测的原理为：由于睾酮或其类似物上没有可以直接连接上标记分子的官能团，需要经过化学合成的方法引入可以直接连接上标记分子的结构(称为连接臂，可以为羧基、氨基等)，得到睾酮衍生物。接着，通过化学键将标记分子连接到睾酮衍生物的连接臂上，制备成睾酮标记分子。在检测过程中，睾酮标记分子与待测样本中的睾酮或其类似物竞争结合相应抗体，利用标记分子直接或者间接产生的光信号，通过赋值校准，获得待测睾酮衍生物的浓度值，从而完成对待测样本中睾酮含量的测定。
然而，目前适用的睾酮衍生物仍有待开发。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一：
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
睾酮或其类似物上的衍生位点即引入连接臂的位置的选择是难点，既要有合成的可行性，又要保证得到的睾酮衍生物能够与相应抗体特异性结合。发明人通过对睾酮或其类似物的结构进行深入研究发现，通过在睾酮或其类似物结构的11或12位碳上修饰合成出连 接臂得到睾酮衍生物。引入的连接臂不会破坏睾酮的抗原决定簇结构和空间位阻，且睾酮衍生物能够有效地与相应抗体特异性结合，达到准确检测睾酮或其类似物含量的目的。
有鉴于此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物具有下式所示的结构，其中，L表示连接臂，R1、R2、R3和R4分别独立地为氢基、羟基、C1～3烷基、C1～3烷氧基、C2～3烯基或C2～3炔基。发明人经过大量实验发现，通过在睾酮或其类似物结构的11或12位碳上修饰合成出连接臂，得到本发明的化合物——睾酮衍生物，引入连接臂不会破坏抗原决定簇的结构和空间位阻，且睾酮衍生物能够有效地与相应抗体特异性结合。此外，根据本发明的实施例，本发明的化合物容易获得，易于推广应用。
Figure BDA0001058325150000021
在本发明的第二方面，本发明提出了一种缀合物。根据本发明的实施例，该缀合物包括前面所描述的化合物以及标记分子，所述标记分子与所述化合物的连接臂相连。根据本发明实施例的缀合物能够有效地与抗体特异性结合，通过标记分子直接或者间接与检测底物进行反应产生的可检测信号，以准确地确定睾酮或其类似物的含量。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测睾酮或其类似物的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所描述的缀合物。发明人发现，利用本发明的试剂盒，基于缀合物能够有效地与抗体特异性结合，通过标记分子直接或者间接与检测底物进行反应产生的可检测信号，以准确地确定睾酮或其类似物的含量。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面描述的试剂盒在检测睾酮或其类似物中的用途。如前所述，根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒能够准确有效地对睾酮或其类似物进行检测。
此外，根据本发明的实施例，化合物、缀合物、检测睾酮或其类似物的试剂盒以及试剂盒在检测睾酮或其类似物的用途具有下列优点的至少之一：
通过将睾酮或其类似物结构的11或12位碳作为衍生位点，引入连接臂，从而得到本发明的化合物。引入连接臂不会破坏抗原决定簇的结构和空间位阻，所得到的化合物能够有效地与相应抗体特异性结合，且该化合物容易获得，易于推广应用。此外，该化合物能够连接到标记分子上，得到缀合物，并将其应用于睾酮或其类似物的检测，能够基于免疫检测原理(如显色、光信号变化等)准确地检测样本中睾酮或其类似物的含量。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的检测睾酮或其类似物的过程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的睾酮浓度-斜率曲线图；
图3显示了根据本发明另一个实施例的睾酮浓度-斜率曲线图；
图4显示了根据本发明又一个实施例的睾酮浓度-斜率曲线图；
图5显示了根据本发明又一个实施例的睾酮浓度-斜率曲线图；以及
图6显示了根据本发明一个实施例的曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了化合物、缀合物、检测睾酮或其类似物的试剂盒及检测睾酮或其类似物的试剂盒在检测睾酮或其类似物中的用途，下面将分别对其进行详细描述。
化合物
在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。该化合物具有式(1)所示的结构，其中，L表示连接臂，R1、R2、R3和R4分别独立地为氢基、羟基、C1～3烷基、C1～3烷氧基、C2～3烯基或C2～3炔基。
Figure BDA0001058325150000031
需要说明的是，关于式(1)所示化合物的连接臂L衍生位点的确定，发明人进行了大量实验研究。
具体地，首先，如下式所示：
Figure BDA0001058325150000041
发明人发现，以11或12位碳作为衍生位点，能够较容易地引入连接臂L，不会破坏抗原决定簇的结构，且合成的化合物稳定性强，L不易丢失。在该位点引入L所得到的化合物能够有效地与抗原进行特异性结合，进而能够准确地对睾酮或其类似物进行检测。然而，以其他位点引入连接臂所得到的化合物对睾酮或其类似物检测的效果不佳。进而，发明人以睾酮或其类似物的11或12位碳作为衍生位点，引入连接臂，从而得到本申请的化合物—睾酮衍生物。
需要说明的是，参见式(b)所示化合物，取代基L画一个键连接到中心的环上所形成的环体系代表取代基L取代环上面11位碳上的氢(如式(b1)所示化合物)或12位碳上的氢(如式(b2)所示化合物)。
Figure BDA0001058325150000042
根据本发明的实施例，R1为羟基，R2为羟基或氢基，R3为氢基，R4为氢基。根据本发明的另一个实施例，该化合物具有以下之一的结构：
Figure BDA0001058325150000051
根据本发明的实施例，该化合物具有以下之一的结构：
Figure BDA0001058325150000052
缀合物
在本发明的第二方面，本发明提出了一种缀合物。本发明化合物可作为式(1)所示化合物的缀合物的形式使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明作为式(1)所示化合物通过其连接臂以共价键与标记分子连接而形成的化合物。根据本发明实施例的缀合物能够有效地与抗体特异性结合，通过标记分子直接或者间接与检测底物进行反应产生的可检测信号，以准确地确定睾酮或其类似物的含量。
根据本发明的实施例，对标记分子的种类不作严格限定。根据本发明的一些实施例，标记分子为生物素、酶、吖啶酯或其类似物、吡啶钌或其类似物、鲁米诺或其类似物、异鲁米诺或其类似物、异硫氰酸荧光素或其类似物。由此，能够通过标记分子与检测底物进行反应产生的可检测的信号，以准确地确定睾酮或其类似物的含量。
根据本发明的实施例，对酶的种类不作严格限定。其中，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或乙酰蛋白酶与催化底物特异性结合能力强，用于免疫检测时效率高，检测结果准确可靠。因而，根据本发明的一些优选实施例，酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或乙酰蛋白酶。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物所描述的特征和优点同样适用于该缀合物，在此不再赘述。
检测睾酮或其类似物的试剂盒
在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测睾酮或其类似物的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所描述的缀合物。发明人发现，利用本发明的试剂盒，基于缀合物能够有效地与抗体特异性结合，且基于其携带的标记分子能够直接或者间接地与检测底物发生反应，产生可检测信号，从而能够准确地检测样本中睾酮或其类似物的含量。
根据本发明的实施例，所述睾酮类似物为雄烯二酮。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对缀合物所描述的特征和优点同样适用于该检测睾酮或其类似物的试剂盒，在此不再赘述。
检测睾酮或其类似物的试剂盒在检测睾酮或其类似物中的用途
在本发明的第四方面，本发明提出了一种检测睾酮或其类似物的试剂盒在检测睾酮或其类似物中的用途。如前所述，根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒能够准确有效地对睾酮或其类似物进行检测。
根据本发明的实施例，试剂盒是采用竞争结合法对睾酮或其类似物进行检测。试剂盒中的化合物结构与睾酮或其类似物具有几乎相同的特异性结合的结构，将竞争性地结合抗体。根据本发明的具体实施例，可以先将含有睾酮或其类似物的样本、抗体、固相载体及缀合物一起进行孵育，使缀合物所携带的衍生物与样本中的睾酮或其类似物同时竞争性结合抗体，得到缀合物-抗体-固相载体复合物及睾酮或其类似物-抗体-固相载体复合物，洗涤游离的睾酮或其类似物、抗体和缀合物，再将复合物与检测底物混合，使标记分子与检测底物产生可检测信号(如光信号)，从而确定样本中睾酮或其类似物的含量。具体地，固相载体可以为磁微粒、胶体金或纤维素膜。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对检测睾酮或其类似物的试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该检测睾酮或其类似物的试剂盒在检测睾酮或其类似物中的用途，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列过程合成式(2)所示的化合物：
Figure BDA0001058325150000071
合成路线如下所示：
Figure BDA0001058325150000072
1、合成化合物2：
投料3.05g(0.01mol)化合物1、2.8g(0.02mol)无水碳酸钾和0.5g DMAP于100mL干燥圆底烧瓶中，加入50mL DMF搅拌溶解。加入3.53g(0.015mol)TBS-Cl(三正丁基氯硅烷)，升温至60℃，反应18小时。定时取样，利用薄层色谱(体系为正己烷/乙酸乙酯＝6/1，磷钼酸显色)对样品进行检测，待显示原料消失时，停止加热。回到室温后，将反应液转至250mL分液漏斗中，加入150mL乙酸乙酯，水洗4次，无水硫酸钠干燥，浓缩，抽干，得油状物6.3g。过柱纯化，得到4.1g化合物2，反应产率81.5％。
MS：正离子峰：503.5，525.5(+Na峰)。
2、合成化合物3：
投料4.0g(0.008mol)化合物2、0.5g DMAP和1.2g丁二酸酐(0.012mol)于100mL干燥圆底烧瓶中，加入60mL二氯甲烷搅拌溶解，室温反应16小时。定时取样，利用薄层色谱(体系为正己烷/乙酸乙酯＝6/1，磷钼酸显色)对样品进行检测，待显示产生一个新点，且为主要成分，有少量原料没有消失时，停止反应，回到室温后，将反应液转至分液漏斗中，水洗四次。无水硫酸钠干燥，浓缩。过柱纯化，得到3.4g化合物3，反应产率70.8％。
MS：正离子峰：603.7，625.7。
3、合成式(2)所示化合物：
投料3g(5mmol)化合物3于100mL圆底烧瓶，加入60mL四氢呋喃，搅拌溶解。加入0.5mL乙酸，加入3.9g(15mmol)TBAF(四丁基氟化氨)，室温反应4小时，停止反应。旋蒸去除溶剂，加入100mL乙酸乙酯，水洗三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。过柱纯化，得到1.55g式(2)所示化合物，反应产率77.5％。
MS：正离子峰：427.4(+Na峰)；负离子峰：403.5。
实施例2
在该实施例中，按照下列过程合成式(3)所示的化合物：
Figure BDA0001058325150000081
合成路线如下所示：
Figure BDA0001058325150000082
合成式(3)所示化合物：
投料0.91g(3mmol)化合物5于50mL干燥冷却反应瓶中，加入20mL二氯甲烷，搅拌溶解，加入0.2g DMAP、0.48g(4.8mmol)丁二酸酐，室温搅拌反应过夜(16小时)。将反应液转入分液漏斗，水洗四次，无水硫酸钠干燥，浓缩，过柱纯化，得到0.95g式(3)所示化合物，反应产率78.7％。
MS：正离子峰：403.6，425.6(+Na峰)；负离子峰：401.5。
实施例3
分别将实施例1和2所得到的化合物按照下列步骤标记碱性磷酸酶，得到缀合物1和 2。
向Mes(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(pH＝4.5)中加入待标记化合物，终浓度为0.2mg/mL；加入碱性磷酸酶(ALP)，终浓度为0.2mg/mL，混匀；再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)，终浓度为2mg/mL，混匀；加入氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)，终浓度为2mg/mL，混匀；25℃下，反应2小时；以pH＝7.5的Tris缓冲液，超滤置换三次，纯化去除过量的睾酮衍生物和交联剂，得到缀合物。
实施例4
在该实施例中，选取睾酮浓度分别为：0、1、4、10、20和40ng/mL的6个样本作为睾酮校准品，分别记为C0、C1、C2、C3、C4和C5。设置四个实验组，每组实验组中睾酮抗体不同，分别利用实施例3所得到的缀合物1和2对不同睾酮校准品进行检测，主要过程示意图如图1所示。具体步骤如下：
(1)将睾酮校准品(25μL)、羊抗鼠抗体磁珠(0.2g/L，50μL)、缀合物(200μg/L，50μL)和睾酮鼠单抗(0.1mg/L，50μL)混匀后37℃孵育11分钟，形成磁珠-羊抗鼠二抗-睾酮鼠单抗-睾酮复合物和磁珠-羊抗鼠二抗-睾酮鼠单抗-缀合物复合物的混合物。其中睾酮与缀合物相互竞争结合睾酮鼠单抗，存在反比例函数关系。然后洗涤磁珠以除去未结合的睾酮和缀合物，得到磁珠-羊抗鼠二抗-睾酮鼠单抗-睾酮复合物和磁珠-羊抗鼠二抗-睾酮鼠单抗-缀合物复合物的混合物。
(2)向反应体系中加入发光底物液(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，简称为AMPPD)(200L)，37℃孵育12分钟，磁珠-羊抗鼠二抗-睾酮鼠多抗-缀合物复合物所携带的碱性磷酸酶，可以催化底物发光，且发光值与碱性磷酸酶含量成正比例关系。记录发光读数。
按照上述(1)和(2)的步骤对不同浓度睾酮校准品依次进行检测。
以睾酮校准品中睾酮浓度为横坐标，以该校准品发光读数/C0发光读数的比值(斜率)为纵坐标，绘制标准曲线，如图2～5所示。其中，图2是以MR1752睾酮鼠单抗作为抗体，图3是以MR-1756睾酮鼠单抗作为抗体，图4是以MR-1761睾酮鼠单抗作为抗体，图5是以MR-1764睾酮鼠单抗作为抗体，均为市售获得。
结果表明本发明的缀合物1和2对抗体具有较强的普适性，能够与多种抗体特异性结合，从而准确地测定样本中的睾酮含量。
方法学比对测试：
分别采用下列两种方式测定96个待测样本中睾酮含量：
方式(1)：利用缀合物1，按照上述方法采用迈瑞CL-2000i全自动化学发光免疫分析系统进行睾酮含量检测。
方式(2)：利用市售获得罗氏的睾酮试剂，按照该试剂的说明书采用罗氏COBAS-e411分析系统进行睾酮含量检测。
结果展示在图6中，其中，可以确定相关系数R2为0.9599，接近1.000，说明本发明的缀合物能够有效地测定样本中的睾酮含量，检测结果与业内认可的试剂盒的检测结果具有很好的相关性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.化合物在制备试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒用于检测睾酮，所述化合物具有以下之一的结构：
Figure FDA0002600885790000011
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒是采用竞争结合法对睾酮进行检测。
3.缀合物在制备试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒用于检测睾酮，所述缀合物包括权利要求1或2所述用途中的化合物以及标记分子，所述标记分子与所述化合物的
Figure FDA0002600885790000012
相连。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，
所述标记分子为生物素、酶、吖啶酯、吡啶钌、鲁米诺、异鲁米诺、异硫氰酸荧光素。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或乙酰蛋白酶。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒是采用竞争结合法对睾酮进行检测。
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Assignee: Shenzhen Mindray Animal Medical Technology Co.,Ltd.

Assignor: SHENZHEN MINDRAY BIO-MEDICAL ELECTRONICS Co.,Ltd.

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Denomination of invention: Compounds, conjugates, kits and their use in the detection of testosterone or the like

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